28

ผลและวิจารณการทดลอง

1. ปริมาณและลักษณะของสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิม

จากการนําสารสกัดจากเปลือกทับทิมทั้งแหงและสด ชนิดละ 300 กรัม และใชตัวทําละลายอินทรีย 4 ชนิดคือ น้ํา เอทานอล 95 % เฮกเซน และ ไดคลอโรมีเทน ชนิดละ 600 มิลลิลิตร แชเปลือกทับทิม แลวนําเขาเครื่องเหวี่ยง ที่ความเร็ว 4,000 รอบ/นาที นาน 5 นาที กอนนําไปกรองแลวระเหยออกดวยเครื่องกลั่นระเหยสุญญากาศ (rotary vacuum evaporator) จนไดสารสกัดหยาบที่มีลักษณะขนเหนียว มีสีตางกัน และปริมาณตางกันดังตารางที่1-2

สารสกัดจากเปลือกทับทิมแหงตารางที่ 1 แสดงปริมาณ น้ําหนัก และสีของสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิมแหง

ตัวทําละลายขอมูลน้ํากลั่น Ethanol 95 % Dichloromethane Hexane

สีของสารสกัดหยาบ สีน้ําตาล สีน้ําตาล สีเขียว สีเขียวน้ําหนักสารสกัดหยาบ(กรัม) 35.10 25.25 17.15 17.45%สารสกัดหยาบ 11.70% 8.41% 5.71% 5.81%

สารสกัดจากเปลือกทับทิมสดตารางที่ 2 แสดงปริมาณ น้ําหนัก และสีของสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิมสด

ตัวทําละลายขอมูลน้ํากลั่น Ethanol 95 % Dichloromethane Hexane

สีของสารสกัดหยาบ สีน้ําตาล สีน้ําตาล สีเขียว สีเขียวน้ําหนักสารสกัดหยาบ(กรัม) 30.10 28.85 15.50 14.45%สารสกัดหยาบ 10.03% 9.61% 5.16% 4.81%

สูตรการคํานวณ %สารสกัดหยาบ = (กรัม)อยางพืชน้ําหนักตัว

(กรัม)บสารสกัดหยาน้ําหนักของ x 100

29

จากตารางที่ 1-2 พบวา สารที่สกัดดวยตัวทําลายลายมีขั้วจะมีลักษณะ เหนียวหนืดและมีสีน้ําตาล สวนสารที่สกัดดวยตัวทําละลายไมมีขั้วจะมีลักษณะ ไมเหนียวหนืด และมีสี เขียว ทั้งในเปลือกทับทิมสดและแหง สวนน้ําหนักสารสกัดหยาบที่ชั่งได สารสกัดที่สกัดดวยตัวทําละลายมีขั้ว จะมีปริมาณเนื้อสารมากกวาสารสกัดหยาบ ที่สกัดดวยตัวทําละลายไมมีขั้ว และพบวาปริมาณสารที่ไดจากการสกัดหยาบ จากเปลือกทับทิมแหง จะมีปริมาณเนื้อสารมากกวา จากการสกัดหยาบจากเปลือกทับทิมสด โดยไดจากการคํานวณ สรุปปริมาณเนื้อสารที่ไดจากการสกัดหยาบจากเปลือกทับทิม โดยสกัดดวยน้ํามีเนื้อสารมากกวาเอทานอล ไดคลอโรมีเทน และ เฮกเซน ตามลําดับ

2. การทดสอบฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียของสารสกัดหยาบจากเปลือก ทับทิม โดยวิธี disc agar diffusion method

การทดสอบฤทธิ์การยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย จากสารละลายสารสกัดหยาบที่สกัดไดจากเปลือกทับทิมสดและเปลือกทับทิมแหง มาละลายในตัวทํา ละลายอินทรียชนิดเดียวกันกับที่ใชในสารสกัด เพื่อเจือจางใหไดความเขมขนที่ตอง การคือ อัตราสวน 1:10 , อัตราสวน 1:100 และ อัตราสวน 1:1000 แลวนํามาทดสอบฤทธิ์การ ยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรีย ดวยวิธี disc agar diffusion method โดยทดสอบกับเชื้อ แบคทีเรียทั้ง 2 ชนิด คือ Streptococcus aureus และ Aeromonas hydrophila ไดผลการทดสอบดังตารางที่ 3-4

30

ตารางที่ 3 แสดงฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียของสารสกัดหยาบจากเปลือก ทับทิมแหงโดยวิธี disc agar diffusion method

ฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรีย (inhibition zone)

ความเขมขนสารละลายของสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิม

ตัวทําละลายอินทรีย

เชื้อจุลินทรีย

1:10 1:100 1:1000

control

S.aureus ++ + - -น้ํากลั่น

A.hydrophila - - - -S.aureus +++ + - -

เอทานอล 95%A.hydrophila - - - -

S.aureus - - - -ไดคลอโรมีเทน

A.hydrophila - - - -S.aureus - - - -

เฮกเซนA.hydrophila - - - -

หมายเหตุ 1. – หมายถึง ไมเกิด inhibition zone 2. + หมายถึง เกิด inhibition zone เล็กนอย

3. ++ หมายถึง เกิด inhibition zone ปานกลาง 4. +++ หมายถึง เกิด inhibition zone มาก

31

ตารางที่ 4 แสดงฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียของสารสกัดหยาบจากเปลือก ทับทิมสด โดยวิธี disc agar diffusion method

ฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรีย (inhibition zone)

ความเขมขนสารละลายของสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิม

ตัวทําละลายอินทรีย

เชื้อจุลินทรีย

1:10 1:100 1:1000

control

S.aureus + + - -น้ํากลั่น

A.hydrophila + - - -S.aureus +++ - - -

เอทานอล 95%A.hydrophila ++ - - -

S.aureus - - - -ไดคลอโรมีเทน

A.hydrophila - - - -S.aureus - - - -

เฮกเซนA.hydrophila - - - -

หมายเหตุ 1. – หมายถึง ไมเกิด inhibition zone 2. + หมายถึง เกิด inhibition zone เล็กนอย

3. ++ หมายถึง เกิด inhibition zone ปานกลาง 4. +++ หมายถึง เกิด inhibition zone มาก

จากตารางที่ 3-4 การทดสอบฤทธิ์การยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ Streptococcusaureus และ Aeromonas hydrophila ของสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิมสดและเปลือกทับทิมแหง ดวยวิธี disc agar diffusion method โดยสังเกตการเกิดวงใส (inhibition zone) พบวาสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิมแหงในอัตราสวนความเขมขน 1:10 และ 1:100 ของสารสกัดหยาบที่มีตัวทําละลายเปน น้ํากลั่น และ เอทานอล จะเกิด inhibition zone โดยเชื้อที่สารออกฤทธิ์คือ เชื้อ Streptococcus aureus และในสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิมสดในอัตราสวนความเขมขน 1:10 และ 1:100 ของสารสกัดหยาบที่มีตัวทําละลายเปน น้ํา

32

กลั่น และ เอทานอล จะเกิด inhibition zone โดยเชื้อที่สารออกฤทธิ์คือ เชื้อ Streptococcusaureus สวนในเชื้อ Aeromonas hydrophila สารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิมสดในอัตราสวนความเขมขน 1:10 ของสารสกัดหยาบที่มีตัวทําละลายเปน น้ํากลั่น และ เอทานอล ก็จะเกิด inhibition zone

3. ปริมาณและลักษณะของสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิม Column Chromatography

จากการศึกษาวิธีการสกัดดวยวิธีการสกัดแบบละเอียด ดวยวิธี Column Chromatography จากสารสกัดหยาบ จากเปลือกทับทิมที่สกัดดวยตัวทําละลายที่มีการยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียไดดีที่สุดคือ สารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิมแหง ที่ใช เอทานอล 95% ในการสกัด โดยตัวชะที่ใชคือ เมทานอล : เอทิลอะซิเตดในอัตราสวน 2:1 พบวาเมื่อสารสกัดหยาบผานซิลิกาเจลภายในคอลัมน เวลาประมาณ 1 ชั่วโมงครึ่ง เก็บได 30 หลอดทดลองโดย 3 หลอดสุดทายไดทําการเติมน้ําเปนตัวชะแทน เมทานอล : เอทิลอะซิเตด ในอัตราสวน 2:1 พบวาสารสกัดหยาบจะเกิดการแยกชั้นๆเปนสารสกัดละเอียดที่มีสีแตกตางกันภายในคอลัมน โดยดานลางจะมีสีน้ําตาลเขม สวนดานบนจะมีสีเหลืองออน

จากนั้นนําหลอดทดลองที่เก็บสารสกัดละเอียดในแตละหลอดทดลองมารวมกันได 10 ลําดับ โดย 3 หลอดทดลองรวมกันเปน 1 ลําดับ จากนั้นนํามาทําการระเหยดวยเครื่องกลั่นระเหยสุญญากาศ (rotary vacuum evaporatory) เพื่อใหสารสกัดที่ไดมีความเขมขนมากขึ้น จากนั้นนํามาเก็บไวในขวด (vial) โดยแตละขวดมีสีที่แตกตางกัน

ภาพที่11 สารสกัดละเอียดแตละลําดับที่ไดจากการแยกสารดวยวิธี Column Chromatography

33

4. การทดสอบฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียของสารสกัดละเอียดจากเปลือก ทับทิม โดย วิธี disc agar diffusion method

จากการสกัดละเอียดจากเปลือกทับทิม ดวยวิธี Column Chromatography จากขอ 3 ซึ่งไดสารสกัดละเอียดทั้งหมด 7 ลําดับ แลวนํามาทดสอบฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียที่ถูกสารสกัดหยาบจากเปลือกทับทิมยับยั้งการเจริญเติบโต คือ เชื้อ Streptococcus aureus และเชื้อ Aeromonas hydrophila ดวยวิธี disc agar diffusion method ไดผลการทดสอบเชื้อดังตารางที่ 5-6

ตารางที่ 5 แสดงฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อ Streptococcus aureus ดวยสารสกัด ละเอียดดวยวิธี Column Chromatography จากเปลือกทับทิมแหง จากสารสกัด หยาบที่ใช เอทานอล95% เปนตัวทําละลาย โดยวิธี disc agar diffusion method

ฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรีย (inhibition zone)ลําดับของสารสกัดครั้งที่1 ครั้งที่2 เฉลี่ย

1 ++ ++ +2 +++ +++ +3 + + +4 - - -5 + + +6 - - -7 - - -8 + + +9 - - -

10 - - -control - - -

หมายเหตุ 1. – หมายถึง ไมเกิด inhibition zone 2. + หมายถึง เกิด inhibition zone เล็กนอย

3. ++ หมายถึง เกิด inhibition zone ปานกลาง 4. +++ หมายถึง เกิด inhibition zone มาก

34

ภาพที่12 แสดงฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อ Streptococcus aureus ดวยสารสกัดละเอียด ดวยวิธี Column Chromatography จากเปลือกทับทิมแหง จากสารสกัดหยาบที่ใช เอทานอล 95% เปนตัวทําละลาย โดยวิธี disc agar diffusion method (ลําดับที่1-5)

ภาพที่13 แสดงฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อ Streptococcus aureus ดวยสารสกัด ละเอียดดวยวิธี Column Chromatography จากเปลือกทับทิมแหง จากสาร สกัดหยาบที่ใช เอทานอล 95% เปนตัวทําละลาย โดยวิธี disc agar diffusion method (ลําดับที่ 6-10)

6

7

8 9

10 c

6

7

8 9

10

c

1

2

3 4

5

1

2

3 4

5 c c

35

ตารางที่ 6 แสดงฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อ Aeromonas hydrophila ดวยสารสกัด ละเอียดดวยวิธี Column Chromatography จากเปลือกทับทิมแหง จากสารสกัด หยาบที่ใช เอทานอล 95% เปนตัวทําละลาย โดยวิธี disc agar diffusion method

ฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรีย (inhibition zone)ลําดับของสารสกัดครั้งที่1 ครั้งที่2 เฉลี่ย

1 + + +2 + + +3 + + +4 - - -5 - - -6 - - -7 - - -8 - - -9 - - -

10 - - -control - - -

หมายเหตุ 1. – หมายถึง ไมเกิด inhibition zone 2. + หมายถึง เกิด inhibition zone เล็กนอย

3. ++ หมายถึง เกิด inhibition zone ปานกลาง 4. +++ หมายถึง เกิด inhibition zone มาก

36

ภาพที่14 แสดงฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อ Aeromonas hydrophila ดวยสารสกัด ละเอียดดวยวิธี Column Chromatography จากเปลือกทับทิมแหง จากสารสกัด หยาบที่ใช เอทานอล 95% เปนตัวทําละลาย โดยวิธี disc agar diffusion method (ลําดับที่ 1-5)

ภาพที่15 แสดงฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อ Aeromonas hydrophila ดวยสารสกัด ละเอียดดวยวิธี Column Chromatography จากเปลือกทับทิมแหง จากสารสกัด หยาบที่ใช เอทานอล 95% เปนตัวทําละลาย โดยวิธี disc agar diffusion method (ลําดับที่ 6-10)

1

6 6

1

2 2

3 3

4 4

5 5

7 7

8 8

9 9

10 10

c c

c c

37

จากตารางที่ 5-6 การทดสอบฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อ Streptococcus aureus และ Aeromonas hydrophila ดวยวิธี disc agar diffusion method โดยสังเกตการณเกิดวงใส (inhibition zone) โดยเปรียบเทียบเสนผานศูนยกลางของ inhibition zone ปรากฏวา ในเชื้อ Streptococcus aureus มีการเกิด inhibition zone ในลําดับที่ 1, 2 ,3 ,5 และ 8 โดยมีเสนผานศูนยกลางเฉลี่ยตามลําดับดังตอไปนี้ 1.30, 1.72, 0.92, 0.80 และ 0.80 เซนติเมตรในเชื้อ Aeromonas hydrophila มีการเกิด inhibition zone เล็กนอยมาก ในลําดับที่ 1, 2และ 3 จึงถือวาไมมีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรีย

5. ทําการเปรียบเทียบความสามารถในการออกฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อ Streptococcus aureus ของสารสกัดละเอียดจากเปลือกทับทิม โดยวิธี disc agar diffusion method ในลําดับที่ 1, 2 ,3 ,5 และ 8

ทําการทดลองซ้ําในลําดับที่มีการออกฤทธิ์ การยับยั้งเชื้อจุลินทรียในตารางที่ 5 เพื่อบอกความสามารถในการออกฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อ Streptococcus aureusของสารสกัดละเอียดจากเปลือกทับทิม โดยวิธี disc agar diffusion method

38

ตารางที่7 เปรียบเทียบความสามารถในลําดับที่มีการออกฤทธิ์การยับยั้งการ เจริญของเชื้อ Streptococcus aureus ของสารสกัดละเอียดจากเปลือกทับทิม โดยวิธี disc agar diffusion method ในfraction ที่ 1, 2 ,3 ,5 และ 8

เสนผานศูนยกลางบริเวณเชื้อที่ไมเจริญ (inhibition zone) (ซ.ม.)ลําดับของสารสกัดครั้งที่1 ครั้งที่2 เฉลี่ย

1 1.10 1.12 1.112 1.50 1.54 1.523 0.70 0.70 0.705 0.70 0.60 0.658 0.60 0.70 0.65

control 0.60 0.60 0.60

หมายเหตุ เสนผานศูนยกลางของ paper disc = 0.60 เซนติเมตร

ภาพที่16 เปรียบเทียบความสามารถในลําดับที่มีการออกฤทธิ์การยับยั้งการ เจริญของเชื้อ Streptococcus aureus ของสารสกัดละเอียดจากเปลือกทับทิม โดยวิธี disc agar diffusion method ในลําดับที่ 1, 2 ,3 ,5 และ 8

1 1

2 2

3 3 5 5

8 8 c c

39

6. จากการวิเคราะหดวยเครื่อง UV-VIS Spectrophotometerจากการนําสารที่สกัดดวยวิธี Column Chromatography โดยทําการวิเคราะห 5

ลําดับคือ 1, 2, 3, 5 และ 8 โดยมีตัวทําละลายเปน เมทานอล กับ เอทิลอะซิเตดในอัตราสวน 2:1 พบวาสารสกัดละเอียดเปนสารสกัดผสม โดยพิจารณาจากลักษณะพีคของสารสกัดที่มีความยาวคลื่นแสงสูงหลายคา ในชวงความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร

ภาพที่17 สเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดลําดับที่ 1 ความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตรจากสเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดจากวิธี Column Chromatography ลําดับที่

1 โดยวิธี UV-VIS Spectrophotometer พบวาพีคของสารสกัดละเอียด ลําดับที่ 1 มีความยาวคลื่นสูงสุดอยูในชวงความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร เมื่อพิจารณาจากลักษณะของพีค พบวาคาการดูดกลืนแสงสูงที่สุดมีความยาวคลื่น 307 นาโนเมตร

40

ภาพที่18 สเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดลําดับที่ 2 ความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร

จากสเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดจากวิธี Column Chromatography ลําดับที่ 1 โดยวิธี UV-VIS Spectrophotometer พบวาพีคของสารสกัดละเอียด ลําดับที่ 2 มีความยาวคลื่นสูงสุดอยูในชวงความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร เมื่อพิจารณาจากลักษณะของพีค พบวาคาการดูดกลืนแสงสูงที่สุดมีความยาวคลื่น 297 นาโนเมตร

41

ภาพที่19 สเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดลําดับที่ 3 ความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร

จากสเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดจากวิธี Column Chromatography ลําดับที่ 1 โดยวิธี UV-VIS Spectrophotometer พบวาพีคของสารสกัดละเอียด ลําดับที่ 3 มีความยาวคลื่นสูงสุดอยูในชวงความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร เมื่อพิจารณาจากลักษณะของพีค พบวาคาการดูดกลืนแสงสูงที่สุดมีความยาวคลื่น 297 นาโนเมตร

42

ภาพที่20 สเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดลําดับที่ 5 ความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร

จากสเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดจากวิธี Column Chromatography ลําดับที่ 1 โดยวิธี UV-VIS Spectrophotometer พบวาพีคของสารสกัดละเอียด ลําดับที่ 5 มีความยาวคลื่นสูงสุดอยูในชวงความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร เมื่อพิจารณาจากลักษณะของพีค พบวาคาการดูดกลืนแสงสูงที่สุดมีความยาวคลื่น 297 นาโนเมตร

43

ภาพที่21 สเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดลําดับที่ 8 ความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร

จากสเปกโตแกรมของสารสกัดละเอียดจากวิธี Column Chromatography ลําดับที่ 1 โดยวิธี UV-VIS Spectrophotometer พบวาพีคของสารสกัดละเอียด ลําดับที่ 8 มีความยาวคลื่นสูงสุดอยูในชวงความยาวคลื่น 200-700 นาโนเมตร เมื่อพิจารณาจากลักษณะของพีค พบวาคาการดูดกลืนแสงสูงที่สุดมีความยาวคลื่น 297 นาโนเมตร

44

7. จากการวิเคราะหดวยเครื่อง Gas Chromatographyจากการนําสารที่สกัดดวยวิธี Column Chromatography โดยทําการวิเคราะห

5 ลําดับคือ 1, 2, 3, 5 และ 8 โดยมีตัวทําละลายเปน เมทานอล กับ เอทิลอะซิเตด ในอัตราสวน 2:1 พบวาสารสกัดละเอียดเปนสารสกัดผสม โดยพิจารณาจากลักษณะพีค ของสารสกัดที่มี retention time ตางกันเมื่อเทียบกับ retention time ของตัวทําละลาย

ภาพที่ 22 แสดง retention time ของตัวทําละลายตางๆ คือ เมทานอล เอทานอล เฮกเซน และ เอทิลอะซิเตด

พีคแรก มีคา retention time 5.36 เปนสารเมทานอลพีคสอง มีคา retention time 6.34 เปนสารเอทานอลพีคสาม มีคา retention time 7.90 เปนสารเฮกเซนพีคสี่ มีคา retention time 9.21 เปนสารเอทิลอะซิเตด

45

ภาพที่ 23 แสดง retention time ของสารสกัดละเอียดในลําดับที่ 1

พีคแรก มีคา retention time 5.15 เปนสารเมทานอลพีคสอง มีคา retention time 7.23 เปนสารเอทานอลพีคสาม มีคา retention time 9.64 เปนสารเอทิลอะซิเตด

46

ภาพที่ 24 แสดง retention time ของสารสกัดละเอียดในลําดับที่ 2

พีคแรก มีคา retention time 5.13 เปนสารเมทานอลพีคสอง มีคา retention time 6.92 เปนสารเอทานอลพีคสาม มีคา retention time 9.31 เปนสารเอทิลอะซิเตดพีคสี่ มีคา retention time 10.33 เปนสาร unknown 1พีคหา มีคา retention time 18.87 เปนสาร unknown 2

47

ภาพที่ 25 แสดง retention time ของสารสกัดละเอียดในลําดับที่ 3

พีคแรก มีคา retention time 5.04 เปนสารเมทานอลพีคสอง มีคา retention time 6.98 เปนสารเอทานอลพีคสาม มีคา retention time 9.17 เปนสารเอทิลอะซิเตดพีคสี่ มีคา retention time 10.34 เปนสาร unknown 1

48

ภาพที่ 26 แสดง retention time ของสารสกัดละเอียดในลําดับที่ 5

พีคแรก มีคา retention time 4.94 เปนสารเมทานอลพีคสอง มีคา retention time 6.95 เปนสารเอทานอลพีคสาม มีคา retention time 9.02 เปนสารเอทิลอะซิเตด

49

ภาพที่ 27 แสดง retention time ของสารสกัดละเอียดในลําดับที่ 8

พีคแรก มีคา retention time 5.06 เปนสารเมทานอลพีคสอง มีคา retention time 7.00 เปนสารเอทานอลพีคสาม มีคา retention time 9.09 เปนสารเอทิลอะซิเตด