"Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento

de la Educación",

ASIGNATURA :

BIOTECNOLOGÍA

DOCENTE :

MSc. GARCÍA LÓPEZ Jhon.

TEMA :

SILENCIAMIENTO GÉNICO

INTEGRANTES :

FLORES SANTOS ALDEMIR

HERRERA CADENILLA JUANCARLOS

RAMOS SONO, Daniel.

SANTAMARIA VELIZ, Olivia.

CICLO :

2014 - II

LAMBAYEQUE, FEBRERO DEL 2015

I INTRODUCCIÓN

El silenciamiento genético se ha convertido en una herramienta efectiva empleada para

disminuir la expresión de genes específicos, cuyo objetivo final es evaluar el impacto de la

disminución en su expresión e inferir con esto su función; este proceso puede ser llevado a cabo

a nivel transcripcional o a nivel posttranscripcional.

El silenciamiento genético transcripcional es debido a una alteración (mutación dirigida) a nivel

de la constitución genética misma, originando organismos knock-out. Entre tanto, a nivel post-

transcripcional el proceso ocurre una vez la célula ha sintetizado una molécula específica de ARN

mensajero, generando con esto aislamientos knock-down; este proceso se basa en la habilidad

de las secuencias de ARN de reconocer y generar un sistema enzimático para degradar

secuencias que son complementarias a ellas.

El silenciamiento por ARN es un mecanismo altamente conservado en la naturaleza; este

fenómeno fue descubierto en 1990 por Napoli y col, quienes intentaban sobre-expresar la

enzima que produce el color púrpura en las petunias (chalcona sintasa); para lograrlo,

introdujeron varias copias del gen que codifica para esta enzima, esperando así encontrar un

incremento en el color púrpura de las flores; pero, contrario a lo esperado encontraron flores

sin color o con parches blancos. Posteriormente realizaron un análisis para determinar los

niveles de expresión de la enzima y encontraron una disminución significativa en estos, lo cual

implica que los genes que introdujeron no solo no se estaban expresando, sino que por el

contrario, el gen natural de la planta “dejaba” de expresarse o “disminuía” su expresión. Por esta

razón a éste fenómeno se le denominó co-supresión.

Un fenómeno similar fue descrito dos años más tarde en Neurospora crassa por Romano y

Macino.En el año 1998 éste fenómeno logra ser entendido más claramente, cuando Andrew Fire

y Craig Mello le inyectaron al nemátodo Caenorhabditis elegans, secuencias específicas de ARN

de doble cadena, obteniendo con esto, un silenciamiento específico de secuencia en la expresión

de genes.

A este fenómeno lo denominaron ARN de interferencia. Gracias a este trabajo, estos dos

investigadores recibieron el premio Nobel de medicina en el año 2006. El ARN de interferencia

(ARNi) y el ARN antisentido (ARNas), son mecanismos que ocurren naturalmente en la célula y

que permiten la regulación en la expresión específica de un gen; sin embargo, la adaptación y la

manipulación de estos mecanismos naturales a nivel de laboratorios de investigación han

permitido obtener aislamientos con disminución en la expresión de genes de interés, y por tanto,

identificar su función en la célula, en un proceso metabólico o inclusive en el proceso infeccioso

durante la interacción hospedero-patógeno.

Estas herramientas de silenciamiento cobran mayor importancia cuando se trata de estudiar la

función de genes esenciales, pues aunque se obtiene disminución en la expresión del gen blanco,

la célula mantiene bajos niveles de expresión de la proteína que le permiten a esta sobrevivir

bajo condiciones de ausencia de estrés o inclusive, bajo poco estrés.

Por tanto, el descubrimiento de moléculas de ARN que regulan la expresión de genes, se ha

convertido en uno de los avances más importantes en la biología de los últimos tiempos.

II SILENCIAMIENTO GÉNICO

1. Definición:

El silenciamiento génico es un proceso llevado a cabo en los organismos eucariotes, con

diferentes objetivos, dentro de los cuales se destacan la regulación de la expresión y la

eliminación y el control de material genético ajeno o externo (virus y transposones) que podría

causar un daño a la célula.

2. Clasificación

Existe una clasificación que establece dos grandes categorías, el Silenciamiento Génico Post-

Transcripcional (PTGS) y el Silenciamiento Génico Transcripcional (TGS), los cuales se encuentran

en todos los eucariotes, con ciertas variaciones.

2.1. El PTGS es un mecanismo que actúa directamente sobre el transcrito de ARN mensajero.

El PTGS se caracteriza por estar mediado principalmente por siRNAs y miRNAs. En este tipo de

silenciamiento además de encontrar esos dos elementos ya mencionados, se asocian los

complejos RISC, mRNP, proteínas DICER, Argonautas y Drosha. El mecanismo general inicia con

la síntesis de los pre-siRNAs y pre-miRNAs en el núcleo y su maduración. Este último proceso se

da mediante proteínas DICER, cuyo centro catalítico dimérico, actúa de una forma similar a una

RNAsa tipo III, clivando en pequeños fragmentos de doble cadena. De acuerdo al organismo del

que estemos hablando actúan otras proteínas, pues en los vertebrados solo se produce un tipo

de DICER, mientras que en animales como Drosophila hay más genes codificantes que dan

DICERs más especializadas.

Estos fragmentos son los que van a unirse al ARNm blanco, pero para ello se da un acople con el

complejo RISC. Este complejo en su estructura posee proteínas argonautas Ago, que tienen

dominios de unión (PAZ y Piwi) al ARN, y su actividad RNAsa H contribuye a que los siRNA de

doble cadena sean procesados a cadena sencilla, volviéndolos funcionales. Existe una gran

variedad de complejos RISC, de acuerdo al tamaño de iRNA que vaya a enlazar

2.2. TGS actúa indirectamente y va a establecer un control que impide la transcripción del ADN.

Aunque es más común encontrar procesos de PTGS en las células, los TGS son mecanismos de

silenciamiento importantes, pues actúan antes de la transcripción. La forma más estudiada de

TGS, ha sido la metilación del ADN, estimulada por una serie de enzimas como las proteínas

Dicer, DNA metiltransferasas (DMTasas) y por la presencia de ciertos promotores que formarán

conformaciones de ARN de doble cadena. A partir de esos promotores, las Dicers formarán

fragmentos cortos de ARN de aproximadamente 21 nucleótidos, que serán útiles para unirse y

ser reconocidos por DMTasas que se encargarán de metilar.

El proceso de metilación se da a partir de proteínas específicas para los diferentes organismos,

y se mantiene a partir de otro tipo de DMTasas que son conservadoras de la metilación,

actuando en la replicación manteniendo la metilación en la hebra templado, y metilando la

hebra sintetizada. Las proteínas que se han reconocido son varias, dentro de las cuales

encontramos en los mamíferos Dnmt3a y Dnmt3b y en plantas sus ortólogos DRM1 y DRM2.

Para la metilación es importante algunas veces la modificación estructural de la heterocromatina

o de las histonas asociadas. El resultado de esto será modificar la expresión alterando

promotores, represores, etc

3. Moléculas Involucradas

Desde su descubrimiento en 1995 por Guo y Kemphues, con el silenciamiento del gen par-1

de C.elegans se ha mantenido un estudio constante respecto a los mecanismos naturales que se

encuentran en una gran cantidad de organismos y que están involucrados en la regulación de la

expresión. Se han reconocido diferentes moléculas y sistemas de estas que se encargan de

silenciar la expresión y se encuentran especialmente en el PTGS. Dentro de estas moléculas se

encuentran proteínas “Dicers”, argonautas, con actividad RNAsa, miRNA (micro ARN de

interferencia), siRNA (ARN pequeño de interferencia) con variaciones como nat-siRNA (inducido

durante situaciones de estrés) y ra-siRNA para la transcripción de secuencias repetidas.

Adicionalmente se encuentran complejos que se acoplan con estos elementos como los RISC

(Complejo de Silenciamiento inducido por ARN) que actúa a nivel citoplasmático acoplando

siRNA producido, y el sistema RIST (Complejo de Silenciamiento Transcripcional Inducido por

ARN) cuya actividad se localiza en el núcleo celular.

Además de estas formas, se han encontrado otros niveles transcripcionales de regulación que

no actúan sobre el ARNm, sino que modifican el ADN a través de procesos de metilación que van

a modificar la cromatina, estableciendo dominios de silenciamiento a los cuales se enlazan

proteínas SIR que evitan la transcripción. En las histonas del ADN también se han detectado

modificaciones como poliadenilación, y deacetilación, cuyo efecto será impedir la unión del ADN

con proteínas enlazantes.

El silenciamiento, no es un proceso localizado, pues a través de uniones celulares como los

plasmodesmos vegetales, hay un flujo de los elementos ya mencionados, de modo que se ejerce

un efecto sistematizado. Una vez iniciado este proceso, se mantiene el silenciamiento, y un

mecanismo para ello es sintetizar secundariamente siRNA a través de ARN polimerasas ARN

dependientes (ARNdARNp). De esta forma los cambios muchas veces se prolongan por un

tiempo, y en algunos casos, como la modificación de la heterocromatina, son heredados.

Heterocromatina

Una gran cantidad de ADN que actúa en centrómeros y telómeros estimulando el silenciamiento

de genes aledaños en la eucromatina. No es codificante, y cerca de sus histonas se dan procesos

de metilación que mantienen el silenciamiento. Esa heterocromatina va a producir siRNA que va

a ser el encargado del silenciamiento interactuando con otras proteínas también asociadas a ella

y a histonas. Se da igualmente un acople entre la heterocromatina con RITS y con ARNpARNd,

para dar una acumulación de siRNA. Su efecto silenciador, está potencializado en parte por la

acción de ARN que se asocia para estimular cambios. Las variaciones existentes entre los

diferentes organismos son principalmente en la cantidad y tipo de repeticiones.

Proteínas DICER y Argonautas

Las proteínas DICER, son nucleasas que degradan ARN de doble cadena, formando pequeños

fragmentos. En sus extremos tienen sitios de unión de ARN y de proteínas argonautas. Las

proteínas argonautas (Ago) se acoplan con el sistema RISC y su función será cortar ARNm blanco

y a su vez guiar al complejo hacia su objetivo con mayor eficiencia.

siRNA (Fragmentos pequeños de ARN interferente)

Estos pequeños fragmentos de ARN son sintetizados a partir de ARN de doble cadena. En esa

conformación las proteínas DICER van a reconocerla y ejercerán su efecto endonucleasa. Luego

los pequeños fragmentos se acoplan con el sistema RISC, que va a romper la doble hebra para

activar la actividad de siRNA. Se movilizan hacia ARNm y se unirán a él, impulsando de nuevo la

actividad RNAsa. Estos fragmentos pueden ser templados para que una ARNdARNp sintetice

más ARN de doble cadena, mantiendo la presencia de siRNA. Tiene varios tipos y algunos son

inducidos bajo condiciones de estrés como nt-siRNA y otros actúan sobre las repeticiones

nucleotídicas como el ra-siRNA.

miRNA (micro fragmentos de ARN interferente)

Es ARN no traducido que va a silenciar de la misma forma que los siRNA, acoplándose a

complejos efectores como RISC. La principal diferencia entre los dos tipos es el tamaño, siendo

estos los más pequeños.

Complejo RISC

Este complejo es una agrupación de varias proteínas, incluyendo su unidad más importante que

es una endonucleasa. Actúa a nivel citoplasmático y se encarga de enlazar el siRNA de doble

cadena activándolo, llevándolo a cortar esos pequeños fragmentos en hebras sensibles, para

dirigirlos posteriormente hacia los blancos a silenciar, estimulando su clivaje.

Complejo RIST

Funciona de una forma semejante a la del complejo RISC, su única diferencia es que actúa a nivel

nuclear.

4. silenciamiento genético en animales

En los animales se ha reportado la presencia tanto de TGS como de PTGS, sin embargo en general

a los mecanismos de silenciamiento en estos organismos se les conoce como ARNi o

cosupresión. Su utilidad se basa en la protección de la integridad del genoma, evitando de esta

forma los transposones, pero también estos mecanismos de silenciamiento establecen rutas de

regulación durante el desarrollo que son indispensables para evitar anomalías. Particularmente

para cada animal se han distinguido una variedad de rutas, sin embargo en términos generales

los mecanismos encontrados son parecidos a los que ya se han mencionado.

Caenorhabditis elegans fue el animal que impulsó el estudio de estas rutas, y en este nemátodo

se han detectado alrededor de 112 miRNA, de los cuales se conoce muy poco sobre su función.

Algunos importantes han sido lin-4 y let-7, involucrados en el desarrollo del organismo, también

lsy-6 y mir-273 que están involucrados en la formación de patrones del sistema nervioso. El

mecanismo más común es el PTGS, usando siRNA producido por proteínas Dicer y utilizando los

complejos RISC. Adicionalmente se ha encontrado una variedad de tipos de siRNA como por

ejemplo el transitorio, producido desde el ARNm blanco mediante una ARNpARNd y algunos

nucleares.8

Además de las funciones en el desarrollo, en el caso de los animales estas rutas de silenciamiento

están involucradas en la protección de infecciones virales, aunque esto se ha estudiado más en

plantas.

4.1. Silenciamiento génico y Enfermedades

La mayoría de las asociaciones que se han establecido entre el silenciamiento génico y las

enfermedades están relacionadas con el ciclo celular. Muchos silenciadores, cumplen un rol

fundamental en esto, de modo que mutaciones en estos genes como el silenciador p53 de EZH,

llevan al desarrollo de cáncer. En pacientes que padecen de esta patología en la próstata, se ha

visto un nivel elevado de EZH, pues no tienen el silenciador.

Las metiltransferasas nuevamente cumplen un papel esencial como SUV39h1 que se encarga de

metilar K9H3, para que se dé la unión de un dominio de heterocromatina. Su ausencia tiene

diferentes efectos en el desarrollo pero también en otras funciones como las reproductivas. Se

desarrollan linfomas, se da un crecimiento lento, etc.

Por último las proteínas de la heterocromatina enlazantes como H1 son esenciales para evitar

enfermedades, impulsando el silenciamiento de ciertos genes. Sin ellas se afecta la segregación

de cromosomas, además son supresores de tumores, de modo que también se afectaría el ciclo

celular. Adicionalmente se encargan de eliminar la transcripción de material genético viral como

en VIH, o herpes virus, por lo tanto sin ellas, habría mayor vulnerabilidad.

4.2. Aplicaciones

Las aplicaciones del silenciamiento génico son muy amplias, pues además de tener fines

terapéuticos, su uso en investigación ha aumentado, pues mediante iRNA y las moléculas ya

mencionadas se ha podido estudiar la función de varios genes.

Una de las aplicaciones con mayor potencial, es el uso de transplantes celulares para evitar el

desarrollo de enfermedades como el cáncer. Modificando células madre de blastocistos

humanos, empleando iRNA, es posible formar líneas celulares no defectuosas desde las células

del paciente en medios de cultivo, para posteriormente ser implantadas.14

Actualmente se están investigando terapias a base de ARN que inhiban la trascripción, esta

nueva tecnología se la ha denominadotriplex. Funciona a través de oligo que no se une a un ARN

mensajero (como haría el ARNi) sino que se une al ADN inhibiendo la trasncripción. Se une un

oligo a la doble cadena formando una triple hélice. En teoría sería útil para mutaciones

dominantes. Solo ha funcionado en promotores de microorganismos donde no hay

superenrollamiento ni histonas.

Otra nueva vía de desarrollo es la construcción de ARN catalíticos (diferentes a las ribozimas).

Se ha propuesto unir al oligo que emparejaría con el ARN mensajero del gen que queremos

silenciar una molécula de EDTA-Fe. Esto provoca la destrucción activa del ARN mensajero al que

se une de forma que el ARN catalítico puede liberarse para degradar otro ARN mensajero.

Otras de las aplicaciones terapéuticas radican en el control de infecciones virales, bacterianas y

parasitarias. En el caso de las virales es mucho más sencillo, y se ha probado mediante el

silenciamiento de genes involucrados en su replicación, o en receptores celulares importantes,

esto se ha hecho con VIH, Hepatitis C y VSR (Virus Sincitial Respiratorio). Para el caso de las

bacterias, no ha sido lo más utilizado, dado que no existen tantos blancos, sin embargo, se han

planteado alternativas para silenciar la respuesta proinflamatoria inducida por muchos factores

de virulencia bacterianos como toxinas. Finalmente, para las infecciones parasitarias, se han

planteado alternativas por ejemplo para la malaria, proponiendo la creación de vectores

artrópodos transgénicos que sean resistentes a la colonización y establecimiento del parásito.15

Uso de vectores virales para la terapia génica

Existen dificultades metodológicas que se deben superar todavía para que estas alternativas

sean funcionales y aplicadas. Los problemas principales están relacionados con la selección de

secuencias adecuadas para diseñar el siRNA, la estabilidad de lo producido, es decir, la

resistencia luego de ser inyectado, a las condiciones celulares (presencia de endonucleasas por

ejemplo), la liberación (selección del vector adecuado) y lo más importante, la especificidad que

garantice que no habrán efectos secundarios ni uniones a otros fragmentos que no son los

blancos determinados. Se han ideado varios posibles vectores, algunos plasmídicos que

mantengan la replicación de la secuencia, algunos virales con una eficiencia más grande, y por

último la lipofección usando lípidos con el ADN en cultivos celulares. Para resolver estos

problemas, falta mucho más estudio, pero adicionalmente debe reforzarse el trabajo con líneas

celulares en medios, pues son modelos in vivo precisos, que podrían ser bastante útiles en el

momento de diseñar una alternativa terapéutica basada en el silenciamiento de genes.

5. Silenciamiento genético en plantas

5.1. Un poco de historia

En un principio, el silenciamiento génico fue descrito en plantas como un mecanismo

mediante el cual la maquinaria celular

desencadenaba la degradación de un ARm deteminado.

Esto

demostró que esta degradación era “específica de secuencia”, ya que s

ólo eran degradadas las moléculas de arnque contenían una secuencia e

n particular, y no otros. Posteriormente, este fenómeno también se denominó

ARN de interferencia o ARNi.

El mecanismo se describió por primera vez en petunias transgénicas, en las que se

pretendía mejorar el color de las flores. Para eso se introdujeron copias

adicionales de un gen que codificaba una enzima clave

para la producción de pigmentos en los pétalos. Sorprendentemente, muchas de

las plantas que tenían copias extras de dicho gen no mostraron el color violeta o

rojo intenso esperado. Por el contrario, aparecieron flores parcialmente o

completamente blancas .Los investigadores notaron que en las plantas transgénicas tanto el

gen endógeno como el introducido habían sido “apagados”, y aunque desconocían el

mecanismo molecular involucrado, llamaron a este fenómeno

como “cosupresión de la expresión génica”.

Figura 1: Fenotipo de las flores de petunias a las que se les agregó copias extra

s del gen clave para la producción de pigmentos. Izquierda: flor de la planta no tra

nsgénica; centro y derecha: distintas líneas transgénicas. Extraído del artículo de Matzk

e MA y col. 2004, PLoS Biol 2 (5):e133.

Algunos años más tarde un grupo de virólogos vegetales observó un fenómen

o similar. El objetivo de su trabajo era mejorar la resistencia de las planta

s al ataque de ciertos virus. En ese tiempo ya se sabía que las plantas

que expresaban proteínas virales eran más resistentes a la infección. Di

chos científicos observaron que las plantas que contenían sólo un pequeño

segmento del ARN viral, y que no codificaba ninguna proteína, eran igualme

nte resistentes al ataque del virus De esta manera, concluyeron que el ARN vir

al producido a partir de transgenes también podía proteger a la planta de nueva

s infecciones virales. Luego realizaron el experimento inverso: insertaron secuen

cias cortas de genes de la planta en el genoma del virus. Infectaron plantas

con el virus modificado y observaron que la expresión de ese gen de la pla

nta era suprimida. Este fenómeno se llamó “Silenciamiento Génico Inducido p

or Virus” (en inglés, Virus-­‐Induced Gene Silencing o VIGS).

El experimento clave que clarificaría

los resultados contradictorios obtenidos con las petunias y las plantas inf

ectadas con virus fue realizado por los investigadores Andrew Fire y Craig Mello

(premios NOBEL en Fisiología y Medicina en 2006). Los investigadores buscaban

un modo eficiente de silenciar genes como estrategia para estudiar la funció

n de los mismos en el desarrollo del gusano C. elegans. El experimento cruci

al consistió en introducir, mediante inyecciones, ARN del gen unc-­

22, implicado en el proceso de contracción muscular. Al inyectar el ARN men

sajero simple cadena, no se obtenía ningún efecto visible, y la contracción mu

scular de los gusanos era normal. Sin embargo, al inyectar ARN doble cade

na, los gusanos presentaban grandes espasmos, tal como también ocurría en

aquellos gusanos que carecían del gen unc-

22. En esta publicación, Fire y Mello demostraron que es posible el silencia

miento específico de un gen mediante la introducción en la célula de ARN

doble cadena (ARNdc) con secuencia homóloga al gen. Además, propusieron qu

e este fenómeno era mediado por un mecanismo endógeno natural, que tení

a como consecuencia la degradación del ARNm y que era usado por

la célula para controlar la expresión génica. Finalmente, sugirieron una conex

ión entre este mecanismo y el fenómeno descrito en plantas.

Algunas diferencias entre organismos

Las vías de silenciamiento varían según las especies. En plantas y en el nematodo

C. elegans, el silenciamiento puede movilizarse a sitios lejanos del punto de inicio y here

darse, lo que no ocurre en la mosca Drosophila melanogaster ni en mamíferos. Esto se

debe, se cree, a que el silenciamiento se propaga de una célula a otra mediante la tra

nsferencia de los siARN (ARNi pequeños, ver más adelante) a través de los plasmodesm

os. También se ha descrito silenciamiento génico en algunos protozoarios, como Tryp

anosoma brucei, aunque se sabe que otros, como Leishmania major y Trypanosoma c

ruzi, no poseen la vía completa de este mecanismo. En hongos filamentosos, como

Neurospora crassa , el fenómeno de silenciamiento se conoce como quelling.

Vías del silenciamiento génico en plantas

Desde que se descubrió este mecanismo, diferentes trabajos científicos

han demostrado las bases moleculares que controlan la expresión de secuencias

endógenas y exógenas en plantas.

En las plantas, como en otros organismos, el silenciamiento es gatillado por la

presencia de ARNdc y mediado por ARN pequeños de interferencia (siARN). El

ARNdc puede generarse por la presencia de transgenes, la expresión de genes

endógenos, por la infección de virus, o bien por medio de la introducción exógena.

Como se dijo previamente, el silenciamiento génico se produce principalmente a nivel tr

anscripcional y post transcripcional. Sin embargo, se han descubierto otras vías por l

as cuales se puede inducir el silenciamiento génico. Una de ellas corresponde al silenci

amiento génico post transduccional, en la cual se reprime la traducción de los ARNm.

El otro mecanismo, descubierto hasta el momento en protistas, involucra la elimina

ción de regiones de ADN.

También las vías de silenciamiento génico se pueden clasificar según el tipo de

ARN pequeño involucrado. Las vías pueden estar mediadas por microARNs, AR

N pequeños de interferencia endógenos (siARNs) o ARN pequeños derivados de virus

(viARNs).

Mecanismo molecular

Las bases moleculares del silenciamiento génico se pudieron dilucidar a partir de l

a identificación de muchos de los genes involucrados en este mecanismo.

Silenciamiento génico post transcripcional

Utilizando análisis bioquímicos y genéticos se ha podido establecer un modelo que

describe cómo se produce el PTGS. En este modelo, el silenciamiento puede

dividirse en una etapa de iniciación y en otra etapa efectora y de manteni

miento

La etapa de iniciación comienza, como se mencionó anteriormente, con la pr

esencia de un ARNdc. Éste es reconocido y digerido por la enzima Di

er, que posee dominios de ARNasa tipo III (enzimas que degradan mol

éculas de ARN), para formar moléculas de ARN pequeñas de

21ª24 nucleótidos de longitud. A estos ARNs se los denominó ARN pequ

eños de interferencia (siARN); y son moléculas cortas de doble cadena que

funcionan como determinantes específicos en el silenciamiento génico mediad

o por ARN.

En la etapa efectora, el siARN se une a un complejo con actividad de nucleasa (

enzimas que degradan ácidos nucleicos) para formar el complejo RISC (complejo de sile

nciamiento inducido por ARN). RISC es un complejo ribonucleoproteico con actividad e

ndonucleasa dependiente de homología de secuencia que se encarga de la degradaci

ón del ARN “target”. La actividad helicasa de RISC separa las dos hebras del siARN, y

sólo una de ellas permanece unida al complejo.

Una vez que RISC está activado, tiene como blanco la degradación de los ARN mensaj

eros homólogos a dichos siARNs. El núcleo o “core” de RISC está formado por pro

teínas pertenecientes a la familia argonauta (AGO). Estas proteínas son partícipes funda

mentales en los mecanismos de ARN de interferencia en diversos organismos. Existen va

rias AGOs en plantas, pero la más estudiada fue la AGO1. Esta proteína se encuentr

a fuertemente implicada en el silenciamiento mediado por transgenes y por virus.

Figura 2: Esquema de los principales pasos de la vía del silenciamiento génico post trans

cripcion

En plantas existe además una etapa de amplificación que ocurre mediante la pr

oducción de copias del ARNdc que originó el silenciamiento, generando más

moléculas de siARNs; o directamente mediante la replicación de los siARNs.

En estos fenómenos interviene una ARN polimerasa dependiente de ARN

(RdRP, capaz de sintetizar moléculas de ARN empleando ARN

como molde). Por otro lado, el silenciamiento desencadenado en un

punto particular de la planta genera una señal móvil que es capaz de gati

llar el fenómeno en tejidos alejados del sitio de inicio. Si bien todavía no

se conoce con exactitud la naturaleza de esta señal, existen

pruebas contundentes que involucran a los siARNs como partici

pantes en este proceso.

miRNAs como reguladores de inmunidad y adaptación al estrés en plantas

Las células eucariontes son capaces de modular la estabilidad de sus miRNAs como respuesta a

estímulos endógenos o ambientales, para controlar los niveles de transcripción de mRNA. Dichas

alteraciones en la reducción de niveles de mRNA son mediadas por RNAi cis regulador, así como

por proteínas de enlace a ARN.

La maquinaria encargada de llevar a cabo dicho mecanismo es conocida como spliceosoma o

complejo de corte y empalme, la cual contiene fragmentos cortos de ARN y numerosas proteínas

de enlace. El uso combinado de diversos sitios de corte dentro del pre-mRNA, genera formas

alternativas del mismo que incrementan la versatilidad de mRNAs maduros para la generación

de variantes de proteínas con diversa disposición de dominios.

Navarro et al. (2008) y Li et al. (2010) han implicado al miRNA en procesos de inmunidad de

plantas, ya que líneas transgénicas mutantes con delecciones en los genes dcl1-9, ago1-25 y

ago1-27 impiden la biogénesis de miRNA involucrado en mecanismos de respuesta de

inmunidad inducida.

Las secuencias de miRNA a menudo se encuentran relacionadas con la regulación de varios

procesos biológicos como la mitigación del estrés. El género Arabidopsis contiene dos genes MIR

(393a y 393b) que son procesados de manera casi idéntica al madurar y transformarse en

secuencias miR393. Este miRNA fue considerado en un principio como una secuencia no-

funcional derivada de la biogénesis de miRNA . Sin embargo, estudios posteriores demostraron

la implicación de estas moléculas en la inmunidad de plantas ya que dicho miRNA fue

identificado en pequeñas poblaciones al estar interactuando con complejos de proteínas AGO

durante situaciones de defensa contra infecciones bacterianas. La secuencia tiene como diana

el gen MEMB12 que codifica una proteína estructural del aparato del Golgi implicada en

procesos de secreción vesicular.

Las plantas responden al estrés ambiental de tipo biótico y abiótico, mediante una expresión

diferencial de genes y secuencias de miRNA. Por ejemplo, en diversas especies se ha observado

un incremento de miR160, miR167 y miR393 (reguladores de la embriogénesis y posterior

desarrollo) durante condiciones de sequía. Se sabe que mientras miR393 bloquea la expresión

del gen que codifica receptores de auxinas, miR167 y miR160 evitan la expresión de algunos

genes relacionados con diversos factores de respuesta a dicho estrés.

Las plantas requieren de al menos 14 minerales esenciales para su correcto desarrollo que

provienen del suelo y, en este sentido, el RNAi se involucra tanto en la regulación como en la

homeostasis de nutrimentos. Vale la pena mencionar que las construcciones de genotecas de

secuencias de RNAi resultarían ser muy valiosas para el estudio de miRNAs relacionados con

estos procesos metabólicos. Es así que las aplicaciones biotecnológicas de miRNAs derivadas de

los antecedentes mencionados podrían radicar en la manipulación de microsecuencias que

jueguen un papel importante en las respuestas al estrés hídrico, térmico, salino, biótico y

radiación UV, así como al estrés mediado por regulación hormonal y homeostasis de

nutrimentos, para de esta manera permitir la creación de líneas transgénicas más resistentes a

condiciones ambientales adversas.

Potencial del RNAi en la protección de cultivos frente a plagas de insectos

Una de las primeras investigaciones que demostraron que el RNAi podía degradar secuencias

específicas de mRNA y bloquear la expresión de genes de insectos, se llevó a cabo en C. elegans,

una especie de nematodo rabdítido de la familia Rhabditidae

. Los investigadores estadounidenses responsables de dicho proyecto recibieron el premio Nobel

de medicina en 2006 por lo que llamaron:

“un mecanismo fundamental para controlar el flujo de la información genética”. Por otra parte,

Kennerdell y Carthew (1998) utilizaron RNAi para estudiar genes de D. melanogaster.

Hasta la fecha, el RNAi ha sido utilizado para el estudio de la genómica funcional de más de 30

especies de insectos de diversos órdenes como Díptera, Coleóptera, Lepidóptera, Isóptera,

Ortóptera, Himenóptera y Hemíptera. Aunque la mayoría de estas investigaciones son realizadas

en la Unión Europea, Japón y Estados Unidos de América, por mencionar algunos ejemplos,

también es posible encontrar antecedentes de su aplicación en América latina aunque en menor

cantidad. La aproximación funcional de esta herramienta ha sido exitosa en la caracterización

de genes relacionados con diversos procesos fisiológicos, que incluyen: desarrollo,

reproducción, comportamiento y sistemas de inmunidad. Evidentemente, la aplicación de RNAi

es una estrategia biotecnológica que permite la identificación de genes mediante el bloqueo de

su expresión y posterior inhibición de la síntesis de proteínas, un proceso de suma importancia

en la defensa contra infecciones antagonistas.

Investigaciones recientes en insectos han permitido conocer los efectos de la aplicación in vitro

de secuencias sintéticas bicatenarias en embriones, a través de procesos de microinyección

celular. Si bien este método de recombinación genética constituye una herramienta para

investigar la función de los genes, la microinyección de ácidos ribonucleicos no resultaría factible

para el control de plagas debido a su alto costo. Hoy en día se considera que para que una

estrategia de control biológico de insectos basada en la aplicación de RNAi sea viable, ésta debe

tener como diana un gen que sea necesario para un proceso fisiológico vital del hospedero,

además de ser imprescindible el empleo de una metodología adecuada para realizar su

vinculación con el organismo.

El potencial del RNAi como una posible herramienta biotecnológica para el control de

poblaciones de insectos fue demostrado por vez primera por Araujo et al. (2006), quienes

lograron introducir ARN bicatenario en este tipo de organismos mediante su administración oral.

En dicho estudio se utilizaron larvas de Rhodnius prolixus, una especie de heteróptero

triatómino, que se alimentaron con el transcrito que codificaba una proteína anticoagulante

denominada nitroporina 2, y se observó una disminución significativa en los niveles de actividad

anticoagulante en las glándulas salivales de los insectos. En el mismo año, Turner et al. (2006)

llevaron a cabo una investigación con Epiphyas postvittana, una polilla perteneciente a la familia

de los lepidópteros que por su naturaleza herbívora es capaz de atacar hasta 123 especies de

dicotiledóneas distintas. La introducción oral de transcritos diana de ARN bicatenario

de genes que codifican una enzima intestinal de larvas, y una proteína intermediaria en la

síntesis de feromonas en las antenas de adultos disminuyó los niveles de ambos transcritos en

los tejidos.

Asimismo, un trabajo involucrado con Aedes aegypti demostró que el RNAi puede ser inducido

en insectos a través de su aplicación tópica .En este estudio, la aplicación cutánea de ARN de

doble cadena diluido en acetona causó que la transcripción del gen AaeIAP1 que codifica una

proteína inhibidora de muerte celular programada (apoptosis) en hembras adultas quedara

bloqueada y, por ende, el incremento significativo de la mortalidad de los insectos.

De manera posterior, la aplicación tópica de este tipo de moléculas en larvas de la polilla

barrenadora Ostrinia furnacalis mostró también tener efecto, ya que en este caso el RNAi fue

introducido en las larvas mediante la aspersión directa de una solución acuosa que contenía los

ribonucleótidos, y se observó tanto un retraso en el crecimiento de las mismas como una muerte

temprana.

Es importante mencionar que el RNAi es susceptible a la degradación por ARNasas, cuya

severidad depende de las propiedades alostéricas de la secuencia. Por otra parte, se observó

una disminución significativa de la capacidad de eclosión de los huevecillos respecto a los

testigos de control, además de que moléculas marcadas con fluorescencia persistieron en los

estadios larvarios hasta llegar al intestino, hemocitos y capullos.

Como se mencionó anteriormente, la obtención de RNAi in vitro tiene un alto costo. Una

alternativa que pudiera ser viable en términos económicos para su inducción, es la expresión de

ARN bicatenario in vivo mediante la construcción de vectores génicos que alberguen segmentos

de secuencias diana. Diversas investigaciones recientes han permitido obtener vectores de

silenciamiento en bacterias

, plantas hospederas y virus de plantas, los cuales han sido implementados con éxito para

estudiar la expresión de genes específicos en insectos.

Algunas investigaciones relacionadas con los mecanismos moleculares que rigen las respuestas

de defensa de las plantas, sugieren que también puede ser posible la aplicación de RNAi como

una estrategia para el control de plagas de nematodos. De manera regular, dichos organismos

son controlados con pesticidas químicos que a largo plazo tienen repercusiones tanto

económicas como de salud y ambientales y, por consiguiente, la aplicación de esta

estrategiapodría proveer de beneficios considerables para la agricultura.

Una forma de generar plantas modificadas genéticamente resistentes a nematodos, es

produciendo copias (repetidas e invertidas) de secuencias de genes diana de tales organismos

bajo promotores fuertes, con la finalidad de que los gusanos se alimenten de la materia vegetal

que contenga el ARN bicatenario y se induzca de dicha manera el RNAi a su genoma. De esta

forma se obtendría un bloqueo de la expresión de genes involucrados en su desarrollo, lo que

resultaría en la disminución de la reproducción o crecimiento de los mismos.

Silenciamiento génico como mediador de patogenicidad viral

Aunque existen antecedentes sobre el potencial del RNAi frente a diversos tipos de virus capaces

de infectar células animales (e.g., virus del dengue y Drosophila) , algunos estudios sugieren la

participación de éste principalmente en la patogenicidad viral en plantas. Los supresores virales

de silenciamiento afectan tanto la acumulación como función de los siRNAs, que incluyen el

proceso de silenciamiento génico posttranscripcional mediado por RNAi corto en trans que fue

descubierto recientemente (tasiRNA; trans-acting siRNA).

Como consecuencia, se desencadena un desarrollo anormal del organismo hospedero.

La participación de tales inhibidores de expresión en el desarrollo de enfermedades de este tipo,

resulta ser consistente con el hecho de que a menudo suelen ser factores determinantes de

patogenicidad. No obstante, la interacción del RNAi en las vías metabólicas del hospedero podría

no ser la causa principal de los síntomas de infección, ya que en principio no todos los supresores

virales afectan el metabolismo de estas moléculas en plantas.

En los modelos convencionales de patogenicidad mediada por RNAi, las secuencias cortas de

ribonucleótidos derivan de virus infectantes, mientras que el ARN subviral induce el

silenciamiento de genes del hospedero a través de complementariedad de secuencias fortuitas.

Este modelo fue sugerido por vez primera por Wang et al. (2004), quienes demostraron que la

expresión de un gen que transcribe horquillas de ARN autocomplementario (self-

complementary hairpin RNA) que codifica una secuencia de un viroide Tubérculo fusiforme de

la papa (Solanum tuberosum L.) denominado PSTVd (Potato Spindle Tuber Viroid), es capaz de

inducir síntomas del mismo tipo en tomate (Solanum lycopersicon L).

Por otra parte, Wang et al. (2004) demostraron que el efecto de pardeamiento causado por el

virusoide o ARN satélite (molécula patógena de ARN) del mosaico del tabaco (Nicotiana tabacum

L.) (Virus del Mosaico del Tabaco; TMV-Tobacco Mosaic Virus) se encuentra fuertemente

inhibido por un supresor de silenciamiento denominado P1/ HC-Pro. En este sentido, se ha

confirmado que dichos síntomas de marchitez son debidos al silenciamiento directo del gen

biosintético de la clorofila (CHLI) del hospedero.

Debido a lo anterior, el silenciamiento por inducción viral de genes del hospedero a través de

RNAi podría considerarse un mecanismo general para la patogenicidad de ARN subviral, ya que

dichas moléculas infectantes pueden silenciar genes de diversas formas. El siRNA que tiene un

alto grado de identidad de secuencia con las regiones promotoras de los genes del hospedero,

puede inducir la metilación de la citosina del promotor a través de la metilación de ADN dirigida

por ARN denominada vía RdDm (RNAdirected DNA methylation), lo cual conlleva a una

inactivación de la transcripción de los genes del hospedero.

Resistencia de las plantas frente a patógenos fúngicos mediante silenciamiento génico

A diferencia de los patógenos víricos que se replican y propagan dentro de las células de las

plantas infectadas, las interacciones entre algunos hongos patógenos y la planta ocurren a través

de células altamente especializadas conocidas como haustorios. Estos últimos son los extremos

de las hifas rodeados por una matriz externa bordeada, por cada lado, por las membranas

celulares del hongo y su hospedero. Dicha situación podría representar una interfase para el

intercambio de señales entre ambos organismos, así como la asimilación de nutrimentos. A su

vez, tal interacción podría facilitar la movilidad de ARN bicatenario (secuencia específica

complementaria a genes del antagonista) proveniente de las células de la planta hospedera hacia

el patógeno fúngico, para crear un factor de resistencia mediado por RNAi.

El concepto de silenciamiento génico en hongos inducido por sus hospederos se ha generado a

partir de Blumeria graminis, un hongo patógeno biotrófico que parasita a la mayoría de las

gramíneas para nutrirse y que se identifica mediante la presencia de manchas polvorientas en

las hojas de las mismas. A través de silenciamiento artificial, la expresión directa de RNAi dirigida

frente a transcritos diana de B. graminis en cebada (Hordeum vulgare L.) redujo

significativamente los síntomas de la enfermedad en la planta, mientras que la cepa del hongo

modificada genéticamente utilizada como control negativo pero que carecía de la secuencia de

RNAi (control de transformación), fue tan susceptible al mismo patógeno como la cepa nativa

de ésta.

A pesar de que existen pocos estudios que relacionen el fenómeno de silenciamiento génico en

hongos en comparación con los realizados en plantas, la mayoría de ellos comprueban la

existencia de un gran número de variaciones dentro del mismo proceso. Por ejemplo, el

descubrimiento del mecanismo que origina puntos de mutación repetidos (RIP) en el genoma

de Neurospora crassa a través de silenciamiento, es el primero reportado como un fenómeno

inducido artificialmente por la introducción de ADN en mdicha especie. Neurospora crassa y

Ascobolus immersus son ejemplos de hongos capaces de producir homólogos de secuencias

repetidas, e inactivarlas en una determinada fase de su ciclo de vida.

Igualmente, existen datos sobre la presencia de moléculas de ARN de doble cadena en aislados

de Sclerotium cepivorum, aunque su existencia no se encuentre directamente relacionada con

su patogenicidad o variabilidad morfológica.

Silenciamiento génico transcripcional

El TGS ocurre en el núcleo de la célula. Mediante este mecanismo se

inhibe la síntesis del ARNm, es decir, no ocurre la transcripción. En este

caso, los genes están silenciados por modificaciones a nivel del ADN, que

implican su metilación (adición de un grupo metilo CH3 a una molécula), r

emodelamiento o modificaciones de las proteínas histonas. Se propone

que dichos cambios, posiblemente, alteran la formación de la heterocromatina, es d

ecir, zonas de ADN de alta densidad que impiden el acceso de la “maquinaria trans

cripcional” y que por ende los genes no se expresan.

Aplicaciones biotecnológics

Más allá de las funciones fisiológicas que se le atribuyen al silenciamiento génico, co

mo la defensa antiviral y la regulación de la expresión génica, este fenómeno pued

e ser utilizado además como herramienta para identificar genes “blanco” para el desarr

ollo de nuevas drogas, eliminar la función de un gen en particular, y hasta potencialment

e eliminar la expresión de un gen responsable de una cierta enfermedad. También es p

osible utilizar el silenciamiento génico como una herramienta para generar mejores c

ultivos y alimentos, como por ejemplo, plantas resistentes a virus, mejoras en la calidad d

e los aceites, y otras mejoras nutricionales en granos y tubérculos.

La rosa azul

La obtención de rosas azules fue anhelada durante siglos, y aunque

parecía imposible de lograr por las técnicas tradicionales de mejoramiento, las

nuevas técnicas biotecnológicas han permitido cumplir con este ambicioso obje

tivo. En Australia, una organización de investigación científica e industrial (CSIRO)

fue capaz de obtener exitosamente rosas azules, en conjunto con

un grupo aponés. Para hacerlo recurrieron a la siguiente estrategia (Fig. 3):

1. “Apagaron”la producción del pigmento rojo silenciando el gen de

la enzima dihidroflavonol reductasa (DFR) original de la rosa.

2. Insertaron un gen de la planta de pensamiento para la

producción del pigmento azul (o delfinidina).

Pre-serminario

3. Restituyeron la actividad de la enzima DFR por introducción del gen de la

DFR del lirio azul.

Figura 3: Etapas en el desarrollo para obtener una rosa azul.

Plantas de tomates resistentes a la enfermedad de agalla de la corona

La agalla de la corona es una enfermedad causada por la bacteria del suel

o Agrobacterium tumefaciens, que tiene la habilidad de transferir su prop

io ADN al genoma de

La planta infectada, en un proceso conocido como “transferencia horizontal”. Una

vez que los genes bacterianos son incorporados al genoma de la planta, se expresan y

producen proteínas que desencadenan la formación de tumores. Estos tumores sirven

de hábitat y proveen alimento a las bacterias, pero a su vez dañan la planta

bloqueando el transporte de nutrientes y agua a lo largo del tallo, disminuyendo

el rendimiento, la productividad y la calidad de los frutos.

Un grupo de investigadores de la Universidad de California empleó

el silenciamiento génico para bloquear la expresión de dos genes bacteriano

s clave para la formación de los tumores. Mediante esta técnica, obtuvieron pl

Pre-serminario

antas de tomate que eran infectadas por la bacteria, pero que no producían las

hormonas necesarias para formación de tumores.

.Figura 4: Obtención de plantas de tomate resistentes a la agalla de la corona.

Tomado de Matthew et al, PNAS, 2001 vol. 98 (23) 13437–13442.

Papas resistentes al pardeamiento

Durante la cosecha mecánica de la papa se pierde cerca del 20% de la producción, debid

o a la oxidación. Una vez que las papas se oxidan cambian su sabor y aspecto, y dis

minuye la cantidad de materia aprovechable. Este problema no es solamente estético,

sino también nutricional, e inclusive pasa a ser un problema sanitario para

productos derivados. Para evitar el pardeamiento, las papas son tratadas con antioxidantes

y conservantes, algunos de los cuales pueden dañar la

salud y no son aceptados en todos los países.

En el Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (IN

GEBI – CONICET), el grupo de investigadores conformado por Briard

o Llorente, Guillermo Alonso, Fernando Bravo Almonacid, Héctor Torr

es y Mirtha Flawiá, desarrolló plantas de papa que expresan un ARNi destin

ado a silenciar el gen de una enzima llamada polifenol oxidasa

(PPO), responsable del fenómeno de oxidación o pardeamiento. Los tub

érculos provenientes de las plantas genéticamente modificadas no sufren el

“pardeamiento” debido a la oxidación al ser cortados o g

olpeados. Gracias a dicha modificación estas papas se pueden exponer

Pre-serminario

al aire durante tiempos prolongados y en comparación con una papa común,

también resultan resistentes al proceso de oxidación enzimática .

Figura 5: Rodajas de papa

s expuestas al aire durante

0, 12, y 24 hs. Luego d

e 12 hs se observa oxidació

n en las rodajas de papa pr

ovenientes de plantas no

transgénicas, mientras que

las rodajas de papas

transgénicas resisten más de

24 hs sin sufrir pardeamiento

.

Planta de café descafeinada

El café descafeinado corresponde al 10% del total de café comercializado

alrededor del mundo. Investigadores japoneses desarrollaron una planta

de café (Coffea sp.) Transgénica que expresa un ARN doble cadena corresp

ondiente a la secuencia del gen CaMXMT1. Dicho gen codifica una enzima que

se encuentra involucrada en la vía de biosíntesis de la cafeína. En las plantas

que se transformaron con dicho ARNdc se indujo

el silenciamiento del gen CaMXMT1 provocando una disminución en los niveles de

cafeína entre un 30

y 50% respecto a los controles. Estos resultados demostraron

que esta tecnología puede ser utilizada para el desarrollo de plantas de

café comerciales descafeinadas.

REFERENCIAS BICLIOGRAFICAS

Conti, G., Rodriguez, C., & Manacorda, C. (n.d.). Introducción al Silenciamiento Génico.

Ernesto, A., Génico, S., Plantas, E. N., Moleculares, M., Arn, D. E. L., Biotecnológicas, Y. A., &

Fitogenética, S. M. De. (2014). PLANT GENE SILENCING : MOLECULAR MECHANISMS OF RNA

INTERFERENCE.

R, O. H. (2012). Silenciamiento genético : una herramienta molecular para el estudio de la función

génica, 3(2), 13–14.

Silencing, T. G., & Silencing, T. G. (2014). Dra . Paula Bey.