Embed Size (px)
DESCRIPTION
:d
Citation preview
"Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento de
la Educación",
ASIGNATURA :
BIOTECNOLOGÍA
DOCENTE :
MSc. GARCÍA LÓPEZ Jhon.
TEMA :
APTÁMEROS Y CHIPS DE PROTEÍNA
INTEGRANTES :
FLORES SANTOS ALDEMIR
HERRERA CADENILLA JUANCARLOS
RAMOS SONO, Daniel.
SANTAMARIA VELIZ, Olivia.
CICLO :
2014 - II
LAMBAYEQUE, FEBRERO DEL 2015
I. INTRODUCCION
Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla que constan de no más de 120
nucleótidos y que presentan una seria candidatura como alternativa a los anticuerpos monoclonales
en la investigación biomédica . Pueden ser utilizados en el ámbito del diagnóstico, como sensores
moleculares, y en el terapéutico, ya que interfieren en las funciones biológicas de moléculas diana.
En la última década hemos asistido a un rápido avance en proteómica, siendo los “microarrays” o
“arrays”( términos tomados del inglés) de proteínas una de las tecnologías más prometedoras en este
campo para el estudio a gran escala de proteomas complejos. En este sentido, la comunidad científica
ha adoptado las técnicas tradicionales de detección, acercándose a disciplinas que como la
nanotecnología permiten satisfacer la creciente demanda de estudios proteómicos en formatos de alto
rendimiento. Las aplicaciones de la nanotecnología en la proteómica surgieron de la necesidad de
detectar proteínas minoritarias, en tiempo real y formato “multiplex”, en mezclas complejas de
proteína
II. APTAMEROS
1. Definición
Los aptámeros son ácidos nucleicos de cadena sencilla, ADN o ARN, con una estructura tridimensional
específica que les permite unirse con alta afinidad a la molécula diana.
Etimológicamente el término aptámero proviene del latín aptus que significa ‘fijar’ o ‘unir’ y del
griego meros que significa ‘partícula’.
2. SELEX
En 1990, dos grupos diferentes identificaron el método para la generación de aptámeros denominado
SELEX (por la sigla en inglés de systematic evolution of ligands by exponential enrichment) .
Este método utiliza la química combinatoria para la selección de ácidos nucleicos sintéticos con alta
afinidad por su molécula diana. La química combinatoria consiste en la síntesis de un número
significativo de moléculas de estructura similar que forman colecciones (bibliotecas) consiguiendo
una gran diversidad química, y en la cual se puede tamizar una molécula diana para encontrar
miembros (es decir, secuencias) de dicha biblioteca que presenten afinidad .
En SELEX, estas secuencias individuales se han denominado aptámeros. El método SELEX consiste
en la selección de los miembros de una biblioteca (aproximadamente 1015 secuencias diferentes) que
se unen a la molécula diana.
2.1. Pasos del método SELEX
Se puede dividir este método en tres pasos principales:
a. La interacción entre los miembros de la biblioteca y la molécula diana;
b. La selección de los miembros que poseen afinidad por la molécula diana
c. El enriquecimiento de la biblioteca mediante amplificación usando pcr (por la sigla en inglés
de polymerase chain reaction).
Figura 1. SELEX (systematic evolution of ligand by exponential enrichment). A) El inicio consiste
en la sintesis quimica de la biblioteca, que contiene aproximadamente 1015 secuencias diferentes. B)
La biblioteca y la molecula diana entran en contacto y solo los miembros con afinidad permanecen
unidos. C) Se separan los miembros de la biblioteca que se unen y se descartan las secuencias poca
afinidad por la molecula diana. D) Enriquecimiento mediante PCR en las bibliotecas de ADN o por
transcripcion reversa y PCR en el caso de las bibliotecas de ARN. E) Comienza un nuevo ciclo, que
se repetira hasta encontrar bibliotecas que contengan un grupo indeterminado de secuencias que se
unen a la molecula diana. F) Secuenciacion del ultimo ciclo para determinar las secuencias
individuales con alta afinidad
3. Composición de los aptameros
La composición natural de los aptámeros incluye ADN y ARN. Sin embargo, se han incorporado
satisfactoriamente al proceso enzimático o de síntesis secuencias con ácidos nucleicos modificados.
Estos últimos han sido evaluados exitosamente mediante ensayos in vitro o modelos in vivo. En el
caso de ADN-SELEX , la doble cadena se separa y una de sus cadenas sencillas es la forma funcional
de la biblioteca. En ARN-SELEX se requieren la transcripción para hacer funcional la biblioteca
partiendo de ADN y la transcripción reversa para enriquecerla posteriormente mediante
PCR .
4. Características de los aptameros
a. La posibilidad de obtener aptámeros bajo condiciones diferentes a las fisiológicas abre
la puerta para la selección de elementos de reconocimiento en condiciones no
convencionales.
Un ejemplo de la versatilidad en este aspecto es la toxicidad de una molécula diana. La selección de
aptámeros no se ve limitada en ningún caso por la toxicidad u otras condiciones diferentes a las
fisiológicas, dado que el proceso se lleva a cabo in vitro. Esta es una ventaja de los aptámeros con
respecto a los anticuerpos, que generalmente solo pueden ser generados en condiciones fisiológicas,
en las que la toxicidad es un factor determinante. Por lo anterior, es poco probable o no viable el
desarrollo de anticuerpos para un gran número de toxinas. En la actualidad se ha seleccionado un
buen número de aptámeros que reconocen una gran variedad de moléculas diana, entre las cuales
se encuentran: toxinas, compuestos inorgánicos y orgánicos,nucleótidos y sus derivados,
cofactores, aminoácidos, carbohidratos, antibióticos, péptidos y proteínas, al igual que
estructuras complejas como células . Esta diversidad de aptámeros, aunada al hecho de que su
selección se hace sin importar el pH o la toxicidad de la molécula diana, lleva a considerar el SELEX
como un método genérico que teóricamente permitiría seleccionar aptámeros para cualquier molécula
bajo las condiciones elegidas.
b. La afinidad de los aptámeros
La afinidad de los aptámeros se encuentra muy frecuentemente en un rango bajo de nanomolaridad,
similar a la reportada para los anticuerpos . En los aptámeros la afinidad está ligada al número de
ciclos de SELEX que se lleven a cabo y a la efectividad del proceso de separación de secuencias que
se unen con alta o baja afinidad a la molécula diana. En algunos casos ha sido posible obtener
aptámeros con afinidades destacadas que evidentemente superan a los anticuerpos y para las que se
reportan valores de un dígito picomolar .
c. La especificidad
Otra característica interesante de estos elementos de biorreconocimiento, que se evidencia en su
capacidad para diferenciar cambios estructurales mínimos entre la molécula diana y moléculas
inespecíficas. Un ejemplo claro de esta característica es el aptámero antiteofilina, que distingue
específicamente la teofilina de la cafeína, a pesar de que solo un grupo metilo diferencia estas dos
moléculas.
5. Aptameros y anticuerpos
En la mayoría de las aplicaciones médicas, se logran altos niveles de afinidad y especificidad
utilizando anticuerpos, pero existen limitaciones en el uso de estos en diversas pruebas clínicas.
Algunas de estas limitaciones están relacionadas principalmente con su producción (se requieren
animales o células), variabilidad de cada lote de anticuerpos, frecuente inmunogenicidad, su tamaño
que dificulta el acceso a compartimentos biológicos pequeños y su susceptibilidad en procesos de
desnaturalización. En contraste, los aptámeros se seleccionan in vitro y se generan de forma
reproducible utilizando procedimientos convencionales de síntesis en fase sólida con el método del
fósforo-amidita. De igual forma, se los puede modificar fácilmente en el proceso de síntesis para
mejorar su estabilidad frente a nucleasas o adicionarles grupos funcionales (ejemplo: grupos
fluorescentes) para incrementar su aplicabilidad. La tabla 1 muestra las principales ventajas y
desventajas en el uso de aptámeros y anticuerpos.
Aptameros Anticuerpos
- Producción sencilla y reproducible
- Pueden ser modificados para incrementar
su estabilidad frente a nucleasas (ácidos
nucleicos modificados) y también
para aumentar su tamaño (pegilación) y
evitar la rápida filtración renal
- Pueden ser desnaturalizados y utilizados
repetidamente
- Pueden ser seleccionados en condiciones
fisiológicas y no fisiológicas
- No son inmunogénicos
- Son las moleculas mas ampliamente
usadas en terapia
y diagnostico clinico
- Su tamano (~150 Kda) reduce su
eliminacion mediante filtración renal, y
generalmente su vida media
es suficiente para la acción terapéutica
- Son muy estables en condiciones
fisiológicas, no presentan degradación por
nucleasas
- Pueden producirse sin pago de propiedad
intelectual
- Su aplicacion clinica está en los primeros
pasos
- Por su tamaño (5-20 Kda) son eliminados
rapidamente por filtracion renal,
generalmente se requieren modificaciones
para alcanzar niveles terapéuticos
- Son degradados por nucleasas en
ambientes fisiológicos,
generalmente deben ser modificados para
uso clínico
- SELEX es un método patentado que
requiere pago de propiedad intelectual para
uso comercial
- Producción dependiente de animales o
células
(variabilidad en cada lote)
- Su modificación genera en muchos casos
reducción o pérdida de su capacidad de
reconocimiento
- Cualquier episodio de desnaturalización
generalmente
reduce o anula su capacidad de
reconocimiento
- Solo pueden ser seleccionados en
condiciones fisiológicas
- La inmunogenicidad es un problema
asociado al uso de anticuerpos
Se ha explorado la utilización de aptámeros como elementos de biorreconocimiento en el desarrollo
de numerosos tipos de biosensores, integrándolos de forma eficiente a distintos sistemas
transductivos.
Una ventaja de los aptámeros en el desarrollo de biosensores es la estabilidad durante su vida útil,
que es generada por su naturaleza química. Los aptámeros pueden ser desnaturalizados mediante
aumento de la temperatura o del pH, pero luego pueden retornar a su estado activo utilizando las
condiciones óptimas de reconocimiento (buffer, temperatura, etc.) . Todo lo anterior contrasta con los
anticuerpos en los que cualquier episodio de desnaturalización generalmente les produce una pérdida
en la capacidad de reconocimiento y por lo tanto en su función en un sensor.
Es de destacar que algunos aptámeros han sido adaptados exitosamente a métodos convencionales
como ELISA , PCR , citometría de flujo y microscopía de fluorescencia . De igual forma, algunas
técnicas mucho más sofisticadas han incorporado los aptámeros como moléculas de reconocimiento;
entre ellas se encuentran SPR (por la sigla en inglés de superficial plasmon resonance)
y AFM (por la sigla en inglés de atomic forcé microscopy) . Uno de los ejemplos más claros de la
flexibilidad que ofrecen estos ácidos nucleicos es el aptámero antitrombina (TBA, por la sigla en
inglés de
thrombin-binding aptamer): es una secuencia de ADN con 15 oligonucleótidos (5’-
GGTTGGTGTGGTTGG-3’) y es posiblemente el aptámero más popular y con el mayor número de
aplicaciones científicas, con más de 400 publicaciones. TBA fue seleccionado por
Bock y colaboradores y desde entonces se lo ha utilizado como modelo en diversas aplicaciones
nanotecnológicas .
Una particularidad de este aptámero es su estructura G-cuádruple (figura 2), que ha facilitado su
adaptación a diferentes biosensores entre los que se destacan los de tipo óptico , fluorescente y
electroquímico . Con la idea de profundizar en el diagnóstico clínico y la terapia basados en
aptámeros, hemos seleccionado un ejemplo representativo en cada caso. Analizaremos los aptámeros
anti-IgE y anti-VEGF en los contextos
diagnóstico y terapéutico, respectivamente.
Figura 2. A) Esquema de la estructura G-cuadruple de TBA. B) Estructura 3D de TBA, utilizando
resonancia magnética nuclear. C) Su interaccion con trombina (gris). Las guaninas estan
representadas en verde y las timinas en azul
6. Aplicaciones de aptamermos
a. Aptámeros en el diagnóstico clínico
A pesar de los grandes avances en la identificación de aptámeros y la utilidad demostrada como
moléculas de biorreconocimiento, solo en algunos casos se los ha utilizado en el diagnóstico en
muestras clínicas.
Por esa razón, se puede decir que aún falta un paso definitivo que genere evidencia sobre su
aplicabilidad en dicho diagnóstico. Sin embargo, un gran avance en esta dirección lo están llevando
a cabo Gold y colaboradores.
Sensor proteómico basado en aptámeros
Recientemente han descrito un sensor proteómico basado en aptámeros que mide simultáneamente
813 proteínas diferentes provenientes de una pequeña muestra de sangre. La efectividad clínica de
este multisensor se demostró mediante la identificación del perfil de proteínas de enfermedades como
la falla renal crónica y el cáncer de pulmón. Es, sin duda, un buen comienzo para la entrada definitiva
de los aptámeros en el campo del diagnóstico clínico.
Aptámero anti-igE
Otro buen ejemplo en este sentido es el aptámero anti-IgE que se utilizó en la identificación de IgE
presente en el suero sanguíneo de 50 muestras clínicas. Utilizaremos este aptámero como modelo
ilustrativo de la aplicabilidad de estos elementos de biorreconocimiento en muestras clínicas.
Aptámero anti-IgE
Las personas que sufren cuadros alérgicos presentan con frecuencia niveles elevados de IgE
comparadas con las no alérgicas. Por lo tanto, se puede deducir la importancia de cuantificar los
niveles de IgE en el tratamiento de un episodio alérgico.
La determinación de IgE se hace generalmente mediante ELISA o radioinmunoanálisis (RIA). Sin
embargo, estos métodos son costosos y consumen mucho tiempo. Partiendo de la necesidad de una
detección de IgE mucho más rápida y confiable, Yao y colaboradores desarrollaron un sensor basado
en aptámeros que mide en 15 minutos los niveles de IgE, de forma específica y reproducible . Este
sensor utiliza una microbalanza de cristal de cuarzo en la que previamente se ha inmovilizado el
aptámero anti-IgE. Una vez que dicho aptámero reconoce la IgE en solución (suero), el biosensor
traduce su nivel que es directamente proporcional a la masa depositada en él (figura 3). Este tipo de
dispositivos abre una puerta hacia la utilización generalizada de aptámeros en muestras clínicas,
campo en el que aún predominan los anticuerpos como moléculas de biorreconocimiento. Es posible
entonces, que la tecnología basada en aptámeros sea una alternativa futura para el diagnóstico clínico,
cuando se generen sensores eficientes y de bajo costo que puedan competir con los métodos
convencionales.
Figura 3. Esquema de la deteccion de IgE utilizando aptameros: el dispositivo desarrollado por Yao
y colaboradores utiliza una microbalanza de cuarzo, en la que previamente se inmoviliza el aptamero
anti-IgE (A). Se inyecta el suero sanguíneo (B) y la IgE presente en la muestra se detecta por el
aptamero anti-IgE. La union entre el aptamero anti-IgE y la IgE presente en la solucion genera un
aumento de la masa en la superficie del sensor (C). Este cambio de masa se traduce en un cambio de
frecuencia (senal) que es directamente proporcional a la concentracion de IgE
b. Aptámeros como agentes terapéuticos
Los aptámeros han tenido un gran impacto en el desarrollo de nuevas terapias; se destacan las
orientadas a las enfermedades hematológicas ,el cáncer y la infección por VIH .
En la revisión llevada a cabo por Keefe y colaboradores, se recopilaron los aptámeros más destacados
en modelos terapéuticos.
Los aptámeros se pueden usar en dos formas diferentes en el desarrollo de procesos terapéuticos:
1. Como moléculas efectoras para reconocer un receptor y ejercer directamente la función terapéutica;
2. Como vehículos para la entrega de una molécula secundaria. En este caso, se utiliza el aptámero
únicamente como elemento de biorreconocimiento, que es modificado con la molécula secundaria
encargada de la acción terapéutica .
Dada la facilidad de modificación de los aptámeros, incluso en el proceso de síntesis, actualmente
están compitiendo con péptidos y anticuerpos en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos, lo
que evidencia el notorio avance logrado durante los últimos años en este campo.
En la actualidad ocho aptámeros se encuentran en fase clínica y uno ya fue aprobado para uso clínico
(tabla 2). Este último es el aptámero anti-VEGF (por la sigla en inglés de vascular endothelial growth
factor) y lo analizaremos más detenidamente a manera de ejemplo.
Aptámero anti-VEGF
El anti-VEGF (pegaptanib - Macugen®) es el primer aptámero aprobado por la FDA y se lo utiliza
en el
tratamiento de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) . Esta enfermedad oftalmológica
se caracteriza por el deterioro de la mácula, tejido de color amarillento sensible a la luz, localizado
en el centro de la retina, cuya función está ligada a la nitidez visual; por lo tanto, está encargado de
las percepciones visuales finas . El proceso patológico consiste en la pérdida de nitidez y agudeza
visuales.
De hecho, la DMAE es la principal causa mundial de ceguera .Por esta razón, se han hecho esfuerzos
significativos para el desarrollo de nuevas terapias para esta enfermedad. Una de las estrategias se
basa en utilizar el aptámero anti-VEGF inyectado intravítreo que reconoce la molécula VEGF165, lo
que inhibe la unión a su receptor natural y es así como se genera el proceso terapéutico, porque se
evita la proliferación y migración de vasos sanguíneos hacia el humor vítreo . Los reportes de la
utilización de este aptámero son promisorios: ha generado una inhibición de 65% y 80% en modelos
animales y 80% de los pacientes que participaron en las pruebas clínicas se estabilizaron o mejoraron
después de tres meses de tratamiento .
En la actualidad más de 50.000 pacientes han sido tratados con pegaptanib con resultados
satisfactorios. Con base en aptámeros hay, sin lugar a dudas, una posibilidad real de desarrollar
nuevos enfoques terapéuticos y cabe destacar que se están adelantando pruebas clínicas para otros
aptámeros de los que se tendrán noticias en los próximos años. Esperamos entonces que el aptámero
anti-VEGF sea solo el inicio de una generación de nuevos agentes terapéuticos.
III. CHIPS DE PROTEINAS
Para la detección de péptidos y proteínas, además de las técnicas de electroforesis bidimensional (two-
dimensional gel electrophoresis, o 2DE) y la cromatografía líquida con espectrometría de masas
(liquid chromatography mass spectrometry. o LC-MS). recientemente han aparecido al menos dos
sistemas de biochips adaptados a la identificación de estas moléculas, cuyo desarrollo promete
abaratar y agilizar los procesos de caracterización de estos biocompuestos. Ambos sistemas se
fundamentan en la especificidad de la unión entre proteínas, algo que suele compararse con el ejemplo
de una llave que hace juego con su cerradura. Para poder utilizar esta propiedad, se crean matrices de
microsuperficies capaces de unirse de forma específica a diversos tipos de péptidos y proteínas.
Las diversas técnicas para lograr este propósito, así como los procedimientos utilizados con la
detección de las mismas pueden diferir bastante, y por ello dar lugar a biochips también distintos.
En todos los casos la muestra a estudiar es preparada (a veces la preparación puede ser mínima en
fluidos como suero, sangre, orina: pero si se trata de tejidos, estos se machacan y homogeneizan para
crear una «sopa de proteínas), a continuación se depositan unas pocas gotas sobre el chip, se deja
transcurrir un tiempo variable para que ambos interactúen (tiempo durante el que las proteínas se
unirán a las diversas regiones específicas de aquel por procesos de absorción según su afinidad con
las superficies tratadas) y se pasa a la etapa de revelado o detección de peptídica.
Veamos con algo más de detalle uno de estos chips proteicos, el denominado Sistema ProteinChip
que fue desarrollado por la compañía Ciphergen Biosystems Ltd., de Palo Alto (California). Está
formado de un sustrato de aluminio en el que existen matrices con multitud de pequeñas superficies
de hasta 1 mm de diámetro que han recibido un recubrimiento químico (hidrófobo, hidrofilico, iónico,
etc) o bioquímico (con receptores, anticuerpos, etc) para interactuar con determinadas proteínas.
unirse a ellas y retenerlas.
1. Microarrays de proteínas
El estudio del proteoma humano puede llegar a constituir una tarea ardua y desalentadora debido al
elevado número de proteínas existentes, codificadas por alrededor de un total de 25.000 genes
distintos, a part ir de los que se generan múltiples variantes proteicos por modificaciones post-
transducionales. En el intento por desarrollar una plataforma metodológica para el estudio del
proteoma humano que pueda manejar la gran cantidad de datos sobre las distintas proteínas y sus
variantes, aparecieron los “micro arrays” (en adelante utilizaremos arrays) de proteínas. Los arrays
de proteínas son una plataforma que permite el análisis masivo, en paralelo y simultáneo de
interacciones proteicas. En general, las proteínas se depositan e inmovilizan sobre superficies planas,
permitiendo el estudio de un gran número de proteínas y/o de interacciones, confiriendo a este tipo
de plataforma un gran potencial para la caracterización biológica de poblaciones celulares o tejidos.
Hasta la fecha, se han desarrollado y empleado diferentes formatos de arrays de proteínas en distintas
aplicaciones, donde se incluyen la identificación de biomarcadores o el desarrollo de vacunas.
Un microarray de proteínas (o chip de proteína) es un método de alto rendimiento utilizado para
el seguimiento de las interacciones y las actividades de las proteínas, y para determinar su función, y
la determinación de la función en una gran escala.
El concepto y la metodología de microarrays de proteínas fue introducido por primera vez y se ilustra
en microarrays de anticuerpos (también conocidos como matriz de anticuerpo ) en 1983 en una
publicación científica y una serie de patentes. La tecnología de alto rendimiento tras el microarray
de proteínas fue relativamente fácil de desarrollar, ya que se basa en la tecnología desarrollada
para los microarrays de ADN , que se han convertido en los más utilizados microarrays .
En términos generales, los arrays de proteínas pueden clasificarse en microarrays diana
("target"), arrays en fase reversa y microarrays in situ (Figura 4).
Figura 4. Esquema de distintos in situ arrays de proteínas. a.-NAPPA arrays. b.- PISA arrays. c.-
Puromycin arrays.
En los arrays de proteínas diana, los agentes de captura pueden ser de distinta naturaleza (p.ej:
anticuerpos o proteínas recombinantes) y se inmovilizan sobre la superficie del array para luego
incubarse con la muestra de interés. Estos arrays se emplean comúnmente para el estudio de patrones
diferenciales de expresión proteica, de acuerdo a su afinidad, especificidad u otras características. No
obstante, pueden presentar algunas limitaciones, tales como reactividad cruzada y/o pérdida de
actividad de las proteínas inmovilizadas. En general, se ha desarrollado un amplio abanico de posibles
aplicaciones en investigación clínica, particularmente en el campo de la inmunología.
A su vez, los arrays de fase reversa (RPP) se generan mediante la inmovilización de lisados celulares
o de tejidos o fluidos corporales, para la posterior detección de proteínas de interés mediante
anticuerpos específicos contra las proteínas diana. Esta interacción antígeno-anticuerpo se visualiza
mediante el empleo de anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta que permita amplificar la
señal de detección. En este caso, la intensidad de la señal será directamente proporcional a la
especificidad, la afinidad y la accesibilidad espacial entre la proteína diana y el anticuerpo. Por todo
ello, la probabilidad de no detectar una proteína de interés es relativamente alta, si se encuentra en
muy baja concentración, o si el anticuerpo empleado tiene escasa afinidad por la misma. Los arrays
RPP se han empleado con éxito para el análisis de modificaciones post-transducionales o para el
estudio de las rutas de señalización; por lo cual, resultan relevantes a la hora de generar mapas
funcionales de vías de señalización celular de interés en el desarrollo de terapias personalizadas.
Finalmente, en el caso de los arrays de proteínas in situ se emplean en sistemas de expresión libres
de células (p. ej.: E. coli 30 o germen de trigo). Para dotar de contenido a estos arrays, se requiere una
colección de clones que contengan los ORF ( "Open Reading Frame"). Durante los últimos años se
han desarrollado numerosos tipos de arrays de proteínas in situ; entre ellos destacan: PISA arrays (
“Protein in situ arrays”), DAPA arrays ( “Printing protein arrays from DNA arrays”), NAPPA arrays
( “Nucleic Acids Programmable Protein Arrays”) ( Figura 4).
3. Constitución
El chip consta de una superficie de soporte tal como un portaobjetos de vidrio, membrana de
nitrocelulosa, perla o placa de microtitulación , a la que una serie de proteínas de captura es
obligado. de la sonda moléculas, normalmente marcados con un colorante fluorescente, se añaden a
la matriz. Cualquier reacción entre la sonda y la proteína inmovilizada emite una señal fluorescente
que es leído por un escáner láser .
4. La motivación para el desarrollo
Microarrays de proteínas se desarrollaron debido a las limitaciones del uso de microarrays de ADN
para determinar los niveles de expresión génica en proteómica . La cantidad de ARNm en la célula a
menudo no refleja los niveles de expresión de las proteínas que corresponden dado que por lo general
es la proteína, más que el ARNm, que tiene el papel funcional en la respuesta de las células, se
necesitaba un enfoque novedoso. Además modificaciones post-traduccionales , que a menudo son
críticas para la determinación de la función de proteínas, no son visibles en microarrays de
ADN. Microarrays de proteínas reemplaza las técnicas tradicionales tales como la proteómica
electroforesis 2D en gel o cromatografía , que se consume mucho tiempo, mano de obra y tratos
adecuado para el análisis de proteínas de baja abundancia.
5. Hacer la matriz
Las proteínas están dispuestos sobre una superficie sólida tal como portaobjetos de microscopio,
membranas, perlas o placas de microtitulación. La función de esta superficie es proporcionar un
soporte sobre el cual las proteínas pueden ser inmovilizados. Se debe demostrar propiedades de unión
máxima, mientras que el mantenimiento de la proteína en su conformación nativa de modo que se
conserva su capacidad de unión. Los portaobjetos de vidrio o silicio son una opción popular, ya que
son compatibles con los arrayers robóticos fácilmente obtenidos y escáneres láser que se han
desarrollado para la tecnología de microarrays de ADN.
La superficie sólida elegido se cubre entonces con un recubrimiento que debe servir las funciones
simultáneas de inmovilización de la proteína, evitando su desnaturalización , orientándolo en la
dirección apropiada de modo que sus sitios de unión son accesibles, y proporcionar
un hidrófilo entorno en el que la reacción de unión puede ocurrir. Además, también necesita mostrar
no específica mínima de unión con el fin de minimizar el ruido de fondo en los sistemas de
detección. Además, tiene que ser compatible con los diferentes sistemas de detección. Agentes de
inmovilización incluyen capas de aluminio o de oro, polímeros hidrófilos, y los geles de
poliacrilamida , o el tratamiento conaminas , aldehídos o epoxi . Tecnologías de película delgada
como la deposición física de vapor (PVD) y deposición química de vapor (CVD) se emplean para
aplicar el recubrimiento a la superficie de apoyo.
Un ambiente acuoso es esencial en todas las etapas de fabricación matriz y operación para evitar la
desnaturalización de proteínas. Por lo tanto tampones de muestra contienen un alto por ciento
de glicerol (para bajar el punto de congelación), y la humedad del entorno de fabricación se regula
cuidadosamente. Microcubetas tienen la doble ventaja de proporcionar un ambiente acuoso al tiempo
que evita la contaminación cruzada entre las muestras.
En el tipo más común de la matriz de proteína, robots colocan un gran número de proteínas o
sus ligandos sobre un soporte sólido recubierto en un patrón predefinido. Esto se conoce como
impresión por contacto robótico o manchado robótico. Otro método de fabricación es de tinta de
chorro , una, el método sin contacto drop-on-demand de dispersar los polímeros de la proteína sobre
la superficie sólida en el patrón deseado. piezoeléctrico manchado es un método similar a la
impresión de chorro de tinta. El cabezal de impresión se mueve a través de la matriz, y en cada lugar
utiliza la estimulación eléctrica para entregar las moléculas de proteína sobre la superficie a través de
pequeños chorros. Este es también un proceso sin contacto. La fotolitografía es un cuarto método de
poner en orden las proteínas sobre la superficie. La luz se utiliza en asociación con máscaras , placas
opacas con agujeros o transparencias que permiten que la luz brille a través de un patrón definido. Una
serie de tratamientos químicos a continuación, permite la deposición de la proteína en el patrón
deseado sobre el material de debajo de la fotomáscara.
Las moléculas de captura dispuestos en la superficie sólida pueden
ser anticuerpos , antígenos , aptámeros (ligandos basados en ácidos nucleicos), aficuerpos (moléculas
pequeñas diseñados para imitar los anticuerpos monoclonales), o proteínas de longitud
completa. Fuentes de tales proteínas incluyen sistemas basados en células de expresión de proteínas
recombinantes , la purificación a partir de fuentes naturales, la producción in vitro por sistemas de
traducción libres de células , y métodos sintéticos para péptidos . Muchos de estos métodos pueden
ser automatizados para la producción de alto rendimiento, pero se debe tener cuidado para evitar las
condiciones de síntesis o extracción que resultan en una proteína desnaturalizada que, puesto que ya
no reconoce a su pareja de unión, hace que la matriz inútil.
Las proteínas son altamente sensibles a cambios en su microambiente. Esto presenta un desafío en el
mantenimiento de arrays de proteínas en una condición estable durante largos períodos de tiempo. En
situ métodos implican la síntesis en el chip de proteínas, cuando sea necesario, directamente a partir
del ADN usando sistemas de expresión de proteínas libres de células. Dado que el ADN es una
molécula muy estable que no se deteriora con el tiempo y por lo tanto es adecuado para el
almacenamiento a largo plazo.Este enfoque también es ventajosa porque evita los procesos laboriosos
y, a menudo costosos de purificación de proteínas y separada de clonación de ADN , ya que las
proteínas se hacen y se inmovilizan de forma simultánea en un solo paso sobre la superficie del
chip. Ejemplos de técnicas in situ en Are PISA (proteína en conjunto situ), NAPA (ácido nucleico
programable gama de proteínas) y DAPA (matriz de ADN a la matriz de proteínas).
5.1. Tipos de matrices
Hay tres tipos de microarrays de proteínas que se utilizan actualmente para estudiar las actividades
bioquímicas de las proteínas.
a. Microarrays analíticos también son conocidos como matrices de captura.
En esta técnica, una biblioteca de anticuerpos, aptámeros o aficuerpos se vistió sobre la superficie de
apoyo. Estos se utilizan como moléculas de captura ya que cada une específicamente a una proteína
particular. La matriz se sondeó con una solución de proteína compleja, tal como un lisado celular . El
análisis de las reacciones de unión resultantes utilizando diversos sistemas de detección pueden
proporcionar información sobre los niveles de expresión de determinadas proteínas en la muestra, así
como las mediciones de afinidades y especificidades de unión. Este tipo de microarrays es
especialmente útil en la comparación de la expresión de proteínas en diferentes soluciones. Por
ejemplo, la respuesta de las células a un factor particular puede ser identificado mediante la
comparación de los lisados de células tratadas con sustancias específicas o cultivados bajo ciertas
condiciones con los lisados de las células de control. Otra aplicación es en la identificación y
elaboración de perfiles de los tejidos enfermos.
b. Microarrays de proteínas funcionales (también conocidos como matrices de proteína
diana) se construyen mediante la inmovilización de grandes cantidades de proteínas
purificadas y se utilizan para identificar proteína-proteína, proteína-DNA, en proteínas de
ARN , en proteínas fosfolípido , y las interacciones de moléculas de proteína pequeñas, para
ensayar actividad enzimática y para detectar anticuerpos y demostrar su especificidad. Se
diferencian de las matrices de análisis en que las matrices de proteínas funcionales están
compuestos de matrices que contienen proteínas funcionales de longitud completa o dominios
de la proteína. Estos chips de proteínas se utilizan para estudiar las actividades bioquímicas
de todo el proteoma en un solo experimento.
c. Microarrays de proteínas de fase inversa (RPPA) implican muestras complejas, tales
como lisados de tejidos. Se aislan las células de diversos tejidos de interés y se lisan. El lisado
se vistió sobre el microarray y se sondeó con anticuerpos contra la proteína diana de
interés. Estos anticuerpos se detectan normalmente con quimioluminiscente , fluorescente
o colorimétricas ensayos. Los péptidos de referencia se imprimen en las diapositivas para
permitir la cuantificación de proteínas de los lisados de la muestra. RPA permiten la
determinación de la presencia de proteínas alteradas u otros agentes que pueden ser el
resultado de la enfermedad. Específicamente, las modificaciones post-traduccionales, que
típicamente son alterados como resultado de la enfermedad se pueden detectar utilizando
RPA.
6. Detección
Los métodos de detección de proteínas matriz deben dar una señal de alto y un fondo bajo. El método
más común y ampliamente utilizado para la detección es el etiquetado de fluorescencia que es
altamente sensible, seguro y compatible con escáneres láser de microarrays fácilmente
disponibles. Otras etiquetas se pueden utilizar, tal como la afinidad, fotoquímicos o un radioisótopo
las etiquetas. Estas etiquetas están unidas a la propia sonda y pueden interferir con la reacción de la
proteína sonda-diana. Por lo tanto un número de métodos de detección libre de la etiqueta están
disponibles, tales como resonancia de plasmón superficial (SPR), nanotubos de carbono, sensores de
nanocables de carbono (donde se produce la detección a través de cambios en la conductancia) y del
sistema microelectromecánicos (MEMS) voladizos. Todos estos métodos de detección gratuitas
etiqueta son relativamente nuevo y todavía no son adecuados para la detección de la interacción de
proteínas de alto rendimiento; sin embargo, sí ofrecen una gran promesa para el futuro.
6.1. Métodos de detección asociados a los arrays de proteinas
En general, en el método de detección ideal para arrays de proteínas debe conocerse su sensibilidad
y límite de detección, su rango dinámico, capacidad de multiplicación “multiplex” y su nivel de
resolución. Aunque en la actualidad existen diversos métodos de detección para arrays de proteínas,
estas pueden agruparse genéricamente en métodos basados en etiquetas y métodos libres de etiquetas.
6.1.1. Métodos basados en marcaje con etiquetas
Hasta la fecha, en la gran mayoría de aplicaciones de los microarrays de proteínas se emplean técnicas
de detección basadas en etiquetas, debido a la amplia disponibilidad tanto de reactivo como de la
instrumentación. Además, se están introduciendo nuevas estrategias con la incorporación de
nanoetiquetas como las quantum dots, nanotubos de carbono, etc.... Incluso se han obtenido resultados
muy prometedores combinando el uso de microesferas fluorescentes y citometría de flujo.
Marcaje fluorescente convencional
Entre los primeros procedimientos de detección aplicados a arrays de proteínas merece destacar los
radioisótopos (por ej.: 32P) empleados con éxito en el estudio de interacciones proteicas.
Posteriormente, adquiere especial relevancia el uso de fluorocromos convencionales (fluoresceína,
BODIPY, cianinas,…). En este caso, la elección de los fluorocromos es importante, dependiendo de
la naturaleza de la muestra y el soporte, de los espectros de emisión y excitación, la auto-fluorescencia
presente en la muestra/array.
En este área, las cianinas (p.ej.: Cy3 y Cy5) se encuentran entre los flurocromos más empleados para
la detección en microarrays de proteínas; debido principalmente a su mínima interacción con otras
biomoléculas, su elevada intensidad y la gran versatilidad de conjugación química.
Además, su combinación permite el empleo de ≥ 2 fluorocromos para la identificación simultánea de
múltiples biomarcadores, tal como se ha desarrollado tanto en cáncer de próstata y en suero de
pacientes con fibrosis quística . En este sentido, los arrays de proteínas permiten el estudio simultáneo
con respecto a los ensayos tipo "sandwich" con una capacidad limitada (<50 antígenos). Además, los
arrays de anticuerpos se han utilizado con éxito para el estudio de vías de señalización como
ErbB/Neu de la familia de EGFR . En este sentido, destaca recientemente una nueva estrategia con
dos fluorocromos para la detección de proteínas séricas con un array de anticuerpos, que permitió
analizar un total de 75 citoquinas con sensibilidades de femtomolar .
6.1.2.-Métodos de detección para arrays de esferas
6.1.2.1. Arrays de esferas de citometría de flujo
Tradicionalmente, la citometría de flujo (CF) se ha empleado para la identificación y caracterización
de distintas poblaciones celulares evaluando entre otras, sus características fenotípicas. Últimamente,
la CF se ha empleado para la detección de proteínas solubles presentes en fluidos corporales o en
lisados celulares empleando microesferas .
De esta última metodología, nacen los arrays de microesferas basado en el empleo simultáneo de
distintas poblaciones de microesferas marcadas con varios fluorocromos, recubiertos cada una por
anticuerpos diferentes, a incubar muestra biológica de interés. Para el revelado de la unión de
proteínas diana a las microesferas en un CF se dispondrá al menos de dos láseres, para el análisis
cualitativo y cuantitativo de dichas poblaciones. El número de láseres y detectores, la configuración
de los filtros y el procesamiento de datos está directamente relacionado con el número de anticuerpos
y fluorocromos; por tanto de proteínas diana a ser evaluadas simultáneamente.
Respecto a las técnicas fluorescentes convencionales, la CF permite la evaluación cuantitativa-
cualitativa rápida y precisa de un número elevado de proteínas, con bajo coste y alta sensibilidad.
Recientemente, se ha desarrollado un gran número de ensayos basados en microesferas con
anticuerpos de captura para la detección simultánea de múltiples analitos provenientes de distintas
fuentes de muestras (Figura 5).
Figura 5.-Arrays de proteínas basados en esferas. a.-Arrays de anticuerpos para detección por
citometría de flujo. b.-Arrays de anticuerpos en microesferas magnéticas. c.-Quantum-dots . d.-
Nanopartículas magnéticas.
Últimamente se ha descrito una plataforma para la detección de proteínas aisladas de diferentes
compartimentos celulares mediante técnicas combinadas de cromatografía por exclusión y citometría
de flujo . El análisis mediante esta plataforma bidimensional, proporciona información sobre los
perfiles de elución permitiendo la identificación a gran escala de complejos proteicos en distintas
fracciones cromatográficas.
En la actualidad, existen en el mercado arrays de esferas dirigidas a detectar múltiples proteínas
solubles por CF dirigidas a aplicaciones concretas en investigación básica y clínica, como una
plataforma versátil para la evaluación y análisis de interacciones proteicas .
Sistemas de esferas magnéticas.
Desde hace tiempo se emplean sistemas de esferas magnéticas acopladas con anticuerpos para la
detección de proteínas diana (Figura 5). Esta plataforma permite la captura de proteínas solubles con
una alta reproducibilidad y sensibilidad, asociada a un bajo ruido de fondo, un amplio rango dinámico
y bajo coste . Recientemente, se ha realizado una comparación entre la utilidad de estos arrays de
anticuerpos acoplados a esferas magnéticas para la detección de 12 auto-antígenos en 21 muestras de
suero de pacientes con enfermedades de carácter autoinmune, demostrándose las múltiples ventajas
del nuevo método.
6.1.2.2 Sistemas de revelado fluorescente mediante Quantum dots
Los “Quantum dots” (QDs) son nano-cristales, formados por un núcleo de material semiconductor y
fluorescente (por ej.: seleniuro de cadmio) recubierto de otro semiconductor (por ej.: sulfuro de
cadmio o de zinc), que presentan propiedades ópticas muy estables y un gran hueco entre las
longitudes de onda de emisión y excitación del complemento (Figura ). Estos compuestos presentan
un amplio abanico de aplicaciones de técnicas de imagen, y otros métodos (p. ej. citometría de flujo)
dirigidos a la detección de biomarcadores en muestras biológicas .
Los QDs son partículas nanométricas que se pueden conjugar con moléculas utilizadas para el bio-
reconocimiento (péptidos o anticuerpos) de componentes celulares, siendo su utilización como
etiquetas biológicas o sondas fluorescentes. Respecto a los fluorocromos tradicionales, proporcionan
ventajas relacionadas con una elevada fluorescencia, mayor foto-estabilidad, excitación multicolor,
un espectro de emisión ajustable y estrecho, y su mayor rendimiento cuántico, comparados con los
fluorocromos orgánicos (39, 18). En otras aplicaciones, los QDs se han utilizado unidos a
estreptavidina para la detección de citocinas con un array de anticuerpos . Asimismo, los QDs se han
asociado a una mayor sensibilidad a la hora de la identificar biomarcadores tumorales, p. ejem.: CEA,
CA125) en suero de pacientes de cáncer .
No obstante, estos compuestos presentan baja estabilidad y corta vida media, debido a su elevada
susceptibilidad a la oxidación y la fotolisis. Además, el uso de este tipo de compuestos se asocia a
riesgos para la salud humana y el medio ambiente.
6.1.2.3. Nanopartículas magnéticas como etiqueta
Las nanopartículas de oro constituyen otra herramienta atractiva para los arrays de proteínas, por sus
propiedades ópticas, eficiencia cuántica y compatibilidad con una amplia gama de longitudes de onda
. Hasta la fecha se han desarrollado inmunoensayos con nanopartículas para la detección "multiplex"
del antígeno prostático específico (PSA), alcanzándose una sensibilidad relativamente elevada con
un límite de detección en el suero de concentraciones 300 amol . De forma similar, se han detectado
moléculas anti-bacterianas, pudiendo discriminar selectivamente entre diferentes cepas de bacterias .
6.1.3. -Métodos de detección libres de etiqueta (“label-free”)
En la actualidad existe un gran interés en el empleo de metodologías de detección que superen las
limitaciones asociadas al uso de etiquetas, especialmente aquellas relacionadas con la conjugación y
la alteración de las biomoléculas.
Las técnicas de detección sin etiqueta son útiles en el estudio de cinéticas de interacción proteicas,
evitando los impedimentos estéricos causados por la presencia de etiquetas.
En el área de los arrays de proteínas, uno de los principales requisitos para los métodos de detección
es su compatibilidad con formatos masivos, la detección de pequeñas moléculas y la existencia de un
amplio rango dinámico. En este sentido, en la actualidad existen diferentes aproximaciones a la
detección de interacciones proteicas , empleando arrays de proteínas, destacando la resonancia de
plasmon superficial, microcantilevers y la microscopia de fuerza atómica.
6.1.3.1..-Resonancia de Plasmón Superficial (SPR)
La tecnología SPR se basa en la generación de plasmones en una superficie. Los plasmones son
oscilaciones de electrones libres propagadas paralelamente a la interfase metal/medio, lo que permite
medir los cambios en el índice de refracción de la superficie del sensor . La aparición de asociaciones
o disociaciones moleculares se traduce en plasmones superficiales que dependen de la variación de
intensidad de la luz reflejada y/o el ángulo de incidencia (Figura 6). De esta forma, los SPR permiten
determinar la relación entre la asociación y disociación de biomoléculas entre sí, además también
permite evaluar la afinidad y especificidad dichas interacciones, facilitando la medición de
interacciones biomoleculares en tiempo real con alta sensibilidad . Por sus características, esta
tecnología resulta muy prometedora y atractiva en investigación biomédica.
A modo de ejemplo, Lausted et al. emplearon SPRi para la detección de biomarcadores tumorales
con fines diagnósticos mediante arrays de anticuerpos.
6.1.3. 2. Microcantilevers
Los microcantilevers son láminas finas de silicio recubiertas de una superficie de oro asociadas a
sistemas nanomecánicos de reconocimiento biomolecular. Por este motivo, se inmovilizan los
anticuerpos o proteínas sobre dichas láminas, de forma que cuando existe una interacción entre estas
moléculas y sus posibles ligandos podemos medir la variación en la posición de la lámina empleando
distintos sistemas ópticos o electrónicos (Figura 6).
Figura 6.-Métodos de detección sin marcaje ( "label-free") para arrays de proteínas.a.-Resonancia
de Plasmón Superficial. b.-Microcantilevers. c.-Microscopía de Fuerza Atómica. Sobre este modelo
de plataforma de detección, se han evaluado interacciones proteicas de distintos fármacos en
diferentes áreas clínicas. Dado que se trata de un sistema relativamente simple, rápido y de fácil
utilización, los microcantilevers representan una herramienta prometedora para ser empleadas en
combinación con los arrays de proteínas para la detección de interacciones biomoléculares.
2.3.-Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)
Brevemente, se podría describir la AFM como el análisis a nivel microscópico observando
únicamente las variaciones topológicas de la superficie de un objeto (Figura 6). En los últimos años,
esta herramienta de análisis microscópico de la superficie de los arrays de proteínas, se ha utilizado
para la evaluación de la inmovilización de biomoléculas con una resolución micrométrica, y para la
detección de interacciones proteicas. Con esta tecnología, Soultani-Vigneron et al. desarrolló una
técnica para la inmovilización de oligopéptidos en microarrays de proteínas combinando AFM,
espectroscopía infrarroja y microscopia de fluorescencia.
7. Aplicaciones
Hay cinco áreas principales en las que se están aplicando arrays de proteínas: diagnóstico, la
proteómica, análisis funcional de proteínas, caracterización de anticuerpos y desarrollo del
tratamiento
Diagnóstico implica la detección de antígenos y anticuerpos en muestras de sangre; la
elaboración de perfiles de los sueros para descubrir nuevas enfermedadesbiomarcadores ; la
vigilancia de las enfermedades y las respuestas a la terapia en la medicina personalizada; la
vigilancia del medio ambiente y la comida.
La proteómica se refiere a la expresión de proteínas de perfiles es decir, que las proteínas se
expresan en el lisado de una célula particular.
Análisis funcional La proteína es la identificación de las interacciones proteína-proteína (por
ejemplo, identificación de los miembros de un complejo de proteínas), las interacciones
proteína-fosfolípido, blancos pequeños de moléculas, enzimáticos sustratos (en particular los
sustratos de quinasas ) y los ligandos del receptor.
Caracterización de anticuerpos está caracterizando reactividad cruzada , especificidad y
cartografía epítopos .
El tratamiento implica el desarrollo el desarrollo de terapias específicas de antígeno para la
autoinmunidad , el cáncer y las alergias; la identificación de objetivos pequeños molécula
que potencialmente podría ser utilizado como nuevos medicamentos.
8. Retos
Los desafíos incluyen:
La búsqueda de una superficie y un método de fijación que permite a las proteínas para
mantener su secundaria o estructura terciaria y por lo tanto su actividad biológica y sus
interacciones con otras moléculas,
La producción de una matriz con una larga vida útil de modo que las proteínas en el chip no
desnaturalizar durante un corto período de tiempo,
Identificación y aislamiento de anticuerpos u otras moléculas de captura en contra de cada
proteína en el genoma humano,
La cuantificación de los niveles de proteína unida asegurando al mismo tiempo la sensibilidad
y evitando el ruido de fondo,
Extraer la detectada proteína desde el chip con el fin de analizar más a fondo que,
La reducción de la unión no específica por los agentes de captura,
La capacidad del chip debe ser suficiente como para permitir una representación completa
del proteoma a ser visualizado como sea posible; proteínas abundantes abruman la detección
de proteínas menos abundantes como moléculas de señalización y los receptores, que
generalmente son de mayor interés terapéutico.
Ventajas
Su principal ventaja radica en el hecho de que gran número de proteínas pueden ser rastreados
en paralelo.
Microarrays de proteínas son rápido, automatizado, económico y altamente sensible, el
consumo de pequeñas cantidades de muestras y reactivos.
V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
"Protein Arrays". Functionalgenomics.org.uk. 2009-05-20. Retrieved 2013-01-19.
BOTERO-HINCAPIÉ, J. A. & HERNANDEZ, F. J. (2014). APTÁMEROS: AGENTES
DIAGNÓSTICOS Y TERAPÉUTICOS.Vitae, 21(1) S81-S82. Recuperado de
http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=169831208040
Protein chip technology .Obtenido de:
ftp://trf.education.gouv.fr/pub/edutel/siac/siac2/jury/agreg_ext/bio42.pdf
Nat. Biotechnol. (2002), 20, 1189-1190.
4. Nanobiotechnology 2010, 8: 10.
