ASAM NUKLEAT

Andini Septadewi A0113102 Eva Simbolon A0920031

PENDAHULUAN

Makromolekul tumbuhan berbeda dengan semua kandungan tumbuhan lain karena bobot molekulnya yang tinggi. Secara kimia, makromolekul terdiri atas rantai panjang satuan struktur kecil atau bangunan dasar yang terikat secara kovalen dengan berbagai cara. Sebagai contoh, protein merupakan rantai panjang asam amino (sampai 20 jenis) yang saling berhubungan melalui ikatan peptida (-CO-NH-). Demikian pula polisakarida terbentuk dari satuan gula sederhana seperti glukosa yang saling berhubungan melalui ikatan eter (-O-). Sebaliknya,asam nukleat, lebih rumit, dan mempunyai tiga jenis satuan struktur: basa purina dan pirimidina, gula pentosa, dan gugus fosfat.

Kebanyakan makromolekul tumbuhan berperan sama seperti makromolekul pada organisme hewan. Jadi, DNA dan RNA terlibat dalam penyimpanan dan transkripsi informasi genetik; protein bekerja sebagai katalisator dalam reaksi enzimatis, polisakarida merupakan bentuk penyimpan energi,dsb. Cara memisahkan dan mengidentifikasi makromolekul tumbuhan berbeda dalam beberapa hal bila dibandingkan dengan cara yang diterapkan pada kandungan berbobot molekul rendah. Misalnya sering kali sukar melarutkan polimer , dan untuk ini diperlukan cara khusus. Dalam hal yang sederhana , kandungan berupa makromolekul dapat dilarutkan dengan melumatkan jaringan tumbuhan dengan larutan garam dan kemudian diendapkan dengan mengubah pH ekstrak. Karena kosentrasi beberapa makromolekul (terutama asam nukleat) pada umumnya rendah dalam jaringan tumbuhan dan memisahkan berbagai organel dengan memusingkannya sebelum diisolasi. Fraksi mitokandria yang terpisah dengan cara demikian, kaya akan protein enzim, sedangkan fraksi inti kaya akan asam nukleat.

Asam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang memegang peranan sangat penting dalam kehidupan organisme karena di dalamnya tersimpan informasi genetik. Asam nukleat sering dinamakan juga polinukleotida karena tersusun dari sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Tiap nukleotida mempunyai struktur yang terdiri atas gugus fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen atau basa nukleotida (basa N).

MACAM ASAM NUKLEAT

asam deoksiribonukleat atau deoxyribonucleic acid (DNA) asam ribonukleat atau ribonucleic acid (RNA)

FUNGSI ASAM NUKLEATmenyimpan, menstransmisi, dan mentranslasi informasi genetik. metabolisme antara (intermediary metabolism) dan reaksi-reaksi informasi energi. koenzim pembawa energi, koenzim pemindah asam asetat, zat gula, senyawa amino dan biomolekul lainnya. koenzim reaksi oksidasi reduksi.

PROSES YANG TERJADI DALAM RNA, DNA

Transkripsi adalah tahap pertama pemebentukan molekul RNA, sesuai pesan (kode) yang diberikan oleh DNA Translasi yaitu molekul RNA menerjemahkan informasi genetika kedalam proses pembentukan protein. Pada tahap ini, asam amino secara berurutan diikat satu dengan yang lainnya oleh rRNA di ribosom sesuai kode yang diberikan dari DNA

Replikasi DNA DNA mampu membelah diri dan masing-masing rantai polinukleotida yang berpisah dapat membentuk rantai baru yang merupakan pasangannya.

EKSTRAKSI ASAM NUKLEAT

Tujuan dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya.

Protokol ekstraksi atau isolasi asam nukleat biasanya melibatkan proses fisik dan kimia. Proses tersebut biasanya dimulai dengan homogenisasi jaringan untuk meningkatkan jumlah sel atau permukaan area yang akan dilisiskan. Homogenisasi jaringan sangat berguna untuk mengekstrak asam nukleat dari organ atau jaringan. Langkah selanjutnya biasanya adalah permeabilisasi sel target. Permeabilisasi sel dapat dilakukan dengan menggunakan detergen non-ionik (sehingga tidak mengikat asam nukleat) seperti Tween, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), Nonidet, Laureth dan Triton. Untuk melepaskan asam nukleat di dalamnya sel perlu dilisiskan terlebih dahulu (biasanya menggunakan bufer hipotonik). Langkah selanjutnya berupa degradasi dan presipitasi protein (dengan pemanasan, enzime proteinase atau dengan menggunakan garam chaotropic). Asam nukleat yang diperoleh dapat dipresipitasi untuk dikonsentrasikan ke dalam volume yang lebih kecil. Presipitat yang sering digunakan adalah isopropanol, etanol, dan PEG (polyethylene glycol). Setelah dilakukan pencucian, langkah terakhir adalah solubilisasi asam nukleat.

Metode yang paling dikenal untuk ekstraksi/isolasi asam nukleat adalah metode fenol/khloroform/isoamilalkohol. Metode ini sangat bermanfaat untuk aplikasi PCR karena dapat membantu menghilangkan penghambat PCR yang terdapat pada larutan ekstrak. Metode ini akan menghasilkan lapisan air yang mengandung asam nukleat, lapisan antara fenol dan air yang berisi protein penghambat yang mengalami presipitasi dan polimer (termasuk karbohidrat), dan lapisan khloroform-isoamilalkohol yang mengikat lemak. Setelah ektraksi fenol ini, lapisan air dipindahkan ke tabung mikrosentrifus steril dan asam nukleat dipresipitasi dengan menambahkan 3 M Sodium asetat pH 5,2 yang diikuti dengan pencucian menggunakan etanol 100% dilanjutkan dengan etanol 70% untuk membuang sisa fenol dan garam. Meskipun sangat murah dan relatif mudah, yang perlu diingat adalah phenol/khloroform/isoamilalkohol sangat toksik dan limbahnya perlu perlakukan khusus sebelum dibuang.

EKSTRAKSI DNA

DNA biasanya diisolasi dari sel dengan menggunakan metode yang melisiskan sel tetapi mencegah fragmentasi DNA. Langkah ini biasanya melibatkan EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) yang dalam proses tersebut akan mengikat ion magnesium (kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim DNase). Idealnya dinding sel (jika ada) didigesti secara enzimatis (misalnya dengan enzim lisosim). Selanjutnya membran sel sebaiknya disolubilisasi dengan detergen. Jika disrupsi fisik dibutuhkan sebaiknya dilakukan seminim mungkin. Dalam proses disrupsi ini enzim nuklease yang terlepas dari komponen selular dapat mencerna asam nukleat secara efisien, sehingga kerja enzim nuklease harus dihambat. Disrupsi sel dan sebagian besar langkah selanjutnya sebaiknya dilakukan pada suhu 4 0C, menggunakan alat yang terbuat dari gelas dan larutan yang telah di-autoclave (fungsi autoclave adalah untuk menghancurkan aktivitas DNase pada alat atau larutan tersebut).

Setelah melepaskan asam nukleat dari sel, RNA dapat dihilangkan dengan penambahan RNase yang telah diterapi panas untuk menginaktivasi DNase kontaminan (RNase relatif stabil terhadap panas karena adanya ikatan disulfida yang akan menyebabkan proses renaturasi ketika didinginkan). Kontaminan mayor lainnya, yaitu protein, dihilangkan dengan dengan larutan fenol atau campuran fenol-khloroform (keduanya akan mendenaturasi protein tetapi tidak mendenaturasi asam nukleat). Setelah campuran tersebut dibuat menjadi emulsi, dilakukan pemusingan. Setelah pemusingan akan terbentuk bagian organik di bagian bawah dan bagian aqueous di bagian atas dipisahkan lapisan yang terdiri dari protein yang terdenaturasi. Cairan aqueous diambil dan dideproteinisasi beberapa kali sampai tidak ada lagi material yang terlihat pada lapisan tengah. Kemudian DNA yang sudah tidak mengandung protein ini dicampur dengan dua bagian etanol. DNA akan menjadi presipitat, terpisah dari larutan sampel tersebut. Setelah dipusingkan, pelet DNA kemudian dilarutkan kembali.

EKSTRAKSI RNA

Metode untuk ekstraksi RNA mirip dengan metode ekstraksi DNA. Namun, molekul RNA relatif pendek dan lebih sulit rusak dengan shearing sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan lebih agresif. Meskipun begitu, RNA sangat mudah didigesti oleh RNase yang terdapat endogen dengan konsentrasi yang bervariasi di dalam sel dan di eksogen di jari. Sehingga, untuk ektraksi RNA harus menggunakan sarung tangan dan medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung detergen kuat untuk segera mendenaturasi RNase yang ada. Proses deproteinisasi harus dilakukan secara lebih agresif karena RNA sering berikatan kuat dengan protein. Penambahan DNase dapat digunakan untuk menghilangkan DNA. RNA kemudian dipresipitasi dengan etanol. Reagen yang sering digunakan untuk ekstraksi RNA adalah guanidinium thiocyanate yang merupakan inhibitor kuat RNase dan merupakan denaturan protein.

Integritas RNA dapat dicek dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Spesies RNA yang terbanyak (molekul rRNA) berukuran 23S dan 16S untuk prokariot dan 18S dan 28S untuk eukariot. RNA tersebut akan tampak sebagai pita yang diskrit dalam gel agarose dan mengindikasikan komponen RNA lainnya masih utuh. Proses ini biasanya dilakukan dalam keadaan denaturasi untuk mencegah terjadinya formasi struktur sekunder pada RNA. RNA sangat sensitif terhadap nuklease. Semua basa RNA memiliki grup 2-hidroksil reaktif sehingga mudah terjadi reaksi kimia yang menghasilkan air dan merusakkan rantai gulanya. Yang perlu diingat, nuklease (RNase) relatif stabil di lingkungan dan bahkan kadang masih dapat bertahan setelah proses denaturasi panas dan ekstraksi fenol.

Aktivitas nuklease selama proses ekstraksi asam nukleat dapat dikurangi dengan cara: Mempertahankan suhu inkubasi dan sentrifugasi di bawah suhu optimum nuklease (37 0C), misalnya dengan mempertahankan larutan ekstrak pada suhu es atau 4 0C. Menginaktivasi nuklease pada permukaan gelas, air dan bahan habis pakai dengan bahan kimia seperti DEPC (diethylpyrocarbonate). Inaktivasi dan atau penghambatan secara kimiawi, misalnya dengan fenol atau garam guanidinium. Penghilangan ion logam ko-faktor untuk nuklease dengan chelating agent.

Untuk mengisolasi mRNA eukariotik (yang hanya 2-5% dari RNA selular) dari campuran molekular RNA total dapat dilakukan dengan afinitas kromatografi terhadap kolumn oligo(dT)-selulosa. Pada konsentrasi garam yang tinggi, mRNA yang mengandung ekor poli(A) akan berikatan dengan molekul oligo(dT) komplementer pada kolumn afinitas, sehingga mRNA tetap tertinggal, sedangkan molekul RNA lainnya dapat dicuci bersih dari kolumn menggunakan larutan tinggi garam. Selanjutnya, mRNA yang terikat tadi dapat dilarutkan dengan garam berkonsentrasi rendah.

EKSTRAKSI DNA DARI DARAH METODE KAWASAKI UNTUK APLIKASI PCR

Reagen: 1) Proteinase K (20 mg/ml dalam 10 mM Tris-Cl pH 7,5) 2) Bufer TE: - 10 mM Tris-Cl - 1 mM EDTA (pH 7,5 atau 8,0) 3) Bufer PCR: - 50 mM KCl - 10-20 mM Tris-Cl - 2,5 mM MgCl2 (pH 8,3) 4) Bufer K: - Bufer PCR - Tween 20 0,5% - 100 mg/ml Proteinase K

Prosedur: 1. Campur 50 ml darah utuh dengan 0,5 ml bufer TE dalam tabung mikrosentrifus. 2. Sentrifus 10 detik dengan kecepatan 13.000 x g. 3. Buang supernatan, resuspen pelet dengan 0,5 ml buffer TE, sentrifus 10 detik 13,000 x g. 4. Ulangi langkah no-3 dua kali. 5. Resuspen pelet terakhir dalam 100 ml Bufer K, inkubasi 45 menit pada 56 0C (atau semalaman jika memungkinkan). 6. Inkubasi 10 menit 95 0C. 7. DNA siap dipakai untuk PCR.

PROTEINProtein dalam tumbuhan, seperti pada organisme lain, merupakan polimer asam amino berbobot molekul tinggi. Asam amino tersusun linier, urutannya ditentukan oleh sandi triplet basa DNA inti,dan setiap protein mempunyai urutan asam amino khas. Protein terdapat pada keseluruhan bagian tumbuhan pada semua jenis jaringan, bahkan organ sederhana seperti daun dapat mengandung beberapa ribu protein, terutama protein enzim. Karena itu, cukup sukar untuk memisahkan dan mengisolasi beberapa protein tertentu.

CARA YANG DIANJURKAN

Dalam mengisolasi protein dari jaringan tumbuhan, ada empat bahaya khas yang harus dihadapi: cairan sel keasamannya tinggi dan adanya fenolase, tanin serta enzim proteolitik. Pengaruh cairan sel asam (pH 2-4) yang dapat menyebabkan denaturasi protein dapat dihindari dengan memaserai jaringan yang disertai dengan dapar netral (pH 6-8). Pengaruh perusakan fenolase dapat diatasi dengan menambahkan senyawa merediksi seperti asam askorbat atau metil merkaptan. Cara lainnya dengan mengekstraksi dalam lingkungan nitrogen. Bahaya tanin yang mudah membentuk kompleks dengan protein dapat dihilangkan dengan menjerapnya kedalam polivinilpirolidon (PVP,Polyclar-AT) yang dapat ditambahkan pada dapar selama ekstarksi pendahuluan. Pengaruh enzim proteolitik hanya dapat dihindari dengan melakukan isolasi secepat mungkin pada suhu rendah (o-4C)

MENENTUKAN PROTEIN

Cara yang paling banyak digunakan untuk menentukan kandungan protein suatu sediaan tumbuhan adalah cara Lowry dkk (1951). Cara ini didasarkan pada ikatan polipeptida. Suatu larutan cuplika (0,1-0,2 ml) (yag mengandungprotein antara 10 dan 100g)dicampur dengan 1 ml pereaksi (dibuat dengan menambahkan 1 ml CuSo4.5H2O 0,5% dalam natrium sitrat 1% ke dalam 50 ml Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1M.) dan larutan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Peraksi Folin-Ciocalteu sebanyak 0,10 ml dipipet, dicampur dan setelah setengah sampai dua jam serapannya diukur pada 750 nm. Glisina bebas tidak boleh ada dalam larutan uji, tetapi penetuan ini tidak dipengaruhi oleh adanya garam anorganik yang biasa digunakan dalam pengelusian protein dari kolom kromatografi.

Untuk menentukan protein kadang-kadang dipakai juga cara lain. Misalnya,protein menunjukan serapan UV umum pada 215 nm, dan dengan tidak adanya molekul lain yang menyerap UV. Di samping itu terdapat juga serapan UV antara 250 dan 300 nm yang disebabkan oleh asam amino aromatik dan dengan pengukuranspektrum UV dalam larutan basa dapat digunakan untuk menentukan kadar tirosina (maks 294 nm) dan tripofan (maks 280 nm) dalam cuplikan protein.

Menentukan bobot olekul protein dengan filtrasi gel Sephadex, cara ini dipakai secara luas.

MENENTUKAN PROTEIN LANJUTAN...

Untuk memisahkan campuran rumit peotein tumbuhan yang paling menguntungkan bila kita memakai kombinasi pemusatan isoelektrik dengan elektroforesis pada gel poliakrilamida dengan adanya natrium dodesil sulfat (SDS). Dengan cara demikian dapat membedakan 1000 macam protein dalam ekstrak tumbuhan tertentu (OFarrel, 1975).