ARTIKEL ILMIAH

PRAKTIKUM BIOKIMIA II

SEMESTER IV TAHUN AKADEMIK 2013/2014

ANALISIS ENZIM DAN KADAR PROTEIN TOTAL DARI CACING TANAH

Oleh :

Yockie Dheafitraza 260110120013

Allin Alian R.N 260110120014

Siti Amirotun Zakiyah 260110120015

Anita Putri Pratama 260110120016

Yuliani Septiani 260110120017

Rembulan Kusmawanti 260110120018

LABORATORIUM FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

ANALISIS ENZIM DAN KADAR PROTEIN TOTAL DARI CACING TANAHANALYSIS OF ENZYMES AND TOTAL PROTEIN CONTENT FROM EARTHWORMOleh: Yockie D. fitraza, Allin A.R. Nagara, Siti A. Zakiyah, Anita P. Pratama, Yuliani S, Rembulan

Fakultas Farmasi Universitas PadjadjaranJl. Raya Bandung Sumedang Km.21 Jatinangor 45363Telp. 022 7996200, Fax 022 779 6200 e-mail: farmasiunpad@yahoo.com

ABSTRAK

Habitat alami cacing tanah adalah tanah yang mengandung bahan organik, dan memiliki kemampuan untuk bertahan hidup dengan menghasilkan berbagai enzim diantaranya enzim amilase, protease dan lipase. Tujuan percobaan ini adalah mengukur aktivitas enzim amilase, protease dan lipase dari hasil isolasi cacing. Hasil yang didapat melalui ekstraksi adalah ekstrak cacing, sebanyak 50,3 gram cacing diblender hingga halus dengan ditambahkan 100 mL PBS. Ekstrak cacing yang didapat, difraksinasi yaitu filtrat hasil sentrifugasi ditambah garam Amonium Sulfat sebanyak 10,8 gram dan 11,2 gram sebagai filtrat 40% dan 80%, lalu didialisis dengan kantung selofan dengan hasil endapan cacing warna cokelat yang terbebas dari kelebihan garam. Filtrat 40% dan 80% dilakukan uji aktivitas, pertama uji aktivitas lipase didapat hasil melalui titrasi alkalimetri volume NaOH 40% 1,75 mL dengan molaritas 0,06936 mol dan volume NaOH 80% 4,4 mL dengan molaritas sebesar 0,17748 mol. Kedua, uji aktivitas protease melalui titrasi formol didapat hasil aktivitas protease dari perhitungan volume NaOH fraksi dikurangi volume NaOH kasein dikali faktor konversi 1,63 adalah sebagai berikut : untuk 40% adalah 8,15 dan 80% adalah 8,965. Terakhir, dilakukan analisis kadar protein total dengan cara biuret, dari spektrofotometri Uv-Vis hasil absorbansi untuk 40% adalah 0,5877 (60851,17 µg/mL) dan absorbansi 80% adalah 0,11736 (11461,27 µg/mL).

Kata kunci : Amilase, Protease, Lipase dan Kadar protein Total.

ABSTRACT

Earthworms natural habitat is soil containing organic matter, and have the ability to survive by producing a variety of enzymes including the enzyme amylase, protease and lipase. The purpose of this experiment is to measure the activity of the enzyme amylase, protease and lipase from worms isolated. The results extraction is to extract the worm, the worm as much as 50.3 grams of blended until smooth with added 100 mL of PBS. Worm extracts were obtained, namely the filtrate fractionated centrifugation results added salt Ammonium Sulphate 10.8 grams and 11.2 grams of the filtrate 40% and 80%, and then dialyzed with a cellophane bag with brown worm precipitated free of excess salt. The filtrate was 40% and 80% of activity test, the first test of lipase activity alkalimetri results obtained by titration of NaOH 40% volume of 1.75 mL with 0.06936 moles molarity and volume of 4.4 mL of 80% NaOH to molarity of 0.17748 mol. Second, the protease activity assay through formol titration results obtained from the calculation of the volume of protease activity reduced the volume of NaOH NaOH casein fraction multiplied by the conversion factor of 1.63 is as follows: for 40% is 8.15 and 80% is 8.965. Finally, an analysis of total protein content by the biuret method, using Uv-Vis spectrophotometry showed absorbance to 40% is 0.5877 (60851.17 mg / mL) and the absorbance of 80% is 0.11736 (11461.27 mg / mL).

keywords : Amylase, Protease, Lipase and total protein content.

PENDAHULUAN

Habitat alami cacing tanah adalah tanah yang mengandung bahan organik dalam jumlah banyak, dan cacing memiliki kemampuan untuk menghasilkan berbagai enzim, diantaranya enzim amilase, protease, lipase yang digunakan untuk memenuhi kebutuhan hidupnya (Affandi, 1996). Enzim adalah biokatalisator yang berfungsi sebagai katalis dalam proses biologis (Lehninger, 1982). Enzim yang dikenal luas penggunaannya adalah enzim amilase, lipase dan protease yang merupakan enzim hidrolitik pemecah senyawa makromolekul karbohidrat, lemak dan protein (Page, 1989).

Fraksinasi adalah suatu proses pemisahan dari campuran dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Pemisahan ini didasarkan atas bobot dari tiap fraksi, fraksi paling berat akan berada paling dasar dan fraksi yang lebih ringan akan berada diatas (Harborne, 1987).

Protease adalah enzim-enzim yang mengkatalisis pemecahan protein. Protease yang aktif dapat ditemukan di seluruh tubuh, termasuk saluran pencernaan, di dalam sel dan beredar dalam darah. protease mengkatalisis proteolisis, proteolisis memotong ikatan peptida antara asam amino dalam protein. Asam amino bebas dan fragmen protein yang lebih kecil adalah produk dari aktivitas protease (Sridianti, 2014).

Lipase merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis ester asam karboksilat dalam lemak atau minyak dan sintesis monoester (menghidrolisis lemak menjadi asam lemak dan gliserol). Lipase adalah biokatalis yang berperan besar dalam aplikasi bioteknologi, seperti dalam sintesis biopolimer, biodiesel, produksi obat, dan produksi flavor (Joseph et al, 2007).

Aplikasi amilase, lipase dan protease dalam bidang industri pangan maupun

nonpangan sangat luas berkembang di Indonesia. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan pengujian aktivitas enzim amilase, lipase dan protease dari ekstrak cacing tanah untuk mempelajari potensi cacing tanah sebagai penghasil enzim amilase, lipase dan protease. Selain itu, dilakukan analisis kadar protein total yang terkandung dalam cacing tanah tersebut.

Aktivitas enzim dilakukan secara spektrofotometri dengan menggunakan metode katekol dan kadar protein enzim dilakukan dengan metode Lowry dan Folin Ciocalteau (Lowry, 1951).

METODE PENELITIAN

Alat yang digunakan : Batang pengaduk, Beaker glass, Buret beserta Klem dan statif, Botol vial, Corong Bucher, Erlenmeyer, Gelas ukur, Kertas pH, Kertas perkamen, Penangas air, Penjepit kayu, Pipet, Plastik Selofan, Timbangan, Spektrofotometri Uv-Vis.

Bahan yang digunakan : Aquadest, Amonium Sulfat, Cacing tanah, Etanol 96%, Fenolftalein, Kalium Biftalat, Kasein, Larutan dapar Fosfat, Na-CMC, NaOH, Olive oil, Peraksi Biuret.

Ekstraksi Enzim Cacing Tanah

Cacing tanah segar dibersihkan dari kotoran fisik (tanah, debris) dengan cara mencuci cacing dibawah air mengalir, lalu dengan aquades. Ekstraksi dilakukan dengan cara mencampur 50,3 gram cacing tanah dan 100 mL pelarut 5 mM bufer fosat (PBS) pH 6,8 pada suhu 4oC. Ekstrak cacing tanah tersebut siap untuk proses selanjutnya.

Fraksinasi Enzim Cacing Tanah

Ekstrak cacing dihomogenkan, dimasukkan kedalam 3 buah tabung sentrifugasi masing-masing sebanyak 10mL. Ketiga tabung disentrifugasi pada 1000rpm selama 2

menit. Filtrat diambil dan digabungkan dalam beaker glass, endapan dibuang. Ditambahkan garam amonium sulfat sebanyak 40% dari total filtrat, diaduk selama 5 menit, dimasukkan dalam 3 tabung sentrifugasi masing-masing sebanyak 10mL. Ketiga tabung disentrifugasi kembali pada 5000rpm selama 5 menit. Ditambahkan kembali amonium sulfat sebanyak 40% dari total filtrat, diaduk selama 5 menit, lalu disentrifugasi kembali pada 5000rpm selama 5 menit. Endapan yang terbentuk diambil dan disuspensikan dalam 5ml larutan PBS. Suspensi kemudian dimasukkan dalam beaker glass yang berisi 50mL larutan PBS dan digunakan penangas es. Suspensi didialisis selama satu jam, setelah satu jam larutan PBS diganti dengan yang baru, didialisis kembali selama satu jam. Suspensi yang didapat kemudian dimasukkan dalam botol coklat lalu disimpan di lemari es.

UJi Aktivitas Lipase

Uji aktivitas Lipase dilakukan dengan substrat Olive oil (2 gram Na-CMC + 75 mL Aquadest Panas + 25 mL Olive Oil) dalam bentuk emulsi. Disiapkan 3 tabung reaksi, 2 tabung reaksi diisikan kedalamnya masing-masing 5ml emulsi olive oil 4% dan satu tabung reaksi control diisi Na-CMC 2,27%. Lalu diinkubasi pada waterbath suhu 35°C selama 3 menit. Setelah itu tabung reaksi yang berisi emulsi olive oil ditambahkan masing-masing 0,5 ml fraksi protein 40% dan 80% kemudian diinkubasi kembali pada suhu 35°C selama 30 menit. Semua tabung dipindahkan kedalam Erlenmeyer berbeda, ditambah aquades sebanyak 10 ml dan indicator fenolftalein sebanyak 2 tetes. Erlenmeyer blanko dan uji dititrasi hingga mencapai titik akhir titrasi yang ditandai dengan perubahan warna menjadi merah muda. Satu unit aktivitas enzim lipase setara dengan 1 mol asam lemak bebas yang dihasilkan dari hidrolisis substrat yang

dikatalisis oleh enzim lipase selama 30 menit.

Uji aktivitas Protease

Uji aktivitas protease menggunakan metode titrasi formol. 0,5 ml substrat kasein 0,5% dimasukkan ke dalam tabung sampel dan 0,6 ml substrat kasein 0,5% dimasukkan ke dalam tabung kontrol, kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu 35oC. 0,1 ml fraksi protein cacing 40% dan 80% ditambahkan pada tabung sampel dan pH nya diatur menjadi 4. Inkubasi dilanjutkan selama 30 menit. Lalu reaksi enzimatik pada tabung sampel dihentikan dengan menambah 5 ml etanol 96%. Sampel dipindahakan ke Erlenmeyer lalu ditambahkan 2 ml formalin dan indikator fenolftalein 2 tetes. Dilakukan titrasi formol menggunakan NaOH 0,05 N yang telah dibakukan dengan kalium biftalat. Ditentukan aktivitas enzim protease dengan mengalikan volume NaOH yang diperoleh dan faktor konversi (1,63).

Analisis Kadar Protein Total

Penentuan kadar protein fraksi 40% dan 80% cacing ditentukan dengan metode lowry. Dibuat pereaksi biuret dengan cara mencampurkan 100 mL NaOH o,1 N ditambah 2 gram Na2CO3 2% yang

ditambahkan 1 mL CuSO4 1% yang ditambahkan lagi K-NA-Tartat 2% sebanyak 2 mL lalu diaduk homogen. Setelah pereaksi biuret jadi, diukur panjang gelombang maksimum dengan mengukur 2 mL larutan kasein 300 µg/mL dan 8 mL pereaksi biuret pada tabung reaksi yang didiamkan selama 10 menit. Setelah itu, diukur panjang gelombang pada spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 400-800 nm. Selanjutnya pengukuran kurva kalibrasi dengan pengukuran kasein dengan konsentrasi 0 – 450 µg/mL pada spektrofotometre UV-Vis dengan panjang

gelompang maksimum yang telah diukur sebelumnya. Dibuat kurva kalibrasi. Penentuan kadar protein fraksi 40% dan 80% cacing dengan mengukur 1 mL fraksi cacing, 1 mL aquades, dan 8 mL pereaksi biuret yang diukur pada panjang gelombang maksimum hasil pengukuran. Berdasarkan absorbandi kemudian dihitung kadar protein pada masing-masing fraksi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi Enzim Cacing

Yang pertama kali dilakukan adalah mengambil cacing yang masih hidup dalam tanah. Digunakan cacing tanah yang masih hidup supaya enzim-enzim yang nantinya akan diekstraksi lebih bagus aktivitasnya atau setidaknya enzim-enzimnya masih digunakan untuk mencerna makanan. Selanjutnya cacing dibersihkan dari kotoran dan debris menggunakan air mengalir. Setelah itu, dibilas dengan aquadest, tujuannya supaya cacing terbebas dari kontaminan, karena jika hanya dialiri air kran saja dikhawatirkan ada logam-logam yang terbawa kedalam cacing yang akan diekstraksi.

Kemudian cacing dikeringkan menggunakan tissue, supaya aquadest yang masih menempel tidak mempengaruhi volume. Kemudian cacing yang sudah kering ditimbang sebanyak 50 gr (terambil 50,3 gr). Setelah itu, cacing diblender dengan ditambahkan sedikit (± 10 ml) dapar fosfat (PBS) 5mM pH 6,8. Dapar fosfat adalah buffer netral dengan kisaran pH 7. Penggunaan PBS pH 6,8 karena buffer PBS merupakan cairan yang komposisinya sama dengan komposisi cairan yang terdapat dalam tubuh makhluk hidup. PBS dapat menjaga fungsi dari enzim sehingga tidak akan merusak enzim. Pada makhluk hidup. dapar fosfat umumnya terdapat pada

sitoplasma sel. Selain itu juga suhu harus pada suhu 4°C, dimaksudkan supaya protein tidak terdegradasi (rusak) atau terdenaturasi.

Setelah selesai diblender dan diperoleh ekstrak kasar dilakukan penyaringan menggunakan corong Buchner. Prinsipnya adalah memisahkan endapan dari pelarutnya dengan cara menghisap udara dari tekanan dalam Buchner, proses ini dilakukan supaya proses penyaringan berjalan lebih cepat. Tetapi dalam waktu yang relatif lama hanya sedikit saja ekstrak yang dapat turun (terhisap) . Sehingga dilakukan cara penyaringan lain yaitu dengan menggunakan lap kain atau kain lain yang pori – porinya lebih besar dibanding pori-pori kertas saring. Sehingga diperoleh ekstrak yang lebih encer karena penambahan PBS pada proses penyaringan sebanyak 100 ml. Berikut hasil dari ekstraksi enzim cacing:

Tabel 1. Hasil Ekstraksi Enzim Cacing

Cacing tanah segar 50,3 gram

Diblender (cacing +

PBS 10 ml)

Ekstrak cacing

kasar

ad PBS 100 ml

(disaring)

Ekstrak cacing

lebih encer

Ekstrak yang diperoleh dimasukkan ke dalam lemari pendingin dengan suhu 4°C untuk selanjutnya dilakukan fraksinasi.

Fraksinasi Enzim Cacing

Fraksinasi enzim cacing ini bertujuan untuk memisahkan enzim berdasarkan kelarutan protein. Prinsip nya adalah mengendapkan enzim dengan menggunakan suatu garam berdasarkan kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan air, dan interaksi ionik protein. Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein oleh garam

berkonsentrasi tinggi disebut "salting out". Prinsip salting out adalah protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya.

Hal yang pertama dilakukan adalah ekstrak cacing dimasukkan kedalam 3 buah tabung sentrifugasi masing-masing sebanyak 10 mL. Lalu disentrifugasi pada 1000rpm selama 2 menit. Sentrifugasi dilakukan dengan tujuan agar mengendapkan enzim ekstrak cacing. Kemudian filtrat hasil sentrifugasi sebanyak 27 mL ditambahkan garam amonium sulfat sebanyak 40% dari total filtrat (10,8 gram), penambahan garam berfungsi untuk mengendapkan protein yang ada didalam ekstrak cacing diaduk selama 5 menit. Ketiga tabung disentrifugasi kembali pada 5000rpm selama 5 menit. Ditambahkan kembali amonium sulfat sebanyak 40% dari total filtrat 28 mL (11,2 gram), diaduk selama 5 menit, lalu disentrifugasi kembali pada 5000rpm selama 5 menit. Hasil dari sentrifugasi ini terbentuknya tiga lapisan, yaitu filtrat, endapan berwarna coklat dan kristal garam. Endapan yang terbentuk diambil dan disuspensikan dalam 5ml larutan PBS. Kemudian suspensi didialisis selama satu jam, dialisis dilakukan untuk menghilangkan garam amonium sulfat, karena garam amonium sulfat akan mempengaruhi kestabilan molekul protein enzim selama penyimpanan, suspensi yang bersifat semipermeabel dan mekanisme yang dilakukan adalah difusi, selama proses dialisis konsentrasi amonium sulfat didalam kantung dialisis akan keluar dari kantung sampai tercapai kondisi keseimbangan. Dialisis dilakukan dengan cara dimasukkan dalam beaker glass yang berisi 50mL larutan PBS dan menggunakan kantung selofan lalu

digunakan penangas es agar menjaga suhu enzim agar tidak rusak. setelah satu jam larutan PBS diganti dengan yang baru, hal ini dilakukan karena larutan PBS sudah menjadi jenuh sehingga tidak dapat menarik kembali garam, didialisis kembali selama satu jam. Suspensi yang didapat kemudian dimasukkan dalam botol coklat lalu disimpan di lemari es agar tidak rusak.

Uji Aktivitas Lipase

Pengujian aktivitas enzim lipase ditujukan untuk mengetahui aktivitas enzim lipase dari setiap fraksi protein. Pengujian aktivitas didasarkan pada alkalimetri. Titer yang digunakan merupakan larutan NaOH yang telah distandardisasi oleh larutan kalium biftalat dan didapatkan konsentrasi NaOH 0,0408 N. Emulsi minyak zaitun (olive oil) merupakan substrat yang akan dipecah menjadi asam lemak dan gliserol. Sedangkan pada blanko digunakan larutan Na-CMC 2,27%.

Inkubasi bertujan untuk mempercepat penguraian emulsi olive oil menjadi asam lemak dan gliserol. Pada suhu inkubasi diharapkan suhu optimal enzim bekerja telah tercapai. Setelah inkubasi, campuran emulsi olive oil dan fraksi protein serta blanko dipindahkan kedalam Erlenmeyer yang berbeda. Penambahan aquades sebanyak 10 ml pada masing – masing tabung reaksi bertujuan untuk menurunkan konsistensi campuran.

Titrasi dilakukan terhadap asam lemak hasil penguraian minyak oleh enzim lipase. Sehingga apabila terjadi titik akhir titrasi, terjadi perubahan warna akibat pembebasan asam lemah oleh NaOH dibantu dengan indicator fenolftalein. Titik akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna dari bening menjadi merah muda. Didapatkan volume NaOH pada blanko

sebanyak 0,05 ml; 1,75 ml untuk fraksi protein 40% dan 4,4 ml untuk fraksi protein 80%. Kontrol negative membutuhkan NaOH yang lebih sedikit dibandingkan jumlah NaOH yang dibutuhkan untuk mentitrasi fraksi protein karena pada kontrol negativ tidak mengandung asam lemak. Fraksi protein 80% seharusnya membutuhkan NaOH lebih sedikit dibandingkan dengan jumlah NaOH untuk fraksi protein 40% karena kandungan protein pada fraksi 40% lebih banyak dibandingkan dengan kandungan protein pada fraksi 80%.

Satu unit aktivitas enzim lipase setara dengan 1 mol asam lemak bebas yang dihasilkan dari hidrolisis substrat yang dikatalisis oleh enzim lipase. Didapatkan molaritas asam lemak untuk fraksi protein 40% sebesar 0,06936 mol dan fraksi protein 80% sebesar 0,17748 mol.

Uji Aktivitas Protease

Uji aktivitas protease dari setiap farksi protein menggunakan metode titrasi formol. Titrasi formol merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui kadar protein dalam suatu bahan. Protein yang digunakan adalah kasein yang akan di pecah oleh enzim protease yang terkandung di dalam fraksi protein. Kasein memiliki pH isoelektrik 4,6 sedangkan pada susu 6,6.

Pertama pembuatan larutan kasein 0,5%, sebanyak 125 mg kasein ditimbang lalu dilarutkan dengan aquades sebanyak 25 ml di dalam labu ukur. Larutan kasein yang telah homogen selanjutnya dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi, untuk tabung reaksi pertama dan kedua diisi larutan kasein sebanyak 0,5 ml dan untuk tabung reaksi ketiga diisi sebanyak 0,6 ml sebagai kontrol. selanjutnya ketiga tabung tersebut diinkubasi pada suhu 35oC selama lima menit tujuannya yaitu untuk mengkondisikan substrat saat akan diberikan fraksi protein

yang diduga mengandung enzim protease. Setelah diinkubasi tabung pertama dan kedua ditambahkan fraksi protein masing –masing sebanyak 0,1 ml, tabung pertama diberi fraksi protein 40% dan tabung kedua diberi fraksi protein 80%. Selanjutnya pH pada tabung reaksi pertama dan kedua diatur hingga mencapai pH 4 dengan dilakukan penambahan 2 tetes HCl hal ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas enzim protease pada pH 4. Tabung reaksi yang telah ditambahkan fraksi protein selanjutnya diinkubasi pada suhu 35oC selama 30 menit tujuannya adalah agar substrat (larutan kasein) dan fraksi protein (enzim protease) dapat bereaksi dan bekerja secara optimum. tabung pertama dan kedua tersebut selanjutnya ditambahkan 5 ml etanol untuk menghentikan reaksi enzimatik yang masih berlangsung.

Prosedur selanjutnya adalah pembakuan NaOH. NaOH yang telah diperoleh dengan normalitas 0,05 N dibakukan dengan kalium biftalat. Pembakuan dilakukan karena NaOH merupakan larutan baku sekunder yang konsentrasinya tidak dapat ditentukan dengan pasti sehingga untuk mendapatkan konsentrasi yang pasti ditentukan dengan menitrasi larutan basa tersebut dengan suatu titran tertentu (titran harus berupa larutan standar primer) yang sudah diketahui konsentrasinya dengan pasti yaitu kalium biftalat. Pertama, kalium biftalat ditimbang sebanyak 2,0423 gram lalu dilarutkan dengan aquades bebas CO2

didalam labu ukur 100 ml diperoleh normalitasnya 0,1 N. Diambil sebanyak 10 ml untuk dititrasi dengan NaOH dan ditambahkan indicator fenolftalein. Titrasi dilakukan secara triplo, diperoleh volume NaOH titrasi 1, 2 dan 3 yaitu sebanyak 20,5 ml, 20,3 ml, dan 20,35 ml. volume yang diambil adalah volume yang yang telah dirata-rakan yaitu 20,38 ml sehingga

normalitas dari NaOH adalah 0,049 N. Lalu tabung reaksi pertama dan kedua tersebut ditambahkan 2 ml formalin dan 2 tetes indikator fenolftalein. Tujuan dari penambahan formalin adalah agar formaldehida bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan pada asam amino sehingga memungkinkan gugus amino untuk membuffer. Pada pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi dengan larutan NaOH secara kuantitatif. Reaksi yang terjadi pada titrasi formal asam amino adalah sebagai berikut:

(Sudarmaji dkk, 2007).Reaksi diatas merupakan reaksi pembentukan dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol, maka gugus amonium akan terikat. Sehingga tidak mempengaruhi reaksi antara gugus asam (COO-) dengan NaOH, dan selanjutnya titik akhir titrasi dapat diamati dengan jelas.

Selanjutnya dilakukan titrasi dengan NaOH yang telah dibakukan pada ketiga tabung reaksi dan ditentukan aktivitas protease menggunakan rumus (VNaOH fraksi – VNaOH kontrol) x factor konversi (1,63). Untuk tabung reaksi ketiga sebagai control di peroleh volume NaOH sebanyak 0,8 ml, untuk tabung pertama dengan fraksi protein 40% volume NaOH yang dibutuhkan sebanyak 5,8 ml dan aktivitas proteasenya sebesar 8,15. Serta untuk tabung reaksi kedua dengan fraksi protein 80% volume NaOHnya sebanyak 6,3 ml dan aktivitas

proteasenya sebanyak 8,965. Terlihat bahwa semakin tinggi persen fraksi maka semakin tinggi juga aktivitas protease karena semakin tinggi persen fraksi maka semakin tinggi protein (enzim) yang dimurnikan dan semakin tinggi pula aktivitas dari enzim tersebut.Analisis Kadar Protein Total

Cacing diketahui memilik kandungan protein yang cukup tinggi dan hal tersebut dibuktikan positif berdasarkan penentuan kadar protein menggunakan metode lowry ini. Meskipun yang digunakan metode lowry namun sebenarnya metode yang digunakan adalah metode biuret sederhana karena tidak digunakan pereaksi Folin-Ciocalteu yang menjadi kunci metode lowry. Namun, hasil yang didapat tetap menunjukkan hasil yang memuaskan.

Tabel 4.1. Pengukuran Kadar Protein Standar Menggunakan Kasein dengan

Spektrofotometer UV-Vis pada λ 635 nm

Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi pada λ 635 nm

Rata-Rata 1 2 3

00,0001 0,0002

0,0002 0,00017

500,0102 0,0097

0,0097 0,00987

1500,0148 0,0145

0,0142 0,01450

2000,0175 0,0177 0,018 0,01773

4500,0215 0,0217

0,0215 0,02157

Grafik 4.1. Kurva Kaibrasi Kadar Protein Standard

0 50 150 200 4500.00000

0.00500

0.01000

0.01500

0.02000

0.02500

Kurva kalibrasi yang dihasilkan ini digunakan untuk enunjukkan persamaan linier pada protein standard yang digunakan sebagai patokan pada protein yang terdapat pada fraksi cacing. Selanjutnya pengukuran absorbansi protein pada fraksi cacing dilakukan dengan mengukur fraksi cacing dengan pereaksi biuret pada spektrofotometer panjang gelombang 635 nm.

Tabel 4.2. Hasil Penentuan Kadar Protein Fraksi 40% dan 80% Cacing Pada Spektofotometer Uv-Vis dengan λ 635 nm

Dari hasil abdsorbansi tersebut kadar protein pada fraksi cacing 80% adalah 14126,72 µg/mL dan fraksi 40% adalah 2726,91 µg/mL. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa kadar protein pada fraksi 80% memiliki lebih banyak protein dibandingkan dengan fraksi 40 %.

KESIMPULAN

1. Dapat dilakukan ekstraksi protein termasuk enzim pada cacing melalui proses penyaringan, dengan menggunakan larutan dapar fosfat 5 mM pH 6,8 suhu 4o C.

2. Pada percobaan fraksinasi enzim cacing, dapat dilakukan pemisahan fraksi enzim berdasarkan kelarutan protein, dengan penambahan garam ammonium sulfat yang menunjukkan salting in dan salting out, dan dengan proses sentrifugasi

untuk pemisahan endapan-filtrat serta dialysis untuk memisahkan garam dan protein.

3. Pada uji aktivitas Lipase, dapat mengetahui aktivitas enzim lipase melalui pengukuran pH optimum, dengan cara titrasi alkalimetri. Hasil yang didapat untuk volume fraksi 40% = 1,75 mL (0,069 mol) dan fraksi 80% = 4,4 mL (0,17 mol).

4. Pada uji aktivitas Protease, dapat mengetahui aktivitas protease melalui titrasi formol, didapat fraksi

No

Fraksi Cacing

A 1 A 2 A 3 Rata-rata

1 40% 0,5878

0,5887

0,5879

0,5877

2 80% 0,1173

0,1174

0,1174

0,11796

protein 40% = 8,15 dan fraksi 80% = 8,96.

5. Berdasarkan analisis kadar protein total cara metode Lowry yang diukur absorbansinya melalui spektrofotometer Uv-Vis panjang gelombang 635 nm, didapatkan hasil 40% rata-rata abdsorbansi 0,58 kadar proteinnya = 14126,72 µg/mL dan abdsorbansi rata-rata untuk fraksi 80% 0,11 kadar proteinnya sebesar 2726,91 µg/mL.