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Analisi degli alimenti(LMC-6: PACKAGING)
Giorgio Bonaga
Anno Accademico 2010/2011
Laurea Magistrale in
CHIMICA
ANALISI DEI CONTAMINANTIDA PACKAGING
Bisfenolo A (BPA)Bisphenol A (BPA) is 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane.
H3C CH3
OHHO
Sintetizzato per la prima volta dal chimico russo A.P. Dianin nel 1891, attualmente viene preparato per condensazione dell’acetone (da cui deriva la lettera A) con due equivalenti di fenolo. La reazione è catalizzata da una acido o da una resina di poliestere sulfonato.
BPA
polisteri
USI DEL BPA
polisulfonati
chetonipolieteri
inibitorepolimerizzazione
PVC
policarbonati
precursore di
ritardatoridi fiamma
BADGEBADGE is an acronym for Bisphenol A diglycidyl ether
H3C CH3
OOO O
BADGE
BADGE E DERIVATI REGOLAMENTATI
H3C CH3
OOO O
H3C CH3
OOO
HOOH
H3C CH3
OOHOOH OH
OH
H3C CH3
OOClOH OH
Cl
H3C CH3
OOO
ClOH
H3C CH3
OOClOH OH
OH
BADGE
BADGE.H2O
BADGE.2H2O
BADGE. HCl
BADGE.2HCl
BADGE.HCl.H2O
RESINE EPOSSIDICHE
resinapigmentisolventi
agenti dicross-linking
resinaepossidic
a
Struttura di resina epossidica:
Sintesi di resina epossidica:
H2C CH2 CH2
O
H2C CH OCH2 CCH3
CH3
O CH2 CHOH
CH2 O
O
CCH3
CH3
O CH2 CH CH2
O
n
NaOH
CCH3
CH3
HO OH H2C CH2
OCH2 Cl+
bisphenol A epichlorhydrine
EPOXY EQUIVALENT WEIGHT (EEW) = quantità di resina espressa in grammi che contiene un grammo-equivalente di gruppo epossidico. L’equivalente epossidico determina anche lo stato fisico e la reattività della resina.
EEW 300 resine liquide la cui reattività dipende dall’elevata concentrazione di gruppi epossidici.
EEW > 300 resine solide la cui reattività è anche legata alla presenza di ossidrili secondari, la cui rilevanza aumenta con l’incremento del peso molecolare.
VANTAGGI E SVANTAGGI DELLE RESINE EPOSSIDICHE
VANTAGGI: i film hanno una notevole resistenza verso i principali agenti
chimici; eccellente resistenza all’abrasione e all’urto; eccezionale adesione a superfici di diversa natura; termostabilità nell’intervallo da -70°C a +100°C; quelle a basso peso molecolare non richiedono solventi per la loro
sintesi.
SVANTAGGI: i film sono abbastanza costosi; possono ingiallire ed opacizzare in presenza di radiazioni UV e a
contatto con l’ossigeno atmosferico; in condizioni spinte possono diventare fragili e il film si polverizza.
RESINE EPOSSI-FENOLICHE
Sono sintetizzate a partire da resine epossidiche e resine fenoliche. Le resine fenoliche sono polimeri generalmente termoindurenti, ottenuti dalla reazione del fenolo con la formaldeide. La reazione è una sostituzione elettrofila nella quale tre molecole di formaldeide sostituiscono gli atomi di idrogeno nelle posizioni orto e para del fenolo. Il 2,2,4-tris(idrossimetil)fenolo che, a sua volta, reagisce con altre molecole di fenolo con eliminazione di una molecola di acqua in ciascuna reazione. Il risultato netto è la condensazione di molecole di fenolo attraverso gruppi metilenici in posizione orto e para.
OH
**
*
CO
HH+ 3
OH
OHHO
OH
OH
*
**
OH
HO
OH
OH
*
**
RESINE EPOSSI-FENOLICHE
resineepossidich
e
catalizzatori
pigmenti
resinefenoliche
resineepossi-
fenoliche
La parte fenolica della resina conferisce le proprietà di resistenza verso acidi e solventi, mentre la pesina epossidica conferisce flessibilità, adesione e durezza. Per queste ragioni le resine epossi-fenoliche sono usate come rivestimento interno di cisterne, contenitori metallici e silos industriali.
VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AL BPA Presso la comunità scientifica le conseguenze dell’esposizione al BPA sono controverse:• sulla base delle conoscenze tossicocinetiche del BPA nel sangue umano (rapida biotrasformazione e velocissima escrezione) le modeste concentrazioni di BPA nel sangue umano non sono ritenute significative per la valutazione del rischio tossicologico
• a causa della rapida e completa escrezione di BPA somministrato per via orale, l’urina è il fluido biologico più idoneo a valutare l’esposizione al BPA.
Gli studi sulla tossicità del BPA risalgono circa all’anno 2000, ad eccezione di alcune ricerche sull’estrogenicità del BPA che risalgono agli anni ‘30.• il BPA non è genotossico, non è carcerogeno e studi ripetuti sulla dose tossica, che includono test di tossicità sulla riproduzione e crescita con un ampio intervallo di dosi, mostrano che gli effetti nocivi si manifestano soltanto ad una dose > 50 mg/Kg peso corporeo/giorno.
RESINE PER RIVESTIMENTI INTERNIDI BARATTOLI, SCATOLE, TUBI
Le resine epossidiche e epossi-fenoliche sono utilizzate come rivestimento interno di contenitori per alimenti.
SCATOLE CON RIVESTIMENTO INTERNO SMALTATO BIANCO
SCATOLE CON RIVESTIMENTO INTERNO TRASPARENTE
Resine epossidiche + TiO2 prodotti ittici (in acqua)pomodorimais
prodotti ittici (in olio)ortaggi verdisciroppi di fruttacibi per animali
Resine epossi-fenoliche
NovolaccheCon un rapporto aldeide: fenolo < 1 ed una catalisi acida si ottengono le novolacche, polimeri termoplastici perché costituiti da lunghe molecole lineari.
CH2 CH2H2C CH2 CH2
OH OH OH OH
ResoliCon un rapporto aldeide:fenolo > 1 ed una catalisi basica si ottengono i resoli, polimeri termoindurenti dalla struttura reticolare assimilabile a quella di una novolacca in cui residui di aldeide fanno da ponte tra due catene lineari.
CH2 CH2H2C CH2 CH2
OH OH OH OH
CH2 CH2
H2C CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
RESINE EPOSSI-FENOLICHE
(*) I. A. Lang et al.: J. Am. Med. Assoc., 300 (11), 1303-1310 (2008).
Gli studi relativi agli effetti di BPA a basso dosaggio non sono considerati sufficientemente convincenti per valutare il rischio dell’esposizione al BPA (EFSA, 2006).
La dose giornaliera tollerabile (tolerable daily intake = TDI) del BPA, basata sulla dose senza effetti nocivi osservati (no-observed-adverse-effect-level = NOAEL) divisa per un fattore di sicurezza (di incertezza) pari a 100, è stata posta a 0.05 mg/Kg p.c./giorno dall’AFC panel dell’EFSA (2006).
La United States Environmental Protection Agency (US EPA) ha calcolato per il BPA una dose di riferimento (reference dose = RfD) pari a 0.05 mg/Kg p.c./giorno, basata sulla riduzione di peso corporeo osservato in ratti alimentati con dosi di 50 mg/Kg p.c./giorno per 103 settimane, applicando un fattore di incertezza pari a 1000 alla dose con il minimo effetto osservato (lowest-observed-effect-level = LOAEL).
I. A. Lang et al. (*) hanno condotto il primo studio incrociato sugli effetti sulla salute umana dell’esposizione al BPA. Certi livelli di BPASono significativamente correlati a disturbi cardiovascolari, diabete e all’aumento anomalo del livello di alcuni enzimi epatici.
EUROPA - BPA FRANCIA
Ottobre 2008: l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA) afferma che i contenitori di policarbonato usati nel packaging degli alimenti per l’infanzia non superano i livelli stabiliti dall’EFSA anche quando vengono scaldati in forno a microonde per meno di 10 minuti.
Marzo 2009: il Ministro francese della Sanità, Roselyne Bachelot-Narquin, in disaccordo con le conclusioni dell’AFSSA dichiara che “la decisone delle autorità Canadesi di vietare l’uso del BPA nella produzione delle babies bottles non è dovuta all’opinione pubblica, ma ai risultati di indagini scientifcamente attendibili”.
GERMANIA
Settembre 2008: il Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), cioè l’ Istituto Federale Tedesco per la valutazione del rischio, afferma che in considerazione delle ricerche di Lang, non ci sono ragioni significative per modificare la valutazione del rischio dell’esposizione al BPA.
PAESI BASSI
Novembre 2008: la Dutch Food and Consumer Product Safety Authority (VWA) afferma che le babies bottles di policarbonato non cedono livelli misurabili di BPA e, pertanyo, vanno considerate sicure.
SVIZZERA
Febbraio 2009: sulla base dei risultati di agenzie sanitarie pubbliche, il Swiss Federal Office for the Public Health afferma che l’assunzione di BPA attraverso gli alimenti e le bevande non rappresenta un rischio per i consumatori, compresi i neonati e i bambini. Nonostante ciò l’ufficio federale suggerisce un uso corretto delle babise bottles di policarbonato e fornisce un elenco di soluzioni alternative.
ITALIA
Novembre 2008: vengono considerati sicuri i livelli di BPA riportati da Lang e pertanto non vengono modificati i limiti della resina negli alimenti.
EFSA - BPA(European Food Safety Authority)
Novembre 2006: TDI (BPA) = 0.05 mg/Kg p.c./giorno
Luglio 2008: per gli adulti e i neonati l’esposizione al BPA ≤ alla TDI
Ottobre 2008: il parere dell’EFSA sulle ricerche di I. A. Lang stabilisce la mancanza di evidenze sulla relazione tra BPA e le patologie prese in considerazione. Di conseguenza l’EFSA non modifica la TDI
EFSA – BADGE( E DERIVATI REGOLAMENTATI)
Luglio 2004:
TDI(BADGE): 0.15 mg/Kg p.c./giorno
BADGE e cloridrin-derivati (BADGE.2HCl, BADGE.HCl e BADGE.H2O.HCl) non sono considerati pericolosi rispetto la
cancerogenicità e la genotossicità in vivo. Viene confermato il limite di 1.0 mg/Kg alimento.
MIGRAZIONE - NORMATIVA
• SML(s) = Limite di Migrazione Specifica (singolo)
Limite di migrazione specifica negli alimenti o nei liquidi simulanti, se non diversamente specificato.
• SML(T) = Limite di Migrazione Specifica (Totale)
Limite di migrazione specifica negli alimenti o nei liquidi simulanti, espresso come totale del gruppo di sostanze indicate.
Direttiva CE 82/711
MIGRAZIONE - NORMATIVA
TIPO DI PRODOTTO SIMULANTE ABBREVIAZIONE
alimenti acquosi(con pH > 4.5)
acqua distillata o acquadi qualità equivalente
Simulante A
alimenti acidi(con pH 4.5)
soluzione di acido aceticoal 3% (p/v)
Simulante B
prodotti alcolicisoluzione di etanolo
al 10% (v/v)Simulante C
alimenti a base di olioolio di oliva rettificato o
altri simulanti oleosiSimulante D
alimenti secchi no no
MIGRAZIONE - NORMATIVACONDIZIONI DI CONTATTO NEI CASI
PIU’ CRITICICONDIZIONI TEST
DURATA DEL CONTATTO TEMPO
t 5 minVEDERE CONDIZIONI
CRITICHE5 min < t 0.5 h 0.5 h0.5 h < t 1 h 1 h1 h < t 2 h 2 h2 h < t 4 h 4 h4 h < t 24 h 24 h
t > 24 h 10 daysTEMPERATURA DI CONTATTO(°C) TEMPERATUTA (°C)
T 5 5 5 < T 20 2020 < T 40 4040 < T 70 70
70 < T 100o temperatura di
reflusso100 < T 121 (*)121 < T 130 (*)130 < T 150 (*)
T > 150 (*)
(*) questa temperatura è usata solo con il simulante D. Per i simulanti A, B e C il test può essere sostituito con una prova condotta a 100°C o a temperatura di reflusso, per un periodo di tempo che è quattro volte maggiore di quello stabilito dalle norme generali.
BPADirettiva 2004/19/EC del 01/03/2004 SML(T) = 0.6 mg/Kg
BADGERegolamento (CE) N. 1895/2005 del 18/11/2005
SML(T) del BADGE e dei suoi derivati regolamentati:
la somma BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O non può
superare:
9 mg/Kg nei simulanti o nell’alimento
9 mg/6 dm2
la somma BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O non
può superare:
1 mg/Kg nei simulanti o nell’alimento
1 mg/6 dm2
MIGRAZIONE- LIMITI NORMATIVI
Simulante D
SML(s) di BPA, BADGE & derivati regolamentati, secondo quanto descritto nella Direttiva CE 82/711 e successive modificazioni, sulle scatole nuove
SCHEMA ANALITICO
ESTRAZIONE
LC-MS/MS RISULTATI
ALIMENTI
CONFRONTOMATRICI ALIMENTARI vs SIMULANTI
Simulanti A & B
ESTRAZIONE È stata utilizzata soltanto per gli alimenti e il simulante D.
Per l’estrazione del BPA, BADGE and i suoi derivati regolamentati l’estrazione solida-liquida-liquida seguita da clean-up con SPE è stata sostituita con il metodo QuEChERS
Il metodo QuEChERS è stato realizzato con DisQue Dispersive Sample Preparation Kit, contenente DisQue di estrazione (tubo 1) and DisQue di clean-up (tubo 2).
LC-MS/MS API 3200 (Applied Biosystems) triplo quadrupolo MS equipaggiato
con Turbo V Ionspray. Agilent (1200 Series), utilizzando una pompa binaria per HPLC
Colonna HPLC: Phenomenex® Luna 3 m C18 (2) 100 Å, 150 x 3.00 mm, con precolonna Security-Guard
Mass Spectrometry: Multiple Reaction Monitoring (MRM)
BPA
Sorgente: ESI (ioni negativi) Fase mobile: Solvente A = 10 mM acetato d’ammonio in ACN Solvente B = 10 mM ammonio acettao in H2O
Velocità flusso 0,5 ml/min
Tempo totale (min)
Flusso(ml/min)
A (%)
B (%)
0 0,5 70 30
3 0,5 70 30
4 0,5 90 10
5 0,5 70 30
8 0,5 70 30
BPA
BP
A
CHROMATOGRAMMA DI BPA STANDARD (500 ppb)
BADGE AND ITS REGULATED DERIVATIVES
Sorgente: ESI (ioni positivi)
Fase mobile: Solvent A = 0.5% acido formico in ACN Solvent B = 0.5% acido formico in H2O
Velocità flusso: 0,5 ml/min
Tempo totale(min)
Flusso(ml/min)
A (%)
B (%)
0,0 0,5 50 505,5 0,5 50 509,0 0,5 95 5
10,0 0,5 95 510,1 0,5 50 502,.0 0,5 50 50
BA
DG
E.H
2O
BA
DG
E.2
HC
l +
BA
DG
E.H
2O
.HC
l
BA
DG
E.2
H2O
BA
DG
E.H
Cl
BA
DG
E
CROMATOGRAMA DEI BADGEs (500 ppb)
RISULTATI - RECUPERI
COMPOUND
LOD (ppb)
LOQ (ppb)
R E C O V E R I E S%
Tuna in water
Tuna in olive oil
TomatoesGreen Beans
Peaches in syrup
White Beans
Anchovy fillets in olive oil
BPA 8 16 55.8 ± 5.8 70.0 ± 8.5 74.3 ± 5.1 78.1 ± 5.3 92.0 ± 2.0 54.7 ± 3.4 68.9 ± 1.4
BADGE.2H2O 4 8121.0 ±
6.685.7 ± 11.5
87.5 ± 9.763.4 ± 11.3
82.0 ± 7.1 72.4 ± 3.7 67.0 ± 1.5
BADGE.HCl.H2O 16 32107.9 ±
13.7107.0 ±
2.588.8 ± 6.3 82.2 ± 5.1
95.0 ± 15.1
91.3 ± 5.4 90.3 ± 1.8
BADGE.2HCl 32 64102.2 ±
8.564.0 ± 4.3
104.5 ± 9.7
73.0 ± 9.0 81.0 ± 4.4 87.2 ± 5.5144.2 ±
4.4
BADGE.H2O 4 8 91.0 ± 5.0102.0 ±
2.686. 7± 6.3 97.6 ± 9.4 90.3 ± 9.6 85.2 ± 6.9
102.0 ± 10.1
BADGE.HCl 16 32 88.7 ± 7.8 60.4 ± 8.6103.0 ±
4.692.9 ± 3.6
105.0 ± 4.2
86.1 ± 5.5 87.0 ± 3.2
BADGE 4 8120.0 ±
4.372.0 ± 4.3
114.0 ± 1.7
102.7 ± 3.4
110.7 ± 9.0
92.5 ± 3.3101.0 ±
0.3
COMPOUND RECOVERIES - SIMULANT D%
BPA 62.0 ± 1.8BADGE.2H2O 82.1 ± 2.4
BADGE.HCl.H2O 99.8 ± 1.6
BADGE.2HCl 67.7 ± 4.9
BADGE.H2O 118.0 ± 2.5
BADGE.HCl 80.0 ± 3.7BADGE 123.0 ± 2.7
FOOD vs SIMULANT A
BPA
BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O
FOOD vs SIMULANT B
BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O
BPA
FOOD vs SIMULANT D
BADGE + BADGE.H2O + BADGE.2H2O BADGE.HCl + BADGE.2HCl + BADGE.HCl.H2O
BPA
HPLC - FLD
• Estrazione con ACN (24 h, T ambiente) di scatole nuove rivestite con resine epossidiche epossi-fenoliche;
• Analisi degli estratti in ACN e dgli estratti mediante QuEChERS di matrici alimentari;
• Colonna HPLC: Waters® X Terra, RP18 5 m, 150mm x 4,6 mm
• Fase mobile: ACN:H2O (50:50, v/v)
• Velocità flusso: 0,5 ml/min
• Diluizione del campione: 1:2 con H2O
• Volume iniettato: 20 µL
exc = 275 nm, em = 325 nm
ESTRATTO DI RESINE EPOSSIDICHE
BA
DG
E 2
H2O
BP
A
BA
DG
E
BA
DG
E.
H2O
?B
AD
GE.2
H2O
RISULTATI
CONCLUSIONI
I risultati relativi agli alimenti sono differenti da quelli relativi ai simulanti, con una discordanza significativa in più del 60% dei casi;
Il trend di migrazione del BPA è differente da quello dei BADGEs;
Il BADGE scompare negli alimenti in relazione alla durata delle sue interazioni con la matrice alimentare;
I test di conformità con i simulanti non sembrano essere in grado di valutare la migrazione reale;
È necessario realizzare le analisi della migrazione dalle resine sia con i simulanti che con gli alimenti reali.