ANTIBIOTICO RESISTENZA

Uno stipite batterico è resistente ad un farmaco quando è in grado di moltiplicarsi in presenza di concentrazioni del farmaco che risultano inibitorie per la massima parte degli stipiti della stessa specie o, operativamente, quando è in grado di moltiplicarsi in presenza di concentrazioni del farmaco pari a quelle massime raggiungibili nel corso dell’impiego terapeutico.

L’antibiotico resistenza è una proprietà geneticamente trasmissibile del microrganismo. Essa può essere naturale oppure acquisita.

Resistenza naturale o intrinseca

E’ una condizione di generale insensibilità ad un farmaco che si estende a tutti gli stipiti di una data specie

• Al microrganismo può mancare la struttura su cui agisce l’antibiotico, come avviene con i micoplasmi che sono privi della parete cellulare e quindi insensibili alla penicillina

• La struttura della parete cellulare o la membrana citoplasmatica di un microrganismo possono essere impermeabili a un antibiotico

RESISTENZA CROMOSOMICA

Ø Costituisce solo il 10-15% di tutte le resistenze acquisite (bassa frequenza di insorgenza)

Ø Si realizza tramite un’alterazione mutazionale spontanea dell’informazione genetica cromosomica

Ø L’antibiotico esercita un’azione selettiva (seleziona i mutanti resistenti, inibendo le cellule sensibili)

Ø Gli stessi mutanti possono essere resistenti anche ad altri antibiotici con caratteristiche simili (resistenza crociata o crossresistenza)

Ø Può essere:

Ø one-step: è sufficiente una sola mutazione per conferire un elevato grado di resistenza (es. rifamicine, chinoloni)

Ø multi-step: sono necessarie più mutazioni perché possa instaurarsi (es. β-lattamine, macrolidi, cloramfenicolo)

RESISTENZA EXTRACROMOSOMICA

Ø Costituisce il 90% di tutte le resistenze (alta frequenza di insorgenza)

Ø Si origina per acquisizione di nuova informazione genetica che deriva da altri microrganismi e che penetra nella cellula mediante i meccanismi di coniugazione, trasformazione e trasduzione

Ø Può riguardare più antibiotici contemporaneamente (resistenza multipla)

Ø E’ a trasmissione orizzontale (tramite lo scambio genetico)

Ø Può essere trasferita anche a microrganismi appartenente a specie differenti (resistenza contagiosa)

Ø E’ dovuta a geni presenti su plasmidi o trasposoni (elementi genici mobili)

Uno dei test più importanti che viene comunemente eseguito nel laboratorio di microbiologia clinica è la determinazione dell’efficacia antimicrobica di un farmaco nei confronti di specifici patogeni. Nella pratica clinica questo tipo di test, essenziale per una corretta terapia, permette di vedere quali siano i farmaci più efficaci nei confronti di un certo microrganismo patogeno e fornisce, inoltre, una stima della dose terapeutica più opportuna per la cura della malattia infettiva.

Studio dell’efficacia degli antibiotici

MIC e MBC

Il metodo più corretto per determinare l’efficacia di un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico, la concentrazione minima inibente (MIC) e la concentrazione minima battericida (MBC).

MIC (Minimal Inhibitory Concentration): la concentrazione minima di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica.

MBC (Minimal Bactericidal Concentration): la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di distruggere i batteri.

Antibiogramma

Test per la determinazione della sensibilità batterica ai farmaci antibatterici

Le varie tecniche per eseguire questo tipo di test sono sostanzialmente riconducibili a due metodi principali:

• Metodo dei dischetti di diffusione• Test di diluizione in agar o brodo

Nel metodo dei dischetti di diffusione il microrganismo in esame viene coltivato su piastre di agar in presenza di antibiotici contenuti in dischi: se il microrganismo cresce normalmente significa che è resistente, se invece è sensibile si rende visibile attorno al disco un alone di inibizione.

È un metodo quali-quantitativo, semplice, rapido ed economico, valido per microrganismi aerobi a crescita rapida.

È il procedimento più comunemente usato in laboratorio, e permette di ottenere una valutazione della MIC.

Attualmente il test di diffusione su dischetto più utilizzato è il metodo di Kirby-Bauer, sviluppato agli inizi degli anni ’60.

Metodo dei dischetti di diffusione

Quantità note dell’agente antimicrobico sono assorbite su dischetti di carta da filtro che vengono poi depositati sulla superficie del terreno agarizzato.L’agente antimicrobico diffonde dal dischetto nell’agar creando un gradiente di concentrazione: quanto più ci si allontana dal dischetto, tanto minore sarà la sua concentrazione, fino al punto in qui si raggiungerà la concentrazione critica (MIC aprossimata). Al di là di questo punto si avrà crescita confluente, mentre nella zonapiù vicina al dischetto la crescita sarà assente.La zona in cui non si è avuta crescita viene chiamata alone diinibizione.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

1 mg/ml0,5 mg/ml

0,25 mg/ml 0,125 mg/ml 0,06 mg/ml

ceppo 1 = 0,25 mg/ml ceppo 2 = 0,5 mg/ml ceppo 3 = 0,25 mg/ml

MIC su terreno solido

S. aureus E. coli

Interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità

Nei test di sensibilità mediante diluizione la sensibilità del microrganismo viene valutata in base alla sua crescita o meno in un terreno di coltura - che può essere solido o liquido - contenente diverse concentrazioni dell'antibiotico. Questo metodo è quantitativo e consente di determinare accuratamente oltre alla MIC anche la MBC (Minimal Bactericidal Concentration), ovvero la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di distruggere la totalità dei batteri. Il metodo è valido e preciso, ma purtroppo anche costoso e di lunga attuazione, per cui l'impiego è limitato a pochi casi:

•trattamenti di affezioni molto serie in cui sia necessario valutare la MBC per determinare il dosaggio dell'antibiotico (es. nelle endocarditi batteriche o osteomieliti);

•valutazione della sensibilità di microrganismi a lenta crescita (es. micobatteri e actinomiceti);

Metodo delle diluizioni progressive

Nel test di diluizione in brodo di coltura si prepara una serie di provette di terreno contenenti diverse concentrazioni di antibiotico, e le si inoculano con quantità convenzionali dell’organismo da testare. La concentrazione più bassa di antibiotico che porta ad assenza di crescita dopo 16-20 ore di incubazione è la MIC.E’ invece possibile calcolare la MBC se le provette che non presentano crescita sono sottoposte a subcultura in terreno fresco privo di antibiotico: la concentrazione più bassa di antibiotico alla quale il microrganismo non è in grado di crescere quando viene trasferito in terreno fresco equivale alla MBC.

Il metodo di diluizione su agar è molto simile al test di diluizione in brodo di coltura: piastre contenenti quantità variabili di antibiotico si inoculano e, quindi, viene valutata la crescita.

TEST DI DILUIZIONE

La Minimum Bactericidal Concentration (MBC) è generalmente superiore (2-4 volte) alla MIC.Dato che comporta la semina del brodo su agar, il test ha delle limitazioni per il tempo che si perde e i costi.

La Minimum Inhibitory Concentration (MIC) indica una inibizione della crescita e non che il batterio venga ucciso (sebbene in pratica una lunga inibizione della crescita conduca alla eliminazione del batterio attraverso le difese immunitarie dell’ospite.

Oggi i test di sensibilità ai farmaci antibatterici possono essere eseguiti con apparecchiature semi-automatiche in cui i batteri vengono fatti crescere in terreno liquido, in presenza di dosi prefissate dei farmaci e la lettura dei risultati, eseguita da un fotometro registratore, viene interpretata da un elaboratore elettronico, che fornisce in tal modo il significato finale.

L’antibiogramma

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

I valori standard di sensibilità variano per ciascun microrganismo e sono basati sulla concentrazione plasmatica di farmaco che può essere raggiunta senza la comparsa di effetti tossici. Questi consentono di classificare il microrganismo in:

• "sensibile", quando l'antibiotico risulta efficace ai dosaggi comunemente raccomandati,

• "intermedio", quando la crescita batterica è inibita solo al dosaggio massimo raccomandato,

• "resistente", quando l'antibiotico dovrebbe essere utilizzato a dosaggi che risulterebbero tossici nell'organismo.

Preliminare identificazione del patogenoConoscere il tipo di patogeno coinvolto può aiutare a scegliere il

farmaco giusto.

Profilo di suscettibilitá

• antibiogramma secondo Kirby-Bauer - diffusione

• MIC (minimal inibitory concentration) - diluizioneAltamente raccomandato. Richiede almeno 1 giorno di tempo

Selezione dell’antibiotico appropriato

La Richiesta di Esame colturale con Antibiogramma

• Le domande che vengono poste:– Qual'è il patogeno in causa ?

– La terapia empirica impostata è efficace anche sul patogeno isolato ?

– Quali sono i farmaci che posso utilizzare in alternativa alla terapia empirica ?

• Meno tossici• Per via orale

Emocoltura:Pseudomonas aeruginosa - Antibiogramma

Interpretazione

Ceftazidime S

Imipenem S

Piperacillina S

Ciprofloxacina R

Gentamicina S

Tobramicina S

Emocoltura:Pseudomonas aeruginosa - Antibiogramma

Interpretazione MIC (mg/L)

Ceftazidime S 2

Imipenem S 0.5

Piperacillina S 32

Ciprofloxacina R 8

Gentamicina S 4

Tobramicina S 1

Pseudomonas aeruginosa

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

PiperacillinaCeftazidime

Cefepime

Imipenem

Meropenem

Aztreonam

Gentamicina

Tobramicina

AmikacinaCiprofloxacina

Levofloxacina

Pseudomonas aeruginosa

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

PiperacillinaCeftazidime

Cefepime

Imipenem

Meropenem

Aztreonam

Gentamicina

Tobramicina

AmikacinaCiprofloxacina

Levofloxacina

RRRRR

RRR

IRR

Sepsidefinizione

Sindrome clinica, (scatenata dalla presenza di un processo

infettivo grave a partenza per es da polmone, addome,

vie urinarie) dovuta all’interazione tra l’agente infettivo e

l’ospite, che porta ad una risposta infiammatoria

sistemica e abnorme, con alterazioni emodinamiche,

respiratorie, metaboliche e immunologiche

• Patogenesi: Focolaio primitivo d’infezione= focolaio sepsigeno o porta d’ingresso a livello del quale i microrganismi si moltiplicano e diffondono nel sangue circolante in gittate successive

SepsiSIRSInfezione

/Trauma

SepsiGrave

ShockSettico

SIRS = Systemic Inflammatory Response Syndrome

Temperatura > 38°C o < 36°C

Battito > 90 battiti / minRespirazione > 20 / min o PaCO2 <32 mm Hg

Leucociti> 12.000/mm3 o < 4.000/mm3 or >10 % Immature SEPSI= SIRS causata infezione sospetta o documentata

SEPSI GRAVE= Sepsi associate a disfunzione d’organo e ipoperfusione o ipotensione

1. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis DefinitionsConference

SepsiIncidenza in terapia intensiva

Secondo lo studio di Angus e al, e Sands una larga porzione di pazienti con sepsi severa viene trasferito nelle terapie intensive (51-9%)

Sands KE, Bates DW, Lanken PN, et al. Epidemiology of sepsis syndrome in 8 academic medical centers. JAMA 1997;278: 234-40.

L’ incidenza di sepsi severa nelle terapie intensive di Francia, Italia, Spagna, Australia si attesta tra il 10 e il14% e la mortalità intorno al 50%.

Infezioni e sepsi sono le principali cause di morte e portano ai maggiori costi nelle unità di terapia intensiva delle medicine

Nell’ambito dello studio SepNet condotto in Germania si è stimata un’incidenza di 154.000 casi di sepsi/anno, che corrispondono a circa 220 per 100.000 abitanti, raffrontabile a quella dell’infarto miocardio acuto (193 per 100.000) e superiore all’AIDS (17 per 100.000).

SepsiEpidemiologia:

Negli ultimi 20 anni si e’ registrato un forte incremento delle infezioni da GRAM+ con una significativa crescita delle infezioni fungine

USA 1979-2000: nel 2000 cause dominanti di sepsi

52% Gram positivi, 37,6% Gram negativi, miceti 4,6%

Aumento del 207% delle infezioni da miceti

Aumento del 26,3% annuo di infezioni da Gram positivi

Greg S. Martin, M.D., David M. Mannino, M.D., Stephanie Eaton, M.D.,and Marc Moss, M.D. The Epidemiology of Sepsis in the United States from 1979 through 2000. N Engl J Med 2003;348:1546-54.

Sepsi Fattori di rischio:

• epidemiologici: aumento dell’età media e delle patologie associate ad un maggior rischio di infezioni (neoplasie, AIDS, interventi chirurgici, malattie croniche)

• iatrogeni: diffuso uso di mezzi invasivi (cateteri venosi centrali, ventilazione meccanica), antibiotici a largo spettro e corticosteroidi

Gram-positive microorganisms account for the majority of episodes of bacteriemia in critically ill patients in the ICU. The occurrence of bacteriemia is an ominous prognostic factor for these patients, with an attributable mortality rate of 16 to 25%

Gram-positive microorganisms account for the majority of episodes of bacteriemia in critically ill patients in the ICU. The occurrence of bacteriemia is an ominous prognostic factor for these patients, with an attributable mortality rate of 16 to 25%

The early recognition of bacteremia is important for instituting adequate antimicrobial therapyI

The early recognition of bacteremia is important for instituting adequate antimicrobial therapy

The early recognition of bacteremia is important for instituting adequate antimicrobial therapy

ICAAC Chicago 17-20 sept 2007 L-477

The Impact of Initiation of Inadequate Antimicrobial Therapy on Survival in Human Septic Shock.A. KUMAR1,2, P. ELLIS 3, Y. ARABI 4, P. DODEK 5, G. WOOD 6, F. KHAN 3, H. PAULIN 3, W. FU 5, W. FU 5, E. HALMARSTROM 1, Catss Study Group; 1Univ. of Manitoba, Winnipeg, Canada, 2Cooper Hosp./UMDNJ, Camden, NJ, 3Univ. of Toronto, Toronto, Canada, 4King Fahd Natl. Guard Hosp., Riyadh, Saudi Arabia, 5Univ. of British Columbia, Vancouver, Canada, 6Univ. of Victoria, Victoria, Canada.

A series of retrospective studies have demonstrated that initiation of inadequate (IA) rather than adequate (AD) antimicrobial therapy in serious infections and bacteremia is associated with a 2 fold reduction in survival. However, a comprehensive examination of adequacy of therapy in a large cohort of septic shock is lacking.

A retrospective analysis of septic shock patients was performed to determine the relationship between adequacy of initial antimicrobial therapy and survival to hospital discharge.

Methods: Data was extracted from the medical records of 5715 cases of septic shock from 24 community and academic hospitals.Outcome was stratified by adequacy of initial therapy, clinical infection site and organism.

Group n % AD O Sur(%) ADSur(%) IA Sur (%)

Overall 5715 80.1 43.7 52 11.3Culture + 4056 76.6 43.7 53.6 10.3Culture - 1659 88.6 43.8 48.8 5.3Community 3142 81.2 51.3 60.2 14.6Nosocomial 2573 71.6 34.8 45.1 8.8Gram + 1355 77.8 44.4 52.8 15.3Gram - 2002 83.7 50.1 57.9 14.7Yeast 443 44.5 16 31 4

P<0.0001 for AD vs IA for each group.

IA initial antimicrobial therapy was associated with 3-10 fold reductions in survival.Similar results were seen for all clinical infections and organisms examined.

Conclusions:Approximately 20% of all septic shock patients receive IA initial antimicrobial therapy.IA initial therapy is associated with a 5 fold reduction in survival of septic shock.

Initiation of adequate initial antimicrobial therapy following diagnosis of septic shock is a critical factor in survival from septic shock.

Paziente “settico”

Esecuzione dei prelievi

Invio al laboratorio

Incubazione delle bottiglie

Emocoltura positiva

Semina su terreno

Crescita su piastra

Identificazione ed antibiogramma

Risultato diagnostico

Colorazione di Gram

Mediamente 96 ore

Mediamente 48 h prima del risultato

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 8 16 24 32 40 48 56 64 72Incubation time (hrs)

% P

osi

tive

sam

ple

s

BACTEC 9240

BacT/Alert

Emocolture: diagramma di flusso

i tempi necessari per giungere alla identificazione del patogeno e al rilevamento delle relative resistenze, implicano una terapia antibiotica empirica ad ampio spettro basata sull’epidemiologia del reparto e sui fattori di rischio del paziente:

• aumentato rischio di effetti collaterali avversi• favorisce l’insorgenza di resistenza ai farmaci antibatterici • induce un generale incremento della mortalità • aumenta i costi di gestione dei pazienti

Puo’ essere falsamente negativa per terapia antibiotica in atto, bassa carica microbica rilevabile, intermittenza dell’agente patogeno in circolo, microrganismi a crescita lenta (l’emocoltura che ha dimostrato livelli di sensibilità analitica variabili tra l’8% e l’88%).

Emocolture: limiti

Nuove tecniche: diagnosi molecolare• Studi di genetica dei microrganismi indicano che la ricerca di specifiche sequenze di

DNA comuni a tutti i batteri è un possibile strumento diagnostico. Infatti tra i batteri e i funghi sono state identificate delle sequenze nella porzione di DNA codificante, rispettivamente, per la sub unità 16S e 18S dei ribosomi.

• Con le tecniche molecolari l’identificazione dei batteri può essere ottenuta in tempi molto ridotti (2-6 ore) e direttamente sul campione di sangue oppure dopo crescita in un terreno di coltura.

• Attualmente l’amplificazione mediante multiplex PCR o mediante amplificazione ad ampio spettro seguita dall’analisi di sequenza dei microrganismi cresciuti in coltura può essere utile per confermare la diagnosi, ma non fornisce vantaggi in termini di tempo

• La PCR può essere applicata per l’amplificazione di DNA batterico direttamente in un campione di sangue. Sono utilizzate metodiche in house tramite amplificazione di DNA ribosomiale della subunità 16s che prevedono il sequenziamento

In alternativa ci sono metodiche pre-confezionate disponibili in commercio con sistema chiuso tramite PCR

real time e identificazione di più microrganismi tramite Multiplex PCR

Therefore, the clinical impact of blood cultures is often limited

Therefore, the clinical impact of blood cultures is often limited

Therefore, the clinical impact of blood cultures is often limited

Therefore, the clinical impact of blood cultures is often limited (Peters rph 2004)

Therefore,the clinicalimpact of bloodcultures is oftenLimited

(Peters rph 2004)

12044021606Tot Esami eseguiti

NegativiPositiviTotale

2008 Emocolture da 3 ICU

2008 Emocolture da 3 ICU

269149418Tot Pazienti valutati

Sempre negativi

Almeno 1 esame pos

Totale

12044021606Tot Esami eseguiti

NegativiPositiviTotale

PCR detection of bacteremia directly in blood samples, without prior cultivation, offers a fast alternative to the blood culture method and is presumably unaffected by the prior use of antibiotics (………)

PCR assays can be aimed at universally detecting bacterial DNA in blood or at targeting a specific microorganism.An additional advantage of the use of a real-time PCR assay is the possibility of quantifying the amount of bacterial DNACursons, Ray T. M. PhD; Jeyerajah, Emmanuel MBBS; Sleigh, James W. MB, ChB, FANZCA The use of polymerase chain reaction to detect septicemia in critically ill patients

We conclude that the use of PCR(for the 16S ribosomal DNA in theplasma) was significantly more sensitive than the use of conventionalblood culturing techniques for thedetection of bacteremia in seriouslyill patients. This could prove to be avaluable adjunct to conventional bloodcultures. (Crit Care Med 1999)

PCR assays can be aimed at universally detecting bacterial DNA in blood or at targeting a specific microorganism.An additional advantage of the use of a real-time PCR assay is the possibility of quantifying the amount of bacterial DNA

Emo+PCR-=11 CNS, 2 STAU; PCR+Emo-= 17 Staph, 10 Strept, 14 NSeq

However, in our opinion, any screening test for use in active surveillance culture programs should have a turnaround time of <24 h.

Results of active surveillance cultures are designed to guide an intervention—implementation of contact precautions for colonized patients.

As recommended in the CDC guidelines for enhanced control of MRSA or VRE, contact precautions should be used for patients for whom active surveillance cultures are performed, pending the result of the screening test.

Standard culture methods require 48–72 h to perform, so all screened patients will be subject to the contact precautions intervention for up to 3 days, regardless of whether they are found to have MRSA or VRE (interestingly, this time interval now approximates the ever-decreasing duration of stay at acute care hospitals, amounting to a formof universal contact precautions).

Given the negative consequences of contact precautions, continuing this intervention for 48–72 h for patients who do not have MRSA or VRE infection may violate the ethical principle of nonmaleficence, especially when faster screening tests are available.

Diekema, CID 2007

Questioni aperte

- certificazione- confronto con altre strutture

- eccesso di domanda- operatività in urgenza(personale qualificato, congruità della richiesta)

- contaminazioni

(Peters rph 2004)

Campioni positivi

SEPTI+EMO

S. CoN (3)Enterococcus faecium

S. AureusEnterobacter cloacae

E.Coli(3)P. Aeruginosa (3)

Discordanza pienaSepti positivo

PneumococcusK. pneumoniae

P. Aeruginosa (2)

Discordanza pienaEmo positive

S. CoNE.Coli

Propionibacterium (3)Corynebacterium (2)

SEPTI+EMOEmo positiva anche…

E.ColiS.CoN

SEPTI+EMOSepti positivo anche…

S. MaltophiliaAspergillus fumigatus

A.BaumaniiCandida kruzei

Numero totale isolati: 29 (anche polimicrobici)

Although the specificities were high, the low sensitivities and suboptimal PPVs noted in the present study discourage routine use of the test in its present form for the detection of community-onset bloodstream infections.

In the subgroup of 34 patients (n=191) who had been receiving antibiotic treatment for >24 hours, SF identified more 35 pathogens (16 vs 6; p=0.049) compared to BC