Upload
hanguyet
View
222
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Genel olarak kromatografi, çeşitli maddelerin hareketli faz
yardımıyla, sabit bir faz arasından değişik hızlarla hareket
etmeleri esasına dayanır.
İlk defa 1906 yılında bir Rus botanikçi Tswetttarafından kullanılmıştır.
Yaptığı çalışmada yapraklardaki pigmentleriayırmayı CaCO3 kolon ve petrol eteri kullanarakbaşarmıştır.
Bu çalışmalardan sonra kromatografi, 1952 ve 1960 yıllar arasında hızlı bir şekilde gelişerek analitik teknikler arasında önemli bir yer almıştır.
Bütün sıvı kromatografik teknikleri arasında en
yaygın kullanılanı dağılma kromatografisidir. Bu
teknik sıvı-sıvı kromatografi ve sıvı-bağlı faz
kromatografisi olmak üzere iki alt sınıfta
incelenir.
Sıvı-sıvı tekniğinde durgun faz katı yüzeyine
fiziksel adsorpsiyonla, bağlı-faz tekniğinde ise
kovalent bağlar ile tutturulur.
ABSORBSİYON ADSORBSİYON
HPLC ne amaçla kullanılır?
HPLC uçucu olmayan kimyasal ve biyolojik bileşenlerin ayrımı için kullanılır.
Örnek olarak
• İlaç etken maddeler, aspirin, ibuprofen veya asetaminofen
• Proteinler, yumurtanın beyazı veya kan proteinleri
• Poimerler gibi organik kimyasallar (polisitiren or polietilen)
• Gıdalardaki pestisit ve vitaminler
• Birçok doğal bileşen, ginseng, bitkisel ilaçlar, bitki ekstraktları
• Sıcaklık ile kararlılığını kaybeden bileşenler, trinitrotoluen (TNT), enzimler
NOT: Eğer uçucu bir bileşik ile çalışacaksak (bir gaz veya petroldeki bir hidrokarbon türevi), Gaz kromatografi sistemi tercih edilmelidir.
Kromatografik ayırmada maddeler birbiriyle karışmayan iki fazarasında dağılırlar.
Fazlardan birine hareketli (mobil) faz, diğerine ise durgun faz(stasyoner faz) denir.
Karışımdaki her maddenin hareket hızı (tR), maddenin hareketliveya mobil faza olan ilgisine göre belirlenir.
Hareketli faza daha çok ilgisi olan maddeler daha hızlı hareketederler.
Kolondan çıkan her maddenin konsantrasyon profili, pik olarakadlandırılır.
Piklerin oluşturduğu tabloya da kromatogram adı verilir.
Bir kromatogram neye benzer?
Zaman
min0 2 4 6 8 10 12 14
Örneğin enjekte edildiği zaman
Her bir sinyal pik olarak adlandırılır
A
B
C
İlaç endüstrisini baz aldığımızda, dozaj formlarında bulunan aktif bileşenin kalite kontrolü hayati önem taşımaktadır ( ) .
HPLC sistemi bu aktif bileşen veya dozaj formunun içerisinde bulunan, ilacın sentezlenmesinden veya bozunmasından kaynaklanan safsızlıkların ( ) tespiti için kullanılabilir.
Bu noktada yapılan kalite kontrol hastanın güvenliğini sağlamaktadır.
HPLC nin uygulanışı
Bileşenlerin ayrımı kolonda gerçekleşir
Kolon, çelik bir borudan oluşan içi silika jel ile doldurulmuş bir yapıdan oluşur.
Kolon
Sabit Faz Partikülleri
2. adım: Ayrım
Hareketli Faz
Kolon boyunca sıvının (metanol ve su karışımı gibi) hareket etmesi için bir basınç uygulanır
Bu sıvı karışımına hareketli faz denir.
Hareketli faz, sabit faz boyunca ilerleyerek, enjekte edilen numuneyi taşımakla görevlidir.
Farklı bileşenler, kolonda farklı hızlarda ilerlerler.
Hareketli Faz
3. Adım: Bileşenlerin miktarlarının tayin edilmesi
Bileşenler ayrıldıktan sonra, karışım içerisindeki bileşenlerin miktarlarının tayini için UV ışık kaynağından faydalanılır
Işığın madde tarafından absorblanması, madde miktarı ile orantılıdır diyebiliriz
Örneğin madde miktarını 2 katına çıkarırsak, madde 2 kat daha fazla ışığı absorblayacak demektir.
Detector
Dedektör ışığın yoğunluğunu ölçmekle görevlidir.
Işık geöişindeki azalma dedektörde bir cevap oluşturur ve buna da pik denir.
4. Adım: Bileşenlerin nicel olarak tayini Öncelikli olarak temel maddeye
ait pik görülmekte Görüntüyü yaklaştırdıkça küçük
pikler gözükmeye başlamaktadır.Businyaller safsızlıklara aittir.
Hasta sağlığı açısından bu safsızlıklar belirlenen limitlerin altında olmak zorundadır.
Genel olarak 5 kısımdan oluşur
• Pompa
• Enjektör
• Kolon
• Dedektör
• Kaydedici
Bu kısımlardan bazıları çalışılacak bileşene göre değişiklik gösterebilir
HPLC sistemine genel bakış
Agilent 1200 Infinity SKSistem
Pompanın görevi sıvının sistemde dolaşımını sağlamaktır. Dakikada akan mL cinsinden gösterilir.
• HPLC için normal bir akış 1- 2-mL/dk aralığındadır.
• Maksimum 400 bar.
• UHPLC pompaları ile 600 - 1500 bar.
Bir deney esnasında, pompa değişmeyen, sabit bir akış sağlıyorsa bu sisteme isokratik sistem denir.
Fakat hareketli fazda analiz esnasında değişimler gerçekleşirse çalışılan sisteme gradient sistem adı verilir.
HPLC sisteminin parçalarıPompa
1260 Infinity Çoklu pompa– Çalışma prensibi
Pump head A Pump head B
From solventbottle
From solvent bottle
Inlet ValveInlet Valve
Outlet Valve
Outlet Valve
Mixing Chamber
To waste
Purgevalve
Pumpoutlet
Mixer
Damper
Seal Seal
Piston Piston
Gradient ve Isokratik Koşulların Kıyaslanması
İzokratik
Çözücü bileşimi hep sabittir
• Basit ayrımlar için idealdir
• Kalite kontrol departmanlarında sıklıkla tercih edilir.
Gradient
Hareketli faz bileşimi zamanla değişim gösterir.
• Kompleks karışımların ayrımı için idealdir.
• Bilinmeyen karışımlarda metodgeliştirmek için tercih edilir.
• En yaygın kullanılan şekli doğrusal artan gradient tir.
Neden gradiente ihtiyaç duyuyoruz?
Time (min)
2
0 25 50 75 0 5 10 15 20 25 30
Time (min)
1,2
3
4
5
6
7
8
1
3
45
6
7
8
Herbisitlerin ZORBAX StableBond-C18 kolon kullanılarak ayrımıKolon: ZORBAX SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 µm
Hareketli faz: A: H2O 0.1% TFA, pH 2
B: Asetonitril
Akış Hızı: 1.0 mL/min
Sıcaklık: 35°C
Örnek: 1. Tebuthiuron
2. Prometon3. Prometryne4. Atrazine5. Bentazon6. Propazine7. Propanil8. Metolachlor
Izokratik70% su/30% Asetonitril
Not:Son pikinalıkonma süresi 25 dakikadır
0 25 50 75Time (min)
0 5 10 15 20 25 30
Time (min)
1,2
3
4
5
6
7
8Not:Son pikinalıkonma süresi 70 dakikadır
1
2
3
45
Gradient 20 – 60% Asetonitrile/su
6
7
8
Enjektör:
– Genellikle enjekte edilen numune hacimleri
0.1- 20-mikrolitre (µL) arasındadır.
– Sistemdeki yüksek basınca dayanıklı olmalıdır.
Günümüzde oto örnekleyiciler analizcilerin zaman kaybını en aza indirecek şekilde tasarlanmaktadır.
Enjektör sistemleri
Manuel enjeksiyon valfi
Oto örnekleyici sistemi
Enjektör bölmesi hakkında bilinmesi gerekenler
Enjeksiyon hacmi aralığı: 0.1 µl den 100 µl ye kadar enjeksiyon yapılabilir. Farklı enjektörler kullanılarak bu miktar arttırılabilir.
Enjektör bölmesi: Farklı hacimdeki vialler kullanılabilir.
Carryover (Bulaşma): Numunenin enjeksiyonlar arasında bulaşmasını ifade eden bir terimdir. En aza indirmek için yıkamalar yapılabilir.
Numune kapasitesi: Oto örnekleyicinin plaka tipine göre değişir.
Kesinlik: Enjeksiyon hacimlerinin tekrarlanabilirliğini ifade eder.
Doğruluk: Kesin olarak alınan numune hacminin doğru değere yakınlığıdır.
5 – 100 °C arasında ayarlanabilmektedir.
Kromatografik sistemin kalbi olarak nitelendirilir.
Ayrım, bileşenlerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre gerçekleşir.
• Partikül boyutu küçüldükçe, uygulanan basınç artar.
Kolon bölmesi
Kolon, ısıtıcı bloklar arasına yerleşir.
Analizler için doğru kolon seçimini yapmak çok önemlidir.
HPLC de kullanılan kolon tipleri
• Analitik: iç çapı (i.d.) 1.0 - 4.6 mm; uzunluğu 15 – 250 mm
• Preparatif: i.d. > 4.6 mm; uzunluk 50 – 250 mm
• Kapiler: i.d. 0.1 - 1.0 mm; boyları değişkendir
• Nano: i.d. < 0.1 mm, ya da < 100 µm
Kolon bağlantı materyalleri
• Paslanmaz çelik En çok tercih edilen bağlantı ekipmanı türüdür, yüksek basınca dayanıklıdır.
• Cam (Biomoleküller için kullanılır)
• PEEK polimer (Baınca daha az dayanıklıdır fakat kullanımı daha pratiktir.)
Kolon
Kolonlar genellikle poroz silica partikuller iledoldurulurlar
En cok kullanılan ebatlar 5 μm, 3.5 μm, ve 1.8 μm
Yüksek basınç altında dolum yapılmalıdır.
Bu yüzden bir çok kişi hazır kolon kullanır
Bir bileşiğin alıkonma zamanı partikül büyüklüğüne, yapısına ve kimyasına göre değişiklik gösterir.
Kolon dolgumateryali
Kolon partikülleri
Kolon seçimi
Çözücü Mod
Molekül ağırlığı < 2,000
Organik
Hekzan Normal faz
MeOH /MeOH:H2O veyaACN /ACN:H2O
Ters Faz (RP)HILIC ( polar bileşikler için)
THF Jel permasyon
Sulu faz
Iyonik olmayanTers FazHILIC
IyonikTers Faz
Molekül ağırlığı> 2,000
Organik Jel permasyon
Sulu faz
Jel permasyonIon-değişim kromatografiTers Faz(Daha büyük partiküllü kolon ile)
Ayrım şekilleri
Temelde 4 yöntem kullanılır
• Ters Faz
• Normal Faz
• Iyon değişim kromatografi
• Boyut eleme kromatografi
Mevcut bileşenlerin 90% ındanfazlası için kullanılabilir.
Apolar, polar, iyonlaşabilen veya iyonik bileşenler için kullanılabilir.
Kolon apolar özellik gösterirken (C18, C8, C3, phenyl) hareketli faz polar özellik gösterir.
(tampon) + su ile karışabilen organik çözücü ( metanol veyaasetonitril)
10 sulfa tipi ilacın ayrımı
Ters Faz
Normal Faz
10% kadar bileşik için tercih edilebilecek bir yöntemdir.
Aşağıdaki durumlarda kullanılabilir:
• Suya karşı hassas bileşikler
• izomerler
• Kiral analizler
Kolon polar (e.g., silika jel, cyanopropyl-bonded, amino-bonded) özellik gösterirken hareketli faz apolarolmalıdır.(hekzan, iso-oktan, methilenklorür, ethil acetate gibi).
Source: Application # 5991-0395EN
Normal-faz kromatografide,
polarlığı en az olan bileşen kolondan ilk önce çıkar;
hareketli fazın polarlığı arttıkça elüsyon zamanı azalır.
Ters-faz tekniğinde ise,
aksine, polarlığı en çok olan bileşik kolondan ilk önce çıkar
ve hareketli fazın polarlığı arttıkça elusyon zamanı artar.
DedektörKolonu terk eden bileşenleri görebilmemizi sağlar
• Ayrılan moleküllerin miktarını belirlememizi sağlar
• Dedektörden geçen maddeler bir kaydedici yardımıyla kaydedilerek, zamana karşı dedektör cevabına ait bir grafik oluştururlar buna da kromatogram denir.
En çok kullanılan dedektörler
• Spektroskopik
• Floresans
• Kırılma indisi
tr1
tr2
Wb1 Wb2
W1/2
h
t
tri Alıkonma zamanı
W1/2 Yari yükseklikteki pik genişliği
Wbi Taban pik genişliği
Ayrım Gücü
Ayrım gücü, kolonun pikleri ayırma kapasitesini ifade eder.
Etkin tabaka sayısına (N), seçiciliğe (a) ve kapasite faktörüne bağlıdır (k)
• Rs değeri 1.5 ve üzeri olursa pikler birbirinden kesin olarak ayrılmıştır diyebiliriz.
Rs 14
N
a 1
a
k
1k
Ayrım gücünü hesaplamak için
SeçicilikEtkinlik Kapasite faktörü
Ayrım gücünün artması aşağıdaki koşullar ile sağlanır
• Bunlardan en önemlisi seçiciliktir. Seçicilik parametresindeki ufak bir değişimin ayrıma etkisi çok büyük olur
• Alıkonma zamanını etkisi k değeri küçük olduğunda önem taşımaktadır.
• Etkinlik ise kolonun ayrım gücünü ve yeni olduğunu ifade eder.
Etkin tabaka saysının hesaplanması (N)
Yüksek tabaka sayısı daha hızlı, simetrik ve keskin piklerin elde edileceğini gösterir.
Kolonun etkinliği
• Kolon uzunluğuna
• Kolon dolgu partiküllerinin boyutuna bağlıdır
2
2/1
54.5
W
tN r
2
16
b
r
W
tN
Tabaka ne demek?
LC Kolon uzunluğu
dp Partikül büyüklüğü
h 1 tabakanın yüksekliği
N41~Rs
p
c
dh
L41~
H
L41~R c
s
Yüksek tanaka sayısı:
• Keskin ve dar piklerin oluşmasını
• Daha iyi bir tayini
• Bileşenlerin birbirinden daha güzel ayrılmasını sağlar
Kapasite faktörü(k)
k =tr - t0
t0
æ
è ç
ö
ø ÷
Kapasite faktörü, maddelerin bağıl alıkonmasının bir ifadesidir.
Hesaplanması için maddelerin alıkonma zamanlarının yanı sıra ölü zamanın da (t0) belirlenmesi gerekir.
t0- kolonda tutunamayan maddenin alıkonma zamanını ifade eder.
Urasil, KBr gibi maddeler ölü zaman belirteci olarak kullanılabilir
Kapasite faktörünü:
• Sabit faz
• Hareketli faz etkiler.
Seçicilik (α)
Birbirini takip eden iki pik arasındaki ayrımın ifadesidir.
α=1 olduğunda iki pik birbirinden ayrılamaz ve birleşerek kolonu terk eder.
α yı etkileyen faktörler:
• Hareketli faz
• Sabit faz
• Sıcaklıktır
a Seçicilik
k1 ilk bileşene ait alıkonma zamanı
k2i ikinci bileşene ait alıkonma zamanı1
2
k
ka