Aluna:Flávia Costa LeonardoOrientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante PereiraCo-orientador: Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa

Estudo do cupim Coptotermes gestroi: Análise da base genética da

diferenciação de castas e busca de genes de importância biotecnológica

CUPIM

• Filo – Arthropoda • Ordem – Isoptera• Mais de 2.700 espécies descritas

• Insetos Eussociais:-sobreposição de gerações -interdependência-divisão de tarefas com indivíduos estéreis trabalhando em benefício dos férteis

CASTAS

• OPERÁRIOS

• SOLDADOS

• REPRODUTORES

Ciclo de vida de uma colônia de Isoptera

Reprodutores alados(♂ ou ♀)

Rei e Rainha (reprodutores

primários)

Ovos

Jovens

Ninfas

Reprodutores suplementares ou de

substituição(♂ ou ♀)

OperáriosSoldados

• Ciclagem de nutrientes• Degradação da madeira• Benefícios para o solo

– Entretanto algumas espécies causam prejuízos...

BENEFÍCIOS DOS CUPINS

• 1986 – tratamentos de edificações infestadas por cupins foram estimados em US$ 2 bilhões.

(Edwards & Mill, 1986)

• 1994 – Na cidade de São Paulo tratamentos de 240 edificações foram estimados em US$ 3,5 milhões. (Lelis, 1994)

PREJUÍZOS CAUSADOS POR ESSES INSETOS

• Principais pragas de edificações nas regiões tropicais e subtropicais do mundo.

(Su & Scheffrahn, 1998)

• + de 2.700 espécies 113 espécies são pragas, 80% das espécies

de importância econômica são do gênero Coptotermes. (Edwards & Mill, 1986)

CUPINS SUBTERRÂNEOS

Coptotermes gestroi

Coptotermes gestroi

• Hábito xilófago, contudo danificam uma variedade de materiais na busca de alimento (plástico, borracha, metal, cabos elétricos e telefônicos, isopor, tecido, betume, gesso)

• Principal praga urbana na região sudeste

• Espécie introduzida, originaria do sudeste Asiático

NINHO SUBTERRÂNEO

DESENVOLVIMENTO

OVOS

LARVA

PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA

ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA

LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA

OPERÁRIO

HJ

Operários C.gestroiCabeça de operário

C.gestroi

Biblioteca de EST

Contigs e Singletons

Seqüências de interesse

biotecnológico

celulases

CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA DE cDNA

RESULTADOS

1

10

100

1000

> 10050 - 100

40 - 50

31 - 40

21 - 30

11 - 20

6 - 102 - 5

1

# EST in unigene

# U

nige

ne (l

og s

cale

)

2332- sequencias777 unigenes

406 Hits 371 No Hits 33 Contaminação98 Ribossomal

178 Hits GO92 No Hits GO Fig1. Histograma da constituição das sequencias

RESULTADOS

• Contaminação-9 Fungos do solo-3 Protozoários – possível endossimbionte-Bactérias – 2 solo

8 solo/endossimbiontes 5 Wolbachia-6 Plantas –hábitos alimentares

29%

29%10%

9%

6%

4%

3%2%2%2%2%2%

Apis mellifera Tribolium castaneum Aedes aegypti Anopheles gambiae Drosophila Strongylocentrotus purpuratus Potamophilinus sp. Bos taurus Gallus gallus Heterotermes longiceps Tetraodon nigroviridis Wolbachia endosymbiont

Fig. 2. Distribution of assembled Coptotermes gestroi ESTs, after manual annotation. The best match result was listed according organism category

Table 2 - Gene Ontology classification of C. gestroi cDNA library sequences

Gene Ontology Number of genes

Biological Process

cellular physiological process 184

metabolism 140

localization 31

cell communication 18

regulation of cellular process 13

regulation of physiological process 12

others 29

Endo –β-1,4 glucanase β glucosidase

DIGESTÃO E ABSORÇÃO DA MADEIRA

• Digestão da celulose e simbiontes• 74 – 99% degradação da celulose

Celulose

CO2

Glicose

NH3 Acetato

Piruvato

Piruvato N2 NH3

Acetil CoA Acetato

CO2 CH4

Celulose

Acetato

Piruvato GlicoseXilose

Co2 + H2 Xilan

ProtistaCupim

Bactéria

Celulose

CO2

Glicose

NH3 Acetato

Piruvato

Piruvato N2 NH3

Acetil CoA Acetato

CO2 CH4

Celulose

Acetato

Piruvato GlicoseXilose

Co2 + H2 Xilan

ProtistaCupim

Bactéria

Celulose

CO2

Glicose

NH3 Acetato

Piruvato

Piruvato N2 NH3

Acetil CoA Acetato

CO2 CH4

Celulose

Acetato

Piruvato GlicoseXilose

Co2 + H2 Xilan

ProtistaCupim

Bactéria

CUPIM

Sistemática do grupo

• Cupins inferiores: Mastotermitidae, Kalotermitidae, Hodotermitidae, Termopsidae, Rhinotermitidae e Serritermitidae

• Cupins superiores: Termitidae

CELULOSE

www.genomics.energy.gov

MECANISMO DE AÇÃO DAS CELULASES

SISTEMA DIGESTIVO

S – Glândulas salivaresOe – EsôfagoF – Intestino anteriorM – Intestino médioMs – segmento mistoMp – túbulos de MalpighiH – Intestino posteriorP1 – 1º Seg proctodealP2 – Válvula entéricaP3 – PançaP4 – Cólon P5 - Reto

CELULASES EM CUPINS INFERIORES

Estudos moleculares das enzimas dos simbiontes são escassos1997 – Nature – Primeira descrição de uma celulase endógena em R. speratus.2002 – Descrição da - glucosidase em Neotermes koshunensis

2002 – Descrito o sistema digestivo duplo do C. formosanus (celulases endógenas + simbiontes).

PROJETO CELULASES

• Aumentar as sequencias

• Testes para avaliar a eficiência enzimática

• Teste comparativo dos níveis de atividade enzimática nas diversas regiões do trato digestivo

• Método semi-quantitativo (RT-PCR) para verificar a expressão das celulases

OBJETIVOS

Compreender a base molecular da determinação de castas de Coptotermes gestroi

• objetivos específicos :

- identificar os aspectos da biologia da espécie através de estudos de expressão gênica casta específica

- utilizar alguns dos genes encontrados como possíveis alvos para o controle da espécie.

- isolar e caracterizar enzimas que possam ter emprego biotecnológico.

MATERIAL E MÉTODOS  OBTENÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS CUPINS C. gestroi

Operários, ninfas e soldadosforrageiros de C. gestroiforam coletados em armadilhas celulósicas,distribuídas na cidade de Rio Claro-SP.

BIBLIOTECAS SUBTRATIVAS

OVOS

LARVA

PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA

ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA

LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA

OPERÁRIO

HJ

X

X

X

X

LARVA X OPERÁRIO+SOLDADO

Redundancia biblioteca subtrativa

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Reads de 006 nos contigs (%)

Num

ero

de c

ontig

s

REAL TIME PCR E MICROARRAY

OVOS

LARVA

PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA

ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA

LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA

OPERÁRIO

HJ

Obrigado!