Analisis Clustering Varian Amorphophallus muelleri Blume

122

Analisis Clustering Varian Amorphophallus muelleri Blume yang Ditemukandi Jawa Timur Berdasarkan Marka Molekuler CslA Pengkode Mannan

Synthase dengan Teknik PCR-RFLP

Novie Ary Priyanti 1)*, Arik Arubil 1), Laras Estri Arumningtyas 2), Rodiyati Azrianingsih 2)

1)Program Studi Magister Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya, Malang2)Dosen Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya, Malang

Diterima 16 Juli 2013, direvisi 19 September 2013

ABSTRAK

Amorphophallus muelleri Blume (Porang) merupakan tanaman yang banyak tersebar di wilayahIndonesia dan berpotensi sebagai bahan pangan alternatif karena memiliki kandungan glukomanan yangtinggi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui clustering porang berdasarkan sekuen gen CslApengkode glukomanan dengan menggunakan teknik PCR_RFLP. Tanaman porang didapat dari empatlokasi di Jawa Timur yaitu: (1) Madiun, (2) Nganjuk, (3) Blitar, dan (4) Jember dianalisis ciri morfologidan molekulernya menggunakan primer AkCslA 680F dan AkCslA1288R serta sekuen gen nya dipotongmenggunakan enzim restriksi HaeIII. Hasil analisis morfologinya didapatkan bahwa tanaman porangdapat dibedakan berdasarkan perbedaan corak tangkai daunnya. Varian (BlitarI, JemberI, danMadiunI) memiliki corak tangkai daun prismatik besar, (Jember2 dan Nganjuk2) memiliki corak tangkaidaun prismatik kecil. Analisis kandungan glukomanan didapatkan bahwa kandungan tertinggi dimilikioleh varian Blitar2 sebesar 5,469% dan terendah Madiun2 sebesar 0,2312%. Hasil amplifikasi sekuengen CslA menggunakan primer AkCslA 680 F dan AkCslA 1288R menunjukkan bahwa sekuen gen CslAteramplifikasi pada ukuran 200 bp. Pemotongan dengan enzim restriksi HaeIII menghasilkan dua pitamonomorfik pada 100 bp dan 2000 bp, dan pita delapan pita polimorfik pada 100 bp sampai dengan 400bp. Hasil analisis ini memperlihatkan bahwa tanaman porang memiliki keragaman yang tinggi. Hasilanalisis clustering antar varian berdasarkan data molekulernya menunjukkan pengelompokan menjaditiga cluster yang terdiri dari : cluster I (varian JemberI, BlitarI, dan MadiunI), cluster II (varian Jember2,Nganjuk2, dan Nganjuk I), dan cluster III (varian Blitar2). Jarak genetik terdekat antar varian JemberIdengan BlitarI, sedangkan jarak terjauh pada varian Blitar2.

Kata kunci : Amorphophallus muelleri Blume, Porang, PCR-RFLP, Clustering

ABSTRACT

Amorphophallus muelleri Blume is a ubiquotus plant found all over Indonesia and has the potentialto be food substitute due to its high glucose content. This research was conducted to investigate theporang’s clustering based on CslA gene glucose coding by using PCR-RFLP technique. Porangs used asthe subjet of this study were obtained from 4 different locations in East Java, wich are : (1) Nganjuk, (2)Madiun, (3) Blitar and (4) Jember, analysed by morphological characteristic and molecular traits.Morphological analysis showed that porang derived based on their stalk pattern. BlitarI, JemberI,MadiunI variant have large prismatic stalk patterns, Jember1 and Nganjuk2 have a tight prismatic stalkpattern. Glucomannan content analysis showed that highest content is from Blitar2 5,469% and the lowestis Madiun2 0,2313%. The amplification of CslA gene sequence using primary AkCslA680F andAkCslA1288R showed that CslA gene sequence was amplified on 200 bp. The cutting by using HaeIIIrestrictive enzyme produced two monomorphic band on 1000 bp and 2000 bp, and 8 polymorphic band on100 bp-400 bp. The result of this analysis showed that porang had high diversity. The analysis of amongvariants clustering based on their molecules data showed that grouping fell into 3 clusters, which were:cluster I (JemberI, BlitarI and MadiunI variants), cluster II (Jember2, Blitar2 and Nganjuk2 variants)and cluster III (Blitar2 variant). The shortest distance was found between JemberI and BlitarI variants,while the furthest was found in Blitar2 variants.

Keywords: Amorphophallus muelleri Blume, Porang, PCR-RFLP, Clustering.

NATURAL B, Vol. 2, No. 2, Oktober 2013

123Novie Ary, dkk : Analisis Clustering Varian Amorphophallus muelleri Blume yang Ditemukan di JawaTimur Berdasarkan Marka Molekuler CslA Pengkode Mannan Synthase dengan Teknik PCR-RFLP

PENDAHULUAN

Sebagai negara dengan konsumsi berastertinggi di dunia, masyarakat Indonesiamemerlukan bahan pangan alternatif penggantiberas. Porang (A. muelleri) merupakantanaman yang dapat dijadikan sebagai bahanpangan alternatif karena mudah didapat danumbinya mengandung kadar glukomanan yangtinggi hingga 67% [8]. Glukomananmerupakan karbohidrat penting yangdigunakan sebagai Thickener, film former,emulsifier, stabilizer, bahan pengikat (bindingagent), pembuat selluloid, bahan peledak,kosmetik dan makanan.

Glukomanan merupakan polisakaridalinear yang terdiri dari 1,4-β-linked D-glucosyldan residu D-mannosyl, perbandingan antaraglukosa:manosa sangat bervariasi [6].Glukomanan dikode oleh famili gen yangmensintesis manan. Gen yang berperan dalamsintesis manan antara lain gen yang berasaldari famili gen Csl. Protein rekombinan CslAmemproduksi mannan polimer ketika disuplaioleh GDP-mannosa. Protein yang sama jugamemproduksi linked glucomannanheteropolymer ketika disuplai oleh GDP-mannosa dan GDP-glucosa.

Berdasarkan penelitian [7] hasilpengamatan genetik A. muelleri denganmenggunakan lima primer RAPDmenunjukkan bahwa 50 aksesi yang digunakandalam penelitian tersebut memiliki 42 fragmenDNA yang berukuran dari 300 bp hingga 1,5kb. Dari 42 fragmen DNA, 29 fragmen(69,05%) diantaranya polimorfik, denganindeks marka tertinggi terdapat pada primerOPD-04. Hal ini menunjukkan bahwa tanamanporang memiliki variasi yang tinggi dalam cirimolekulernya.

Salah satu metode untuk melihatkeanekaragaman genetik dalam analisis DNAialah dengan menggunakan RestrictionFragment Lenght Polimorfisme (RFLP). RFLPmerupakan suatu teknik untuk membedakanorganisme berdasarkan pola hasil pemotonganDNA terhadap enzim restriksi. Kesamaan polafragmentasi DNA tersebut dapat digunakan

untuk membedakan spesies satu denganlainnya [3]. Enzim restriksi merupakan enzimyang memotong DNA pada urutan basatertentu sesuai sekuen pengenalannya. Padapenelitian ini dipelajari karakteristik morfologi12 varian porang dari 6 daerah di Jawa Timurserta karakteristik genetisnya berdasarkanmarka PCR-RFLP menggunakan primerAkCSLA680F dan AkCSLA1288R sertaenzim restriksi HaeIII.

METODE PENELITIAN

Pengamatan morfologi tanaman porang.Tanaman porang yang diambil dari 4 daerahyaitu, Blitar, Madiun, Nganjuk dan Jemberdiamati ciri morfologinya meliputi perawakan,corak tangkai daun (prismatik kecil, prismatikbesar, prismatik bergaris), warna tangkai daun(hijau, hijau muda), bentuk daun, warna daun,pola venasi, pertulangan daun, bentuk umbi,warna daging umbi dan kandunganglukomanan. Setiap daerah diambil 2 sampeltanaman yang berbeda corak tangkai daunnya.

Isolasi glukomanan. Isolasi Glukomanandilakukan dengan menggunakan metode dari[1]. Umbi tanaman porang segar dikupas,dibersihkan, dan dicuci, lalu diparut dandijadikan bubur. Sebanyak 250 g hasil parutanini dimasukkan ke dalam baskom ukuransedang dan ditambahkan air suling sebanyak500 ml, lalu diremas-remas selama 2-3 menit,sehingga larutannya menjadi kental. Setelah itudisaring sampai seluruh patinya keluar semua.Filtrat ditampung (diulang 6-8 kali), sehinggalarutan menjadi jernih dan cair, tidak kentallagi. Filtrat yang diperoleh digabungkankemudian ditambahkan NaCl ke dalam filtrathingga konsentrasi NaCl mencapai 0,05%dengan cara mengukur banyaknya larutan hasilpenyaringan dan dikalikan 0,05 NaCl/100,didiamkan selama 24 jam pada suhu 4C,selanjutnya didekantir. Setelah didiamkan,filtrat dipisahkan dan disentrifus 14.000 rpm,15 menit, pada suhu 4C. Hasilnya akanterdapat 2 fase, yaitu endapan dan cairankental. Kemudian filtrat ditampung dandiendapkan dengan menggunakan isopropilalkohol dengan perbandingan 1:1,5. Setelahmengendap filtrat dibuang. Endapan yangdiperoleh dikeringkan pada suhu 80C selama

---------------------*Coresponding author :E-mail: [email protected]

124 Novie Ary, dkk : Analisis Clustering Varian Amorphophallus muelleri Blume yang Ditemukan di JawaTimur Berdasarkan Marka Molekuler CslA Pengkode Mannan Synthase dengan Teknik PCR-RFLP

3 jam, dihaluskan sehingga diperolehglukomanan.

Ekstraksi DNA. Daun segar tanamanporang sebanyak 0,1 g digerus pada mortar,kemudian ditambah 700 μL bufer ekstrak yangditambah dengan β-merkaptoetanol, dipindahke tabung 1,5 ml dan divorteks. Tabungdiinkubasi dalam water bath suhu 65C selama45 menit, selanjutnya disentrifugasi 13000 rpmselama 10 menit pada suhu 4C. Supernatandipindah ke tabung baru kemudian ditambahPCI1 vol, kemudian divorteks. Disentrifugasikembali dengan kecepatan 13000 rpm selama5 menit pada suhu 4C. Selanjutnya dipindahke tabung baru dan ditambah larutan CI 1 voldan divorteks. Selanjutnya disentrifugasikembali dengan kecepatan 13000 rpm selama5 menit pada suhu 4C. Supernatan ditambahdengan ammonium asetat 7,5 M (0,1 vol) dandithawing kemudian ditambahkan ethanolabsolut dan dikocok pelan 3-4 kali. Campuranini selanjtnya diinkubasi pada suhu -20Cselama 24 jam, dan selanjutnya disentrifugasiulang pada 13000 rpm selama 15 menit pada4C. Pelet yang didapatkan ditambah denganethanol 70% sebanyak 500 μl dandihomogenkan pelan. Setelah disentrifugasi,supernatan dibuang dan pelet dikeringkandalam inkubator suhu 55C. DNA yang berupapelet dilarutkan dalam 50 μL buffer TE (pH7,6), kemudian larutan dicampur disuhu ruangsampai larut.

Amplifikasi gen CslA. DNA hasilekstraksi diamplifikasi dengan menggunakanteknik PCR. Reaksi PCR (total volume 25 μL)terdiri atas 10 μL sampel DNA, 2 μM BSA, 5μM PCR mix, 1 μM primer AkCSLA680F (5’-CTACCACTTCAAGGTGGAGCAG-3’) dan1 μM primer AkCSLA1288R (5’-CTCCCGATCTCCAACAAACC-3’), dan 1μM DNA hasil isolasi. Semua bahan tersebutdimasukkan dalam tabung PCR. Tabung-tabung PCR tersebut ditempatkan pada mesinPCR (thermal cycler) pada suhu 95C selama 5menit untuk pre-denaturasi, 95 C selama 45detik untuk denaturasi, 58,5 C selama 45 detikuntuk annealing, 72C selama 45 detik untuktahap ekstensi dan 72C selama 10 menit untukpost ekstensi. Tahapan PCR dilakukansebanyak 35 siklus. Hasil PCR disimpan dalam

freezer untuk digunakan lebih lanjut

RFLP. Molekul DNA hasil PCRdigunakan sebagai bahan dasar pemotongandengan enzim restriksi. Tiap-tiap tabungmikrosentrifuge berukuran 1,5 ml diisi ddH2O(free water nuclease) sebanyak 6 l, digestbuffer + BSA 0,1 mg/ml (Fermentas) 1 l,DNA hasil PCR sebanyak 3 l serta enzimrestriksi HaeIII sebanyak 1 l. Kemudiandilakukan mix gentle dan spindown. Campurankemudian diinkubasi 3 sampai 16 jam padawaterbath suhu 37C. Hasil PCR-RFLPkemudian dielektroforesis pada gel agarosadengan konsentrasi 1,5%.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Karakteristik morfologi porang(Amorphophallus muelleri Blume). Porangdari 4 daerah yaitu, Blitar, Madiun, Nganjukdan Jember dianalisis ciri morfologinya danmenghasilkan varian porang Blitar1 (B1)memiliki corak tangkai daun prismatik besardan berwarna hijau muda. Warna daging umbioranye kekuningan dan kandunganglukomanan sebesar 2,551%. Varian Blitar2(B2) memiliki corak tangkai daun berbentukprismatik kecil dan berwarna hijau warnadaging umbi oranye, kandungan glukomanan5,469%. Varian Jember1 (J1) memiliki coraktangkai daun prismatik kecil dan bergaris,warna daging umbi oranye, kandunganglukomanan 4,004%. Varian Jember2 (J2)corak tangkai daun prismatik besar bergaris,warna daging umbi oranye kekuningan dankandungan glukomanan 3,040%. VarianMadiun1 (M1) corak tangkai daun bentukprismatik besar, warna daging umbi oranyedan kandungan glukomanan 0,338%. VarianMadiun2 (M2) corak tangkai daun berbentukprismatik kecil yang rata di seluruh batangtanaman, warna daging umbi oranye dankandungan glukomanan 1,231%. VarianNganjuk1 (N1) corak tangkai daun prismatikkecil-kecil yang diselingi dengan garispanjang, warna umbi oranye dan kandunganglukomanan 1,662%. Varian Nganjuk2 (N2)corak tangkai daun bentuk prismatik bergaris,warna umbi oranye dan kandunganglukomanan 0,934%.


Gambar 1. Corak tangkai daun dan warna umbi tanaman porang varian (a,i) Blitar1, (b,j) Blitar2, (c,k) Jember1, (d,l)Jember2, (e,m) Madiun1, (f,n) Madiun2, (g,o) Nganjuk1, (h,p) Nganjuk2.

Gambar 2. Kandungan glukomanan setiap varianporang

Berdasarkan perbedaan corak tangkai

daun, porang dapat dikelompokkan menjadi 3kelompok, yaitu (1) berbatang hijau danbercorak prismatik besar, dimiliki oleh B1, J1,dan M1 (2) berbatang hijau dan bercorakprismatik kecil yang dimiliki oleh B2, M2, danN1 (3) berbatang hijau dan bercorak prismatikbesar bergaris yang dimiliki J2 dan N2(Gambar 1).

Berdasarkan kandungan glukomanannya,kandungan glukomanan tertinggi dimiliki olehvarian B2 sebesar 5,469% sedangkan terendaholeh varian J2 sebesar 0,231% (Gambar 2).

Karakteristik genetik porangberdasarkan marka molekuler PCR-RFLP.Berdasarkan hasil PCR menggunakanAkCslA680F dan AkCslA1288R terdapatdelapan sampel yaitu Blitar1, Blitar2, Jember1,Jember2, MadiunI, Madiun2, Nganjuk1, danNganjuk2 teramplifikasi pada 200 bp (Gambar3).















126 Novie Ary, dkk : Analisis Clustering Varian Amorphophallus muelleri Blume yang Ditemukan di JawaTimur Berdasarkan Marka Molekuler CslA Pengkode Mannan Synthase dengan Teknik PCR-RFLP

Gambar 3. Hasil PCR (M:marker, 2: Kp1, 3:M3,4:Kp1, 5:Kp1, 6: B2, 7:J1, 8:B2, 9:B1,10:N2, 11:B1, 12:J3, 13:M2, 14:M1, 15:P1,16:J3, 17:N1, 18:P2, 19:M3, 20:M2, 21:P3,22:P2)

Berdasarkan hasil RFLP dari delapansampel yang teramplifikasi pada proses PCRhanya menghasilkan tujuh sampel yangterpotong oleh enzim restriksi HaeIII yaitusampel dari daerah Nganjuk1, Nganjuk2,Blitar1, Blitar2, Jember1, Jember2, danMadiun1, sedangkan satu sampel dari Madiun2tidak dapat terpotong. Hal ini kemungkinandikarenakan sampel Madiun2 memiliki sisipemotongan yang tidak bisa dikenali olehenzim HaeIII. Menurut [2,9] hal ini terjadikarena anggota gen CslA mengalami evolusidan diversifikasi sehingga telah banyakberubah dari gen ancestral awalnya, sehinggapada pemotongan dengan enzim restriksiHaeIII tidak semua gen CslA dapat terpotongsehingga mengakibatkan perbedaan hasilpotongan .

Pada hasil elektroforesis terdapat pitayang bersifat monomorfik karena ketujuhisolat porang yang diuji menghasilkan pitapada ukuran yang sama yatu pada 1000 bp dan2000 bp. Sedangkan pada pita yang lainnyabersifat polimorfik karena menghasilkan pitapada ukuran tertentu yang terletak pada 100bp, 150 bp, 170 bp, 190 bp, 200 bp, 250 bp,350 bp, 400 bp.

Dilihat dari letak pola pita pada setiaplokus pada antar varian porang yang diuji,delapan lokus polimorfik yang terletak diantara100 bp sampai dengan 400 bp dan dua lokusmonomorfik pada 100 bp dan 2000 bp(Gambar 4). Hal tersebut menunjukkan bahwateknik PCR-RFLP menggunkaan primerAkCslA680F dan AkCslA1288R dan enzimrestriksi HaeIII dapat menunjukkan keragamangenetik pada varian porang yang dipelajari.

Gambar 4. Hasil RFLP (M:marker, 1:B1, 2: B1, 3:B2,4:J1, 5:J2, 6:M1, 7:N1, 8:N2)

Pengelompokan varian porang berdasarkandari ciri molekuler menggunakan teknik PCR-RFLP menunjukkan bahwa berdasarkan jarakgenetik tanaman porang dibagi menjadi tigakelompok. Kelompok I terdiri dari tiga varianporang, yaitu J1, B1 dan M1. Kelompok IIterdiri dari tiga varian porang, yaitu varian J2,N2 dan N1. Sedangkan kelompok III hanyaberisi satu varian yaitu B2.

Gambar 5. Dendogram hubungan kekerabatan.

Jarak genetik antar varian terlihat daripengelompokan tersebut. Varian dalam satukelompok memiliki jarak genetik lebih dekatdibandingkan dengan varian dari kelompokyang berbeda. Jarak genetik terdekat ialahantara varian J1 dan B1 dalam kelompok I,serta varian J2 dan N2 pada kelompok II(Gambar 5).

Kandungan glukomanan tertinggi berasaldari varian B2 yaitu sebesar 5,469% dankandungan glukomanan terendah dimilikivarian M2 sebesar 0,2312%. Pada tanamanporang dari daerah yang sama ternyatamemiliki kandungan glukomanan yang

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Similarity

3

1

5

4

7

6

2

Blitar 1

Blitar 2

Jember 1

Jember 2

Madiun 1

Nganjuk 1

Nganjuk 2


berbeda. Hal ini disebabkan oleh perbedaandan mutasi dari den CslA sebagai gen yangbertanggung jawab dalam sintesis glukomanan.Seperti dijelaskan pada penelitian [4] yangmenyatakan bahwa anggota gen CslA memilikibanyak mutan dan dari setiap mutan mengkodepembentukan glukomanan yang bervariasi.Penelitian [5] menegaskan bahwa kandunganglukomanan yang berbeda-beda tergantungdari perbandingan glukosa dan manosa sertaprotein rekombinan CslA yang bekerja padaindividu tersebut (Gambar 6).

Gambar 6. Aktivitas protein rekombinan CSLA dalampembentukan mannan dan glukomanan padasel Drosophilla S2 secara in vitro [5].

KESIMPULAN

Perbedaan ciri morfologi yang didapat darihasil pengamatan adalah corak tangkai daundan warna daging buah. Kandunganglukomanan tertinggi didapatkan dari varianBlitar2 yaitu sebesar 5,469% dan kandunganglukomanan terendah dari varian Madiun2yaitu sebesar 0,231%.

Amplifikasi gen CslA menggunakanprimer AkCslA680F dan AkCslA1288Rmenghasilkan delapan potongan DNAberukuran 200 bp, dan pemotonganmenggunakan enzim restriksi HaeIIImenghasilkan dua pita monomorfik dandelapan pita polimorfik yang menunjukkankeragaman pada sampel yang dianalisis. Hasilanalisis clustering berdasarkan markamolekuler RFLP didapatkan bahwa jarakterdekat adalah antar varian Jember 1 denganBlitar1. Sedangkan jarak terjauh pada varianBlitar2.

DAFTAR PUSTAKA

[1] Chairul dan Chairul, S. (2006), IsolasiGlukomanan dari dua jenis Araceae: talas(Colocasia esculenta (L.) Schott) daniles-iles (Amorphophallus campanulatusBlumei), Berita Biologi, 8(3).

[2] Del Bem, L.E., and M. G. Vincentz(2010), Evolution of xyloglucan-relatedgenes in green plants, BMC Evol. Biol,10:341. Doi: 10.1186/1471-2148-10-341.

[3] Hill, W. (2005), RFLP Definition.http://vm.cfsan.fda.gov/~frf/rflp.html,diakses tanggal 3 November 2007 pukul21.00 WIB.

[4] Liepman, A. H. and D. M. Cavalier(2012), The cellulose synthase-like A andcellulose synthase-like C families: recentadvances and future perspektives, Minireview, Frontiers in Plant Science.

[5] Liepman, A. H., C. Joseph Nairn, Willats,G. T. William, Iben, Sorensen, Alison W.Roberts and Kenneth Keegstra (2007),Functional genomic analysis supportsconservation of function among cellulosesynthase-like A gene family members andsuggest diverse roles of mannans inplants, Plant Physiology, April 2007, Vol.143, pp.1881-1893,www.plantphysiol.org

[6] Megazyme (2004), Glucomannan AssayProcedure K-Glum 08/01, MegazymeInternational Ireland limited, Ireland.

[7] Poerba, Y. S dan D. Martanti (2008),Keragaman genetik berdasarkan markarandom amplified polimorphic DNA padaAmorphophallus muelleri Blume di Jawa,Biodiversitas, vol.9.

[8] Wahyuni, S., E. A. Hadad, Hobir dan A.denian (2004), Plasma nutfah anekatanaman perkebunan. Balai PenelitianTanaman Rempah dan Obat,Perkembangan Teknologi, TRO, 16 : 28-42.

[9] Yin , Y., J. Huang and Y. Xu (2009), Thecellulose synthase superfamily in fullysequenced plants and algae, BMC PlantBiol, 9:99. Doi: 10.1186/1471-2229-9-99.

Documents

Analisis Clustering Varian Amorphophallus muelleri Blume