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27/05/2015
1
ANÁLISE DE IMAGENS EM
TECNOLOGIA DE SEMENTES
Produção de Sementes (LPV-5705)
Pós-graduação - Fitotecnia
Primeiro Semestre de 2015
C.C.
Francisco Guilhien Gomes Junior
Tecnologia de Sementes
Depto de Produção Vegetal
USP/ESALQ
Permitida a cópia desde que citada a fonte. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação de direitos
autorais, sob pena da Lei nº 9.610, de 19 de fevereiro de 1998
11/05/2012 13h10 - Atualizado em 11/05/2012 14h14
Satélite russo registra maior foto já feita da Terra, com 121 megapixelsCada pixel da imagem corresponde a 1 km de distância
PIXEL, RESOLUÇÃO E TAMANHO DA IMAGEM
TamanhoO tamanho de uma imagem digital está definido no número de linhas e colunas que a forma
ResoluçãoCapacidade que um sistema de captura/reprodução de imagens tem para reproduzir detalhes
A resolução de uma imagem é o número de pixels impressos ou exibidos por unidade de medida
Pixel: (“Pictures Elements”)É o menor ponto que forma uma imagem
27/05/2015
2
Imagem digital
Representação de uma imagem bidimensional usando números
binários codificados de modo a
permitir seu armazenamento,
transferência, impressão ou
reprodução, e seu processamento
por meios eletrônicos
x
y
Pixel = f(x,y)
Imagem digital
Imagem bitmapImagem vetorialCDR, AI e EPS TIFF, JPEG, PNG, GIF, BMP e PSD
Tipos de imagens digitais
Cada pixel
tem um valor
independente
de cor
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3
Esquerda: semente
de milho captada
em imagem de
100dpi, 256 tons de
cinza e 8bits.
Direita: ampliada 7x
em tela (700%)
Resolução de imagem digital
Teixeira (2004)
Propriedades das cores
RGB - Modelo aditivo CMYK - Modelo subtrativo
Escala de cinzas
Fonte: Google
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4
28 x 28 x 28
16,7 milhões de
cores
Modelo
RGB
8 bits
Escala de
cinzas
8 bits
Pixel = f(x,y)
Pixel = f(x,y)28
256 níveis
x
y
x
y
Bits nos modelos RGB e escala de cinzas
Imagem digital
Níveis de cinza
2568 bits
1287 bits
646 bits
325 bits
164 bits
83 bits
42 bits
21 bit
Marques Filho e Vieira Neto (1999)
IMAGEM BINÁRIA
27/05/2015
5
Procedimentos não destrutivos para avaliação da
qualidade de sementesRaios X
Microtomografia computadorizada de raios X
Tomografia por ressonância magnética
Câmera multiespectral
Fluorescência de clorofila
Avaliação de características físicas e morfológicas
de sementes e de plântulasDescritores de cor, forma e tamanho das sementes
Avaliação do vigor de sementes com base em imagens
digitais de plântulas
Análise de imagens de sementes e de
plântulas
Procedimentos não destrutivos para avaliação da qualidade de sementes
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6
RAIOS X
Procedimentos não destrutivos para avaliação da qualidade de sementes
Raios X
Descoberta dos raios X
Físico alemão Wilhelm Conrad Röntgen (1845-1923)
8 de novembro de 1895: primeira chapa de raios X
Fonte: google
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7
Raios X
Características dos raios X
Fonte: google
Como os raios X são gerados?
filme
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8
Fatores que afetam o nível de absorção
dos raios X pela semente
Espessura e densidade dos tecidos
Fonte: google
Composição química da semente
Espécie Proteínas (%) Carboidratos (%) Lipídios (%) Estrutura
Algodão 39 15 33 Embrião
Amendoim 31 12 48 Embrião
Arroz 8 65 2 Endosperma
Ervilha 25 52 6 Embrião
Feijão 23 56 1 Embrião
Girassol 17 19 46 Embrião
Mamona 18 0 64 Endosperma
Milho 10 80 5 Endosperma
Soja 37 26 17 Embrião
Trigo 12 75 2 Endosperma
Adaptado de Bewley e Black (1985)
Principais reservas armazenadas em sementes
de algumas espécies de interesse econômico
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Composição porcentual de reservasarmazenamdas em diferentes partes da semente de milho, cv. Iowa 939
Reserva Semente Endosperma Embrião
Proteínas 8 7 19
Amido 74 88 9
Lipídios 4 <1 31
Bewley e Black (1985)
Endosperma
Embrião
A composição química da semente define seu grau de avidez
por água
O teor de água da semente influencia a densidade óptica
35% de água 15% de água
Imagens radiográficas de sementes de Tucumã
(Astrocaryum aculeatum) apresentando
diferentes graus de umidade
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Comprimento de onda () da radiaçãoionizante
Raios X de menor comprimento de onda possuem maior poderde penetração
objetos menos densos objetos mais densos
O TESTE DE RAIOS X
interpretação
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O TESTE DE RAIOS X
interpretação
Trinca 3Trinca 1
Trinca 2
Radícula
Plúmula
Raízes seminais
ISTA (2003) e RAS (2009)
Recomendado com a
finalidade básica de
detectar sementes cheias,
vazias, com injúrias
mecânicas ou atacadas
por insetos
1 mm
Crotalaria juncea L.
radícula
hipocótilo
plúmula
cotilédones
tegumento
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Viabilidade da utilização de raios X emsementes
CAUSA EFEITO
Radiografia de semente
de milho doce
A pequena dose de radiação usada durante o teste não exerceinfluência negativa sobre a germinação (não provocamutação)
Não inviabiliza a
semente (método não
destrutivo): relações
de causas e efeitos
Gomes-Junior e Cicero (2012)
ISTA - desde a década de 1980 (detecção de sementes
vazias, danificadas mecanicamente ou por insetos).
RAS 2009 – capítulo específico (16) sobre o teste de
Raios X para análise de sementes
Histórico
Início da década de 1950 na Suécia: avaliação da
qualidade de sementes de Pinus sylvestris L.
(Simak e Gustafsson,1953)
Pinus sylvestris L.
Primeiro trabalho foi realizado por Lundström em
1903: sementes de coníferas
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Raios X
Aplicações em Tecnologia de Sementes
Detecção de anormalidades em embriões
Determinação do estádio de desenvolvimento das
sementes
Estudos de alterações fisiológicas durante os
processos de maturação, secagem, germinação ou
condicionamento fisiológico
Identificação de injúrias mecânicas, injúrias causadas
por insetos ou injúrias decorrentes de outros fatores
adversos em pré e pós-colheita
Seleção de sementes cheias
Base para utilização de programas computadorizados
na avaliação de alterações da morfologia interna
Embrião
deformadoPA
Embrião com
pequeno defeito PA
PNEmbrião sem
defeito
Socolowski e Cicero (2008)
Tecoma stans
Raios X
Detecção de anormalidades em embriões
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Raios X
Identificação de injúrias mecânicas
Gomes-Junior e Cicero (2012)
Flor et al. (2004)
milho doce
soja
Plântula anormal
Plântula anormal
Raios X
Identificação de injúrias por “umidade”
Injúrias severas no eixo
embrionário
Injúrias severas na
região dos cotilédones
Plântula anormal
soja
Forti et al. (2010)
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Menezes et al. (2012)
Semente de
arroz: secagem
a 50o C
Raios X
Identificação de injúrias causadas por secagem
Caruncho em
feijão-caupi
Melo et al. (2010)
Raios X
Identificação de injúrias causadas por insetos
Forti et al. (2008)
Percevejo em
feijão
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Raios X
Seleção de sementes cheias
Totalmente formada Parcialmente formada Não formada
(Carvalho et al., 2010)
Sementes
de mamona
Área do embrião = 57%
Raios X
Base para utilização de programas computadorizados na
avaliação de alterações da morfologia interna
Espaço livre interno total = 1,28 mm2
Semente
de algodão
Semente de
Xylopia aromatica
Sokolowski et al. (2011)Marcos-Filho et al. (2010)
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1 Moega de entrada de sementes
2 Tubo de raios X
3 Ampliação da imagem
4 Interface de usuário
5 Unidade de classificação
Posicionamento
da semente
Obtenção da
imagem radiográficaAnálise e processamento
dos dadosClassificação
Raios X no controle de qualidade de
sementes
Fonte: google (adaptado)
Tomografia computadorizada de
raios X (TC)
É uma técnica que permite a visualização de
seções transversais (cortes internos) de um
objeto de forma não destrutiva
A captura é feita através de uma série de
pequenas rotações
As informações de atenuação da radiação que
atravessa o objeto são gravadas para um plano
de interesse
Um algoritmo processa os dados para formar
uma imagem 2D
A combinação dessas imagens pode gerar a
visualização em 3D
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Microtomografia de raios X
Tubo de
raios X
Intensificador
de imagem
Câmera
CCD
Projeções
Imagem 3D
Algoritmo de reconstrução
Seções
Análise das imagens
Determinação de
parâmetros físicos
Modelo 3D
Sistema de
circulação
Amostra
Tomografia e microtomografia de raios X
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A tomografia por ressonância magnética
utiliza fortíssimos campos magnéticos e
ondas de rádio para formar imagens de
uma amostra
São utilizados os pulsos de
radiofrequência direcionados somente ao
hidrogênio contido na amostra
O excesso de energia liberado pelos
prótons de hidrogênio quando o pulso de
radiofrequência é desligado emite um
sinal de uma bobina para o computador
Por meio de cálculos matemáticos os
sinais são transformados em uma
imagem
Tomografia por ressonância magnéticaTomografia
Prótons de hidrogênio sob ação do
campo magnético externo
Campo magnético
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Tomografia por ressonância magnética
Método não invasivo
Informações sobre o estado químico e físico dos
materiais
Informações sobre o estado fisiológico e as
condições de metabolismo em sistemas biológicos
Não emprega radiação ionizante e não exige o uso
de meios de contraste
Diferencia claramente cada tipo de tecido mole,
mesmo que estes tecidos tenham a mesma
densidade, quando seus estados fisiológicos
diferem entre si
Raios X RM
Soja
Imagens: Francisco G Gomes Junior
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Imagem: Francisco G Gomes Junior
Imagem: Francisco G Gomes Junior
Milho: RM
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Monitoramento da secagem de sementes de cevada
Seefeldt et al. (2007)
Imagem por ressonância magnética
5 min 2 h 5 min 5 h 5 min 6 h 5 min
8 h 5 min 11 h 5 min 12 h 5 min 17 h 5 minKoizumi et al. (2008)
Monitoramento da hidratação de sementes de soja
Imagem por ressonância magnética
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Câmera multiespectral
Imagem multiespectral: imagens de um mesmo objeto, tomadas com diferentes comprimentos de ondas eletromagnéticas (luz visível, infravermelha, ultravioleta, raios X ou qualquer outra faixa do espectro)
Imagem colorida tradicional
Utiliza três filtros
para as bandas
Red, Green e
Blue
Imagem RGB
Limite do
Infravermelho
Comprimento de onda (nm)
Resposta
rela
tiva
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Imagem multiespectral
ultravioleta infravermelho
Clorofila b
Clorofila a
Comprimento de onda (nm)
Absorb
ância
Imagem colorida tradicional
Clorofilas a e b
apresentam
quase o mesmo
sinal RGB
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Clorofila b
Clorofila a
Comprimento de onda (nm)
Absorb
ância
Imagem multiespectral
Em comprimentos
de onda específicos
as clorofilas a e b
apresentam
diferentes sinais e
podem sem
identificadas
Identificação de fungos em sementes de
espinafre
Olesen et al. (2011)
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Identificação de fungos em sementes de
espinafreN
úm
ero
de p
ixe
lsN
úm
ero
de p
ixe
ls
Intensidade do pixel
Alternaria spp.
Cladosporium spp.
Fusarium spp.
Verticillium spp.
Stemphylium spp.
Sem infecção
Olesen et al. (2011)
Câmera multiespectral no controle de
qualidade de sementes
Entrada das sementes
Esteira móvel
Espectômetro e unidade de iluminação
Classificação:Sementes maduras e sadiasSementes imaturasSementes infectadas por fungos
Fonte: google (adaptado)
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Fluorescência de clorofila
Jalink et al. (1998)
A clorofila fluoresce quando
excitada em um determinado
comprimento de onda
1. Um laser ou uma luz de LED
excita a clorofila
2. Um filtro de largura de banda
estreita filtra a fluorescência
3. A clorofila da semente é
determinada
Fluorescência de clorofila em semente de
pimenta durante a germinação
Mé
dia
de
FC
/pix
el x1
00
0 (
va
lor
esca
la d
e c
inza
)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
40
30
20
10
0
Tempo (h)
68h 20min
50
http://www.phenovation.com
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Lote de baixo vigor
Ocorrência de sementes esverdeadas
Lote de alto vigor
Sinal de fluorescência, baixo para alto: pretovermelholaranjaamareloverde
Fluorescência de clorofila em sementes
de soja
http://www.phenovation.com
Avaliação de características físicas e morfológicas de sementes e de plântulas
Sementes
Plântulas
Câmera CCD
Escâner de mesa
Computador e programa
para análise de imagens
Imagens em Time-lapse
Descritores de cor, forma e
tamanho das sementes
Classificação do vigor
de lotes de sementes
Construção da imagem da semente
Curva de embebição (monitoramento)
Taxa de crescimento da raiz
Índices médios RGB
Descritores biomorfológicos Adaptado de Dell´Aquila (2006)
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Dell’Aquila (2009)
Índices RGB como indicadores da viabilidade
de sementes
Inicial Após envelhecimento
Escurecimento do tegumento de
sementes de lentilha após o
envelhecimento (51 dias a 40 °C
e teor de água de 14,4%)
Onobrychis viciifolia
Behtari et al. (2014)
Índices médios RGB como indicadores da
viabilidade de sementes
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Método direto para a
identificação de sementes
com alto potencial de
desempenho
Armazenamento das imagens
de plântulas
Resultados rápidos, objetivos
e precisos
Biossíntese incompleta
Membranas incompletas
MATURIDADE FISIOLÓGICA
Degeneração das membranas
Redução das atividades respiratórias e biossintéticas
Germinação lenta
Redução do potencial de conservação
Menor taxa de crescimento e de desenvolvimento
Menor uniformidade de desempenho
Maior sensibilidade a adversidades
Redução da emergência de plântulas em campo
Aberrações morfológicas (plântulas anormais)
Perda do poder germinativo
MORTE Adaptado de Delouche e Baskin (1973)
Avaliação automatizada do vigor de sementes baseada em imagens digitais de plântulas
Hipocótilo
Marcos-Filho et al. (2009)
Programas
Seed Vigor Imaging System (SVIS)
Análise Automatizada do Vigor de Sementes (Vigor-S)
Sistema de Análise de Plântulas (SAP)
Avaliação automatizada do vigor de sementes
alface soja
Foto: Miller B. McDonald
(Características morfológicas de plântulas)
Raiz
primária
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Finalidade da avaliação automatizada do
vigor de sementes
determinar o potencial de desempenho das plântulas em
campo e o estabelecimento do estande
Auxiliar os melhoristas na seleção de genótipos com
rápida emergência de plântulas ou com tolerância à seca
ou temperaturas altas
Monitoramento do desempenho de lotes de sementes ao
longo do armazenamento
Avaliar a eficiência do tratamento fungicida, da
peletização e do condicionamento fisiológico de sementes
75 a 80 °
Semeadura e posicionamento do substrato
Germinação:20 a 25 sementes por repetição
Temperatura constante
Substrato posicionado com angulação próxima da
vertical (75 a 80 ° em relação à horizontal)
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Seed Vigor Imaging System (SVIS)
Imagens de plântulas digitalizadas por meio de escâner:
as partes são identificadas e marcadas por software
específico
Imagem: Francisco G Gomes-Junior
escâner instalado na
posição invertida no interior
de uma caixa metálica
plântulas são transferidas
para a base da caixa
metálica
Obtenção de dados de comprimento da raiz
primária, do hipocótilo, das plântulas e da
relação raiz/hipocótilo
Hipocótilo
Raiz primária
Normalmente, são avaliadas plântulas com 3 e 4
dias de idade
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Processamento de uma imagem digital de
plântula de milho
256 tons de cinza
(8 bits)
300 dpi
Imagem binária Esqueleto em
imagem binária
Algoritmocontador de
pixels
Teixeira et al. (2006)
Cn = média aritmética
do comprimento (cm)
n = número de
plântulas medidas em
"pixels" sob resolução
(r) dada em dpi.
Resultados: SVIS (soja)
Comprimento da plântula em destaque (mm)Índice de vigor
CrescimentoUniformidade
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SVIS: índices de vigor para soja(plântulas com três dias de idade)
Proposta da Ohio Seed Improvement Association
Alto vigor: > 500
Vigor médio: 200 - 500
Baixo vigor: < 200
Proposta da Ohio State University
Vigor excepcional: 800 - 1000
Alto vigor: 600 - 799
Bom vigor: 400 - 599
Baixo vigor: 200 - 399
Grãos: < 200
Comp. plântula em azul: 7,8 cm
Índice de Crescimento: 837
Índice de Uniformidade: 947
Índice de Vigor: 870
Comp. plântula em azul: 4,5 cm
Índice de Crescimento: 435
Índice de Uniformidade: 925
Índice de Vigor: 582
Baixo vigor Alto vigor
Gomes-Junior et al. (2014)
Avaliação automatizada do vigor de sementes de feijão (programa SVIS)
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Cultivar Nitro
Lote Germ.(%) PCG (%) EASS (%) EP (%) IV IU
6 99 a* 96 a 97 a 99 a 902 ab 922 ab
7 88 b 80 b 77 b 92 b 752 c 882 c
8 99 a 97 a 97 a 100 a 918 a 907 bc
9 99 a 96 a 98 a 100 a 883 ab 934 a
10 99 a 93 a 95 a 95 a 861 b 921 ab
C.V. (%) 5,5 5,5 6,0 5,3 3,6 2,9
Marcos Filho et al. (2006)* Comparação na coluna (teste de Tukey: p≤ 0,05)
Avaliação automatizada do vigor de sementes
de melão: comparação com métodos tradicionais
Índice de VigorÍndice de
Uniformidade
Índice de vigor: 613
Crescimento: 541
Uniformidade: 782
Índice de vigor: 973
Crescimento: 995
Uniformidade: 924
Abóbora(3 dias de idade)
SVISImagens: Francisco G. Gomes Junior
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Eficiência comprovada do SVIS®
Alface - Sako et al. (2001)
Soja - Hoffmaster et al. (2003); Marcos Filho et al. (2009)
Milho - Otoni e McDonald (2005)
Milho doce - Gomes Junior et al. (2009); Alvarenga et al. (2012)
Melão - Marcos Filho et al. (2006)
Crotalária - Silva, C.B. et al. (2012)
Pepino - Chiquito et al. (2012)
Amendoin - Marchi et al. (2011)
Trigo - Silva, V.N. et al. (2012)
Girassol - Rocha (2012)
Tomate e berinjela - Silva, V.N. (2012)
Quiabo - Kikuti e Marcos Filho (2013)
Algodão - Alvarenga (2013)
Arroz – Gomes Junior et al. (2013)
Feijão - Gomes Junior et al. (2014)
Cuidados: SVIS
Temperatura no germinador
Otoni e McDonald et al. (2005)
Parâmetros
SVIS
Temperatura °C
Milho Soja
24 25 26 24 25 26
Crescimento 531 b 459 b 734 a 612 b 573 b 731 a
Uniformidade 832 b 861 a 859 a 867 a 872 a 870 a
Vigor 621 b 579 b 765 a 739 b 722 b 800 a
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Uniformidade de umedecimento do substrato
Grau de umidade e tamanho das sementes
Horário de instalação e digitalização da imagens
Sementes dormentes
Diferenças na taxa de crescimento entre genótipos
Cuidados: SVIS