Upload
hollye
View
89
Download
4
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita M.Jarošová, A. Mišurcová, M .Vávrová, D. Střítecká I.patologicko-anatomický ústav FN u sv. Anny, Brno Rožnov pod Radhoštěm, 2007. Žít s epidermolysis bullosa znamená…. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita
M.Jarošová, A. Mišurcová,M.Vávrová, D. StříteckáI.patologicko-anatomický ústav FN u sv. Anny, Brno
Rožnov pod Radhoštěm, 2007
Žít s epidermolysis bullosa znamená…
… mít kůži tenkou, křehkou a lehce zranitelnou, jako jsou motýlí křídla.
… vědět, že stačí tlak, tření švu prádla, které způsobí bolavé poranění a puchýře na kůži.
… že při polknutí tuhé stravy mohou být poraněny sliznice v dutině ústní, což
znemožní polknout třeba vlastní sliny … mít puchýře na chodidlech už po deseti
či patnáctiminutové chůzi.… vyřazení z většiny dětských her, protože i
obyčejné hračky mohou neobyčejně ublížit.… denně trávit až tři hodiny ošetřováním
poraněné kůže, bolestivých ložisek.… vyvazovat prsty na rukou, aby se oddálil
jejich srůst.
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
EB je velice vzácné onemocnění kůže Každý z nás může být nosičem vadného genu V současné době neexistuje žádný způsob
léčby Jedná se o onemocnění genetické, ne
nakažlivé, nepostihuje intelekt Největší nadějí je genová terapie Těžká forma může skončit smrtí pacienta v
raném věku Poraněná kůže je velmi citlivá a rány (defekty)
neustále bolí. Dochází k řídnutí a vypadávání vlasů a ke ztrátě nehtů a zubů
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
Tvorba puchýřů na kůži, někdy i na sliznicích
Po drobných traumatech (tření, tlak) nebo i spontánně - mechanobulózní dermatózy
Při postižení sliznic nelze pak polknout ani sliny, sousto jídla, tvoří se puchýře v GIT a dýchacím systému
Typické pro EBC – projevy onemocnění se mohou lišit i v rámci jedné rodiny
Rozlišujeme tři formy – simplex, junkční a dystrofickou, z nichž každá má několik podtypů
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
EB SIMPLEX → rovina štěpení epidermální - uvnitř epidermis jako následek cytolýzy
Je nejběžnější forma onemocnění
Puchýře a rány na rukou a nohou
Je popsána jako nejslabší, neboť kůže nezjizví, ale není možné podceňovat každodenní bolest a omezení
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
EB JUNKČNÍ (ATROFICKÁ ) → štěpení uvnitř lamina lucida (v oblasti dermoepidermální junkce)
Junkční forma EB má několik podtypů, které se liší svou závažností
Bývají postiženy i průdušky a hrtan
Těžký typ junkční formy EB obvykle končí smrtí dítěte během prvních měsíců života
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
EB DYSTROFICKÁ → dochází ke štěpení těsně pod lamina densa v oblasti kotvících fibril (subepidermálně)
Dystrofická forma EB může mít různé projevy
Patří mezi nejzávažnější a velice omezuje běžný život člověka
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) - terapie Obecně - antiseptika, lokální
antibiotika, krytí, zvláčňující krémy, pohodlná obuv, minimum švů, volné bavlněné prádlo
EBS – v rodinách vlastní zkušenosti, jak předejít provokujícím vlivům, autosomálně dominantní dědičnost, rodiče předávají dětem vlastní specifické způsoby terapie
EBJ – obecné zásady lokální terapie stejné jako u ostatních, generalizované formy onemocnění se ošetřují snadněji než EBD
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) - terapie
EBD – nejnáročnější péče, zahrnuje péči o kůži, prevenci a léčbu komplikací např.
Srůsty prstů → existuje možnost operace - plastická chirurgie – odseparování
Poranění sliznice GIT → tekutá a kašovitá strava
Infekce v dutině ústní → kazivost chrupu, poškozené dásně
Sideropenické anémie → ztráta Fe vlivem krvácení aj.
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
Procentní zastoupení tří skupin EBC
SEB 46%
JEB 10%
DEB 44%
dystrofická simplex
junkční
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody Biopsie kůže pacienta
provedena raznicí (punch biopsy) velikosti asi 4 mm
Vzorek ihned po dodání ve vlhké komůrce zmražen v propanu chlazeném tekutým dusíkem a uchován v suchém ledu v mrazničce
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody Zhotoveny kryostatové řezy Metodou nepřímé IMF lze
prokázat antigenní komponenty v oblasti dermoepidermální junkce
Inkubace s normálním sérem Inkubace s primární neznačenou
Ab Inkubace se sekundární Ab
konjugovanou s fluoresceinem (FITC)
Hodnocení vždy s pozitivní a negativní kontrolou ve fluorescenčním mikroskopu, dokumentace každého případu
pacientkontroly
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody Inkubace s normálním
sérem zvířete, ze kterého je získána sekundární značená protilátka
Například jestliže použijeme jako sekundární protilátku - koza anti králík IgG - FITC,
zvolíme normální kozí sérum k blokaci nespecifických vazeb
Inkubace probíhá 20 minut ve vlhké komořeAnti králík IgG
FITC
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody
Inkubace s primární protilátkou ředěnou pufrem TRIS/HCl, pH 7,2 – 7,4
Použita myší, krysí a kozí primární protilátka
Čas a konkrétní ředění je uvedeno v tabulce
Při použití vlhké komory jsme inkubovali za pokojové teploty
Protilátka Protilátka anti-anti-
ImunizovaImunizované zvířené zvíře
Ředění Ředění protilátky - protilátky - μl/100μl μl/100μl TRIS/HClTRIS/HCl InkubaceInkubace
BPAg 1BPAg 1 kozakoza 5/1005/10017h, v ledničce 17h, v ledničce při 4°Cpři 4°C
BPAg 2BPAg 2 kozakoza 5/1005/10017h, v ledničce 17h, v ledničce při 4°Cpři 4°C
Cytokeratin Cytokeratin 55 myšmyš 1/1001/100
60min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Cytokeratin Cytokeratin 1414 myšmyš 3/1003/100
60min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Cytoretatin Cytoretatin 10 10 myšmyš 1/1001/100
40min, vlhká 40min, vlhká komorakomora
Integrin α6Integrin α6 krysakrysa 2/1002/10040min, vlhká 40min, vlhká komorakomora
Integrin β4Integrin β4 myšmyš 2/1002/10040min, vlhká 40min, vlhká komorakomora
Kolagen IVKolagen IV myšmyš 1/1001/10060min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Kolagen VIIKolagen VII myšmyš 1/50,1/100,1/2001/50,1/100,1/20060min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Laminin 5Laminin 5 myšmyš 3/1003/10040min, vlhká 40min, vlhká komorakomora
PlectinPlectin kozakoza 1/1001/10060min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Epidermolysis bullosa congenita
(EBC) – materiál a metody
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody Inkubace se sekundární protilátkou
konjugovanou s FITC Pro krysí primární protilátku
používáme koza anti- krysa IgG-FITC Pro kozí primární protilátky
používáme osel anti-koza IgG-FITC Pro myší primární protilátky koza
anti-myš IgG-FITC Ředěno pufrem TRIS/HCl pH 7,2 – 7,4 Inkubace ve vlhké komoře za pokojové
teploty
Ig GFITC
Ig GFITC
Kozí primární protilátka
Krysí a myší
primární protilátka
Sekundární Sekundární protilátkaprotilátka
Ředění v µ/100µl pufru Ředění v µ/100µl pufru TRIS/HClTRIS/HCl Čas inkubace Čas inkubace
Koza anti-krysa Koza anti-krysa IgG FITCIgG FITC 2/1002/100
120 min, vlhká 120 min, vlhká komorakomora
Koza anti-myš IgG Koza anti-myš IgG FITCFITC 1/1001/100
40 min, vlhká 40 min, vlhká komorakomora
Osel anti-koza IgG Osel anti-koza IgG FITCFITC 4/1004/100
120 min, vlhká 120 min, vlhká komorakomora
Epidermolysis bullosa Epidermolysis bullosa congenita congenita
(EBC) – materiál a metody(EBC) – materiál a metody
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody
Důkladný oplach destilovanou vodou
Zamontování do DAPI – fluorochrom, váže se na DNA, RNA
Hotové preparáty lze uchovávat v lednici, dle našich zkušeností i po měsíci lze ještě prohlížet
Jádra buněk označena DAPI
Lamina dnesa
Lamina lucida
Cytoskelet
Desmosom CK5,CK 14
BPAg1,Plectin
BPAg2, integriny
Laminin 5
Kolagen IV Kolagen VII
Hemidesmosom
Bazální keratinocyt
Kotvící destička
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
CK 5, CK 14 lLaminin 5
Kolagen VII
Procentní zastoupení tří skupin EBC
SEB 46%
JEB 10%
DEB 44%
Epidermolysis bullosa simplex
snížená nebo chybějící reakce s PL proti CK5 a CK14, mutace v genech pro CK5 nebo CK14
BPAg 1, BPAg 2, laminin 5, kolagen IV v bázi puchýře, nezměněné pozitivní reakce
drobné zbytky bazálních keratinocytů jsou prokazatelně i v bázi puchýře, lze dokázat protilátkami Anti-CK MNF 116 (obsahuje keratiny 5, 6, 8, 18) a Anti-CK HMW (high molecular weight, CK 1, 5, 10, 14)
Epidermolysis bullosa simplex
Pacient, CK 5, fragmentybazálních keratinocytů
Pozitivní kontrola,CK 5
Epidermolysis bullosa junkční
kolagen IV, kolagen VII v bázi puchýře, pozitivní nezměněná reakce
BPAg 1, CK 1, 5, 10, 14 nezměněná pozitivní reakce
reakce s lamininem 5 (GB3) je zeslabena nebo chybí úplně, mutace v genu pro laminin 5
BPAg 2 ve stropu puchýře
Epidermolysis bullosa junkční
Pozitivní kontrolaLaminin 5
Pacient, EBJ,Laminin 5 chybí
Epidermolysis bullosa junkční
Pacient, kolagen VII v bázi puchýřePacient, BPAg 2 ve stropu puchýře
Epidermolysis bullosa junkční
Pacient, kolagen IV v bázi puchýřePacient, junkční puchýř, BPAg1
Epidermolysis bullosa dystrofická
EBD - snížená nebo chybějící rekce s PL anti-kolagenVII, mutace v genu pro kolagen VII (COL7A1)
všechny Ag (antigeny) keratinocytů a Ag lamina lucida (laminin 5 (GB3), α6β4 integrin) pozitívní nezměněná reakce
Kolagen IV (lamina basalis), BPAg1, laminin 5 ve stropu puchýře
Epidermolysis bullosa dystrofická
Pozitivní kontrolaKolagen VII
Pacient EBD Chybí kolagen VII
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
Antigenní mapování slouží k navedení molekulárně-genetické laboratoře ve vyšetřování genetických změn a přesnější subtypizaci onemocnění
ZDROJE INFORMACÍ
Buček, J., Bučková, H., Epidermolysis bullosa congenita, IDVPZ, Brno, 2000
Internetové stránky organizace DEBRA www.debra-cz.org
Internetové stránky Univerzity Groningen, http://dissertations.ub.rug.nl/faculties/medicine/2006/a.m.g.pasmooij/
Weedon, D.: Skin Pathology. Churchill, Livingstone, Edinburgh, 1997, s. 17-28
J.D. Fine, L.T.: Smith,Nonmolecular Diagnostic Testing of Inherited Epidermolysis Bullosa. chapter 3, s.60-73
Děkujeme za pozornost