Analisisasamnukleatsecarakuantitatif AnalisisDNAMikroarray AnalisisPCR AnalisisSAGE

Analisisasamnukleatsecarakualitatif

DNASequencing Elektroforesis(agarosedanSDSPage) Staining Blotting Hibridisasi

AnalisisDNAMikroarrayTeknikanalisismicroarraydigunakanuntukmenginterpretasikandatayangdihasilkandarieksperimenterhadapDNA,RNA,danprotein.Metodeinimemungkinkanparapenelitiuntukmenyelidikikeadaanekspresisejumlahbesardarigendalambanyakkasus,suatuorganismediseluruhgenomdalamsatupercobaan.Percobaantersebutdapatmenghasilkanvolumedatayangsangatbesar,memungkinkanparapenelitiuntukmenilaikeadaankeseluruhanselatauorganisme.Jumlahdatayangbesarinidapatsulituntukdianalisis,terutamadalamketiadaangenanotasi.

Contohdarisekitar40.000probeyangditandaidenganoligomicroarraydandiperbesaruntukmenunjukkandetail.Analisisdatamicroarraymelibatkanbeberapalangkahyangberbeda,sepertiyangdiuraikandibawahini.Mengubahsalahsatudarilangkahlangkahyangmemilikipotensiuntukmengubahhasilanalisis,sehinggaproyekMAQC[1]diciptakanuntukmengidentifikasistrategistandar.PerusahaanadayangmenggunakanprotokolMAQCuntukmelakukananalisislengkap.

Creating raw data

microarraykebanyakanprodusen,sepertiAffymetrixdanAgilent,[3]menyediakanperangkatlunakanalisisdatakomersialdenganmicroarrayperalatansepertipiringpembaca.

Background correction tergantungpadajenisarray,sinyalyangberkaitandengannonspesifikmengikatfluorophoredapatdikurangiuntukmencapaihasilyanglebihbaik.Salahsatupendekatanmelibatkanmengurangiintensitassinyalrataratakawasanantarabintikbintik.BerbagaialatuntukkoreksilatarbelakangdananalisislebihlanjuttersediadariTIGR,[4]Agilent(GeneSpring),[5]danOcimumBiosolusi(Genowiz).[6]

Depending on the type of array, signal related to nonspecific binding of the fluorophore can be subtracted to achieve better results. One approach involves subtracting the average signal intensity of the area between spots. A variety of tools for background correction and further analysis are available from TIGR,[4] Agilent (GeneSpring),[5] and Ocimum Bio Solutions (Genowiz).[6]

Quality control Seluruharraymungkinmemilikijelaskelemahanterdeteksiolehinspeksivisual,pairwiseperbandinganuntukarraydalamkelompokeksperimentalyangsama,ataudengananalisisRNAdegradasi.[7]Hasildapatmeningkatkandenganmenghapusarrayinidarianalisissepenuhnya.

Entire arrays may have obvious flaws detectable by visual inspection, pairwise comparisons to arrays in the same experimental group, or by analysis of RNA degradation.[7] Results may improve by removing these arrays from the analysis entirely.

Spot filtering Identifikasivisualartefaklokal,sepertimencetakataumencuciCacat,demikianjugamungkinmenyarankanpenghapusanbintikbintikindividu.Inidapatmengambilsejumlahbesarwaktutergantungpadakualitasmanufakturarray.Selainitu,beberapaprosedurpanggilanuntukpenghapusansemuabintikdenganekspresinilaidibawahambangbatasintensitastertentu.

Visual identification of local artifacts, such as printing or washing defects, may likewise suggest the removal of individual spots. This can take a substantial amount of time depending on the quality of array manufacture. In addition, some procedures call for the elimination of all spots with an expression value below a certain intensity threshold.

Aggregation and normalization Membandingkanduaarrayyangberbeda,atauduasampelberbedahibridisasikearraysamaumumnyamelibatkanmembuatpenyesuaianuntukkesalahansistematikyangdiperkenalkanolehperbedaandalamprosedurdanpewarnaintensitasefek.Normalisasipewarnauntukduawarnaarrayseringdicapaidenganregresilokal.LIMMAmenyediakanseperangkatalatuntukkoreksilatarbelakangdanscaling,

sertapilihanuntukrataratabintikbintikduplikatpadaslide.[8]Metodeumumuntukmengevaluasiseberapabaikdinormalisasiarray,adalahuntukplotMAplotdata.

Comparing two different arrays, or two different samples hybridized to the same array generally involves making adjustments for systematic errors introduced by differences in procedures and dye intensity effects. Dye normalization for two color arrays is often achieved by local regression. LIMMA provides a set of tools for background correction and scaling, as well as an option to average on-slide duplicate spots.[8] A common method for evaluating how well normalized an array is, is to plot an MA plot of the data.

Raw Affy data contains about twenty probes for the same RNA target. Half of these are "mismatch spots", which do not precisely match the target sequence. These can theoretically measure the amount of nonspecific binding for a given target. Robust Multi-array Average (RMA) [9] is a normalization approach that does not take advantage of these mismatch spots, but still must summarize the perfect matches through median polish.[10] The median polish algorithm, although robust, behaves differently depending on the number of samples analyzed.[11] Quantile normalization, also part of RMA, is one sensible approach to normalize a batch of arrays in order to make further comparisons meaningful.

The current Affymetrix MAS5 algorithm, which uses both perfect match and mismatch probes, continues to enjoy popularity and do well in head to head tests.[12]

Factor Analysis for Robust Microarray Summarization (FARMS)[13] is a model-based technique for summarizing array data at perfect match probe level. It is based on a factor analysis model for which a Bayesian maximum a posteriori method optimizes the model parameters under the assumption of Gaussian measurement noise. According to the Affycomp benchmark[14] FARMS outperformed all other summarizations methods with respect to sensitivity and specificity.

Identification of significant differential expression Many strategies exist to identify which array probes show an unusual level of over expression or under expression. The simplest one is to call "significant" any probe that differs by an average of at least twofold between treatment groups. More sophisticated approaches are often related to t-tests or other mechanisms that take both effect size and variability into account. Curiously, the p-values associated with particular genes do not reproduce well between replicate experiments, and lists generated by straight fold change perform much better.[15][16] This represents an extremely important observation, since the point of performing experiments has to do with predicting general behavior. The MAQC group recommends using a fold change assessment plus a non-stringent p-value cutoff, further pointing out that changes in the background correction and scaling process have only a minimal impact on the rank order of fold change differences, but a substantial impact on p-values.

Pattern recognition

Commercial systems for gene network analysis such as Ingenuity[17] and Pathway studio[18] create visual representations of differentially expressed genes based on current scientific literature. Non-commercial tools such as GenMAPP and Moksiskaan also aid in organizing and visualizing gene network data procured from one or several microarray experiments. A wide variety of microarray analysis tools are available through Bioconductor written in the R programming language. The frequently cited SAM Excel module and other microarray tools[19] are available through Stanford University. Another set is available from Harvard and MIT.[20]

Specialized software tools for statistical analysis to determine the extent of over- or under-expression of a gene in a microarray experiment relative to a reference state have also been developed to aid in identifying genes or gene sets associated with particular phenotypes. One such method of analysis, known as Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), uses a Kolmogorov-Smirnov-style statistic to identify groups of genes that are regulated together.[21] This third-party statistics package offers the user information on the genes or gene sets of interest, including links to entries in databases such as NCBI's GenBank and curated databases such as Biocarta[22] and Gene Ontology. Protein complex enrichment analysis tool (COMPLEAT) provides similar enrichment analysis at the level of protein complexes.[23] The tool can identify the dynamic protein complex regulation under different condition or time points. Related system, PAINT[24] and SCOPE[25] performs a statistical analysis on gene promoter regions, identifying over and under representation of previously identified transcription factor response elements. Another statistical analysis tool is Rank Sum Statistics for Gene Set Collections (RssGsc), which uses rank sum probability distribution functions to find gene sets that explain experimental data.[26] A further approach is contextual meta-analysis, i.e. finding out how a gene cluster responds to a variety of experimental contexts. Genevestigator is a public tool to perform contextual meta-analysis across contexts such as anatomical parts, stages of development, and response to diseases, chemicals, stresses, and neoplasms.

AnalisisPCRBiotechnology,PCRMay7,2009at2:28pm

MengenalPCR(PolymeraseChainReaction)byYepyHardiRustam

Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas, diagnosa penyakit, penentuan keabsahan keturunan, dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP, atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit, ajaib!

Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 l ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita.

Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase.

PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.

[simage=201,512,y,left]

KomponenPCRSelain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:

Primer

Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

dNTP(deoxynucleosidetriphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

Buffer

Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

IonLogam

Ionlogambivalen,umumnyaMg++,fungsinyasebagaikofaktorbagienzimDNApolymerase.TanpaioninienzimDNApolymerasetidakdapatbekerja.

Ionlogammonovalen,kalsium(K+).

TahapanReaksi[simage=200,512,y,left]

Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

Denaturasi

Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.

Annealing

Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

Ekstensi/elongasi

Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

Pradenaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).

FinalElongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.

AplikasiteknikPCRKita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

IsolasiGen

Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?

Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik.

Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.

Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi.

Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

DNASequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

Forensik

Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.

Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

DiagnosaPenyakit

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.

PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993).

AnalisisSAGE DNASequencingPrinsipDasarDNASequencingDNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Proses Cycle Sequencing (Image from appliedbiosystems.com)

Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

Primeryangdigunakanhanyasatuuntuksatuarahpembacaan,tidakdua(sepasang)sepertiPCR ddNTPs(dideoxyNucleotideTriphosphate)adalahmodifikasidaridNTPsdenganmenghilangkan

gugus3OHpadaribosa.

Struktur molekul dNTP dan ddNTP, perhatikan bedanya (Image from csa.fi.it)

Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester.

Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa. Lalu bagaimana caranya menentukan urutan basa DNA dari produk cycle sequencing ini?

CaraKlasik

Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.

Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP.

Prinsip Sanger Method dengan primer labelling (Image from noaa.gov)

DyePrimersdenganLabelBerbeda

Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur saja, digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle sequencing.

Prinsip Sanger Method dengan primer fluorescent labelling yang berbeda-beda (Image from appliedbiosystems.com)

Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda. Coba bandingkan cara ini dengan cara sebelumnya, lebih mudah mana membacanya?

Pembacaan sekuen DNA, lebih mudah mana? (Image from wikipedia.org)

DyeTerminatorsSequencing

Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas menemukan cara untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.

Prinsip Sanger Method dengan dye dideoxy terminator (Image from appliedbiosystems.com)

Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan fragmen dan pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat dan terotomatisasi. Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga 96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya.

Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang menunjukkan urutan basa DNA-nya.

Contoh Electropherogram (image from ggpht.com)

Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini tidak hanya digunakan untuk menentukan urutan basa-basa DNA semata, tapi bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti tRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) dan segudang aplikasi lainnya. Banyaknya aplikasi DNA Sequencing kapiler ini menunjukkan bahwa metode ini meskipun kini tergolong lambat setelah ditemukannya high-throughput sequencing akan tetap jadi primadona dan andalan para life-scientist di seluruh dunia. Dan tak heran pula jika Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua kalinya di tahun 1980 atas penemuannya ini.

Elektroforesis

ElektroforesisSebelumfragmenfragmenDNAgenomikhasildigestirestriksidiligasikankedalamsuatuvektortertentu(lihatBabIX)terlebihdahuluperludilakukanpemeriksaanataskeberhasilandigestitersebut.Untukmelihatkeberhasilan digesti restriksi, DNA divisualisasikan menggunakan teknik elektroforesis. Namun,elektroforesissendirisebenarnyabukanlahteknikvisualisasiDNAsematamatakarenateknikinidapatjugadigunakanuntukkeperluanisolasidanpemurnianfragmenDNAtertentu.Prinsipkerjaelektroforesisadalahmemisahkanmolekulmolekulbermuatanlistrikberdasarkanatasukuran(beratmolekul)danmuatan listriknya.KhususuntukDNA,pemisahan tidakdidasarkanatasperbedaanmuatan listriknya,tetapimenurutukurandankonformasiataustruktur fisikmolekulnya.Gelyangbiasadigunakan adalah agarosa dan poliakrilamid. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan sampel DNAdenganukurandaribeberaparatushingga20.000pasangbasa(pb),sedangkangelpoliakrilamiddigunakanuntukfragmenfragmenDNAyanglebihkecil.MolekulDNAbermuatannegatifsehinggadidalammedanlistrikakanbermigrasimelaluimatriksgelmenujukutubpositif(anode).Makinbesarukuranmolekulnya,makinrendahlajumigrasinya.Jikahubunganantaraukuranmolekuldanlajumigrasi102dipetakandalamsuatugrafiklogaritmik,makaakandiperolehkurvalinier.Olehkarenaitu,kitadapatmemperkirakanberatmolekul suatu fragmenDNAdenganmelihatataumembandingkan lajumigrasinyadengan lajumigrasifragmenfragmenmolekulDNAstrandar(marker)yangtelahdiketahuiukurannya.FragmenfragmenDNAdivisualisasikandibawahsinarultravioletsetelahterlebihduludirendamdidalamlarutanetidiumbromid,pewarnayangakanmenyisipataumelakukaninterkalasidiselaselabasaDNA.Perendamandilakukansetelahmigrasidianggapcukupuntukdihentikan.FragmenDNAakannampaksebagaipitaberwarnamerahdenganposisimigrasiyangsesuaidenganberatmolekulnya.CarainidapatmemvisualisasikanfragmenDNAhinggasekecil0,05g.Sepertitelahdikatakandiatasbahwaselainkarenaperbedaan ukurannya, laju migrasi DNA pada gel elektroforesis juga ditentukan oleh konformasimolekulnya. DNA dengan bentuk covalently closed circular (CCC) akan bergerak paling cepat, disusulberikutnya konformasiopen circular (OC),dan yang terakhir linier.Oleh karenaperbedaan konformasimenyebabkanperbedaanlajumigrasi,makapenentuanukuransuatufragmenDNAselaludilakukanpadakonformasilinier.

SouthernblottingDinamaisetelahpenemunya,biologiEdwinSelatan,SelatanBlotadalahmetodeuntukmenyelidikikeberadaan sekuensDNA tertentudalam sampelDNA.DNA sampel sebelumatau setelahpencernaanenzimrestriksidipisahkandenganelektroforesisgeldankemudianditransferkemembrandenganblottingmelaluiaksikapiler.MembrantersebutkemudianterkenaprobeDNAberlabelyangmemilikiurutanbasapelengkapuntukurutanDNApadabunga.Kebanyakanprotokolasliyangdigunakanlabelradioaktif,namunnonradioaktifalternatifyangsekarangtersedia.Southernblottingkurangumumdigunakandalam ilmulaboratoriumkarenakapasitastekniklain,sepertiPCR,untukmendeteksiurutanDNAspesifikdarisampelDNA.Bercakinimasihdigunakanuntukbeberapaaplikasi,bagaimanapun,sepertimengukurjumlahsalinantransgenpadatikustransgenik,ataurekayasagenselindukgarisKOembrio.SouthernblotadalahsuatuteknikyangdikembangkanolehEdwin.M.Southernpada1975,seorangahlibiologiasalInggris.Teknik inidigunakanuntukpendeteksiansuatuDNAsequencespesifik(genataulain)dalamsamplekompleksDNA(selularDNA).Ini jugadigunakanuntukmenentukanbobotmolekularsuaturestriksi fragmendanuntukmengukursejumlahrelatifdalamsampleberbeda.Dibawahkondisikondisi optimal, Southern blotmendeteksi ~ 0.1 pg DNA yangmenarik. Blot teknik digunakan untukmemindahkanproteinDNAdanRNAkesuatupengangkutsehinggadapatdipisahkan,danseringjugadiikutipenggunaansuatugelectrophoresis.SouthernblotdigunakanuntukmemindahkanDNA.DigunakanbiologimolekularuntukmelihatkemungkinankehadiransuatuurutanDNAdalamsuatusampleDNA.SouthernblotSelatanberkombinasigelagaroseelectrophoresisuntukseparasiukuranDNAdenganmetodauntukmemindahkanDNAkesuatumembranfilteruntukpemeriksaanhybridisasi.MetodalainadalahWesternblotdanNorthernblotmemilikiprinsipkerjayangsamatetapimenggunakanRNAdanprotein. Setelahelectrophoresis,geltersebutdiperlakukandengansuatualkaliyangmenyebabkanDNAterdenaturasidanterpisahmenjadirantaitunggal.Suatumembransepertiselaputditempatkanpadageldandiberitekananmelaluipengisapanataumetodamundanedalamkertashanduk(papertowels)dengansuatuberat.DNAberpindah tempatkemembrandanstick.MembranDNAimpregnanteddibakarataumenyebar secarapermanendenganmenyertakanDNA tersebut.Molekul yang kemudiandiperlakukandengansuatupemeriksaanhybridisasiyangmanahanyasuatumolekulDNAdenganurutandikenaliyangakandipasangkandenganurutanDNA yang telah ditandai (diblot).PemeriksaanDNAberlabel denganfluorescents atau chromogenic berpijar sehingga dapat teridentifikasi. Dengan pengujian pola darihybridisasi dengan sinar X atau Autoradiografi, peneliti dapat menentukan fragmen yang berisi DNAsequencespesifikataugen.Southernblotsdigunakanpenemuangendanpemetaan,evolusidanstudipengembangan,forensikdan diagnostik. Dalam tingkat genetik untukmemodifikasi pada organisme, Southern blot digunakansebagaitestuntukmemastikanbahwabagianDNAtertentumengenalurutangen.Southernblotanalysisuntukmenandaikaraktertransforman.Southernblotanalysisbermanfaatuntukmengidentifikasibentukberbeda,menentukanmemasukkan ataumenyisipkan jumlah copy dan untukmendeteksi gross DNApenyusunan kembali yang mungkin telah terjadi perubahan. Jika kamu sedang menganalisis galactosidasedenganmemasukkanataumenyisipkandandipotongpotongdenganEcoRVmakaakandihasilaknpotongansekitar1kbdariatasdanbawahdariurutangalactosidasepersandiandimulai.Pemecahanolehenzimrestriksi,AnalisisGel,danbloting.IniadalahprosedurstandardariSouthernblotanalysis.1.dipecahsedikitnya1uggenDrosophiladenganenzimrestriksiyangsesuai.Dipecah15ugDNAdalamvolume20uldengan10unitenzim.Pemecahandilalukanselama412jam.

2.Periksakualitaspemecahandengananalisis100ngdari tiap sampledalamminigel.meliputi samplecontrolyangbelumdipecahsebagaiperbandingan.Sampleyangtelahdipecahtampaksebagaibandbanddarirepetitifsequen(urutanberulang)yangdapatdiperlihatkan.3.SisaDNA1%padagelagarosemeliputi jalurdenganpenanda lamdauntukgelyangdiwarnaidenganethidiumbromidadandifoto.4.Geldiwarnaiselama20menitdalam1ug/mlethidiumbromida.Destaindalamairselama10menitdandifoto.5.Serapgelselama15menitdalam0.12MHCLbromophenolbluehinggamenguning.6.Serapgeldalam0.4MNaOHselama30menit.7.Potong3potongandalammemblotkertasyangakanmeluassekitar1incidiluargelpadaempatsisi.Rendammasingmasingdengan0.4MNaOHDantumpukandalamsuatukaca.8. Potong gel sampai pertengahan dan membuang bagian puncaknya. Dengan memotong jalurpertengahan,identasiakantertinggaldipuncakgeldimanageldiratakandenganprosedurblotting,daninidapatdigunakanuntukpenyaringanbaiktelahditempatkandiatasgel.Hempaskangelyangtakteraturdanmenempatkannyapadapertengahan tumpukan kertashisapuntukmendorongke luargelembungudara.9.GeldilemparkandisebabkanDNApadaumumnyasemakindekatkepadasisibawahgel.framegeldenganpotongan plastik. Plastik meluas di bawah tepi gel dari 1 2 milimeter. dengan perlahanmemaksagelembungudaramemberesbebasdarigel.Plastikmencegahpenyanggamengalirdisekitargel.10.SuatupotonganGenescreenyang lebihuntukmemenuhiukurangel.Permukaanbasahgeldenganbeberapatetesan0.4MNaOH.perlahan lahanmeletakkangenmenyaringkepermukaangel.HindarimenjeratgelembungudaradibawahsaringanjugamenghindaribergesernyasaringanyangberhubungandengangelsepertibeberapaDNAmungkintelahmulaiuntukdipindahkankesaringan.11.Dua potongan kertas hisap untukmemenuhiGenescreen danmeletakkan hingga lembar tersebutmengeringkanpadawaktuyangsamadiatassaringan.Kertaspertamabasah,danmelicinkannyasebelummenambahkan yang kedua.Potongan yang kedua basah sepenuhnyamengumpulkan tumpukanpapertowels.12.Menumpuk 1 inchi lapisan dari paper towels di atas potongan puncak kertas hisap. Towels harusmemotonguntukmemenuhiukuransaringan.13.Tempatkanpotonganflat/plexiglassataukacayangdiletakkandipalingatas.Menimbangtumpukanyang hancur bersama suatu botol yang berisi 200 500 ml tentang segala bentuk. Kemudian DNAdipindahkanselama6jam.14.Setelahtransfer,dipindahkankesaringandandiserapselama15menitdalam200ml0.2MTrisClpH7.5,2XSSC.15.Blotfilterdikeringkandenganpapertowelsdankemudiandibiarkankeringselamasedikitnya1 jam.Saringandapatdisimpanbilatelahkering,keadaaninicukupuntukmenentukanDNAkedalamsaringan.TidakkebutuhanuntukmembakarsaringangenescreenuntukmenyertakanDNA.PersiapanDNAradiolabeleduntukmenyelidikiSouthernblot.Beberapakotakpersediaanberbedauntuk pemeriksaan radiolabeling. Kotak berdasarkan pada cat dasar acak menghasilkan radioaktifmemeriksadenganaktivirtaskirakira109cpm/ul.SuatufragmenDNAgelpurifiedakandisediakanuntukreaksidasaryangacak.Sejakreaksidasarpalingacakterutamayangsama,proseduryangberikutdapatdigunakanuntukmemindahkanunincorporatedradioactivenucleotide

1.Stopreaksidenganmenambahkan0.5MEDTAdengankonsentrasiakhirkirakira20mM.2.TambahkanNambahkan400ulTE,1ul5mg/mlDNAsalmondan20ul100mMspermine.Campurandenganbaik.3.Inkubasidiatasesselama15menit,sentrifugasimesinselama15menitdanbuangansupernatant.4.Pecahkanbutirpada37oCdalam50ul0.5MNaCl/TEselama10menituntukmemecahkan.5. Tambahkan200ul TE danmenghitung jumlah kecil untukmenentukan efisiensi labelDNA. Simpanpemeriksaandidalamlemaries.AnalisisSouthernblotdenganpemeriksaanradiolabeled.Saringanpertamadirendamuntukperiodeyangsingkatdalampemeriksaancampuranhybridisasi.Kemudianpemeriksaanditambahkansecara langsunghybridisasisolusi.Tidakadaprehybridisasicampurankhusus.1.GulungblotkedalamsilindersehinggasisiDNAsisikearahpusatsilinderdanmenempatkanblotdalamtabung50ml.2.Siapkankirakira10mlhybridisasicampuran(minusprobe)dalam200ul5mg/mlDNAsalemsonicatedselama5menitdanvampurkansecaramenyeluruh10ml6XSSC,50%Formamide,1%SDS,10%DextranSulfate.(30mlsolusiyangkekuranganDNAsalmondapatdibuatdenganmeletakkan9ml20XSSC,15mlFormamide,3ml10%SDS,3gSodiumDextranSulfatekedalamsuatutabung50mldanputarcampuranitudalamtungkuhybridisasitungkupadasuhu42oCselamabeberapajam.Simpancampuranpada20oCdansuhupanas42oCsebelumpenggunaan)3.tambahakancampuranhybridisasikedalamtabungyangberisiblot,captabung,danberputartabungdalamtungkuhybridisasipadasuhu42oCselamaminimal15menit.4.Didihkan 5 10 juta cpms dalam volume 200 ul TE selama 5menit dan kemudianmenempatkanpemeriksaandiatases.5.Mindahkan tabung yangberisiblotdari tungkuhybridisasidanmenambahkanpemeriksaandenganhybridisasisolusi.Mengikhtisarkan tabung,campurkandankembali tabungke tungkuhybridisasi.Putartabungdengansuhu42oC.6. Hari berikut, menuangkanhybridisasi radioaktif dan mencampurkan ke dalam tabung untukdipergunakankembalijikadiperlukan.Menyimpancampuranhybridisasidalamlemaries.(untukdigunakanpemeriksaankembali,didihkancampuranselama15menit)7.Siapkantotal200ml2XSSC,0.5%SDSuntukmencuciblot.Tambahkankirakira30mldarisolusiinikedalam tabungyangberisiblot itu, rekapdanberputar tabungpada suhu25C selama15menit.Buangdenganmencucilimbahradioaktifdanmengulangimemeriksaprosedurduakali.8.Pindahkanblotdaritabung50mldancuciblotselama15menitpadasuhukamardalambakidengan2XSSC,0.5%SDS(~100ml).buangtabungradioaktif.9.Siapkan200ml0.1XSSC,0.1%SDSdandalamkeadaanhangatataupadasuhu55oC.10.Gulungkan tblotkedalam suatu silinderdengan sisiDNAkearahpusatdanmenaruhnyakedalamtabung baru 50ml. Tambahkan 30ml 0.1X SSC, 0.1% SDS pada blot dan putar tabung dalam tungkuhybridisasiselama15menitpadasuhu55oC.Buangdenganmencucidanmengulangimemeriksaprosedursampaisolusihabistercuci.11.Pindahkanblotdaritabungdantempatkanpadaflatpotonganplastik.Blotcairankelebihandibuangtetapitidakdengansaringanuntukdikeringkansepenuhnya.12.SingkapkansaringankefilmsinarxPenyinaranmemfilmkandalamintensifscreen.

IniadalahsuaturingkasdariSouthernblotdilakukandansepertiapadatayangdapatdiperoleh.Southernblotsmemberikanpenyelidikanatauanalisisuntukmenentukanbobotmolekularsuaturestriksifragmenfragmendanuntukmengukursejumlahrelatifdalamcontohberbeda.1.DNA(genomicatausumberlain)dipecahdenganenzimrestriksiEnzimrestriksiendonucleasedigunakanuntukmemotonghighmolecularweightDNAstrandskedalam fragmenyang lebihkecil.DNA fragmenkemudianadalahdielectroforisispadasuatuagarosegeluntukdipisahkanberdasarkanukurannyapadaumumnyanampaksebagaiband.DNAterdenaturasimenjadirantaitunggaldenganinkubasidenganNaOH.2. Jika sebagian dari fragmen DNA lebih besar dari 15 kb, kemudian sebelum di blot, gel mungkindiperlakukandengansuatuasam,sepertiHCLencer,yangdepurinatesfragmenDNA,memotongDNAkedalam potongan lebih kecil, dengan begitu membiarkan perpindahan yang lebih efisien dari gel kemembran.DNA ditransfer kemembran seperti lembaran dari kertas hisap khusus.DNA fragementswmempertahankan pola separasi yang sama dalam gel. Blot di inkubasi dengan banyak copy dalampemeriksaanyangmerupakanDNAsinglestranded.3.Jikametodaperpindahanalkalidigunakan,gelyangmengandungDNAditempatkankedalamsuatusolusibersifatalkali (SecarakhasberisiSodiumhydroxide)untukmengubah sifatDNAyangdoublestranded.DenaturationdalamlingkunganbersifatalkalimenyediakanuntukikatanDNAyangbermuatannegatifkedalammembran bermuatan positif,memisahkannya ke dalam rantaiDNA tunggal untuk pemeriksaanhybridisasidanmenghancurkanRNAresiduyangmasihhadirdalamDNA.4.PemeriksaaniniakanmembentukbasepairsdenganDNAsequenceyankomplitdanbanddalambentukmolekulDNAdoublestranded.Pemeriksaantidakbisadilihattetapiselaindenganradioaktifatauenzimdapatdilihat(phosphatasebersifatalkaliatauhorseradishperoxidase).5.PenempatanlokasipemeriksaandiungkapkandenganinkubasisubstratetanpaterwarnaiitumengikatenzimmengkonversiprodukdiwarnaiyangdapatdilihatataumenyemburkancahayayangakandisingkapdengansunarX.Jikapemeriksaantelahdiberilabeldenganradioaktifitas,dapatmenyingkapkanfilmsinarX secara langsung. Misalnya pada Southern Blot analysis of DNA Panel yang kiri adalah suatu gelelectrophoreticyangdiwarnaidenganethidiumbromida.TotalDNA telahdiekstrakdari9clonplasmid(lanes##19),yangdidigestidenganpembatasanendonuclease restriksi tertentudanyangdipisahkanmenurutukuranolehelectrophoresis.DNAyangterlihatdinodainampakdengantidakadaikatanterpisah,tidaksatupunurutanDNAhadirlebihdarisatucopy.MolekulardenganberatstandarStandardmempunyaisaturangkaianfragmenDNAdariukurandikenal.SuatuclonfragemenDNAtelahterisimuatanlane#10:bebanstandarmenandaiadanyaukuransekitar400bp.

Paneltenggahadalahsuatusouthernblotautoradiogramgelyangsama.DNAdalamgeltelahditransfer (yangdinodai)kesuatu filter,kemudian filterdiunjukkankesuatuDNAradioactivelylabelledyangdibuatdariDNAmemuatjalur#10.SaringankemudianadalahdiunjukkandenganfilsinarX.DimanapemeriksaanDNA ditemukan suatu urutan homolog sepancaran yang di nodai, basepairs (hybridizes)untukDNA.Radioaktifitaskemudianmenyingkapkanfilm itudanmenghasilkansuatubandgelapdiatasfilm sinar X.Panel kanan adalah suatu bagan untuk southern autoradiogram, isi informasi adalah kehadiran atauketidakhadiran suatu band serta ukurannya. Kehadiran suatu bandmenunjukkan bahwa urutan DNAhomologdalampemeriksaan ituDNAhadirdalam clone##3,4,&8,denganukuranyang samaketikapemeriksaan,danketidakhadiranclone##1,2,5,&9.Dijalur#6urutanhomologyanghadirtetapidengansuatulokasipembatasantambahanyangmemotongfragmenitumenjadiduafragmenlebihkecil.Analisainimenunjukkanbahwagenmenarikmenjadiclonsuksesdengansatuantertentudalamplasmid,danadavariasigenetikdalamclone#6.Geninisekarangdapatdianalisalebihlanjut.A. Pria normal : ikatan tunggal yang ukurannya normal serta tidak mengandung metilB.Wanitanormal:duaikatanyangukurannyanormal,satutidakmengandungmetil(kromosomXaktif)dan satu mengandung metil (kromosom X yang tidak aktif)C.Priapremutasi:ikatantunggalyangukurannyaditingkatkansertatidakmengandungmetil.Premutationinimempunyai75pengulangan(diukuranolehanalisisPCR).D.Wanitapremutation :empat ikatandenganpolatidakmengandungmetil(Xaktif))danmengandungmetil (Xtidakaktif)bentukkeduaduanyapremutasidan ikatannormal.Premutation inimempunyai92pengulangan(diukuranolehanalisisPCR)E.Priamutasipenuh:ikatan>200pengulanganyangikatannyamengandungmetil.Ketidakhadiransuatuikatantidakmengandungmetilnormal.Dalamhaliniadatigaukuranmutasipenuhberbeda,280,430dan920pengulangan(diukurdenganSouthernblotanalysis)F.Wanita,mutasipenuh:ikatan>200pengulanganyangikatannyamengandungmetil.Duaikatannormaldariallelyangnormaladalahjugatersedia.Mutasipenuhinimempunyai355pengulangan(diukurdenganSouthernblotanalysis)G. Pria mosaik : Mutasi penuh dan premutation. Dalam hal ini mutasi yang penuh mempunyai 510pengulangan(diukurdenganSouthernblotanalysis)danpremutationmempunyai84pengulangan(diukurdengananalisisPCR) Metode inimengkombinasikanelektroforesisgelagarosauntukmemisahkanDNAberdasarkanukurannya dan kemudian ditransfer kemembran filter untuk selanjutnya dilakukan hibridisasi denganprobe.Untukmengidentifikasi ataupunmelacak suatu fragmenDNA spesifik diperlukan suatu pelacak(probe).DNAdipisahkanterlebihdahuludenganelektroforesis.Probeyangdilabelakanterhibridisasipadapitapita DNA untuk mengetahui apakah DNA tersenonetheless mengandung gen yang diinginkan.SouthernblotmendeteksissDNAdenganmenggunakanDNAsebagaipelacak.SelainSouthernBlotmetodelainyangmiripdandikembangkandariSouthernBlotadalahWesternBlotNorthernBlotdanSouthwesternBlotyangmemilikiprinsipyang samanamunmolekulyangakandideteksidanpelacakyangdigunakanberbeda.KegunaandariSouthernBlotadalahuntukmenganalisiskeberadaanmutanyangadapadasuatuorganismedandapatdiketahuiukurandarigenyangmenjadimutanpadaorganismetersenonetheless.

==AplikasiTeknikSouthernBlottelahdigunakandalamberbagaiaplikasidibidangkesehatanmaupunpadarekayasagenetika.Salah satunyadigunakanuntukmenganalisis sistemmajorhistokompatibilitaspada tikusdanmenganalisispenyusunanklondarigenTcellreceptorpenyakit lukayangdiakibatkanolehmikosisdarifungoides.GuntherEWurstWWonigeitKEpplenJT.AnalysisoftheratmajorhistocompatibilitysystembySouthernblothybridization.JImmunol143(2);12571261.DosakaNTanakaTFujitaMMiyachiYHorioTImamuraS.1989.SouthernblotanalysisofclonalrearrangementofTcellreceptorgeneinplaquelesionofmycosisfungoides.JInvestDermatology93;626629.TahapanSouthernBlotTahapawaldarimetodeSouthernBlotadalahpendigestianDNAdenganenzimrestriksiendonukleasesehingga terbentuk fragmenfragmen DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA dipisahkan sesuai ukurandenganelektroforesisagarosa.SetelahDNAterpisahdilakukanpemindahanDNAkemembrannitroselulosatahapinidiseneverthelessdengantahapblotting.Membrannitroselulosadiletakkanpadabagianatasdarigelagarosa.Padateknikblottingdenganmenggunakanvakummembrandiletakkanpadabagianbawahgel. Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk memastikan terjadi kontak antara gel denganmembran.Prosestransferberlangsungdenganmemanfaatkandayakapilaritas.setalahDNAditransferkegelmembrannitroselulosadipanaskandengansuhutinggi(60oC100oC)kemudianmembrandiberiradiasiUVagarterbentuk ikatankovalendanpermanenantarapitapitaDNAdenganmembran.Lalumembrandicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabel radioaktif tetapi dapat juga digunakan tagnonradioaktifyangdapatberpendar.ProbeyangdigunakanadalahDNAutastunggalyangmemilikisekuenyangakandideteksi.ProbediinkubasidenganmembranagardapatberhibridisasidenganDNAyangadapadamembran.Setelahproseshibridisasiprobeyang tidak terikatdicucidarimembran sehinggayangtinggalhanyaprobe yanghibriddenganDNAdimembran.Polahibridisasi kemudiandideteksidenganvisualisasipadafilmXraymelaluiautoradiografi.

PemisahanDNAdanRNAberdasarkanukurandenganelektroforesispadaberbagaisistemgelmerupakanteknikdasaryangpentingdalambiologimolekuler.PadapHnetral,DNAdanRNAbermuatannegatifdanakan bermigrasi ke arah anoda. Jikamigrasi dilakukan padamatriks polimer (gel), fragmen kecil akanbergeraklebihcepatdaripadafragmenyangbesar(Gambar12).Dengandemikian,migrasielektroforetikmelaluigelakanmemisahkancampuranfragmenDNAsehingganampaksebagaipitapitayangberbedaukurannya.Banyakmatriksgel yangdapatdignakanuntukpemisakhan asamnukleat, tapi yangpalingbanyakdigunakanadalahgelagarosedanpoliakrilamid.GelagarosesesuaiuntukpemisahanfragmenDNAyangberukuran0.120kb,sedangkanpoliakrilamiduntukfragmenDnaberukuran0.0252kb.DenaturansepertiureadapatditambahkanpadagelpoliakrilamiduntukdapatmemisahkanfragmenDNAsampaipadatingkatresolusi1pb (misalnyauntuksekuensingDNA).Salahsatu jeniselektroforesiselagaroseadalahpulsedfieldgelelectrophoresis(PFGE)yangdigunakanuntukmemisahkanfragmenDNAyangsangatbesar(lebihdari1000kb).UntukmelihatfragmenDNAsetelahdipisahkandenganelektroforesisgeldigunakanteknik lain. Jika fragmenDNAcukupbanyak,geldapat langsungdiwarnai (staining)selamaatassetelahelektroforesis sehingga DNA dapat langsung dilihat. Ethidium bromide mengikat DNA dan akanberfluoresensi/berpendarmerah dibawah sinarUV. Jika jumlah DNA terlalu sedikit untuk divisualisasilangsung, radioaktifdigunakanuntukmendeteksi (lihathibridisasi).Hibridisasiasamnukleat.Hibridisasiasamnukleatadalahsalahsatumetodeanalisisyangpalingseringdigunakan.TeknikinidigunakanuntukSouthernblotting,Northernblottingdanuntukskrining library.Tujuanmetode iniadalahuntukmelihat(visulisasi) sekuens asamnukleat tertentu (DNA atauRNA)dalam lingkungan/latarbelakang campuransekuens lain yang kompleks. Teknik ini memanfaatkan sifat DNA yaitu dua untai asam nukleat yangkomplemenakansalaingmengikat(hibridisasi)dengantingkatspesifisitasyangtinggi.Sebaliknya,sekuensasam nukleat yang nonkomplemen tidak berikatan secara spesifik,mismatch nukleotidamenurunkantemperatur/titikleleh.UntukmendeteksiDNAatauRNAtertentudalamsuatucampuranyangkompleks,isicampuranharusdiimobilisasipadamembrandandiubahmenjadibentukuntaitunggal(lihatSoutherndanNorthernblotting).Larutanhibridisasiyangmengandungprobeuntaitunggalyangdilabelradioaktifditambahkanagarterjadihibridisasipadakondisitertentu.Temperaturdankonsentrasigarampadalarutanhibridisasimenentukankespesifikanpengikatan.Padatemperaturtinggidankonsentrasigaramrendah,probehanyaakanmengikatsekuenstargetyangbenarbenarcocok.Setelahhibridisasi,kelebihanprobeyangtidakterikatdicuci,sinyalradioaktifakanterdeteksipadalokasidimanasekuenstargetterletak.Sinyalradioaktifdivisualisasi denganmengeksposkanpada fim Xraymenghasilkan titik ataupitahitam padatempat radioaktif. Southern blotting. Ketika DNA genom didigesti dengan endonuklease restriksi dandipisahkandenganelektroforesisgel,fragmen individualtidakakandapatdilihat,bahkan jikadigunakanDNAdalamjumlahbesar.KarenakompleksnyaDNAgenom,digestidenganenzimrestriksiyangdivisualisasidenganethidiumbromideakanmenghasilkanpolasmearyangterciptadariribuanfragmenDNA.UntukmendeteksifragmentertentupadasmeartersebutdigunakanteknikhibridisasidenganproberadioaktifyanglazimdikenalsebagaiSouthernblotting(diambildarinamapenemunyaEdSouthern)(Gambar19).SouthernblottingdimulaidenganpemisahanelektroforesisgelfragmenDNAyangtelahdidigestidenganenzim pemotong.DNA kemudian didenaturasi (dipisahkanmenjadi 2 untai tunggal) dengan perlakuanalkali,selanjutnyauntaitunggalditransferkemembranmelaluitransferkapilaritas.DNAakanterikatpadasecarakovalenpadamembrandandiimobilisasipadafasepadat,menghasilkanreplikafragmenpadagel.FagmenDNA spesifik padamembran dapat diidentifikasi dengan hibridisasimenggunakan probe yangspesifikuntukfragmengenyangdikehendaki.

Gambar19Southernblot.DNAgenomdiisolasidandigestidenganenzimrestriksi.DNAkemudiandirunpada gel agarose dan ditransfer kemembran dimana DNA kemudian diikatkan secara kovalen. DNAselanjutnyadihibridisasimenggunakanprobeyangdilabel32P.InteraksiantaraDNAdanprobeyangdilabeldideteksidengancaramemajankanDNAmembrankefilmotoradiografi

Northernblotting Blotutaradigunakanuntukmempelajaripolaekspresidari jenistertentumolekulRNAsebagaiperbandinganrelatifantarasetsampelyangberbedadariRNA.InipadadasarnyaadalahkombinasidaridenaturasiRNAelektroforesisgel,dansebuahnoda.DalamprosesiniRNAdipisahkanberdasarkanukurandan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutankepentingan.Hasilnyadapatdigambarkanmelaluiberbagaicara tergantungpada labelyangdigunakan,namun hasil yang paling dalam penyataan band yangmewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel.Intensitasbandband iniberkaitandengan jumlahRNAtargetdalamsampelyangdianalisis.Prosedur iniumumnya digunakan untukmempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi denganmengukurberapabanyakbahwaRNAhadirdalamsampelyangberbeda. Iniadalahsalahsatualatyangpalingdasaruntukmenentukanpadawaktuapa,dandalamkondisiapa,gengentertentuyangdinyatakandalamjaringanhidup.

Northernblotting.PemisahangeldanhibridisasiasamnukleatdapatjugauntukanalisisRNAmenggunakanprosedurNorthernblotting(Tabel12).BeberapahalyangmembedakandenganSouthernblottingadalah:(1)RNA jauh lebih rentan terhadapdegradasidibandingDNA,oleh karena ituelektroforesisdilakukandalambuferyangmengandungzatkimiayangbersifatmelindungi(biasanyaformaldehid),(2)RNAsudahberupauntaitunggaldanmembutuhkankondisidenaturasiyanglebihringan,(3)RNAbiasanyaberukurantertentusehingga tidakmemelukandigestienzimuntukmemperolehpolapita.Keduaprosedursangatmiripkarena setelahelektroforesisRNA jugaditransferkemembranmelaluidifusikapilaritas.BiasanyasinarUVdigunakanuntukmengikat(crosslink)RNApadamembransehinggatidakbergerak(imobilisasi).

Penentuan urutan nukleotida merupakan analisis DNA yang paling detil. Ada beberapa teknik untuksekuensingDNA, tetapimetode penghentian rantai dengan dideoksi (dideoxy chain termination) yangdikembangkanolehSangeradalahmetodeyangpalingbanyakdigunakan(Gambar110).DNAmulamulaharus didenaturasi dan dipisahkan menjadi untai tunggal dengan cara pemanasan. Satu primeroligonukleotidayangdilabelradioaktifkemudianditambahkankedalamreaksidanakanmenempelpadasekuenspasangannyapadaDNA target.DNApolimerasedigunakanuntukmenyalinDNAuntai tunggal.dNTPdalamjumlahbanyak(sampaijenuh)hanyaakanmenghasilkanprodukekstensidenganujungterlabelradioaktif,tapitidakmenghasilkaninformasiurutanbasa.PenambahansedikitddNTPkedalamcampurandNTPakandapatmemberikan informasiurutanbasaDNA.Dideoksinukleotidaakanterinkorporasipadaujung3untaiDNAyangbarudisintesis.DNApolimerasetidakdapatmenambahkanbasabarupadaddNTP.Dengandemikian,inkorporasiddNTPmengakibatkanpenghentiansintesisrantaiDNA.PenambahandNTPdanddNTPdengan rasioyang tepatmemungkinkanuntukmenghentikansintesis rantaiDNApada tiapposisinukleotida. Sebagai contoh, jikaektensiprimerdilakukanmenggunakandATP,dTTP,dGTPdannddCTP,polimerase akanmensintesis untaiDNAbaru sampaidiaharusmenggunakanddCTP (misalnyaketikabasakomplemennyaG).ddCTPakanterinkorporasi,danpadatitik iniDNApolimerasetidakakandapatmelanjutkan ekstensi. Dengan demikian, panjang produk hasil ekstensi yang terlabel radioaktifmenentukanosisiGpertama yangdisalin.UntukmenentukanposisiG yang lain,bukanhanyaG yangpertama,reaksisekuensingyangsebenarnyadilakukandenganmenggunakancampurandCTPdanddCTPdenganperbandingan~200:1.PadakondisiinikemungkinanterjadipenghentianrantaiDNAadalah~1:200yang terjadi ketika terdapat G pada DNA yang disekuensing. Akan diperoleh produk ekstensi denganberbagaipanjang,yangdapatdivisualisasisetelahelktroforesispadagelpoliakrilamid.Berdasarkanpadapanjangproduk,makatiapfragmenakanmenentukanposisisatuG.Untukmenentukanposisikeempatbasa,empatreaksisekuensingdilakukanuntuktiapsampel.PadatiapreaksidicampurkandNTPdanddNTPyang sesuai dikombinasi dengan 3 dNTP lainnya dalam konsentrasi jenuh. Keempat reaksi kemudiandielektroforesisbersebelahanpadagel(poliakrilamiddenaturasi)sekuensingsehinggahasilsekuensDNAdapat langsungdibaca.Secara teoritis sekuensingDNAnampaknya cukup rumit, tapi sebenarnyapadakenyataannyarelatifsangatmudah.TeknologimoderntelahmemungkinkanuntukmelakukanotomasisasisekuensingDNA.Untukskalabesar,robotdapatdigunakanuntukmenyiapkanreaksisekuensing.Yanglebihpentingadalahperalatanyangadasaatinitelahmemungkinkankitauntukdapatmembacahasilsekuensingsecara langsungdansekaligusdapatmenyimpandatakedalamdatabasekomputer.Selainmengurangikerja manusia, otomasisasi demikian juga mengurangi faktor kesalahan yang sering terjadi dalampembacaan dan pemulisan urutan DNA secara manual. Kebanyakan mesin sekuensing sekarangmenggunakan fluorescent (cat yang berfluoresensi) sebagai pengganti radioaktif. Cat ini dapatdiinkorporasikankedalamprimersekuensingataukedalamnukleotida.Sepertipadasekuensingmanual,elektroforesis gel (atau elektroforesis kapiler) digunakan untukmemisahkan fragmenDNA berdasrkanukurannya.Hanya saja pada sekuensing otomatis deteksi fragmenDNA yang berfluoresensi dilakukan

dengan bantuan sinar laser dan sinyal diproses oleh komputer.

Gambar110SekuensingDNA.Cetakan,primerdanpolimeraseditambahkanpadasuatureaksiyangberisidideoksi dan deoksinukleotida. Empat reaksi yang terpisah yangmasingmasingmenggunakan ddATP,ddTTP,ddCTPdanddGTP.Tiapreaksikemudiandirun(dielektroforesis)padagelpoliakrilamid.Atausebagaialternatif,reaksisekuensingdilakukanmenggunakannukleotida(atauprimer)yangdilabelfluorescentagardapatdideteksidenganlaser.Sekuens/urutanDNAkemudiandidownloadkekomputer.Metode sekuensing otomatis lainnya sedang dikembangkan, termasuk penggunaan chips DNA. PadastrategiinisejumlahbesarnukleotidayangdiaturdandilekatkanpadachipsDNA.HibridisasifragmenDNApadachipsmemungkinkandeteksisekuensyangoverlapyangdapatdiubahmenjadisekuensDNAyangterhubung(nyambung).Teknologiiniterutamaakansangatbergunauntukmendeteksipolimorfismedanmutasi,karenasekuensyangtelahdiketahuidapatdilekatkanpadachipsdenganvariasitertentupadatiapnukleotida.

Molecular Probe and Hybridization Lecture 4, by Fatchiyah

Probe is labeled, defined sequence used to search mixture of nucleic acids for molecule containing a complementary sequences.

click here Molecular probe ppt

HIBRIDISASI

Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara pemanasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses renaturasi dengan cara pendinginan. Pengujian sel bakteri pembawa rekombinan, gen-gen target, level mRNA, hasil pemotongan ER (RFLP) dan uji lainnya yang menggunakan teknik hibridisasi, membutuhkan proses denaturasi dan fragmen asam nukleat yang tidak diketahui dan memfiksasi fragmen tersebut pada bahan solid seperti filter nitroselulosa. Untuk pengujian dengan hibridisasi diperlukan suatu probe asam nukleat yang komplementer dicampurkan dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan solid tersebut pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi dapat juga dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak didiagnosis (target) maupun probe dimasukkan dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada di bahan solid. Keadaan tersebut sangat penting dalam aplikasi kebanyakan diagnostik mikrobiologi yang memiliki konsentrasi DNA target sangat sedikit dan membutuhkan waktu diagnosis lebih cepat. Probe dapat juga dibuat dari oligonukleotida (biasanya terdiri dari 30-40 nukleotida) yang dibuat secara sintetik. Oligonukleotida tersebut dapat berupa fragmen DNA rantai tunggal atau fragmen RNA yang dilabel. Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarose ke nilon berpori atau membrane nitroselulosa. Transfer DNA disebut Southern blotting, mengacu kepada nama penemu teknik tersebut yaitu E.M. Southern (1975). Pada metode ini mula-mula gel didenaturasi dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan. Selanjutnya di atas gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori atau membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya diberi pemberat. Semua fragment hasil pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal. Pola fragmen akan sama dengan yang berada pada gel.

Gambar . Skreening pustaka DNA genomik (www.personal.psu.edu/rch8/workmg/Isolat_analy). Untuk identifikasi bakteri atau sel inang yang membawa plasmid rekombinan juga dilakukan hibridisasi dengan menggunakan membran nitrosellulosa yang meiliki ukuran dan bentuk sesuai dengan petridish yang digunakan. Membran ditempel ke medium LB yang telah ditumbuhi

koloni bakteri, kemudian membrane diambil dan petri berisi koloni bakteri diinkubasi lagi untuk ditumbuhkan kembali. Kemudian membran diinkubasi bersama probe DNA Bila antara probe dan DNA target merupakan komplemen maka akan terjadi hibridisasi. Bila probe yang digunakan dilabeli maka selanjutnya dupleks yang terjadi dapat dideteksi. Bila kondisi hibridisasi yang digunakan mempunyai stringency yang tinggi (highly stringent), maka tidak akan terjadi hibridisasi dengan DNA yang mempunyai kekerabatan yang jauh atau non homolog. Jadi probe DNA akan mengenali hanya sekuen yang komplemen dan secara ideal homolog diantara beribu-ribu atau bahkan berjuta-juta fragmen yang bermigrasi sepanjang gel. Fragmen yang diinginkan dapat dideteksi setelah dilakukan pemaparan membran yang telah mengalami hibridisasi pada film. Ada berbagai cara untuk memperoleh dari melabel probe asam nukleat. Sebuah gen dan agen penyakit yang akan dideteksi harus dimurnikan terlebih dahulu, kemudian dilabel apakah dengan radioisotop seperti 32P atau dengan substansi non-radioisotop. Walaupun substansi non-radioisotop dan dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Sensitifitas uji diagnostik menggunakan probe yang dilabel dengan non-radioisotop dapat ditingkatkan dengan penggunaan PCR. Substansi non-radioisotop yang paling sering digunakan sebagai label adalah biotin dan digoxigenin.