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Análises de DNA
O DNA e sua história
DNA nos remete a Hereditariedade -Hipócrates (460-377 a.C.): “pangênese” -Aristóteles (384-322 a.C.): transmissão das características pelo sêmen
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Friedrich Miescher (1869) Primeiras evidências da presença de DNA no núcleo das células identificou uma substância rica em fósforo que não se enquadrava como nenhuma das substâncias protéicas conhecidas até aquele momento. A esta substância ele deu o nome de nucleina.
Richard Altman (1889) Obteve amostras de nucleina livres de proteína e cunhou uma denominação mais apropriada para a substância: ácido nucléico.
O genoma e sua história
Primeiras extrações de DNA Final 1800s e início 1900s -35 kg de pâncreas bovino dissolvido em 200 litros de ácido sulfúrico -Timo, também utilizado (…legado “timina”)
Estrutura do DNA
Watson & Crick 1953, Nature 171: 737-738
Rosalind Franklin: cristalografia de raio-X de moléculas de DNA
A dupla Hélice
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Modelo da estrutura do DNA elaborado por Watson e Crick
Crick's first sketch of the deoxyribonucleic acid double-helix
Watson & Crick's 1953 Nature paper Recent view of double-helix DNA structure
Cristalografia e Difração de raio X
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DNA
processo de cristalografia por raio-X padrão resultante de difração – estrutura tridimensional do DNA
Cristalografia e Difração de raio X
Genômica integrativa
Laboratório
Eletroforese em Gel
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Genômica integrativa
Laboratório
Princípios da eletroforese Gel (malha): agarose, poliacrilamida... Fonte de energia – campo elétrico
Resultados
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Enzimas de Restrição e Tecnologia do DNA recombinante
Enzimas de Restrição
-Nomenclatura; –Reconhecem seqüências palindrômicas; -Finais coesivos e finais retos; -Freqüência de cortes;
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Restrição enzimática
Arber, Smith e Nathans Prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em 1978
Construindo moléculas recombinantes
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Produção de moléculas recombinantes
Complementariedade entre os finais gerados pela enzima de restrição e produção de moléculas recombinantes
Construindo moléculas recombinantes
Restrição Enzimática
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Restrição Enzimática
Construindo moléculas recombinantes
Molécula de DNA recombinante
Complementariedade entre os finais gerados pela enzima de restrição
Construindo moléculas recombinantes
1970s – Engenharia Genética
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DNA recombinante Bactéria
Fazendo clones do DNA recombinante
Fazer uma molécula de DNA recombinante, para que?
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Polymerase Chain Reaction (PCR)
Desnaturação
Anelamento dos Primers
Duplicação do DNA
PRINCÍPIO DA PCR
-Diagnósticos moleculares -Identificação e isolamento de genes -Marcadores moleculares -Expressão gênica (RT-PCR e PCR em tempo real)
APLICAÇÕES
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GENÉTICA FORENSE
Ex: identificação de criminosos
caso de estupro
Ex: Polimorfismo da enzima conversora da Angiotensina I ! Angiotensina II ! Cardiopatias
Alelo I
Alelo D
Indivíduos
APLICAÇÕES da PCR
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Genômica integrativa
Laboratório
Hibridização de ácidos nucléicos
Método para identificação e localização de ácidos nucléicos em materiais fixados
Cromossomos
Fibra de cromatina
Células Núcleo
Tecidos
DNA imobilizado
Hibridização de ácidos nucléicos
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Hybridization of interphasic nuclei
Chromosome 18 (blue), X (green) e Y (red)
Chromosome 13 (red) e 21 (green)
Chromosome hybridization
Normal Chromosome 13
(blue) e 21 (green)
Down Chromosome 13 (blue) e 21 (red)
Chromosome hybridization
Hybridization of interphasic nuclei
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Whole chromosome probes
Human karyotype
Chromosome hybridization
Male normal cell
Tumor female cell
Whole chromosome probes
Chromosome hybridization
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Partial chromosome probes
Chromosome hybridization
Human karyotype
Tissue section hybridization – RNA hybridization