„Prototipuri pentru un biopesticid si un produs antimicotic pe baza de biocomplexe vegetale obtinute prin biotehnologii superioare de exploatare a speciilor

de Solanum si Camelina sativa”

REALIZARI TEHNOLOGICE SI STIINTIFICE

PROIECT 21 PTE – BIOCAMISOL

Contract: 21 PTE/2016, Cod Depunere: PN-III-P2-2.1-PTE-2016-0166 Parteneriat:

1. BIOTEHNOS SA - CO 2. ASOCIATIA "CENTRUL DE BIOTEHNOLOGII MICROBIENE" – BIOTEHGEN – P1 3. UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRONOMICE SI MEDICINA VETERINARA – P2

Perioada de derulare a proiectului: 2016-2018

Conceptul proiectului

Valorificarea superioara a unor culturi agricole autohtone de camelina si specii din familia Solanaceae in scopul obtinerii a 2 prototipuri cu aplicabilitate in tratamentul antifungic si antibacterian

OBIECTIVE PREVAZUTE / REALIZATE

Obiectivele principale prevazute: a) validare/standardizare biotehnologii de obtinere a uleiului de camelina; b) validare/standardizare biotehnologii de obtinere a glicoalcaloizilor steroidici din specii de Solanum; c) validarea asocierii componentelor active in scopul obtinerii unor biocomplexe cu activitate antimicrobiana complementarizata cu efecte antioxidante, antiinflamatoare si de regenerare dermica; d) dezvoltarea unui prototip biopesticid cu baza uleioasa pentru tratamente pomicole; e) dezvoltarea unui prototip de uz topic antimicotic / antibacterian; f) validarea prototipului biopesticid prin demonstararea eficacitatii tratamentelor pomicole.

Modalitati de realizare in cadrul proiectului: a) Validare biotehnologie de obtinere a uleiului de camelina, standardizat in componente active – acizi grasi ω3 si ω6. b) Validare biotehnologie de obtinere din specii de Solanum a glicoalcaloizilor steroidici, standardizati 65-70% component activ; c) Activitate antimicrobiana demonstrata pe Candida albicans si Staphylococcus aureus; Efecte de regenerare cutanata, antioxidant si antiinflamator demonstrate pe fibroblast, keratinocit si endoteliu vascular; d) Formulare si caracterizare prototip biofungicid, pe baza eficacitatii asocierii Gly /Cam demonstrata “in vitro” pe patogeni izolati din livada; e) Formulare si caracterizare prototip de uz topic antimicotic/antibacterian; Forma de conditionare – crema si microemulsie f) Eficacitate biofungicida in monilioze si rapan demonstrata la ICDP-Maracineni.

OBIECTIVE PREVAZUTE / REALIZATE

Obiective secundare prevazute : g) dezvoltarea transferului de cunostinte intre mediul academic si cel privat; h) consolidarea capacitatii de inovare si de realizare de noi produse si tehnologii necesare pietii si cu potential comercial real; i) implicarea tinerilor cercetatori / studenti in activitatea stiintifica de inalta performanta cu aplicabilitate in transfer tehnologic.

Modalitati de realizare: g) Interrelationarea cercetarilor, cu valorificarea expertizei complementare a partenerilor (cercetare / biotehnologii vegetale/ dezvoltare de produs); h) Know-how in: • initiere si cultivare de Camelina sativa in sistem ecologic (BIOTEHGEN) •dezvoltare de bio-fungicid (USAMV); (BIOTEHNOS) •dezvoltare de produs antimicotic cu eficienta imbunatatita si reactii adverse minime; (BIOTEHNOS) i) contributii la activitatea de cercetare din cadrul scolii doctorale. (USAMV); stagii de practica (BIOTEHNOS); (BIOTEHGEN)

REZULTATE – Stabilire conditii de cultivare ecologica a Camelinei

Studiile tehnologice si analitice pentru obtinerea uleiului de camelina cu continut optimizat de principii active (in special acizi grasi) au fost sustinute de implementarea unui sistem de cultura ecologic.

Pentru investigatii ulterioare si standardizare in principii active s-a ales soiul Madalina datorita productivitatii sale mai mari (2500kg/ha), continutul mai mare de ulei in seminte (cu 2% mai mare fata de GP202) si continut mai mare de acid linolenic. De asemenea, soiul Madalina este mai adaptat la conditiile climatice din Romania (rezistent la inghet).

pentru a conserva resursele, a minimiza reziduurile şi daunele asupra mediului înconjurător, menţinând şi/sau crescând totodată profitabilitatea exploataţiei agricole

S-au inițiat la ferma Moara Domneasca 3 loturi de cultivare a camelinei în sistem ecologic (soiuri Madalina, GP202, GP204), de mentionat fiind soiul Madalina, ameliorat clasic prin tehnica incrucisarii de embrioni imaturi, insumand in total 0.5 ha.

REZULTATE – biotehnologie de obtinere a uleiului de camelina, standardizat in componente active – acizi grasi ω3 si ω6.

S-a eficientizat extractia uleiului de camelina, prin metoda presarii la rece si s-au stabilit conditiile de purificare a uleiului. Analiza compozitiei in acizi grasi (prin cromatografie GC-MS) a evidentiat un profil similar.

3 sarje reproductibile de ulei de camelina ecologic (CAM) si validarea la scara pilot a tehnologiei de extractie

Schema flux tehnologic de obtinere a uleiului de camelina

REZULTATE – biotehnologie de obtinere din specii de Solanum a glicoalcaloizilor steroidici, standardizati 65-70% component activ.

Ca urmare a realizarii celor 3 sarje micropilot pentru obtinerea compusilor glicoalcaloidici s-au stabilit parametrii tehnologici optimi si s-a evidentiat reproductibilitatea tehnologiei. Extractele obtinute la nivel micropilot au fost analizate, stabilindu-se un continut optim de principiu activ (minim 60%)

3 sarje reproductibile de glicoalcaloizilor steroidici (GLY) si validarea la scara pilot a tehnologiei de obtinere

Schema flux tehnologic de obtinere a glicoalcaloizilor steroidici

REZULTATE - Activitate antimicrobiana demonstrata pe tulpini microbiene standardizate (ATCC): Candida albicans, Aspergillus brasiliensis si Staphylococcus aureus.

Evidentierea unui efect antimicrobian in special pe compusul GLY, potentat insa de combinatia cu uleiul de camelina. Varianta CAM 20% și GLY 1mg/ml este activa pe Staphylococcus aureus, Candida albicans și Aspergillus brasiliensis. Varianta CAM 20% și GLY 4mg/ml a inhibat cresterea microorganismelor standardizate de Candida albicans și Aspergillus brasiliensis.

Metoda godeurilor a constat în fabricarea unor godeuri de 8mm diametru în mediul agarizat Muller Hinton însămânțat cu diferite suspensii microbiene. În urma incubării (18-24h) s-au determinat zonele de inhibiție a creșterii microbiene în jurul godeurilor, prin măsurare cu șublerul, cu rezoluția de 0,01mm. Testul coagulazei este utilizat curent pentru a diferenția specia Staphylococcus aureus (coagulazo-pozitiv) de alte specii de stafilococi coagulazo-negativi. Punerea în evidență a coagulării plasmei de iepure a fost realizată în scopul determinării calitative a

acțiunii anti-patogenice a substanțelor studiate asupra stafilococului auriu.

Efect antimicrobian (anti-Candida albicans) evidentiat prin metoda godeurilor

Efect antimicrobian (anti-Staphylococcus aureus) evidentiat prin testul coagulazei – plasma coaguleaza in prezenta agentului patogen; prezenta fito-complexului inhiba coagularea, evidentiind efect anti-stafilococic

REZULTATE - Efect de regenerare cutanata, antioxidant si antiinflamator demonstrat pe fibroblast, keratinocit si endoteliu vascular;

Demonstrarea efectelor antiinflamator, antioxidant si de regenerare cutanata pentru GLY, CAM si combinatii.

Ca element de sustinere a principalei actiuni biologice, cea antimicrobiana, s-au derulat studii „in vitro” in vederea stabilirii limitelor citotoxice pe celula umana, avand in vedere in special caracterul agresiv al glicoalcaloizilor fata de membrana celulara, dar si identificarea unor efecte complementare atat ale uleiului de camelina cat si ale compusilor din Solanum la nivel dermo-epidermic.

Determinarea limitelor citotoxice ale compusilor CAM si GLY, singulari si asociati pe linii celulare normale, umane standardizate, relevante pentru aplicarea topica a unui produs: keratinocit, fibroblast, endoteliu vascular.

Glicoalcaloizii steroidici formeaza complexe cu sterolii (colesterolul) din structura membranei celulare.

Ruperea membranei conduce la moartea celulara prin pierderea constituentilor importanti pentru activitatea metabolica. De asemenea, distrugerea structurii membranei afecteaza si potentialul membranar, reducand transportul activ celular (prin pompa sodiu-potasiu).

Mecanismul de distrugere a membranei fungice de catre tomatina. GA- glicoalcaloidul Chol- colesterol PC- fosfatidilcolina

EFECTE COMPLEMENTARE actiunii antifungice pentru dezvoltarea unor produse de uz topic performante

REZULTATE - Efect de regenerare cutanata, antioxidant si antiinflamator demonstrat pe fibroblast, keratinocit si endoteliu vascular;

Simularea „in vitro” a conditiilor pro-inflamatoare prin tratare cu stimuli:

Modelele experimentale complexe

•Inducerea regenerarii cutanate prin reepitelizare - diferentiere keratinocite (supraexpresia keratinei 5/14; transglutaminazei-1 si involucrinei), corelata cu stimularea multiplicarii celulare; •hidratare epidermala datorata supra- expresiei filagrinei (qRT-PCR); •refacere dermica prin stimularea dinamicii celulare si a sintezei de colagen

•Efect antiinflamator, demonstrat prin qRT-PCR si citometrie in flux la nivelul factorilor pro-inflamatori IL6, IL8, VEGF si a moleculelor de adeziune ICAM si VCAM in special pentru GLY 50ng/ml si combinatia A4= Cam 0.04%+Gly 70ng/ml; • Efect antioxidant prin modularea catalazei/superoxid-dismutazei, corelativ cu apa oxigenata si anion superoxid intracelulare indus de Cam si Gly

Linii celulare standardizate relevante pentru tesut cutanat

• HaCaT – keratinocite umane imortalizate, cu capacitate de diferentiere •HS27 – fibroblast dermic uman •HUVEC – endoteliu vascular

•LPS- lipopolizaharid din Escherichia coli – mimarea atacului bacterian / fungic la nivel cutanat •TNFalfa –inductor al inflamatiei sistemice nespecifice

EFICACITATE “in vitro” DEMONSTRATA

REZULTATE - eficacitatea antifungica a asocierii Glicoalcaloizilor steroidici (GLY) si uleiului de camelina (Cam) demonstrata “in vitro” pe patogeni izolati din livada

Izolare patogeni ai pomilor fructiferi responsabili de rapan si monilioza după prelevarea probelor direct de pe materialul vegetal, din câmpul experimental si determinarea eficacitatii “in vitro” a complexelor bioactive, singulare si asociate.

Monilinia fructigena – responsabil de producerea moniliozei la pomii sământoşi- mar

Monilinia laxa – responsabil de producerea moniliozei la pomii samburosi- prun

Venturia inaequalis– responsabil de producerea rapanului la mar

S-au identificat dozele active si raportul optim de asociere GLY / CAM pentru eficacitate maxima impotriva Monilinia spp. si Venturia inaequalis.

Efectul antifungic al produsului GLYCAM asupra dezvoltarii patogenului V inaequalis (in vitro) EX

EMP

LIFI

CA

RI

REZULTATE – Formulare prototip biofungicid pentru tratament in livada

Forma de conditionare – suspensie bifazica, ce se agita inainte de stropirea pomilor pentru limitarea gradului de atac in monilioze si rapan la specii de pomi fructiferi.

Asocierea principiului activ extras din speciile de Solanum (GLY) cu ulei de camelina (CAM)cu efect protector pentru planta intr-un prototip de biopesticid

Utilizarea produselor biofungicide conduce la diminuarea impactului nociv, remanent al compusilor de sinteza utilizati in tratamentele fitosanitare. Combinatiile de tipul substantelor active/extracte din plante si ulei vegetal sau mineral sunt de mare actualitate in cercetarea de profil. Exemple de produse pe baza de ulei horticol: Confidor Oil, Emerit Oil, Fyfanon, Oleodiazol, Mospilan + Toil; MIMOX - fungicid ce conţine substanţe flavonoide, taninuri, alcaloizi, saponine

Produsul final se prezinta sub forma unei suspensii bifazice, de culoare alb-bej deschis, opaca, aspect laptos si spuma abundenta la suprafata, care isi mentine stabilitatea 15-20 minute dupa agitare.

Fungicid Natural Glycam . Seria 9_ L050518-4 R

REZULTATE – Formulare prototip de uz topic antimicotic/antibacterian; Forma de conditionare – crema si microemulsie

Produse de tip antimicotic, de uz topic, condiţionate sub formă de crema, respectiv micro - emulsie, care conţin ca substanţe biologic active ulei de camelina (CAM), complex standardizat de glicoalcaloizi steroidici din Solanum – (GLY), aplicabile în terapia infectiilor fungice cutanate.

Crema cu efect antimicotic varianta L250718-V3-111105

Microemulsie -seria L190518 - usor translucida,galben-pai, vascoasa, omogena

Preparatele semisolide pentru aplicare cutanata sunt destinate eliberarii locale sau transdermale a substantei active, cu complementaritate in actiune emolienta sau protectoare. Formularile asigura livrarea substantei active la situsul actiunii terapeutice, mentin integritatea chimica si biologica a moleculelor active, a dozelor incorporate precum si cedarea principiilor pe perioada bine definita, stabilita functie de patologia tratata. Au fost elaborate 26 variante de crema cu efect antimicotic si 19 variante de microemulsie, realizandu-se multiple bucle de feed-back in procesul de formulare in functie de rezultatele de stabilitate si de cedare din baza. Eficacitatea antifungica a variantelor selectate a fost confirmata de testarea microbiologica.

REZULTATE - Eficacitate biofungicida in monilioze si rapan demonstrata la Institutul de Cercetare – Dezvoltare pentru Pomicultură Piteşti – Mărăcineni.

REZULTATE - Eficacitate antimicrobiana asupra Candida albicans si Staphylococcus aureus

Agentul de dăunare: rapănul mărului – Venturia inaequalis monilioze - Monilinia laxa, Monilinia fructigena Aplicarea produsului Glycam la conc. de 1,0% respectiv 2,0% a limitat frecvența atacului rapănului pe frunze, lăstari si fructe, si respectiv frecvența atacului moniliozelor pe fructe.

3,00

2,00

1,00

0,33

2,00

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

V1 Martor

netratat

V2 Glycam 0,5% V3 Glycam 1,0 % V4 Glycam 2,0 % V5 Copfort 0,3%

+ Mimox 0,3%

Inte

nsi

tate

I [1

-3]

I [1-3]

3,00

2,00

1,00

0,00

2,00

3,00

2,00

1,00

0,00

2,00

3,00

2,00

1,33

0,67

2,00

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

V1 Martor

netratat

V2 Glycam 0,5% V3 Glycam 1,0 % V4 Glycam 2,0 % V5 Copfort 0,3% +

Mimox 0,3%

Inte

nsi

tate

a at

acu

lui I

[1-3

]

I Rozete I Lăstari

Efect antimicrobian indus de ambele variante de prototip antimicotic de uz topic (Metoda macrodilutiilor- reducere logaritmica a nr. ufc al tulpinilor inoculate in cele 2 produse)

REALIZARI SEMNIFICATIVE – IMPACT

•Tehnologie agricola de cultivare ecologica a camelinei •Valorificare deseuri vegetale din specii de Solanum •Tehnologii de extractie si purificare compusi activi din camelina si Solanum sp. •Compusi bioactivi standardizati in principii active cu proprietati antifungice, antioxidante si antiinflamatoare:

•ulei de camelina (acizi grasi ω3, ω6, vitamina E, etc); • extract Solanum sp.(glicoalcaloizi steroidici- GLY)

•2 prototipuri antimicotice de uz topic cu eficacitate terapeutica extinsa prin efecte complementare – forma de conditionare crema si microemulsie •prototip biofungicid cu baza uleioasa realizat prin asocierea originala a celor doua componente active: ulei de camelina si extract Solanum sp..

Punerea pe piaţă a unor bioproduse şi noi servicii pe segmente de piaţă individualizate (de ex.: infectii fungice ale pielii, tratamente antifungice eficiente si cu remanenta redusa in culturile pomicole). – IMPACT in mediul universitar, medical, farmaceutic, in dezvoltarea agriculturii ecologice si combatere daunatori in livezi.

• valorificarea potentialului agricol si al deseurilor vegetale (in extractia de glicoalcaloizi) • extinderea utilizarii uleiului de camelina ecologic ca vehicul pentru tratamentul pomicol si ca

ingredient activ in afectiuni cutanate; • dezvoltare de complex biopesticid din glicoalcaloizi steroidici si ulei de camelina protector pentru

planta; • design de prototip topic cu extracte de Solanum si ulei de camelina regenerator si antioxidant; • caracterizarea complexa a activitatii biologice a grupurilor structurale, explorand mecanisme

celulare si genice interrelationate.

BREVETARE

SINTEZA

TEHNOLOGII SI PRODUSE NOI

Elemente de noutate:

Coroborarea cunostintelor stiintifice si tehnice ale celor trei parteneri in publicatii si participari la Congrese nationale si internationale

1.V. Drumea, B. Dumitriu, S. Jurcoane, L.Olariu, Fatty acid composition of three camelina sativa varieties grown in Romania, Academy of Romanian

Scientists Annals Series on Biological Sciences, Volume 5, No. 1, 2016, pp. 141-145 Online Edition ISSN 2285 – 4177

2. Stefana Jurcoane, Stelica Cristea, Silvana Danaila Guidea, Brandusa Dumitriu, Laura Olariu, Vaeronica Drumea, 2017. PROMOVAREA ÎN ROMÂNIA A PLANTEI ENERGETICE Camelina sativa. Simpozionul BIOTEHNOLOGIE ȘI ECOTEHNOLOGIE, București, 20 mai 2017. -Publicare Rezumat in Programul simpozionului (Anexa 1-Rezumat) 3.DĂNĂILĂ-GUIDEA Silvana-Mihaela, CORNEA Călina Petruţa, JURCOANE Ştefana, SICUIA Oana-Alina, VIŞAN Valerica Luminiţa, 2017. Effect of biological and chemical agents on increasing morphological and productive performance on Camelina sativa L. varieties. Conferinţa ştiinţifică internaţională „MUZEUL şI CERCETAREA şTIINţIFICă”,BIODIVEST Craiova, 07 – 09 septembrie 2017--Manuscris pentru Publicare articol in extenso (Anexa 2) –in curs de aparitie în volumul XXXIII/2017 „Oltenia. Studii şi comunicări. Ştiinţele Naturii” (http://www.olteniastudii.3x.ro/), acreditată C.N.C.S.I.S. în Reviste ştiinţifice Categoria „B+”, (cod CNCSIS – 703). 4.Stelica Cristea, Mali S. Manole, Cristinel Zala, Ștefana Jurcoane, Silvana M. Dănăilă – Guidea, Matei Florentina, Brandușa Dumitriu, Laura Olariu, 2017, Antifungal activity of some steroidal glycoalkaloids extracted from species of the genus Solanum on Venturia inaequalis extension. The 6th Central European Congress of Life Sciences EUROBIOTECH, Cracovia 11-14 Septembrie 2017, Polonia, -Publicare Rezumat (Anexa 3) - in Book of Abstracts, Session 3 Plant Biotechnology, P.3.5, pg.81. ;Intocmire Manuscris pentru Publicare articol in extenso in revista in Acta Biochimica Polonica (Anexa 4) –in curs de evaluare. 5.Stelica Cristea, Mali S. Manole, Cristinel Zala, Ștefana Jurcoane, Silvana M. Dănăilă – Guidea, Matei Florentina, Brandușa Dumitriu, Georgeta Temocico, Alina-Loredana Popa, Mirela Călinescu, Laura Olariu, 2017 In vitro antifungal activity of some steroidal glycoalkaloids on Monilinia spp. - Articol publicat in -Romanian Biotechnological Letters-Vol. 22, No. 5, 2017, pg. 12972- 12978 Received for publication, July 10, 2017, Accepted, October 4, 2017 6. Brindusa Dumitriu, Stefana Jurcoane, Stelica Cristea, Larisa Stancu, Cristina Croitoru, Mirela Calinescu, Laura Olariu - Valorificarea superioara a unor culturi agricole autohtone de camelina si specii din familia Solanaceae in scopul obtinerii unui prototip cu aplicabilitate in tratamente antifungice si antibacteriene – medalie de argint – Euroinvent 2017 7. LUIZA M. CRĂCIUN, BRANDUSA G. DUMITRIU, LAURA OLARIU, STEFANA JURCOANE, STELICA CRISTEA, ABDI ADIL, NATALIA ROSOIU, RALUCA PAPACOCEA,Regenerative and scare healing potential of active compounds from Camelina sativa oil and grape pomace, proved by cellular specific mechanisms - Romanian Biotechnological Letters - in curs de evaluare.

SC Biotehnos SA – C&D: Director CSI dr. biofiz Laura Olariu Brindusa Dumitriu Emilia Buse Diana Ene Luiza Craciun Lenus Zglimbea Veronica Drumea Roxana Nita Adelina Bicu Denissa Mihai Gabriela Dinca Alina Perisoara Cristina Croitoru

USAMV Prof.univ.dr. Stelica Cristea si colectivul

Institutul de Cercetare – Dezvoltare pentru Pomicultură Piteşti – Mărăcineni Dr.ing. Mirela Calinescu

BIOTEHGEN Prof univ dr. Stefana Jurcoane si colectivul

MULTUMIRI ECHIPEI DE REALIZARE A PROIECTULUI!