CUPRINS

INTRODUCERE………………………………………………………………………………….3

CAPITOLUL I: CADRUL NATURAL ŞI INSTITUŢIONAL ÎN CARE SE VOR

DESFĂŞURA CERCETĂRILE ŞI OBSERVAŢIILE

1.1. Cad

rul natural…………………………………………………………………………….........4

1.2. Cadrul

instituţional……………………………………………………………………………7

CAPITOLUL II: DESCRIEREA ŞI TEHNOLOGIA DE CULTURĂ A SPECIEI

ARACHIS HYPOGAEA L.

2.1. Particularităţile morfologice ………………………………………………………………..11

2.2. Particularităţile biologice……………………………………………………………………14

2.3. Cerinţele faţă de climă şi de sol……………………………………………………………..16

2.4. Tehnologia de cultură a alunelor de pământ………………………………………………...16

CAPITOLUL III: DESCRIEREA SUBSTANŢELOR MUTAGENE

3.1. Sulfatul de dimetil…………………………………………………………………………...23

3.2. Azida de sodiu……...………………………………………………………………………..24

3.3. Etil metansulfonat……………………………………………...……………………………25

CAPITOLUL IV: PROIECTAREA PLANULUI EXPERIMENTAL PENTRU

REALIZAREA TEMEI PROPUSE

4.1. Obiectivele tezei de doctorat………………………………………………………………...26

4.2. Materialul biologic folosit.......................................................................................................28

4.3. Metodele de cercetare……………………………………………………………………….30

4.3.1. Metoda de efectuare a tratamentelor la seminţe şi aşezarea experienţei în câmp……...30

1

4.3.2. Metode statistice de prelucrare a datelor........................................................................32

4.3.3. Metode citogenetice …………………………………………………………………...32

4.3.3.1. Efectul substanţelor chimice mutagene asupra facultăţii şi energiei germinative a

seminţelor.......................................................................................................................................32

4..3.2. Efectul substanţelor chimice mutagene asupra ritmului de creştere în lungime a

rădăciniţelor şi tulpiniţelor ............................................................................................................33

4.3.3.3. Identificarea şi frecvenţa aberaţiilor cromozomice în mitoză...............................34

4.3.4. Metode fiziologice...........................................................................................................37

4.3.4.1. Determinarea conţinutului de pigmenţi asimilatori din frunze pe cale

spectrofotometrică .........................................................................................................................37

4.3.4.2. Efectul indus de tratamentul cu substanţe chimice mutagene asupra intensităţii

fotosintezei ....................................................................................................................................39

4.3.4.3. Determinarea intensităţii transpiraţiei…………………………………………...39

CONCLUZII …………………………………………………………………………………….42

BIBLIOGRAFIE……………………………………………………………………………........43

2

INTRODUCERE

Ţara de origine a arahidelor este America de Sud. Cât priveşte zona exactă de origine

persistă incertitudinea. Unii consideră a fi Argentina şi anume în partea muntoasă unde se găsesc

încă specii strict înrudite. După alte păreri zona de origine ar fi platoul înalt central al Braziliei,

unde se găsesc tipuri sălbatice bienale de arahide sau regiunea andină a Argentinei. Indiferent de

zona de origine, un lucru este cert, că în aceste părţi ale lumii arahidele s-au cultivat din vremuri

foarte îndepărtate (Pop L. şi colab., 1986). Astfel, fructe de arahide s-au găsit în grotele peruane

din Ankona, de langă Lima, iar călătorul portughez Gabriel Suarez de Suza menţiona în anul

1570, că arahidele au fost cultivate de către indienii din Peru, care le denumeau anhuc (Pop L. şi

colab., 1986).

În Europa arahidele au fost aduse de marinarii portughezi în secolul al XVI-lea, din India

şi s-au răspândit în zonele sudice mai calde, favorabile pentru cultivare.

Arahidele (alunele de pământ, alunele americane) prezintă o importanţă deosebită

datorită conţinutului ridicat al seminţelor în proteine (25-34%) şi grăsimi (45-60%). În producţia

mondială de ulei, arahidele ocupă locul al treilea (peste 3 milioane tone anual), situându-se după

soia, floarea soarelui şi înaintea bumbacului. În hrana oamenilor, arahidele au folosinţe multiple.

Uleiul (de o calitate foarte bună, conţinut ridicat în vitamina B1) se foloseşte în alimentaţie, în

industria conservelor, a margarinei şi a untului, iar seminţele proaspete şi întregi se consumă

prăjite sau în diferite preparate culinare, la obţinerea pâinii, biscuiţilor, ciocolatei etc. Cojile

rezultate în urma decojirii păstăilor de arahide şi după măcinare se folosesc la prepararea de

nutreţuri furajere, iar frunzele şi tulpinile pot constitui un nutreţ valoros pentru animale dar pot fi

întrebuinţate şi ca îngrăşământ verde (Marin Ş. şi Constantinescu Emilia, 2011).

Arahidele au utilizări variate şi valoroase, iar cultura acestora prezintă o serie de avantaje,

care îi sporesc importanţa, cum ar fi:

- posibilitatea de a obţine producţii mari la unitatea de suprafaţă şi relativ constante;

- solicită un consum redus de îngrăşăminte;

- constituie o plantă bună premergătoare pentru alte culturi, oferind posibilitatea de a forma

asolamente şi succesiuni raţionale;

- valorifică superior solurile cu o capacitate de producţie mică, cum sunt de exemplu cele

nisipoase.

3

CAPITOLUL I

CADRUL NATURAL ŞI INSTITUŢIONAL

ÎN CARE SE VOR DESFĂŞURA CERCETĂRILE ŞI OBSERVAŢIILE

Cercetările care fac obiectul tezei de doctorat se vor desfăşura atât în câmp, la ferma

Ezăreni, din cadrul Staţiunii Didactice a Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară

“Ion Ionescu de la Brad” Iaşi unde se vor cultiva alune de pământ în vederea realizării

observaţiilor pe parcursul perioadei de vegetaţie, cât şi în cadrul laboratorului LECOM, unde se

vor efectua toate analizele citogenetice şi morfo-fiziologice.

1.1. Cadrul natural

Aşezarea Fermei Ezăreni

Ferma Ezăreni aparţine Staţiunii Didactice a Universităţii de Stiinţe Agricole şi Medicină

Veterinară “Ion Ionescu de la Brad” şi se află situată la 2,5 km sud–vest de oraşul Iaşi, fiind

aşezată în extremitatea sud–vestică a Câmpiei Moldovei.

Caracteristici generale ale reliefului şi climei

Relieful

Relieful zonei este strâns legat de alcătuirea geologică. În urma studiilor efectuate s-a

constatat prezenţa în această zonă a unui fundament precambian, puternic cutat şi metamorfozat.

Categoriile de relief specifice zonei, rezultate în urma eroziunii diferenţiate, sunt alcătuite din

două etaje structurale principale, distincte atât prin conformaţie cât şi prin geneză: un etaj

inferior, constituit din roci cristaline, cutate şi un etaj superior de cuvertură, care cuprinde

depozite sedimentare, necutate. Relieful actual al Fermei Ezăreni se integrează în aspectul

geomorfologic general al câmpiei Moldovei.

4

Solul. Conform modificărilor Structurii Sistemului Român de Taxonomie a Solurilor

(S.R.T.S) tipurile de sol formate pe teritoriul fermei Ezăreni sunt: cernoziomul cambic, solul

aluvial molic şi gleiosolul salinic (Blaga şi Filipov, 2005).

Solul pe care a fost amplasată experienţa este un cernoziom cambic mezoalcalic, slab

degradat, luto - argilos, ce prezintă o morfologie de tipul Ap, Atp, Am, AB, Bv1, Bv2, Bv3k

Cca1, Cca2, II Ck (figura 1.1) (Răus şi Jităreanu, 2007).

5

I Ap 0-19 cm; lut argilos; brun cenuşiu foarte închis (10YR 3/2); glomerulară medie; frecvent-macropori fini şi medii; cervotocine rare; rădăcini frecvente, nu face efervescenţa cu acid clorhidric; trecere clară.

Atp 19-25; lut argilos; brun foarte închis (10YR 2/2); structura poliedrică angulară mare; moderat compact; distribuţia rădăcinilor neuniformă, preferenţial pe feţele elementelor structurale; cervotocine rare; nu face efervescenţa cu acid clorhidric; trecere clară, ondulată.

Am 25-32 cm; lut argilos; brun fo arte închis (10YR 2/2); structura glomerulară mare; rădăcini frecvente distribuite relativ uniform atât pe feţele elementelor strucurale cât şi în interiorul agregatelor structurale; nu face efervescenţa cu acid clorhidric; cervotocine rare; trecere treptată.

AB 32-40 cm; lut argilos; brun gălbui închis (10YR 3/4); structura columnoid prismatică; rădăcini frecvente în interiorul şi preferenţial pe suprafaţa elementelor structurale; cervotocine rare; nu face efervescenţa cu acid clorhidric; distribuţia humusului uniform descrescândă; trecere treptată.

Bv1 40-51 cm; lut argilos; brun gălbui închis (10YR 4/4) structura columnoid prismatică medie; slab-moderat compact; distribuţia rădăcinilor preferenţial pe feţele elementelor structurale; melanocornevine rare; nu face efervescenţa cu acid clorhidric; trecere difuză.

Bv2 51- 78 cm; lut argilos; brun gălbui închis (10YR 4/4) structura columnoid prismatică medie; slab-moderat compact; distribuţia rădăcinilor preferenţial pe feţele elementelor structurale; melanocornevine rare; nu face efervescenţa cu acid clorhidric.

Bv3k 78-90 cm; lut argilos; brun gălbui (10YR 5/4); structura columnoid prismatică medie; slab - moderat compact; rădăcini rare distribuite preferenţial pe feţele elementelor structurale; melanocornevine rare; efervescenţa moderată spre puternică; eflorescenţe şi pseudomicelii de CaCO3; trecere treptată.

Cca1 92-108 cm; lut mediu; galben bruniu (10YR 6/6); structura masivă; efervescenţa foarte puternică cu acid clorhidric; rădăcini foarte rare; trecere difuză.

Cca2 108-138 cm; lut mediu; galben bruniu (10YR 6/6); structura masivă; efervescenţa foarte puternică cu acid clorhidric; eflorescenţe, pete şi vinişoare frecvente de carbonat de calciu; rădăcini foarte rare; trecere difuză.

II Ck 138 – 160 cm; lut mediu; galben bruniu (10YR 6/6); structura masivă; efervescenţa foarte puternică cu acid clorhidric; concreţiuni şi păpuşi de loess frecvente de carbonat de calciu.

Vegetaţia

Situată în zona de contact dintre limita nordică a bazinului păduros din Podişul Moldovei

6

Figura 1.1 - Profilul de sol (Răus şi Jităreanu, 2007)

şi Câmpia Jijiei şi Bahluiului, ferma Ezăreni se încadrează din punct de vedere geobotanic în

formaţiunea floristică de silvostepă. Acest fapt explică prezenţa unor elemente specifice stepei şi

silvostepei caracterizate printr-o vegetaţie ierboasă, xeromezofilă şi mezofilă.

Clima

Zona geografică a Iaşului se caracterizează printr-un climat temperat continental cu

particularităţi determinate de influenţa climatului stepei ruseşti. Ferma Ezăreni face parte din

provincia climatică Dfdx (după clasificarea lui Koppen), sau IIDps (după clima României),

caracterizată prin climă boreală, cu ierni geroase şi friguroase, cu temperatura celei mai reci luni

sub –33°C şi temperatura celei mai calde luni de 25 – 27° C.

Temperatura medie multianuală (la staţia meteorologică Miroslava) este de 9,6°C, cu

minima de –8,1°C înregistrată în luna ianuarie, iar maxima de +28,4° C realizată în luna iulie.

Temperatura maximă absolută a fost de +40,2° C (27 iulie 1909), iar minima absolută a fost de –

30,6° C (21 ianuarie 1997) (Administraţia Naţională de Meteorologie, 2011).

Precipitaţiile

Precipitaţiile medii multianuale în ecosistemul agricol Iasi sunt de 517,8 mm (la staţia

meteorologică Miroslava), lunile cele mai ploioase fiind: mai, iunie, iulie şi august. Precipitaţii

reduse cantitativ cad în lunile: ianuarie, februarie, martie, noiembrie şi decembrie. Precipitaţiile

sunt repartizate neuniform de-a lungul anului cu un maxim în luna iunie şi un minim în luna

februarie.

Evapotranspiraţia potenţială medie anuală determinată pentru perioada de vegetaţie a

culturilor agricole este de 648,7 mm, cu valori maxime în luna august (115,7 mm) şi minime în

luna octombrie de 65,6 mm. Indicele de ariditate are valoarea de 26,4, corespunzând condiţiilor

climatice de silvostepă.

Regimul eolian

În timpul iernii, dinamica atmosferică se caracterizează prin preponderenţa vânturilor de

la nord–vest şi nord ce bat cu o viteză medie de 2,8 m/s. Vara vânturile au direcţie sudică şi sud –

estică şi o viteză de 5,1 m/s. Vânturile cu o viteză de peste 2,5 m/s au o frecvenţă medie de

7

78,0%, activând puternic evaporarea apei din sol. În general, frecvenţa maximă a vânturilor

coincide cu perioada cea mai ploioasă a anului.

Primăvara cunoaşte cea mai sporită frecvenţă a vânturilor, care bat din toate direcţiile,

ceea ce diminuează procesul de calm. Toamna, când în estul ţarii începe să se simtă influenţa

anticiclonului siberian, se înregistrează o evidentă scădere a frecvenţei vânturilor dinspre nord –

vest. Iarna, deşi frecvenţa vânturilor este mai mică, se manifestă destul de activ crivăţul, care

bate din estul Europei, producând frig şi viscole puternice.

Luminozitatea şi nebulozitatea

Nebulozitatea medie a zilei este de 6 ore. Nebulozitate mică au lunile iunie şi iulie cu

valori de 3,4–5,6 ore, iar cea mai mare nebulozitate se înregistrează în lunile decembrie, ianuarie

şi februarie. Durata de strălucire a soarelui este de 2050 ore anual ceea ce reprezintă 44,5% din

durata teoretic posibilă.

Lunile cu cea mai lungă durată de strălucire a soarelui sunt în ordine descrescătoare:

iulie, august şi iunie, la care durata de strălucire a soarelui este de 294 ore. Durata cea mai redusă

de strălucire a soarelui este întâlnită în cursul lunilor noiembrie, decembrie şi ianuarie.

1.2. Laboratorul L.E.C.O.M

Laboratorul pentru expertiza şi controlul organismelor modificate genetic şi a produselor

agro-alimentare obţinute (L.E.C.O.M.) este parte integrantă a Departamentului de Cercetare al

Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară “Ion Ionescu de la Brad” Iaşi. A fost

creat în anul 2006, în contextul intrării României pe piaţa unică europeană, avându-se în vedere

necesitatea existenţei unor laboratoare care să poată certifica conformitatea şi calitatea

produselor agricole pentru consumul regional, dar şi celor care pătrund pe piaţa europeană.

Suportul tehnic, personalul calificat al laboratorului permit efectuarea de analize genetice

atât la plante cât şi la ADN– ul extras din produse alimentare şi furajere. Aparatura asigură

realizarea analizelor conforme cu metodele de referinţă agreate de directivele şi reglementările

Uniunii Europene.

Fluxul laboratorului este realizat astfel:

8

Camera de primire a probelor - este destinată recepţionării materialului ce urmează a fi

analizat. Camera este utilată cu calculator PC, pentru evidenţa probelor primite şi înregistrarea

lor.

Camera de măcinare a probelor - este dotată cu o moară de laborator de tip RETSCH

MM400 şi un aparat de tip Smasher. Moara este prevăzută cu 4 capsule metalice, iar măcinarea

se realizează cu ajutorul bilelor metalice. Se pot prelucra probe de soia, porumb boabe, fasole

boabe s.a. De asemenea, moara permite măcinarea cu ajutorul criogenei. Folosind acest tip de

măcinare se poate mojara şi material vegetal îngheţat în vederea extragerii ADN. Aparatul de tip

Smasher se foloseşte la mărunţirea butonilor florali, în vederea realizării culturilor de microspori

la diverse plante.

Camera de extragere ADN - probele supuse măcinării sunt aduse aici în vederea

extragerii ADN– ului. Camera are în dotare toate echipamentele necesare acestei operaţiuni, şi

anume:

Nişa chimică – cu rol de protecţie a operatorului şi a mediului înconjurător în cazul manipulării

substanţelor şi pulberilor periculoase, prin utilizarea filtrelor de cărbune activat şi a filtrelor

HEPA;

Ultracentrifugă cu răcire (HETTICH MIKRO 200R) – folosită pentru centrifugarea tuburilor

eppendorf la o temperatura de 4°C;

Balanţa analitică (KERN) – utilizată la cântărirea materialului vegetal;

Baie marină – utilizată pentru incubarea probelor la temperatura de 65ºC;

Incubator (etuva) – folosit(ă) la uscarea pelletului de ADN;

Agitatoare magnetice cu încălzire – folosite pentru prepararea substanţelor necesare în cadrul

procesului de extragere;

Vortexuri de laborator – utilizate la amestecarea componentelor biologice şi chimice în tuburi de

1,5 ml.

Camera de realizare a amestecului PCR – ADN–ul extras şi dizolvat în soluţie de TBE

buffer, este adus aici în vederea realizării amestecului PCR, pentru amplificarea lui.

În acest scop, camera este dotată cu:

- Hota cu flux laminar – funcţionează pe principiul recirculării aerului din interior. Aerul circulă

descendent prin filtrul principal montat deasupra spaţiului de lucru;

9

- Centrifuga (HETTICH MIKRO 120) - folosită pentru centrifugarea tuburilor de 1,5 ml, în

vederea separării compuşilor cu greutate specifică diferită;

- Fluorospectometru (NanoDrop 3300) – utilizat pentru aflarea concentraţiei de ADN după

extragere.

Camera de amplificare - după cititrea concentraţiilor şi realizarea amestecului pentru

reacţia PCR, probele sunt supuse ciclurilor necesare amplificării fragmentelor de ADN.

Camera este utilată cu:

- Sistem de electoforeză în gel vertical – utilizează gel acrilamidic, în timp real, pentru analiza

rapidă a fragmentelor de ADN;

- Sistem pentru apa ultrapură – utilizat pentru obţinerea apei cu grad foarte înalt de puritate,

necesară în diferite diluţii sau medii de reacţie.

Camera de electroforeză – utilizată pentru realizarea gelurilor de agaroză în plan

orizontal, în vederea vizualizării fragmentelor de ADN amplificate în urma reacţiei PCR.

Camera este dotată cu:

- Centrifugă pentru plăci – folosită la centrifugarea plăcilor PCR înainte de încărcarea probelor

pe gelul de agaroză, pentru amestecarea probelor cu colorant;

- Cuptor cu microunde – utilizat pentru prepararea gelului de agaroză;

- Balanţa analitică – folosită la cântărirea diferitelor substanţe chimice folosite în laborator;

- Cuve de electroforeză cu sursele aferente, de diferite mărimi – permit separarea fragmentelor

de ADN din soluţia de reacţie pe principiul vitezei diferite de deplasare, invers proporţională cu

masa moleculară a acestora în gelul de agaroză.

Camera de secvenţiere – dotată cu:

- Secvenţiator ADN (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) – este un analizor cu un singur capilar ce

permite realizarea unui număr mare de aplicaţii (secvenţiere, analiza fragmentelor ADN,

genotipizare, obţinerea de grupe linkage).

- Real time PCR – este un termocycler care permite vizualizarea curbelor de amplificare ADN.

Are 4 detectori, fiind capabil să suporte multiple aplicaţii, inclusiv cuantificarea relativă şi

genotipizarea SNP. Florocromii calibraţi care pot fi detectaţi sunt SYBR Green, FAMTM VICTM,

JOETM, NEDTM, TAMRATM, ROXTM. Poate detecta de la 10 copii de ADN, iar gradul de

confidenţă este de 99,7%.

10

Camera de preluare imagini - vizualizarea fragmentelor de ADN încărcate pe gelul de

agaroză se face în camera destinată special pentru această operaţie, principiul de vizualizare a

fragmentelor bazându-se pe efectul bromurii de etidium.

- Sistemul de preluare a imaginilor – este format din transiluminator, sistem de fotodocumentare

şi computer.

11

CAPITOLUL II

DESCRIEREA ŞI TEHNOLOGIA DE CULTURĂ A SPECIEI

ARACHIS HYPOGAEA L.

2.1. Particularităţile morfologice

Arachis hypogaea L.(figura 2.1) face parte din ordinul Leguminales, familia

Leguminosae, tribul Arachidineae, genul Arachis. Genul Arachis prezintă o singură specie

cultivată, Arachis hypogaea L., această specie nu prezintă forme sălbatice.

Figura 2.1. Alune de pământ - Arachis hypogaea L.

(www.plant-pictures.de)

Rădăcina este pivotantă şi pătrunde la mare adâncime în sol. Pe cernoziomurile din

Podişul Caucazului se citează o adâncime de pătrundere de 186 cm. Din rădăcina principală

pornesc multe rădăcini secundare, care permit explorarea unui volum mare de sol. Rădăcinile

terţiare sunt puţin evidente, subţiri şi scurte, rolul de pătrundere a solului revenind, în acest caz

rădăcinilor primare şi secundare. Sistemul radicular al arahidelor nu posedă rizodermă şi în

consecinţă nici peri absorbanţi adevăraţi. Absorbţia apei şi a elementelor chimice se face direct

12

prin parenchimul cortical. Pe rădăcinile laterale, în special în primii 15 cm de sol, apar

numeroase nodozităţi, ca urmare a prezenţei şi activităţii bacteriilor simbiotice. Nodozităţile sunt

mici, sub 4 mm diametru, în număr de 400-700 la o plantă şi de culoare maro-roşcată. Apar la

15-20 zile de la răsărire şi sunt rotund-sferice sau angular (Gillier P. şi Silvestre P., 1969).

Tulpina arahidelor este ierboasă şi erectă sau târâtoare, în funcţie de subspecie. În

secţiune, tulpina prezintă 5 muchii când plantele sunt tinere şi devine cilindrică într-o fază mai

înaintată de vegetaţie. Înălţimea tulpinilor variază în funcţie de subspecie şi soi. La formele cu

port erect înălţimea tulpinilor poate ajunge la 60-70 cm, pe când la cele cu port târâtor nu

depăşesc 20-25 cm (Pop L. şi colab., 1986).

Frunzele la arahide sunt compuse, paripenate şi formate din două perechi de foliole

opuse. Foliolele sunt ovale, ovoide sau elipsoidale şi ascuţite sau rotunjite la vârf. Forma şi

mărimea foliolelor depinde mult şi de poziţia pe care o ocupă frunzele pe plantă. Astfel foliolele

situate pe frunzele de la baza plantelor sunt mai mici decât cele situate spre vârful plantei. Faţa

superioară a foliolelor este lucioasă, iar cea inferioară este acoperită cu o reţea deasă de perişori

(Pop L. şi colab., 1986).

Florile sunt situate la arahide la subsuoara frunzelor şi pot fi solitare sau grupate în

inflorescenţe de tip racem (figura 2.2).

Figura 2.2 – Floarea la arahide

Florile au o culoare galbenă sau galbenă–portocalie şi sunt de două tipuri: flori

chasmogame (de la chayymos–deschis) care se deschid şi sunt poziţionate mai mult la vârful

tulpinii, de obicei sterile (mascule după Gillier P. şi Silvestre P., 1969) şi flori cleistogame care

13

sunt situate spre baza tulpinii şi nu se deschid (trec din faza de boboc la cea de fructificare şi se

autopolenizează). Există flori cleistogame şi pe baza subterană a tulpinii, dar numai la soiurile

precoce (Pîrşan P., 1998).

Gillier P. şi Prevot P. (1960) susţin că androceul este alcătuit din 8 stamine şi 2

rudimente. Anterele staminelor sunt de două tipuri: 4 de formă sferică şi uniloculare şi 4 în formă

de sac, dispuse altern în jurul stilului şi stigmatului. Pistilul este alcătuit dintr- un ovar unilocular,

cu un stil lung filamentos şi un stigmat de formă globulară. Ovarul este situat la baza tubului

caliciului şi are câteva ovule. Corola este alcătuită din 5 petale, stindardul este bine dezvoltat,

larg şi rotunjit, iar carena este alcătuită din 2 petale încovoiate (Pop L. şi colab., 1986).

Fructul arahidelor este o păstaie, de formă mai mult sau mai puţin cilindrică,

indehiscentă şi care prezintă la suprafaţă un desen reticular caracteristic (figura 2.3). La unele

soiuri desenul reticular este abia vizibil, în timp ce la altele este puternic pronunţat. La unele

soiuri, conformaţia păstăilor este asemănătoare cu aceea a gogoşilor viermilor de mătase.

Figura 2.3- Fructul la arahide

Lungimea păstăilor variază între 1-8 cm, iar lăţimea între 0,5-2 cm. Masa a 1000 de

păstăi variază în funcţie de tipul şi soiul de arahide, între 1000–1900 g, iar masa hectolitrică este

de 20–25 kg. Păstăile de arahide prezintă un număr variabil de boabe, între 1–4 boabe, iar în

unele cazuri se ajunge chiar şi la 7 boabe într-o păstaie. Culoarea boabelor variază în funcţie de

soi: gălbuie, galben – deschis, albă, roşie cu diverse nuanţe şi neagră. Boabele prin păstrare mai

îndelungată primesc treptat o nuanţă închisă şi îsi pierd luciul caracteristic iniţial (Pîrşan P.,

1998).

14

2.2. Particularităţile biologice

Arahidele, în special comparativ cu celelalte specii de plante cultivate în ţara noastră,

prezintă o serie de particularităţi biologice.

Germinaţia. La unele soiuri de arahide seminţele germinează numai după parcurgerea

repausului germinal. Soiurile care aparţin tipurilor Valencia şi Spaniol, germinaţia poate avea loc

la maturitatea tehnologică. În condiţii favorabile de umiditate a boabelor aflate în păstăi, şi

anume de 8% şi de temperatură de 15ºC, boabele îşi păstrează capacitatea germinativă timp de 5

ani. Boabele decojite îşi pierd repede capacitatea germinativă dacă nu sunt păstrate în cele mai

bune condiţii de umiditate şi temperatură (Pop L. şi colab., 1986). Temperatura minimă de

germinare este de 12–15 ºC. În cazul soiurilor sensibile, temperaturile sub 15ºC, din perioada

încolţirii, dăunează obţinerii unei semănături viguroase. La încolţire, prima care iese din boabe

este radicela, care este foarte viguroasă şi în condiţii de câmp se înfinge de la început puternic în

sol. Tulpiniţa apare mai târziu, iar radicela înfiptă în sol înlesneşte străbaterea solului de cele

două cotiledoane şi apariţia tulpiniţii la suprafaţa solului (Pîrşan P., 1998).

Creşterea sistemului radicular este relativ lentă la începutul perioadei de vegetaţie şi la

sfârşitul perioadei de vegetaţie. Rădăcinile reprezintă un procent ridicat din greutatea totală a

plantelor la începutul perioadei de vegetaţie. Pe măsura înaintării în creşterea plantelor, ponderea

rădăcinilor scade ca urmare a dezvoltării accentuate a părţii vegetative supraterestre şi a formării

organelor de fructificare.

Apariţia nodozităţilor şi activitatea bacteriilor simbiotice. Nodozităţile apar pe rădăcinile

de arahide începând cu cca. 15–20 zile de la răsărire. Până la apariţia nodozităţilor plantele au o

culoare verde–pal şi perioada corespunde cu o creştere vegetativă slabă. Apariţia şi numărul

nodozităţilor sunt influenţate de condiţiile de sol şi de climă. Astfel, arahidele nu formează

nodozităţi pe terenurile fertile. Minchevici A. I. şi Borcovschi E. V. (1953) arată că, pe

cernoziomurile levigate din nordul Caucazului, arahidele nu formează nodozităţi pe rădăcini, în

schimb numărul lor este mai mare la culturile de pe terenurile nisipoase. Cercetătorii indieni Nair

S. K. et al., (1972) arată că insuficienţa fosforului determină o slabă apariţie a nodozităţilor,

precum şi o slabă aprovizionare cu magneziu.

Creşterea tulpinilor. După ajungerea cotiledoanelor la suprafaţa solului se dezvoltă mai

întâi mugurele terminal, urmat de cei 2 muguri laterali. Înălţimea şi greutatea la care ajung

15

tulpinile plantelor de arahide depind de soi, condiţiile climatice, de sol şi de condiţiile de cultură

(Pîrşan P., 1998).

Creşterea frunzelor. Ritus G. I. (1952) a găsit că pentru formarea frunzelor soiurile

precoce au nevoie de mai multă căldură decât cele tardive şi formează un număr mai mic de

frunze. Un număr mai mare de frunze poate avea un rol important asupra producţiei obţinute. În

acelaşi timp prezenţa unui număr mai mare de frunze în masa supraterestră a plantelor are o

influenţă favorabilă şi asupra calităţii acesteia ca furaj. Acest lucru se datorează conţinutului

ridicat de proteine (Pop L. şi colab., 1986).

Înflorirea. În condiţiile climatice din zona de cultivare a arahidelor, în ţara noastră,

înflorirea începe la 25–30 zile de la răsărire, mai devreme la soiurile timpurii şi mai târziu la

soiurile tardive şi durează o perioadă mai mare de timp la soiurile tardive până la recoltare.

Durata medie de înflorire a unei flori este scurtă. În mod normal florile se deschid dimineaţa

înainte de răsărirea soarelui şi rămân desfăcute până la prânz, când începe ofilirea. În cea de a

treia zi floarea se usucă şi cade (Pop L. şi colab., 1986). Datorită aşezării stigmatului în carena

inchisă a corolei, nu este în general posibilă polenizarea alogamă. Autopolenizarea este mult

uşurată şi de faptul că, anterele se maturează înainte de deschiderea florilor. De aici rezultă

posibilitatea pe care o au arahidele de a realiza fructe din flori situate la nivelul solului. Totuşi

polenizarea încrucişată poate avea loc foarte rar datorită unor specii de albine (Hera Cr. et al.,

1980).

La început ginoforii au o creştere orientată în sus, iar după şase zile se orientează spre

sol, în care pătrund şi unde încep dezvoltarea fructelor. Fructele încep să crească când ginoforii

ajung la o adâncime de 2–7 cm. Păstăile cresc în poziţie orizontală. În situaţia când florile se află

la o înălţime prea mare pe plante, ginoforii nu pot să ajungă la sol şi nu are loc formarea fructelor

(Pop L. şi colab., 1986).

Formarea păstăilor. În condiţiile de cultură a arahidelor din ţara noastră, formarea

păstăilor are loc foarte lent la început şi accelerat spre sfârşitul perioadei de vegetaţie. Culoarea

cojilor de arahide în curs de formare este alb–gălbuie. Pe măsură ce se apropie de momentul

recoltării arahidele primesc o culoare specifică soiului. La începutul formării păstăilor, cojile

sunt netede. Pe măsură ce cresc şi se apropie de maturizare, apare la suprafaţa lor un desen

reticular. Desenul reticular începe să se contureze din momentul în care seminţele au mărimea

unor boabe de mazăre şi începând de la locul de legătură al păstăii cu ginoforul. Apariţia

16

desenului reticular se încheie la vârful păstăii. Mărimea boabelor este un caracter de soi, dar la

acelaşi soi se înregistrează diferenţe mari în funcţie de condiţiile pedoclimatice şi de tehnologia

aplicată (Pîrşan P., 1998).

2.3. Cerinţele faţă de climă şi de sol

Temperatura: În perioada de la semănat la răsărire, temperaturile extreme sunt de 15ºC şi

45ºC, temperatura optimă fiind de 30ºC. În această perioadă nevoile de căldură sunt în general

mai mici. Pentru o răsărire rapidă, în 4 -5 zile, are loc numai dacă se realizează o temperatură de

32–34ºC (Gillier P. şi Silvestre P., 1969). În timpul creşterii şi îmbobocirii nevoile de căldură

sunt mai mari, temperatura minimă fiind de 18ºC. La temperaturi inferioare valorii de 10ºC

creşterea plantelor se opreşte, iar la 0,5ºC plantele mor. Cele mai mari pretenţii privind căldura,

alunele de pământ le prezintă în perioada înflorire–fructificare (temperatura minimă fiind de

20ºC), în perioada de maturare temperatura poate să scadă până la 10-12ºC, optimă fiind 25ºC

(Pop L. şi colab., 1986).

Umiditatea: Consumul direct de apă variază între 370-570 mm, iar nevoile de precipitaţii

sunt cuprinse între 450 – 700 mm, cu o bună repartizare pe parcursul perioadei de vegetaţie.

Umiditatea solului este foarte importantă pentru pătrunderea ginoforilor şi formarea păstăilor. În

perioada recoltării este de dorit ca pământul să fie reavăn, pentru a nu adera la păstăi (Pîrşan P.,

1998).

Lumina: Arahidele nu sunt fotoperiodice. Lungimea zilei nu provoacă modificări în ceea

ce priveşte parcurgerea fazelor de vegetaţie. Pop L. et al. (1986) au constatat că perioadele

intermitente de soare sunt benefice pentru înflorire, fecundare şi creşterea păstăilor.

Solul: Alunele de pământ au nevoie de soluri profunde, uşoare şi fertile. Compoziţia

texturală luto–nisipoasă şi nisipo–lutoasă este foarte importantă pentru pătrunderea în sol a

rădăcinilor şi a ginoforilor. Solurile acide şi alcaline, de asemenea, nu sunt prielnice pentru

cultura arahidelor. Valoarea pH- ului trebuie să fie cuprinsă între 6,5–7,5 (Pop L. şi colab.,

1986).

2.4. Tehnologia de cultură a alunelor de pământ

Locul în asolament: În condiţiile ţării noastre este indicat ca arahidele să urmeze în

cultură după prăşitoare la care s-a asigurat o foarte bună combatere a buruienilor. Bune

17

premergătoare pentru arahide sunt cerealele păioase (grâul şi orzul). Leguminoasele pentru boabe

nu sunt indicate ca plante premergătoare pentru alunele de pământ, atât datorită bolilor şi

dăunătorilor comuni cât şi ca urmare a faptului că arahidele nu pot valorifica calitatea acestora ca

premergătoare. În cazul folosirii ca premergătoare a porumbului, trebuie avut în vedere

sensibilitatea mare a arahidelor la acţiunea remanentă a atrazinului. Pentru a preveni atacul de

boli şi dăunători arahidele nu pot reveni pe aceeaşi solă decât după 3-4 ani (Pop L. şi colab.,

1986).

Fertilizarea: Alunele de pământ prezintă un consum relativ moderat de elemente chimice

nutritive, mai ales în zonele calde. Azotul este elementul nutritiv necesar în cea mai mare

cantitate, care se asigură pe cale simbiotică. După azot urmează potasiul, calciul, magneziul şi

fosforul. Potasiul, calciul şi magneziul sunt exportate prin tulpini şi frunze, fosforul în principal

prin boabe şi azotul prin păstăi (62%), tulpini şi frunze (Pîrşan P., 1998).

Îngrăşămintele chimice cu azot. Azotul simbiotic nu asigură în totalitate necesităţile

plantelor. Îngrăşămintele chimice cu azot sunt importante mai ales în primele faze de vegetaţie.

Kornienko M. T., citat de Zamfirescu N. et al. (1958) menţionează obţinerea în regiunea Cherson

din U.R.S.S., a unui spor de recoltă de 600 kg/ha cu ajutorul dozei de N60. Îngrăşămintele cu azot

se aplică înainte de semănat şi încorporarea în sol să se facă prin lucrările de pregătire a patului

germinativ (Pop L. et al., 1986).

Îngrăşămintele chimice cu fosfor. Fosforul este absorbit din sol prin sistemul radicular,

dar în proporţie însemnată, de 39%, după Chahal S.R. şi Virmani M. S. (1973) prin ginofori şi

păstăi, iar majoritatea fosforului absorbit pe această ultimă cale se găseşte în zona fructiferă.

Experienţele efectuate în Senegal de către Giller P. şi Prevot P. (1960) au arătat că diferenţele de

producţie între aplicarea localizată şi cea prin împrăştiere sunt mari la doze mici de îngrăşământ

şi scad pe măsură ce dozele cresc. Când fosforul se administrează sub formă de îngrăşăminte

chimice complexe, aplicarea lui se poate administra şi premergător semănatului, iar încorporarea

în sol se face cu grapa cu discuri.

Îngrăşămintele chimice cu potasiu. Arahidele extrag cantităţi mari de potasiu din sol. Cu

toate acestea, dat fiind aprovizionarea bună a solurilor din ţara noastră cu acest element nutritiv,

nu în toate zonele aplicarea lui ca îngrăşământ este însoţită de sporuri de recoltă. Aplicarea

îngrăşămintelor cu potasiu este indicată să se facă premergător efectuării arăturii de bază şi să se

încorporeze odată cu aceasta (Pop L. şi colab., 1986).

18

Lucrările solului: Arahidele necesită un sol afânat, care să permită pătrunderea

rădăcinilor şi mai târziu a ginoforilor, curat de buruieni, în special în prima parte a perioadei de

vegetaţie, când plantele cresc încet şi pot fi uşor înăbuşite de buruieni.

Arătura adâncă trebuie făcută toamna şi lăsată în brazdă crudă, în cazul terenurilor

nisipoase pentru a nu favoriza spulberarea nisipului. Primăvara când încep să răsară buruieni,

arătura se lucrează cu grapa cu discuri. Ultima lucrare cu grapa cu discuri nu trebuie să

depăşească adâncimea de 10 cm pentru că la semănat boabele să nu fie introduse prea adânc în

sol, ceea ce ar întârzia răsărirea arahidelor. Cu 1–2 zile înainte de semănat terenul se lucrează cu

combinatorul. Lucrarea cu combinatorul perfectează patul germinstiv necesar unui semănat de

calitate (Pîrşan P., 1998).

Sămânţa şi semănatul: Sămânţa folosită pentru semănat trebuie să aparţină unor soiuri

superioare, caracterizate prin productivitate ridicată, randament mare de boabe, compoziţie

chimică favorabilă proteinelor sau grăsimilor. Materialul semincer trebuie să fie păstrat până în

preajma semănatului sub formă de păstăi. Se va reduce astfel atacul de Plodia interpunctella

Hubner (molia fructelor) (Pop L. şi colab., 1986).

Boabele folosite la semănat trebuie să fie sănătoase, mari, cu o puritate şi capacitate

germinativă ridicată şi să fie tratate împotriva bolilor şi dăunătorilor care pot ataca seminţele

introduse în sol la semănat. Mărimea boabelor folosite la semănat influenţează nivelul recoltei.

În Argentina se recomandă boabele de mărime mijlocie, care reprezintă, în general, 70–80% din

producţie (Pietrarelli R. J., 1971). Înainte de semănat, seminţele se tratează cu insectofungicide

care dimunuează pierderile la germinare, ameliorează răsărirea, înlesneşte realizarea desimii

stabilite şi asigură obţinerea unor recolte ridicate (Saese H. şi Fahey G., 2006). Pentru tratarea

seminţelor de arahide se folosesc următoarele produse: Captan 80 WDG 2 g/kg şi Vitavax 1

g/kg. Înainte de semănat, semânţa se tratează cu biopreparatele Rhizobium, cu deosebire în

zonele noi de cultivare a arahidelor (Pop L. şi colab., 1986).

În condiţiile din România, epoca optimă de semănat este determinată de realizarea pe

adâncimea de semănat a unei temperaturi minime de încolţire a seminţelor de 12º C şi de

încălzirea progresivă a vremii. Calendaristic, epoca de semănat corespunde cu ultimele zile din

luna aprilie şi primele zile din luna mai. Semănatul mai timpuriu prelungeşte răsărirea, aceasta

fiind neuniformă şi plantele mucegăiesc în sol. Semănatul realizat cu întârziere conduce

19

întotdeauna la reducerea numărului de păstăi ajunse la maturitate, mai ales în cazul soiurilor

tardive (Pîrşan P., 1998).

Arahidele au capacitatea de a compensa o parte din producţie atunci când au o densitate

mai scăzută, printr-o creştere mai viguroasă şi printr-un număr sporit de păstăi ajunse la

maturitate. Rehm S. şi Espig G. (1976) au recomandat desimi de 220–440 mii plante la hectar. În

India, producţiile ridicate s-au obţinut la desimi de peste 200 mii plante la hectar (Saini J.S. et al.,

1971). În cercetările efectuate la S.D.E. Tîmbureşti (Pop L., Chichea I. şi Pitiş S., 1976),

producţiile au crescut când s-au semănat mai multe boabe în cuib.

Cantitatea de boabe la semănat variază între 60–70 kg/ha, obţinută din 100–120 kg păstăi.

Distanţa între rânduri fiind de 50 cm şi 16-20 cm între plante pe rând, în funcţie de vigurozitatea

de creştere a soiului cultivat. Adâncimea de semănat se realizează la 3-5 cm în zonele calde şi

umede şi de 5-7 cm în zonele cu un climat mai răcoros şi mai puţin umed (Pop L. şi colab.,

1986).

În unele ţări din zonele calde, semănatul se efectuează în teren plan, iar altele pe teren

bilonat în prealabil. Semănatul în teren nebilonat se practică în ţările din Africa. Semănatul în

biloane se practică în ţările cu precipitaţii multe şi pe terenuri mai grele şi cu pante de peste 3-5%

(Pîrşan P., 1998).

Lucrările de îngrijire

Combaterea buruienilor: Plantele de arahide prezintă o creştere foarte înceată în primele

aproximativ 45 de zile de la răsărire, perioada când pot fi uşor înăbuşite de buruieni. De aceea, în

această perioadă trebuie asigurată o combatere eficientă a buruienilor. Combaterea buruienilor se

poate face prin praşile şi cu ajutorul erbicidelor. Prima praşilă se aplică în primele 15 zile de la

răsărire. Praşila a doua se efectuează în momentul în care începe înflorirea (la 30–40 de zile) şi

urmăreşte să asigure luminozitatea necesară în acest stadiu vegetativ (Pop L. şi colab., 1986).

La arahide bilonarea este necesară pentru realizarea unui strat de sol afânat capabil să

permită pătrunderea ginoforilor şi formarea păstăilor. Bilonarea este necesară mai ales dacă solul

este predispus tasării şi formării de crustă la suprafaţă. Nu este necesară bilonarea la soiurile

târâtoare, care aparţin subspeciei procumbens. Bilonarea se face la începutul înfloririi şi înainte

de a forma primii ginofori. Întârzierea bilonării poate determina vătămarea ginoforilor şi poate

lipsi plantele de posibilitatea de a forma păstăi din primele flori, care au şansele cele mai mari de

a ajunge la maturitate (Pîrşan P., 1998).

20

Combaterea chimică a buruienilor, metodă folosită pe scară largă în agricultura modernă,

se foloseşte şi în cultura arahidelor. La pregătirea patului germinativ pot fi încorporate în sol

erbicidele Stomp 330 E 4 l/ha şi Dual Gold 960 EC 1-1,5 l/ha. După semănat, în timpul perioadei

de vegetaţie se folosesc erbicidele Basagran forte 2-2,5 l/ha şi Fusilade forte 0,8 l/ha pentru

buruienile monocotiledonate anuale (Pop L. şi colab., 1986).

Bolile şi mijloacele de combatere a lor:

Cercosporioza este boala provocată de Cercospora arachidicola Hori şi de

Cercospora personata. Plantele bolnave prezintă pe frunze pete întunecate sau negre. Boala se

transmite prin rezidurile plantelor bolnave, care rămân în sol, prin plantele spontane şi prin

inoculări la păstăi. Sporii ciupercii pot fi transportaţi pe distanţe mari de vânt şi insecte. Pentru

prevenirea atacului de Cercospora se recomadă cultivarea de soiuri rezistente, revenirea culturii

pe acelaşi teren numai după 2–4 ani, îngroparea rezidurilor plantelor bolnave adânc în sol sau

arderea lor (Pop L. şi colab., 1986).

Botritis cinerea Pers. provoacă putregaiul cenuşiu. Boala se manifestă prin

putrezirea bazei tulpinilor şi ramurilor, pe care apare ca un puf de culoare cenuşie–violacee,

alcătuit din miceliul şi organele de fructificare a ciupercii. Pe păstăi atacul se manifestă când

întârzie recoltarea şi le imprimă acestora un gust amar. Apariţia bolii se poate preveni prin rotaţie

raţională, arături adânci, distrugerea resturilor vegetale bolnave şi prin tratamente cu Captan 50

0,3% la apariţia primelor simptome de atac (Pop L. şi colab., 1986).

Ascochyta arachidis War. produce pătarea brună a frunzelor. Boala se manifestă

prin apariţia pe frunze de pete circulare brune, apoi cenuşii şi delimitate de o dungă brună–

închis. Atacul se previne prin revenirea arahidelor pe acelaşi teren după 3 ani, arături adânci,

îndepărtarea resturilor la recoltare şi prin tratarea seminţelor cu formalină 0,25% (Pop L. şi

colab., 1986).

Fusarium vasinfectum Atk. produce fuzarioza arahidelor sau veştejirea plantelor.

Primele simptome ale bolii apar în perioada înfloririi şi constau în aplecarea bruscă sau treptată a

frunzelor. La suprafaţa tulpinii, în zona coletului, apare pe vreme umedă un mucegai alb sau roz

format din miceliul şi fructificaţiile ciupercii. Se previne şi se combate prin: folosirea la semănat

de sămânţă sănătoasă, rotaţie care să asigure revenirea arahidelor pe acelaşi teren numai după 3–

4 ani şi soiuri rezistente şi tratamente la sol (Pop L. şi colab., 1986).

21

Sclerotium omnivorum V.d. Wolk produce putrezirea rădăcinilor şi tulpinilor.

Atacul se manifestă pe tulpini, rădăcini şi fructe, printr- un mucegai albicios, ce reprezintă

miceliul ciupercii, în care apar mai târziu scleroţii sub forma unor corpuşoare negre, mici, de 2-3

mm diametru şi tari. Se previne şi se combate prin: o rotaţie raţională a culturilor, agrotehnică

superioară, eliminarea plantelor bolnave şi prin tratarea seminţelor cu Captan 80 în doză de 250 g

la 100 kg seminţe (Pop L. şi colab., 1986).

Fusarium martii Bark. provoacă putrezirea rădăcinilor. Acesta atacă plantele în

toate fazele de dezvoltare, efectând mai mult sistemul radicular. Rădăcinile plantelor atacate se

acoperă cu un puf alb–roşcat format din miceliul ciupercii şi în final putrezesc. Se previne şi se

combate prin: o rotaţie raţională a culturilor, agrotehnică superioară, eliminarea plantelor

bolnave şi prin tratarea cu fungicide (Pop L. şi colab., 1986).

Dăunătorii şi mijloacele de combatere a lor:

Melolontha hypocastanea Fabr. (viermii albi) atacă arahidele prin roadere totală

sau parţială a rădăcinilor sau tulpinilor la câţiva centrimetri sub nivelul solului. Atacul începe

odată cu încălzirea mai accentuată a timpului şi respectiv a solului. În condiţiile nisipurilor din

sudul Olteniei, atacul viermilor albi se manifestă intens pe vârful dunelor. Viermii albi se pot

combate cu insecticide la sol pe toată suprafaţa cultivată sau numai localizat în zonele cunoscute

ca foarte infestate (Pop L. et al., 1986).

Plodia interpunctella Hubner. sau molia fructelor se întâlneşte în spaţiile de

depozitare a arahidelor. Are 2-3 generaţii pe an. Fluturele îşi depune ponta pe boabe. Când

acestea sunt decojite, atacul este foarte mult înlesnit, în schimb când recolta se găseşte depozitată

sub formă de păstăi sunt atacate numai păstăile care prezintă crăpături ce oferă posibilitatea

fluturilor să îşi depună ouăle pe boabe. Se combate prin măsurile preventive ce privesc produsele

agricole depozitate (Pop L. şi colab., 1986).

Nematozii provoacă pagube mari culturilor de arahide în numeroase ţări

cultivatoare. În S.U.A. se apreciază că 80 % din suprafaţa cultivată cu arahide este infestată cu

nematozi (Wells C.J, 1972).

Careydon fuscus Goeze. ( sin. gonagra) este un coleopter care se găseşte în câmp

şi se aduce în locurile de depozitare odată cu recolta, produce pagube mari în Africa Occidentală

la arahidele nedecortificate. Larvele tinere pătrund în păstăi şi găuresc boabele. Larvele ajunse la

22

maturitate se metamorfozează în păstăi sau între păstăi învecinate. Pentru prevenirea atacului

este necesară dezinfectarea depozitelor (Pop L. şi colab., 1986).

În zonele nisipoase din sudul Olteniei, în funcţie de regimul precipitaţiilor din cursul

verii, sunt necesare 8 udări a câte 300-350 m3/ ha. Pe solurile cernoziomice, numărul udărilor se

reduce până la 5, însă norma de udare va fi de 400-500 m3/ ha (Pîrşan P., 1998).

Recoltarea, condiţionarea şi păstrarea recoltei

Epoca optimă de recoltare a arahidelor este înainte de venirea brumelor, când

temperaturile medii zilnice încep să scadă sub 12ºC. Aceasta corespunde cu ultima decadă a lunii

septembrie. Recoltarea se face prin smulgerea tufelor şi culegerea păstăilor de pe vreji. Se vor

reţine numai păstăile ajunse la maturitate deplină. Pe solurile uşoare şi reavene, la smulgerea

manuală nu rămân, în mod obişnuit, păstăi mature în sol. Când pământul este uscat şi la smulgere

se rup tulpini şi rămân păstăi în sol se recomandă folosirea dislocatorului premergător smulgerii

plantelor (Pop L. şi colab., 1986).

La recoltare, păstăile au un conţinut foarte mare de apă (40-50%) şi din acest motiv ele

mucegăiesc uşor. Pentru a preveni acest lucru, este necesară uscarea pătăilor la soare în strat

subţire şi uscătorii. O păstrare bună se poate asigura dacă în momentul depozitării păstăile au un

conţinut de apă dub 8-10% (Pîrşan P., 1998).

23

CAPITOLUL III

AGENŢII MUTAGENI UTLIZAŢI ÎN CADRUL STUDIULUI

3.1. Sulfatul de dimetil – DMS

Sulfatul de dimetil (sulfat neutru de metil – figura 3.1) este un lichid incolor sau uşor

gălbui, cu uşor miros de ceapă. Substanţa este toxică, corosivă şi mutagenă (Vyskocil A., 1999;

Rippey J. C. R. şi Stallwood M. I., 2005; Pohanish R. P., 2008). Dimetil sulfatul este un compus

chimic cu formula (CH3O)2SO2 şi cu greutatea moleculară de 126,14 g/mol (Brown Terry A.,

1998; Pohanish R. P., 2008).

Cercetările au arătat că, sulfatul de dimetil a determinat inhibarea ADN-ului, deteriorarea

celulelor somatice umane şi schimburile dintre cromatidele surori în celulele fibroblaste umane

(Pohanish R. P., 2008).

Nu are un miros puternic sau iritaţii imediate pentru a putea depista concentraţia letală

din aer. Expunerea pe termen lung la acest reactiv poate determina afecţiuni ale rinichilor,

ficatului şi sistemului nervos la om, în timp ce, la animale poate produce cancerul (Pohanish R.

P., 2008).

Acest agent mutagen este solubil în apă, eter, alcool, acetonă, hidrocarburi aromatice şi

puţin solubil în hidrocarburile alifatice (National Toxicology Program, 2011).

Figura 3.1. Sulfat de dimetil - formula stucturală (http://en.wikipedia.org/wiki/Dimethyl_sulfate)

Utilizat în sinteze organice, este cunoscut ca reactiv de metilare a fenolilor, aminelor şi

tiolilor (IARC, 1999; National Toxicology Program, 2011). De asemenea acest reactiv este

utilizat ca solvent pentru separarea uleiurilor minerale, pentru analiza fluidelor auto (National

Toxicology Program, 2011).

24

Sulfatul de dimetil poate afecta clivajul specific de bază, la guanina din ADN prin

ruperea inelelor de imidazol prezente în guanină (Cartwright I. L şi Kelly S. E., 1991; Rippey J.

C. R. şi Stallwood M. I., 2005).

Unii cercetători consideră această substanţă a fi o posibilă armă chimică (National

Toxicology Program, 2011).

3.2. Azida de sodiu – SA

Azida de sodiu (NaN3) (figura 3.2.) se obţine prin reacţia protoxidului de azot cu amidura

sodică sau din hidrazină, nitrit de etil şi sodă caustică. Se prezintă sub formă de paiete cristaline,

incolore. Este solubilă în apă, puţin alterabilă la umiditate, dar alterabilă în contact cu dioxidul de

carbon din aer. Este sensibilă la şoc, ca fulminantul de mercur, ea este mai puţin sensibilă decât

acesta la căldură. Utilizată la prepararea explozivilor de amorsare pentru detonatoare.

Poate exista pericolul de explozie sau formare de gaz toxic cu următoarele substanţe:

acizi, metale grele, săruri de metale, brom, dimetilsulfat, cupru, diclormetan, disulfură de carbon

şi acid sulfuric.

Este iritantă pentru ochi, piele, mucoase şi tractusul respirator. Pregătirea soluţiei de

azidă de sodiu trebuie realizată cu echipament de protecţie pentru a preveni inhalarea.

Formula chimică: NaN3

Figura 3.2.- Azidă de sodiu - formula structurală

(http://en.wikipedia.org/wiki/File:Sodium_azide.svg)

Azida de sodiu este considerată a fi un agent mutagen chimic foarte puternic în cultura

plantelor. Plantele mutante rezultate în urma tratamentulului cu azidă de sodiu sunt capabile să

supravieţuiască în condiţii de mediu diferite, au un randament mai bun şi sunt tolerante la stres în

comparaţie cu plantele normale (Fahad Al. Q şi Salim K., 2009).

25

Efectul mutagen reiese din producerea unui metabolit anorganic din azida de sodiu. Acest

metabolit intră în nucleu, interacţionează cu ADN- ul şi creează mutaţii punctiforme în genomul

plantelor (Owais W.M. şi Kleinhofs A., 1988).

3.3. Etil metansulfonat - EMS

Etil metansulfonatul (figura 3.3.) determină introducerea în structura nucleotidelor a unor

grupări alchil: la nivelul atomului din poziţia 7 din structura guanidinei (cel mai adesea), în

poziţia 3 a adeninei, foarte rar în poziţia 1 a adeninei. De asemenea, prezenţa grupării alkil la

nivelul guanidinei, slăbeşte legătura β- glucozidică şi determină eliminarea guaninei

(depurinare), cu formarea unor breşe în structura ADN. Bazele azotate pirimidinice sunt mai

rezistente la acţiunea agenţilor alkilanţi, deşi etil metansulfonatul poate determina uneori

alchilarea citozinei. Alkilarea este însoţită de fenomene de denaturare a ADN-ului sau de

formarea unor legături încrucişate sau transversale între nucleotide, ceea ce împiedică

împerecherea normală. Etil metansulfonatul prezintă o eficienţă crescută în modificarea

materialului genetic, atât al celulelor procariote cât şi al celor eucariote.

Etil metansulfonatul este un lichid incolor. Este iritant pentru ochi, piele, mucoase şi

tractusul respirator. Pregătirea soluţiei de etil metansulfonat trebuie realizată cu echipament de

protecţie pentru a preveni inhalarea.

Formula chimică: CH3SO3C2H5

Figura 2.3 Etil metansulfonat- formula structurală

(http://en.wikipedia.org/wiki/File:Ethyl-mesylate-2D-skeletal.svg)

Masa molară: 124,2 g/mol.

26

CAPITOLUL IV

PROIECTAREA PLANULUI EXPERIMENTAL PENTRU REALIZAREA TEMEI

ALESE

4.1. Obiectivele tezei de doctorat

În prezent, se cunosc un număr foarte mare de substanţe chimice cu efect mutagen.

Modificările produse de ele sunt asemănătoare cu cele ale mutaţiilor spontane. Nici una nu

posedă specificitate pentru inducerea unui anumit tip de mutaţie. Acţiunea acestor substanţe

provoacă în organismul în care au pătruns modificări biochimice şi fiziologice. La nivelul

cromozomilor se produc ruperi cromozomice şi ca urmare reconstrucţii de diferite tipuri, corelate

cu modificări fenotipice. La nivelul genei se produc mutaţii genice. Întreaga acţiune a

substanţelor depinde de foarte mulţi factori.

Scopul principal al cercetărilor este urmărirea efectelor tratamentelor cu substanţe

chimice atât în condiţii de câmp cât şi de laborator, în ideea surprinderii diferenţelor de

sensibilitate a speciei la acţiunea substanţelor mutagene, efecte surprinse prin aplicarea unor

metode fiziologice, biochimice şi citogenetice.

În selecţia şi ameliorarea plantelor cu importanţă economică, un prim pas îl constituie

obţinerea unui material biologic foarte divers, inducerea unei variabilităţi individuale de largă

amplitudine. În practică s-a dovedit că tendinţa spre variabilitate, manifestată la orice specie,

creşte în urma intervenţiei cu diverşi factori fizici, chimici sau biologici, cunoscuţi sub

denumirea de factori mutageni.

Prin programul de ameliorare se va urmări obţinerea unor linii care să aibă însuşiri

valoroase privind productivitatea, calitatea producţiei, precocitate, rezistenţa la temperaturi

scăzute, secete, boli şi dăunători şi pretabile pentru mecanizare.

Capacitatea de producţie este controlată de mai multe gene şi este dată de numărul de

păstăi ajunse la maturitate în momentul recoltării, de mărimea acestora şi de procentul de boabe

din greutatea păstăilor.

27

Calitatea recoltei se urmăreşte sub aspectul compoziţiei chimice, şi anume a procentului

de grăsimi, când se urmăreşte realizarea de soiuri pentru extragerea uleiului şi a procentului de

proteine ridicat şi de grăsimi mai moderat (sub 47%) când scopul ameliorării este obţinerea de

soiuri pentru consumul sub formă prăjită. De mare importanţă este şi prezenţa cantitativă a

aminoacizilor esenţiali şi valori scăzute ale indicelui sodic şi al acidităţii.

În cazul arahidelor cultivate pentru consum sub formă prăjită, calitatea interesează şi sub

aspectul procentului de păstăi cu un anumit număr de boabe şi culoarea boabelor, în privinţa

căreia există preferinţe ridicate în anumite ţări şi pentru anumite categorii de consumatori.

Precocitatea constituie un obiectiv de ameliorare important, atât în ţările cu climat în care

alternează perioadele ploioase cu secetoase, cât mai ales în ţările situate la limita nordică a

arealului de cultivare a arahidelor. Precocitatea se apreciază după numărul de zile de la răsărire la

înflorire, procentul de păstăi ajunse la maturitate din totalul păstăilor şi dacă boabele din păstaie

prezintă sau nu repaus germinativ ( soiurile timpurii nu au repaus germinativ şi deci boabele din

păstăi pot să încolţească în sol înainte de recoltare).

Rezistenţa tinerelor plante la temperaturi scăzute şi la oscilaţii bruşte de temperatură

constituie un obiectiv de ameliorare pentru ţările situate la limita nordică a arealului de cultivare

a arahidelor, cum este şi ţara noastră.

Un obiectiv al ameliorării pentru toate zonele de cultură a arahidelor îl constituie

realizarea de soiuri rezistente la secetă, cu deosebire în perioada înfloririi şi formării fructelor. În

vederea recoltării mecanizate este necesar ajungerea la maturitate a unui număr cât mai mare de

păstăi.

Cercetările şi observaţiile realizate au urmărit atingerea următoarelor obiective:

evaluarea cadrului natural, a condiţiilor pedoclimatice, în vederea aprecierii gradului de

favorabilitate pentru cultura arahidelor;

inducerea unor mutaţii cu ajutorul substanţelor chimice în vederea creşterii variabilităţii

speciei Arachis hypogaea L.;

studiul efectului unor substanţe chimice mutagene asupra particularităţilor morfo-

fiziologice la specia Arachis hypogaea L.;

comportarea unor mutante în ceea ce priveşte identificarea de forme biologice valoroase,

în scopul productivităţii;

28

4.2. Materialul biologic folosit

În calitate de material biologic pentru cercetări au fost folosite seminţe de Arachis

hypogaea L., soiurile Tâmbureşti, Jelud, Braziliene negre şi linia L 9184 de la Universitatea din

Craiova din cadrul Facultăţii de Agricultură.

Soiul Tâmbureşti a fost obţinut prin selecţie individuală din populaţia Tâmbureşti. Face

parte din subspecia fastigiata, subtipul Natal Spaniol. Plantele au înălţimea cuprinsă între 30-45

cm, în medie 35 cm şi un număr de 7 tulpini. Portul plantei este erect, frunzele sunt de culoare

verde, compuse din două perechi de foliole lungi de până la 8,6 cm şi late de până la 4,3 cm.

Numărul de flori la o plantă variază între 250-350 şi sunt de culoare galben-portocalie.

Ginoforii au o lungime de până la 21 cm. La recoltare o plantă prezintă între 16-35 de păstăi, iar

greutatea medie a unei păstăi este de 1,43 g. Păstăile au o lungime variabilă, cuprinsă între 0,9 şi

4,7 cm şi o lăţime de 0,7 şi 1,9 cm, o culoare brună-deschis şi sunt de formă cilindrică. Numărul

de boabe în păstăi variază de la 1 la 3, majoritatea păstăilor având 2 boabe.

Cât priveşte însuşirile biologice, soiul Tâmbureşti este semitimpuriu, având o perioadă de

vegetaţie de 130-140 de zile. Primele flori apar, în funcţie de data semănatului şi de condiţiile

climatice din perioada după semănat, între 5-10 iunie. Înflorirea continuă apoi în tot cursul verii

până spre sfârşitul lunii august. Plantele sunt rezistente la boli şi păstăile nu încolţesc în sol în

perioada premergătoare recoltării. Boabele au un conţinut în grăsimi de până la 51,1% şi 28%

proteine (figura 4.1).

Figura 4.1–Soiul Tâmbureşti

Soiul Jelud a fost obţinut la Institutul de cercetări pentru cultura plantelor uleioase din

U.R.S.S. şi aparţine subspeciei fastigiata. Plantele au talie mică şi portul erect. Aparatul foliar

este redus, numărul de flori la o plantă variază între 160-210 şi sunt de culoare galben-

portocalie. Ginoforii sunt scurţi, iar la recoltare pe o plantă se găseşte un număr de 10-30 păstăi,

29

din care mature circa 85%. Păstăile au o culoare brună-deschisă spre galben şi formă cilindrică.

Majoritatea păstăilor au două boabe şi sunt puternic reticulate, iar la recoltare acestea reţin o

cantitate mare de pământ.Bo abele au formă cilindrică şi o culoare brună către roz ( figura 4.2.).

Figura 4.2 - Soiul Jelud

Soiul Jelud este timpuriu având o perioadă de vegetaţie de 120-135 de zile. Primele flori

apar la cca. 20 de zile de la răsărire în ultimele zile ale lunii mai-începutul lunii iunie. Înflorirea

continuă până la sfârşitul lunii iulie. Partea supraterestră a plantelor acoperă mai slab solul, iar

ciorile provoacă pagube mari prin scoaterea păstăilor din pământ şi consumarea boabelor în

perioada imediat premergătoare recoltatului.

Dacă se întârzie cu recoltarea şi timpul este cald, iar solul este umed, unele păstăi

putrezesc şi un procent ridicat de boabe din păstăi încolţesc, de unde reiese lipsa unui repaus

germinativ al seminţelor. Boabele au cca. 50% grăsimi şi cca. 25% proteine.

Soiul Braziliene negre prezintă plante cu talie înaltă, un număr mai mare de tulpini şi port

erect. Plantele asigură o foarte bună acoperire a solului. La recoltare numărul de păstăi în medie

este de 24-28, acestea au o formă cilindrică, foarte fin reticulate şi cu un rostru uşor încovoiat.

Numărul de boabe la o păstaie variază între 1 şi 4, majoritatea 3 boabe, iar MMB-ul în medie

400g (figura 4.3).

Figura 4.3 – Soiul Braziliene negre

30

Boabele sunt negre, cu o formă apropiată de cilindrică, cu unele feţe turtite, determinat

de poziţia pe care o ocupă în păstăi. Soiul braziliene negre este timpuriu, cu o perioadă de

vegetaţie de 130-140 zile.

Plantele au o creştere uniformă şi o rezistenţă mare la boli. Vegetaţia plantelor este

întreruptă de coborârea temperaturii medii zilnice sub 12°C, care are loc la începutul lunii

octombrie. Boabele au un conţinut de grăsimi între 47-51 % şi de proteine între 27-28%.

4.3. Metodele de cercetare

4.3.1. Metoda de efectuare a tratamentelor la seminţe şi aşezarea experienţei în câmp

Pentru realizarea obiectivelor de cercetare propuse s-a stabilit un program de lucru

necesar parcurgerii tuturor etapelor ce s-au desfăşurat în câmp şi în laborator.

În urma documentării, am constatat că literatura de specialitate străină este destul de

bogată în ceea ce priveşte cercetările privind sistematica, tehnologia de cultivare şi compoziţia

chimică a acestei plante.

În România, cercetările referitoare la ameliorarea speciei Arachis hypogaea L., sunt

destul de puţine.

Pentru a testa rezistenţa formelor biologice luate în studiu, şi de asemenea pentru a

provoca o variabilitate cât mai mare în cadrul acestora, seminţele au fost tratate cu cele trei

substanţe chimice mutagene. Etilmetansulfonatul şi sulfatul de dimetil au fost în doze de 0,2%,

0,4%, 0,6% şi 0,8%, iar azida de sodiu a fost în doze de 0,02%, 0,04%, 0,06% şi 0,08%, fiecare

concentraţie având ca timp de acţiune de şase ore.

După efectuarea tratamentelor cu substanţe chimice mutagene seminţele au fost uscate,

apoi semănate în câmpul experimental al disciplinei de Ameliorarea plantelor, din cadrul

fermei Ezăreni, în blocuri randomizate cu trei repetiţii (figura 4.4).

31

Figura 4.4.– Aspecte din câmpul experimetal – Ferma Ezăreni, 2012

Semănatul s-a efectuat manual, primăvara când pe adâncimea de semănat se înregistrează

12ºC şi vremea este spre încălzire. Combaterea buruienilor s-a realizat manual, prin praşile şi

pliviri. Nu s-au folosit erbicide sau substanţe chimice de sinteză pentru combaterea bolilor sau

dăunătorilor.

În cadrul experienţei, în generaţia M1 şi M2, s-au făcut observaţii privind influenţa

agenţilor mutageni chimici asupra următoarelor caractere:

gradul de răsărire al plantelor în câmp

gradul de supravieţuire al plantelor în câmp

înălţimea plantelor

numărul de ramuri principale pe plantă

numărul de boabe pe plantă

numărul de păstăi pe plantă

greutatea boabelor pe plantă

masa a o mie de boabe

32

4.3.2. Metode statistice de prelucrare a datelor

Datele obţinute în urma observaţiilor şi determinărilor efectuate au fost prelucrate

statistic conform modelelor consacrate, menţionate în literatura de specialitate (Snedecor, 1968,

Săulescu N. A., 1967, Ardelean, 1994, Onisie, 1992, Jităreanu, G., 1994, Leonte C., 1997).

Semnificaţia diferenţelor dintre variantele tratate şi martor se vor determinate prin

metoda diferenţelor limită ( DL 5%, 1% şi 0,1%). Caracterele cantitative se vor interpreta

statistic cu ajutorul analizei varianţei şi al coeficientului de variabilitate (s%) ( Săulescu N. A.,

1967).

4.3.3. Metode citogenetice

Investigaţiile citogenetice vor fi realizate pe meristeme radiculare obţinute prin

germinarea seminţelor provenite de la specia Arachis hypogaea L., soiurile Tâmbureşti, Jelud,

Braziliene negre şi linia L 9184.

Pentru colorarea materialului nuclear, respectiv a cromozomilor, se va folosi metoda

rapidă Feulgen, elaborată în anul 1924 de F. Feulgen şi H. Rossenbeck şi modificată de J. A.

Tomasi în 1936 (Tudose, 1996). Metoda se bazează pe faptul că în celulele aflate în diviziune

numai cromatina cromozomilor se colorează selectiv în roşu-violet cu fuxină bazică, în timp ce

ARN-ul din nucleoli şi din citoplasmă, precum şi toate celelalte elemente celulare nu se

colorează.

4.3.3.1. Efectul substanţelor chimice mutagene asupra facultăţii şi energiei

germinative a seminţelor

Germinaţia reprezintă procesul fiziologic de trecere a seminţelor din starea de repaus, de

viaţă latentă, în stare de viaţa activă şi se pune în evidenţă prin transformări biochimice intense,

prin creşterea embrionului. Acest proces nu presupune acumularea de substanţe organice din

mediul extern, ci o nouă repartiţie a celor de rezervă depozitate în sămânţă în timpul formării ei.

Facultatea germinativă măsoară capacitatea semințelor de a germina, exprimată prin

procentul numeric de semințe germinate normal în condiții optime şi într-un timp stabilit pentru

fiecare specie în parte (Mogârzan Aglaia şi colab., 2004).

33

Energia germinativă reprezintă testul prin care se determină viteza de germinare a

seminţelor şi se exprimă prin procentul de seminţe germinate într-o perioadă egală cu 1/3 din

durata stabilită pentru determinarea facultăţii germinative (Starodub, 2008).

Numărul de zile stabilit pentru determinarea energiei germinative a fost de 3 zile, iar cel

pentru stabilirea facultăţii germinative a fost de 9 zile.

După 3 zile se vor număra şi vor fi eliminate din fiecare probă seminţele care vor germina

şi se va calcula valoarea procentuală a energiei germinative (figura 4.5.). Media seminţelor

germinate normal, aflată la prima numărare, reprezintă energia germinativă, care se exprimă în

procente deoarece corespunde la 100 de seminţe.

Figura 4.5. – Seminţe de arahide germinate

Se vor îndepărta la prima numărare seminţele germinate normal cât şi cele mucegăite.

Restul seminţelor se vor lăsa în continuare la germinat până la următoarea numărătoare.

După 9 zile se vor număra restul seminţelor, iar la fiecare probă se va adăuga numărul de

seminţe obţinut la prima citire. La a doua numărătoare, media aritmetică a numărului total de

seminţe germinate normal reprezintă facultatea germinativă (Boldor şi colab., 1983).

4.3.3.2. Efectul substanţelor chimice mutagene asupra ritmului de creştere în

lungime a rădăciniţelor şi tulpiniţelor

Ritmul de creştere a rădăciniţelor şi tulpiniţelor plantelor provenite din boabe tratate cu

agenţi mutageni fizici, chimici sau biologici constituie un criteriu de apreciere a sensibilităţii

materialului biologic, relativ expeditiv, deoarece poate fi urmărit nu numai în câmp ci şi în

laborator sau case de vegetaţie (Ţîrdea Gh., 1984).

34

Pentru determinarea ritmului de creşte în lungime a rădăciniţelor şi tulpiniţelor se vor

realiza măsurători la intervale constante de timp. Intensitatea creşterii se va exprima prin sporul

parametrilor analizaţi, raportaţi la unitatea de timp (o zi, 3 zile), în funcţie de periodicitatea

măsurătorilor efectuate.

În cazul nostru pentru a pune în evidenţă modificările apărute în procesul de creştere al

rădăciniţelor precum şi influenţa substanţelor folosite asupra intensităţii procesului de creştere se

vor efectua măsurători liniare la un interval de 3, 6 şi 9 zile (figura 4.6).

Figura 4.6. - Măsurarea rădăciniţelor de arahide

4.3.3.3. Identificarea şi frecvenţa aberaţiilor cromozomice în mitoză.

Pentru identificarea aberaţiilor cromozomice şi a frecvenţelor acestora se va utiliza

metoda clasică care presupune următoarele etape (Ţîrdea şi Leonte, 2003):

- fixarea;

- hidroliza;

- colorarea;

- efectuarea preparatelor microscopice;

- examinarea preparatelor la microscop.

Fixarea

Când rădăciniţele vor ajunge la lungimea de 1-1,5 cm acesteavor fi introduse în fixatorul

Carnoy I (soluţie de alcool etilic absolut: acid acetic glacial în proporţie de 3:1) la temperatura

camerei, timp de 24 de ore (figura 4.7.).

35

Fixarea are rolul de a omorî celulele în starea în care se află în acel moment, proces care

are loc foarte repede, aproape instantaneu. Prin fixare trebuie să se păstreze structura fină a

tuturor organitelor celulare. În afară de aceasta, prin fixare biocoloizii celulei se coagulează şi ca

urmare, constituenţii celulari se pot colora cu diferiţi coloranţi.

Până în momentul prelucrării rădăciniţelor în vederea colorării, acestea vor fi păstrate în

frigider, în soluţie de alcool etilic 70%.

Figura 4.7. – Fixarea rădăciniţelor recoltate la Arachis hypogaea L.

Hidroliza

Are drept scop macerarea ţesuturilor prin dizolvarea parţială a substanţelor pectice dintre

celule, prin care se uşurează procesul de colorare şi apoi de etalare a celulelor între lamă şi

lamelă.

Rădăciniţele fixate vor fi spălate cu apă distilată, apoi introduse în soluţie de HCl 1 N şi

lăsate timp de 14 minute la etuvă la temperatura de 60°C (figura 4.8.).

Figura 4.8. – Hidroliza rădăciniţelor de arahide

36

Colorarea materialului biologic

Se va efectua prin menţinerea rădăciniţelor în soluţie de carbol-fuxină modificată 10%

(Carr şi Walker, 1961), la frigider, până în momentul în care vârful acestora devine mai intens

colorat (circa 24 de ore). Zona apexului radicular se va colora mai repede şi mai intens întrucât

aici majoritatea celulelor se află în diviziune, în timp ce restul rădăciniţei, unde frecvenţa

diviziunilor este scăzută (celulele sunt mari şi alungite) rămâne vizibil necolorată. Acest colorant

determină colorarea nucleelor şi cromosomilor în roşu-violaceu, citoplasma fiind roz-pal.

Principiul acestei metode de colorare constă în reacţia grupelor aldehidice ale ADN eliberate prin

hidroliza HCl 50% cu fuxina bazică din colorantul Carr (figura 4.9.).

Figura 4.9 – Colorarea rădăciniţelor de arahide

Efectuarea preparatelor microscopice-metoda squash

Pe o lamă de microscop curată, uscată şi degresată, într-o picătură de colorant Carr cu

ajutorul unei pensete se pun rădăciniţele unui bob de arahidă. Cu ajutorul unui ac spatulat sau a

unei lame de bărbierit se vor tăia 1-2 mm din vârful colorat al rădăciniţelor (ale unui singur bob)

peste care se pune o lamelă curată şi degresată.

Cu ajutorul unei hârtii de filtru se fixează lamela pe lamă astfel încât să se absoarbă

excesul de colorant Carr şi în acelaşi timp să se evite glisarea lamelei pe lamă. Cu ajutorul unui

băţ de chibrit se loveşte lamela (în zona unde se află rădăciniţa) la început mai slab, apoi mai

puternic, pentru a se asigura o etalare perfectă a celulelor şi cromozomilor metafazici.

37

După etalare, între lamă şi lamelă, trebuie să se observe cu ochiul liber un strat foarte fin,

abia perceptibil, de material colorat în roşu-violet. Şi această operaţiune trebuie efectuată cu

mare grijă pentru a se evita glisarea lamelei pe lamă. De la locul iniţial, fapt ce duce la

rostogolirea celulelor şi compromiterea parţială sau totală a preparatului.

Examinarea preparatelor la microscop

Observarea preparatelor la microscop se va efectua în lumină puternică, la început cu

obiectivul 10x, cu ajutorul căruia se examinează preparatul în mare, iar citirea preparatului se va

face la obiectivul 40x. Datele obţinute vor ajuta la calcularea indicelui mitotic şi a frecvenţei

tipurilor de celule aflate în diviziune mitotică.

Efectuarea fotografiilor.

Fotografiile se vor realiza cu ajutorul aparatului digital Cannon, adaptat microscopului

optic Hund – Wetzlar, aflat în dotarea laboratului L.E.C.O.M. la obiectivul de 100x cu imersie.

Se vor realiza fotografii celulelor aflate în interfază, profază, metafază, anafază şi

diferitelor tipuri de aberaţii cromosomiale întâlnite.

În urma analizei fazelor mitozei se va determina indicele mitotic. Acesta reprezintă

procentul de celule aflate în diviziune, faţă de numărul total de celule analizate (Ţîrdea şi Leonte,

2003). Indicele mitotic se va calcula utilizând următoarea formulă:

Im% = N m X 100

N t , unde

Im = indicele mitotic;

Nm = numărul de celule aflate în diviziune;

Nt = numărul total de celule analizate.

4.3.4. Metode fiziologice

4.3.4.1. Determinarea conţinutului de pigmenţi asimilatori din frunze pe cale

spectrofotometrică

38

Pentru experimentare se va utiliza material vegetal recoltat în fenofaza de creştere a

frunzelor, înflorire şi coacerea boabelor.

Se cântăresc 0,2-1g material proaspăt şi se introduc într-un mojar. Se adaugă nisip de

cuarţ şi un vârf de cuţit (amestec în părţi egale) de CaCO3 şi MgCO3. Carbonatul de calciu este

folosit în vederea neutralizării sucului celular vacuolar rezultat în urma distrugerii celulelor şi

care, prin aciditatea sa, fixează Mg din moleculele de clorofilă, transformându-le în feofitine

(Boldor şi colab., 1983).

Materialul, în care se adaugă 2-3 ml acetonă 85%, se triturează bine timp de câteva

minute. Cu ajutorul unei hârtii pH se controlează reacţia extractului, care nu trebuie să fie acidă.

După tritrurarea completă a ţesutului vegetal asimilator, acest omogenat se filtrează

printr-o pâlnie cu rondele de hârtie de filtru Watmann. Omogenatul se spală de mai multe ori

până la completa decolorare a ţesutului vegetal (1g-10ml acetonă).

Se adaugă apoi alţi 4-5 ml acetonă 85%, iar conţinutul se filtrează în balon cotat de 25

ml. Se aduce la semn cu acetonă. Extractul astfel obţinut se introduce în cuva aparatului, iar ca

martor se foloseşte numai soluţie de acetonă 85% (Jităreanu Carmen şi colab.; 2011) (figura

4.10).

Figura 4.10 - Extragerea pigmenţilor clorofilieni din frunzele de Arachis hypogaea L.

39

Mai întâi se face o determinare pentru soluţia martor (numai cu reactivi) şi apoi pentru

cea de clorofilă, câte două citiri, iar media va reprezenta valoarea pentru clorofilă/carotenoizi.

Conţinutul de pigmenţi foliari va fi apreciat pe baza absorbţiei luminii, determinată prin

metoda spectrofotometrică, asistată de calculator. Cunoscând gradul de absorbţie la diferite

lungimi de undă, se va stabili tipul pigmentului şi cantitatea acestuia.

Astfel, clorofila a 663 absoarbe lumina în λ = 663 nm, clorofila b 646 în λ = 646 nm, iar

pigmenţii carotenoizi absorb lumina în λ = 470 (Jităreanu Carmen, 2006).

Pentru determinarea cantităţii de clorofila a, clorofila b şi carotenoizi din frunzele de

arahide s-au utilizat formulele de calcul propuse de către Lichtenthaler şi Welburn în anul 1983

(Lichtenthaler şi Wellburn, 1983):

Clorofila a (μg/ml) = 12,21 (A663) – 2,81 (A646)

Clorofila b (μg/ml) = 20,13 (A646) – 5,03 (A663)

Carotenoizi (μg/ml) = (1000A470 – 3,27 [clorofila a] – 104 [clorofila b]) / 227

Se vor determina în acest fel conţinutul de pigmenţi asimilatori şi carotenoizi, raportul

dintre clorofila a şi clorofia b şi raportul dintre pigmenţii clorofilieni şi cei carotenoizi în

dinamica dezvoltării ontogenetice, în funcţie de fenofaza plantelor.

4.3.4.2. Efectul indus de tratamentul cu substanţe chimice mutagene asupra intensităţii

fotosintezei

Sistemul LC pro+ asigura un control complet asupra mediului din interiorul frunzei.

Controlul automat al parametrilor se va realiza în orice condiţii de ambient respectiv: controlul

CO2, controlul H2O, controlul temperaturii respectiv controlul radiaţiei.

40

Figura 4.11 - Determinarea intensităţii fotosintezei cu aparatul LC pro+

Pentru determinarea intensităţii fotosintezei s-au realizat câte 3 determinări pe plantă în

fenofaza de creştere a frunzelor, înflorire şi coacerea boabelor, rezultatele obţinute reprezentând

media aritmetică a citirilor efectuate (figura 4.11).

4.3.4.3. Determinarea intensităţii transpiraţiei

Plantele elimină prin transpiraţie cantităţi considerabile de apă. În condiţii normale

aceasta ajută la desfăşurarea optimă a proceselor fiziologice. În cazul apariţiei unui deficit de apă

în substrat, deşi intervin mecanisme fiziologice de diminuare a transpiraţiei, plantele prezintă

simptome de suferinţă. De aceea, având în vedere efectele favorabile ale acestui proces în viaţa

plantelor, transpiraţia a fost considerată de K. A. Timiriazev ca “un rău necesar” (Boldor, 1991).

Transpiraţia propriu-zisă se raportează fie la suprafaţă, fie la masa (proaspătă sau uscată)

materialului vegetal. În funcţie de suprafaţă se exprimă în grame apă/dm2/h, iar în funcţie de

masă în mg apă/g/h.

Pentru determinarea intensităţii transpiraţiei se va folosi metoda indirectă prin măsurarea

scăderii masei materialului vegetal.

Procedeul cântăririlor rapide (procedeul de moment a lui L. A. Ivanov) (Boldor şi

colab., 1983) constă în cântărirea frunzelor detaşate folosind balanţa de torsiune. Pierderile din

masa vegetală, ca urmare a transpiraţiei, se măsoară prin cântărirea iniţială a materialului vegetal

şi recântărirea lui după intervale scurte de timp (1-2, maximum 3 minute), considerându-se că în

acest timp intensitatea transpiraţiei nu este denaturată prea mult prin detaşarea frunzei.

Pentru calcularea intensităţii transpiraţiei voi folosi următoarea formulă:

(mi−mf )⋅60

P⋅T ,

în care:

mi – masa iniţială a frunzei (în grame);

mf - masa finală (după 1, 2 şi 3 minute) a frunzei (în grame);

60 = factor de raportare a intensităţii transpiraţiei la unitatea de timp (o oră);

41

P = parametrul frunzei faţă de care se face raportarea intensităţii transpiraţiei (masa ei

iniţială sau suprafaţa ei foliară în dm2);

T = durata determinării

Pentru fiecare variantă se va efectua câte 3 cântăriri (C1; C2 şi C3) pe baza cărora am

realizat o medie. Acest lucru ne-a permis şi stabilirea ritmului de deshidratare a frunzelor. Prima

cântărire (C0) se va echivala cu 100% iar celelalte cântăriri ne furnizează valorile de deshidratare

a ţesuturilor, conform relaţiei:

X1 =

100⋅C1

C0 X2 =

100⋅C2

C0 X3 =

100⋅C3

C0

42

CONCLUZII

În selecţia şi ameliorarea plantelor cu importanţă economică, un prim pas îl constituie

obţinerea unui material biologic foarte divers, inducerea unei variabilităţi individuale de mare

amplitudine. Practica a demonstrat că tendinţa spre variabilitate, manifestată la orice specie,

creşte în urma intervenţiei cu diverşi factori fizici, chimici sau biologici, cunoscuţi sub numele

de factori mutageni.

Studiul mutagenezei la specia Arachis hypogaea L. reprezintă un ansamblu de lucrări de

cercetare, care include formarea unei baze teoretice ample, prin informaţii privind: cadrul natural

în care este amplasată experienţa, tehnologia de cultivare şi biologia speciei, cât şi un volum

crescut de metode practice pentru realizarea etapelor din protocolul de lucru. La final se vor

sintetiza rezultatele şi se vor interpreta în urma calculului statisc.

Prin acest studiu ne-am propus investigarea unor particularităţi anatomice şi morfologice,

deoarece considerăm că fenotipizarea unor trăsături morfologice ale suprafeţelor foliare, a

boabelor, genic determinate, în urma tratamentelor cu substanţe chimice mutagene, poate

reprezenta un criteriu suplimentar pentru selecţie.

43

BIBLIOGRAFIE

1. Ardelean M., 1994 - Ameliorarea plantelor horticole- curs. Tipo. Agronomia, Cluj –

Napoca.

2. Blaga Gh., Filipov F., 2005 – Pedologie. Ed. AcademicPres, Cluj-Napoca.

3. Boldor O., Raianu O., Trifu M., 1983 – Fiziologia plantelor – lucrări practice, Ed. Did.

şi Pedag., Bucureşti:74 -77.

4. Boldor O., Raianu O., Trifu M., 1991 - Fiziologia plantelor, Ed. Did. Şi Pedag.,

Bucureşti: 16 – 18.

5. Brown Terry A., 1998 - Molecular biology Labfax: Gene analysis, vol. II. Academic

Press, California, USA.

6. Carr D. H., Walker J. E., 1961 – Carbol-fuchsin, a dye for human chromosomes. Stain

Technol., 36: 233 – 236.

7. Cartwright I. L, Kelly S. E., 1991 - Probing the nature of chromosomal DNA protein

content by in vivo footprinting. Biotechniques, Nr. 11, pag. 188–190.

8. Chahal S.R. şi Virmani M. S., 1973 - Rev Oléagineux. Revue générale des corps gras, nr.

4.

9. Cîmpeanu M. M., Maniu M., Surugiu I. I., 2002 – Genetica – metode de laborator, Ed.

Corson, Iaşi.

10. Doniţă M., Ivan Doina, 1975 – Metode practice pentru studiul ecologic şi geografic al

vegetaţiei, Ed. Univ. Bucureşti: 37-39.

11. Fahad Al. Quarainy and Salim Khan., 2009 – Mutagenic effects of sodium azide and its

application in crop improvement. World Applied Sciences Journal. 6, pp. 1589-1601.

12. Gillier P. şi Silvestre P., 1969 - L´arachide. Maisonneuve et Larose, Paris.

13. Hera Cr., Toncea I., Ghinea L., 1980 – Rev. Probleme de agrofitotehnie teoretică şi

aplicată. Vol. II, nr. 1.

14. IARC, 1999 – Dimethyl sulfate. In Re-evaluation of some Organis Chemicals, Hydrazime

and Hydrogen Peroxide, vol. 71. International Agency for Research on Cancer, Lyon,

France, pag. 575-588.

44

15. Jităreanu Carmen D., Toma Doina L., Slabu Cristina, Marta Alina E., 2011 – Lucrări

practice de fiziologia plantelor. Editura Ion Ionescu de la Brad, Iaşi.

16. Jităreanu G., 1994 – Tehnică experimental- curs. Editura Universităţii Agronomice, Iaşi.

17. Leonte C., 1997 – Ameliorarea plantelor horticole şi tehnică experimentală - lucrări

practice. Editura Universităţii Agronomice, Iaşi.

18. Lichtenthaler H. K., Wellburn A. R., 1983 - Determinations of total carotenoids and

chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents. Biochemical Society

Transactions, Nr. 11, pag. 591 - 592.

19. Marin Ş. şi Constantinescu Emilia, 2011 – Fitotehnie-Manual universitar pentru

învăţământ la distanţă, Craiova.

20. Mogârzan Aglaia, Morar G., Ştefan M., 2004 - Fitotehnie. Curs. Editura Ion Ionescu de

la Brad, Iaşi.

21. Nair S. K., Ramaswami P. P., Pemmal R., 1972 – Rev Oléagineux. Revue générale des

corps gras, nr. 3

22. National Toxicology Program, 2011 - Report on Carcinogens (12th Ed.). U. S.

Department of Health and Human Services, Public Health Service, pag. 174-175.

23. Onisie T., Jităreanu G., 1992 - Tehnică experimentală- lucrări practice, U.S.A.M.V. Iaşi.

24. Owais W. M. şi Kleinhofs A., 1988 - Metabolic activation of the mutagen azide in

biological systems. Mutat. Res. 197, p. 313-323.

25. Pietrarelli R. J., 1971 - Rev Oléagineux. Revue internationale des corps gras, nr. 8-9.

26. Pîrşan, P., (1998). Leguminoase pentru boabe. Ed.Mirton,Timişoara.

27. Pohanish R. P., 2008 - Sittig's Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals and

Carcinogens, William Andrew Inc.

28. Pop L., Bîrnaure V., Marghitu Valeria şi Chichea I., 1986 – Cultura alunelor de pământ,

Editura Ceres, Bucureşti.

29. Pop L., Chichea I. şi Pitiş S., 1976 – Rev. Producţia Vegetală. Cereale şi plante tehnice,

nr.4

30. Răus L., Jităreanu G., 2007 – Corelaţii între unii indicatori ai stării de compactare a

solului şi producţia culturilor de grâu, fasole şi porumb. Compactarea solurilor –

proecese şi consecinţe. Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

45

31. Rippey J. C. R., Stallwood M. I., 2005 - Nine cases of accidental exposure to dimethyl

sulphate -a potential chemical weapon. Emergency Medicine Journal, Nr. 22, pag. 878-

879.

32. Ritus G.I., (1952) – Fitotehnie, Moscova.

33. Saese H. and Fahey G., 2006 - Comparison of seed dressing treatments of peanut

(Arachis hypogaea L.) at cleanwater in the lower Markham Valley, Papua New Guinea.

ACIAR Proceedings No. 122, p. 51–53.

34. Săulescu N. A., Săulescu N. N., 1967- Câmpul de experienţă. Ediţia a II- a. Editura

Agro-Silvică Bucureşti.

35. Snedecor G. W., 1968 -Metode statistice aplicate în cercetările de agricultură şi

biologie, Editura Didactică şi Pedagogică.

36. Starodub V., 2008 – Tehnologii în fitotehnie. Ed. UASM, Chişinău.

37. Ţîrdea Gh., 1984 – Contribuţii la crearea unor linii noi de linte (Lens esculenta Moench)

prin folosirea agenţilor mutageni. Teză de doctorat, Institutul Agronomic, Iaşi, pag. 138-

141.

38. Ţîrdea Gh., Leonte C., 2003 – Citogenetică vegetală – metode de laborator. Ed. Ion

Ionescu de la Brad, Iaşi.

39. Tsuschiya T., 1971 – An improved aceto-carmine squash method, with special reference

to the modified Rattembury”s method of making a preparation permanent. Barley Genet.

News, 1: 71-72.

40. Tudose I. Gh., Băra I. I., Tudose M., 1996 - Cytogenetic effects induced by nicotine in

Vicia faba (2n=12), Analele ştiinţifice ale Universităţii “Al. I. Cuza” din Iaşi (Serie nouă)

Secţiunea II a. Biologie ,volum: v. 42 pagina: p. 95-99.

41. Vyskocil A., 1999 - Dimethyl sulphate: review of toxicity. Central European Journal of

Occupational and Environmental Medicine, Nr. 5, pag. 72–82.

42. Zamfirescu N., Velican V., Valuţă Gh., Săulescu N., Canţăr F., 1958 – Fitotehnia vol. II,

Editura Agro-Silvică de Stat, Bucureşti.

46