KROMATOGRAFİKromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin,birisabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriylekarışmayan iki fazlı

bir sistemde ayrılması,

tanınması

ve saflaştırılması

yöntemlerinin genel adıdır.Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla,sabit fazüzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veyasürüklenmeleri esasına dayanır

Kromatografi

tekniğinin temelinde üç

ana unsur yer alır.•

Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir

"katı

destek üzerine emdirilmiş

bir sıvı tabakasından" oluşur.

•

Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur.•

Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer

alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide

"yüzey tutunması

veya

adsorpsiyon" ile "çözünürlük" gibi olgular temel etkileşim türlerini

oluştururlar.

İlk kez Rus botanikçi Mikhail

Tsvett

(1903)tarafından geliştirilen bir yöntemdir.

Tsvett

bu yöntemi bitki pigmentlerinin(klorofil A,klorofilB

ve

ksantofil)renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır.Kullandığı

kolonda renkli bandlar

oluştuğundan, bu ayırma yönteminekromatografi

adını

vermişti

Bir parça kağıt şeridin aşağı

hizasından1 cm kadar yukarısına bir damla siyahmürekkep damlatınız

Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınızkısım su hizasının üstünde kalacakşekilde su tankına batırınız ve dik birşekilde tutunuz. Su,kapiler

etkisiyle

kağıt üzerinde yukarı

doğru yürürkenmürekkebi çözer ve sürüklemeyebaşlar. Mürekkebin içindeki bileşenlerkağıt üzerinde farklı

hızlarda ilerleyerek

ayrılmış

olur.

Kromatografi

‘nin

Sınıflandırılması

1-Uygulama Biçimine Göre2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre3-Faz Tiplerine Göre

1-Uygulama Biçimine Göre

-

Düzlemsel kromatografiKağıt kromatografisiİnce tabaka kromatografisi

(TLC)

-Kolon kromatografisiGaz kromatografisi

(GC)

Yüksek basınçlı

sıvı

kromatografisi

(HPLC) Süperkritik

akışkan kromatografisi

2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre

•

Adsorpsiyon

kromatografisi•

Dağılma kromatografisi

•

İyon değiştirme kromatografisi•

Jel filtrasyon

(Moleküler eleme)

kromatografisi•

İyon çifti kromatografisi

•

Afinite

kromatografisi

3-Faz Tiplerine Göre

-Sıvı

kromatografisiSıvı-Katı

kromatografisi

Sıvı-Sıvı

kromatografisi-Gaz kromatografisi

Gaz-Katı

kromatografisiGaz-Sıvı

kromatografisi

KOLON KROMATOGRAFİSİ

depo(tampon)

sabit faz(katı

porlu matriks)

mobil faz(tampon)

elüent

Proteinkarışımı

•Kolon

kromatografisi:biyomoleküllerinsaflaştırılmasında sıklıkla kullanılır

•Kolon, biyomolekülleri

seçici adsorblayan

bir maddeyle (katı

porlu

matriks) doldurulur SABİT FAZ•biyomolekül

karışımı

kolona tatbik

edilir HAREKETLİ FAZ•Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile

yıkanan kolon tarafından,adsorbe

edilmeyenler önce

adsorbe

edilenler daha geçkolonu terkeder.

Başlıca katı

dolgu maddeleri

(hareketsiz faz) şunlardır:•

Silika jel: Genellikle nötür

ve asidik yapıdaki bileşikler

için uygundur.•

Alumina: Genellikle nötür

ve bazik yapıdaki bileşikler

için uygundur.•

Sellüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur.Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; Sikloheksan, Kloroform (kansorojen), Metanol, Petrol eter, Metilen klorür, Etanol, Benzen(kansorojen), Etil asetat, Aseton, Toluen, Dietil

eter, Karbon

tetraklorür(kansorojen), n-Butanol

İzopropanol olabilir.

1903 yılında Tsvet

bitki pigmentleriyle çalışırkenkolon dolgu maddesi olarak kireç

kullanmıştı.

Günümüzde ise çoğunlukla silika jel

ve aluminakullanılmaktadır.

Kolon Kromatografi

TipleriKolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyonmetoduna göre gruplandırılır:

i.Jel filtrasyonu büyüklükii.İyon değişim yükiii.Affinite (bağlanma)

i.Jel Filtrasyon KromatografiKarışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması

esasına dayanır

•Kolon, jel boncuklar(belli büyüklüğe sahip ve karışımdaki bileşenlerle etkileşmeyen bir madde) ile doldurulur katı matriks•Biyomolekül

karışımını

içeren tampon, kolondan geçirilir

Küçük moleküller,jel boncuklar arasındakiboşluklara girer,kolondan geç

çıkarlar.

Büyük moleküller,jel boncuklar arasındakiboşluklara giremez ve kolondan hızlı

bir

biçimde sürüklenerek önce çıkarlar.

Kromatografik

ayırma sırasında bozunması

veya degişikliğeuğraması

istenmeyen protein ya da enzim gibi biyolojik

moleküllerin birbirinden ayrılması

için kullanılır.Bu yöntem ile polimerlerin molekül ağırlığı

dağılımı

da tayin

edilebilir

•Avantaj Büyük miktarda

:

biyomolekül karışımı

saflaştırılabilir

•Dezavantaj: Yavaş

ayırım

ii.İyon exchange

(değiş-tokuş)Kromatografi

Maddelerin iyonik grupları

ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı

yer değiştirmesi

esasına dayanır

İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına göre sırasıyla anyon değiştirme

kromatografisi

veya katyon değiştirme kromatografisi

olarakadlandırılır.Anyon değiştirme kromatografisinde,kolon içindeki sabit tabaka olan matrixe

kovalent

bağlı

iyonlar pozitif yüklüdür,bu

iyonlar kolondan geçirilen çözeltideki anyonları

kendine çeker,çözeltideki anyonlar ayrılır,sadece katyonlar ortamdan çıkar.Katyon değiştirme kromatografisinde

ise,benzer sistemle

çözeltideki katyonlar ayrılır,anyonlar ortamdan çıkar.

Cl-

ve I-

karışımının nitrat bağlanmış

anyon

değiştirici RNO3

ile bileşenlerine ayrılmasındageçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir:

Cl-

+ RNO3

RCl

+ NO3

I-

+ RNO3

RI + NO3

R: Çözünmeyen Matriks RNO3

: Anyon Değiştirici

AnyonDeğiştirici

I

Cl-

İyon değiştirmeyi etkileyen faktörlerHareketli faz derişimiHareketli faz pH’sıKompleks oluşturucu etki

İyon değiştirme kromatografisinin

uygulanmasıAyrılmaları

güç

olan bazı

iyonları

ve asitlerin

AminoasitlerSeyreltik iyon çözeltileri deriştirmedeAsit ve baz elde edilmesinde

NaCl↔NaOH

+ Cl

iii.Affinite

KromatografisiEnzim, hormon,vb spesifik proteinlerin

saflaştırılmasında kullanılır.Kolonun dolgu maddesine,(dekstran, poliakrilamid, selüloz vb)spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır:

Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı

desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler.Bağlı

protein, daha sonra, pH

değişikliği / tuz çözeltileri

veya ligand

ilavesiyle kolondan elüe

edilir

Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir.

Antijen –

Antikor Enzim –

Substrat

Reseptör–

İlaç

gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır.

Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir.

Kolon Kromatografisi

b)Yüksek Basınçlı

Sıvı

Kromatografi(HPLC)

a)Gaz Kromatografi(GC)

a)

Gaz kromatografisiGC

Bir karışımda gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen bileşenlerin birbirinden ayrılması

amacıyla gaz kromatografisi

yöntemi kullanılır. Bu yöntemde ayrılma, bileşenlerin farklı

katı

yüzeylerdeki farklı

adsorpsiyon

ilgilerine göre gerçekleşir. Numunede bulunan bileşenler bir cihazla spektrum haline getirilir ve bu spektrumda bulunan her pik ayrı

bir bileşeni gösterir.

Hareketli faz olarak helyum, azot veya argon gibi inert

bir gaz kullanılır ve bu gaza taşıyıcı

gaz adı

verilir. Kolon içinde kullanılan sabit faz; silika,

alumina

veya karbon gibi bir katı

ise yöntem, gaz-katı

kromatografisi

adını alır. Eğer sabit faz kiezelguhr

gibi inert

katı

bir dolgu maddesi üzerine

tutturulmus

uçucu olmayan bir sıvı

film ise yöntem gaz-sıvı

kromatografisi adını

alır. Bu şekilde kullanılan kolonlara dolgulu kolonlar

denilir.

Gaz kromatografisi

yönteminde kolonlar 2-10 mm iç

çapında ve 1-5 m boyundadır. Fakat inert

bir katı

dolgu maddesi üzerine uçucu olmayan bir

sıvı

kaplanması

yerine, bu sıvı

filminin doğrudan ince bir cam veya silika kapiler

borunun iç

yüzeyine tutundurulmasi

ile 0.2-0.5 mm iç

çapinda

ve

10-50 m gibi çok uzun kapiler

kolonların kullanılması

mümkün olabilir. Bu nedenle kapiler

kolonların verimliligi

ve ayırıcılığı, dolgulu kolonlara oranla

çok daha iyidir.

Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması

için ısıtılan bir bölme vardır. Hemen ardından sıcaklığı

programlanabilen bir fırın içine

yerleştirilmiş

olan kolon gelmektedir. Sıvı

örnekler bir şırıngayla bir septumdan

giriş

kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına yerleştirilen bir

dedektörden

sinyal izlenir ve bir integratör

ile kaydedilir.

Gaz kromatografisi

yönteminde incelenebilen maddeler için belli sıcaklıktaki alıkonma sürelerinin birbirinden farklı

olmasından yararlanarak

nitel analiz

yapılabilir.Bir maddenin alıkonulma süresi, belli bir kolon için, belli sıcaklıkta ve belli taşıyıcı

gaz akış

hızında sabit bir değerdir. Bu

sebeple de,bir iç

standart maddesinin analiz örneğine eklenmesi ve sonuçların bu maddeye bağlı

olarak belirtilmesi daha çok tercih edilen bir

yoldur.Gaz kromatografisi

yönteminde nicel analiz

ise kromatogramdaki

piklerin altlarında kalan alanların hesaplanması

ile veya pik yüksekliğinin ölçülmesi ile yapılır.Örneğin, enjekte ettigimiz

bir karışımda baslangıçta

eşit miktarlarda A ve B bilesenlerinin

olduğunu varsaydığımız bir durumda, kromatogramda

bu bilesenlere

ait piklerin altında kalan alanlar

da birbirine eşit olacaktır.

Bir bileşen kolondan ne kadar erken çıkarsa, o bileşene ait pik de o kadar keskin elde edilirken, kolondan geç

çıkan

bileşenlere ait pikler ise geniş

ve yayvan olarak elde edilmektedir. Bu ise istenmeyen bir durumdur. Bu durumu önlemek için sıcaklık programlaması

yöntemi

uygulanır.

Baslangıçta

kolon sıcaklığı

düşük tutulur ve zamanla doğrusal bir biçimde arttırılır.

b)

Yüksek basınçlı

sıvı

kromatografisiHPLC

Sıvı

kromatografi

bir ayırma tekniğidir. Bir sıvıda çözünmüş

ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı

bir destek üzerindeki

sabit faz ile farklı

etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler. Kolonu değişik zamanlarda terkederler

ve böylece birbirlerinden

ayrılırlar. Burada taşıyıcı

faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış

hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak

gerçekleşmektedir. Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle

tesbit

edilip miktarıyla orantılı

olarak kaydedilir. Yüksek hızda

gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı

sıvı

kromatografi

sistemlerine, Yüksek Basınç

Sıvı

Kromatografi

(HPSC)

denir

Normal Faz Sıvı

Kromatografisi:

Polar sabit faz ve apolar

veya düşük polariteye sahip hareketli faz

Ters Faz Sıvı

Kromatografisi:

Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardır

Ters faz kromatografisinin

avantajları

1. Normal faz kromatografide, sıvı

fazın kontrolü

çok önemli ve kritiktir.Hareketli faz bileşimindeki küçük değişiklikler kromatogramda

belirgin farklılıklara neden olabilir.

2. Dengeye ulaşma normal faz kromatografide

çok yavaştır.

3. Normal faz kromatografide

polar maddelerin elüsyonu çok yavaştır ve yayvan piklere sebep olu

4. Apolar

çözücüler çok pahalıdır, ayrıca nemden uzak tutmak zordur.

•

HPLC kolonu, rejenerasyon

gerekmeksizin pek çok kezkullanılabilir.

•

HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır vetekrarlanabilirlik daha yüksektir.

•

Nicel analiz kullanılabilir.

•

Analiz süresi kısadır.

•

Duyarlık yüksektir.

HPLC’nin

avantajları