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目的
蛋白质混合物的靶向定量分析需要将蛋白
质酶解与准确定量蛋白质的策略相结合,
以获得特异性高、灵敏度高、动态范围宽、
重现性和稳定性出色的结果。Xevo® TQ-S系
统在仪器性能方面表现卓越,能够使用稳
定同位素肽作为内标实现高准确和高灵敏
的蛋白质定量。
背景
蛋白质生物标志物验证/确认的初期和后
期阶段,基于多反应监测(MRM)/单反应监
测(SRM)的定量分析方法比基于生物化学
的蛋白质定量方法(例如ELISA)具有更快的
分析速度和更低的成本优势,因而被认为
是更具有吸引力的替代方法。此类研究对
LC/MS系统有着极高的性能要求,即必须需
要最高的灵敏度、特异性、分析速度,以
及稳定性,能够对样品中的目标蛋白质进
行定量的分析。正因如此,技术改进不可
或缺。本文介绍了Xevo TQ-S和TRIZAIC UPLC®
系统的应用,还介绍了定量分析福尔马林
固定石蜡包埋的胎盘样本中与子痫前症相
关的calcyclin定量的结果。�
利用Xevo TQ-S以最高特异性和灵敏度检测和
定量潜在的蛋白质生物标志物。
利用AQUA稳定同位素和化学等价内标实现生物标志物的MRM绝对定量
解决方案
本文研究了使用AQUA稳定同位素和化学等价内标对溶液、合成基质和
福尔马林固定石蜡包埋组织样品中的蛋白质进行定量分析的适用性。
本文还通过实验研究了检测限(LOD),所用的样品是向合成基质中加标
氨基酸序列中间额外插入了一个甘氨酸的钙周期素肽。利用AQUA稳定
同位素肽作为内标测定了MRM分析的线性和蛋白质浓度。基于Waters®
TRIZAIC UPLC系统,nanoTile™技术与Xevo TQ-S质谱仪进行肽段的分离和定量。
采集数据时采用时间设定的MRM采集模式并由TargetLynx™应用软件进行
定量分析。
技术简报
图1.LQDAEIAR、插入了甘氨酸的化学等价LQDAGEIAR和AQUA标准品LQDAEIAR-13C6,15N4的碎片离子谱图。
*MRM定量的候选碎片离子。
图1展示了MRM定量的候选Calcyclin肽段碎片例
子之一以及两种可能的内标等价物的碎片离
子谱图。插入了甘氨酸的化学合成等价物表
现出与目标内源性肽相似的电离、碎裂和色
谱特性。我们将内源性肽段标准品加入至合
成基质中,用以评价MRM分析的检测限,结果
表明可实现低至埃摩尔级的柱上定量,如图2
所示。
图3展示了其中一条AQUA稳定同位素肽段的MRM定量曲线,其线性定量
动态范围覆盖了四个以上数量级。为测定Calcyclin的水平,将两种稳定
同位素AQUA肽段加入至约300个显微切割的滋养细胞和基质细胞的酶解
物中。图3显示了内源性肽及对应的AQUA稳定同位素重标肽的MRM通道。
含量测定结果为每个滋养细胞和基质细胞分别含约0.3埃摩尔和7.0埃摩
尔,证实了此前报道的结果1。
总结
本文展示了使用AQUA稳定同位素和化学等价肽段对凝聚素分子进行的
绝对定量的方法(凝聚素是检测福尔马林固定石蜡包埋子痫前症胎盘样
本的一种潜在生物标志物)。由于灵敏度更高,Xevo TQ-S能够对数量更
少的显微切割胎盘细胞中的calcyclin肽段进行检测和定量1。目前,采用
大规模患者实验组对血浆凝聚素分子进行MRM验证的研究正在进行中。
参考文献
1. Güzel C, Ursem NT, Dekker LJ, Derkx P, Joore J, van Dijk E, Ligtvoet G, Steegers EA, Luider TM. Multiple reaction monitoring assay for pre-eclampsia related calcyclin peptides in formalin fixed paraffin embedded placenta. J Proteome Res. 2011;10(7):3274-82.
图2. 分析合成基质和空白基质中加标2.5埃摩尔LQDAEIAR的样品所得的三个MRM通道(458.2 > 559.3,458.2 > 674.3和458.2 > 802.4)的总离子流谱图。
图3. LQDAEIAR-13C6 ,15N4的MRM校准曲线和回归曲线指标,柱上进样量为0.5埃摩尔至5.0埃摩尔。插图展示了分析大约300个滋养细胞的酶解物时,LQDAEIAR和LQDAEIAR-13C6 ,15N4的当前transition的总离子流图。
技术简报
Waters、Xevo和TRIZAIC UPLC是沃特世公司的注册商标。The Science of What's Possible、nanoTile和TargetLynx是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。
©2011年 沃特世公司。中国印刷2011年11月 720004155ZH AO-PDF
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