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Unidad 4. Mutagénesis, carcinogénesis y teratogénesis Departamento de Farmacia, Facultad de Química, UNAM.

1 Profesor: Francisco Hernández Luis

Unidad 4. Mutagénesis, carcinogénesis y

teratogénesis

4.1 Mutagénesis

Mutación es todo cambio transmisible en el material genético de un

organismo. Algunos de los agentes físicos y químicos que producen dichos

cambios son: la radiación ionizante, mostazas nitrogenadas, epóxidos,

sulfonatos de metilo.

De las alteraciones que se producen en el ácido desoxiribonucléico

(ADN), no todas son necesariamente dañinas, ya que muchas mutaciones

han ocasionado mejores adaptaciones de los individuos en los procesos

evolutivos. El peligro se presenta con aquellas mutaciones cuyos efectos

provocan reacciones adversas para el organismo. Las consecuencias

nocivas de las mutaciones incluyen desordenes en la fertilidad, muerte

embrionaria y perinatal, malformaciones, enfermedades hereditarias, y

cáncer. Los propósitos de la toxicología en este campo son:

a) Identificar aquellas sustancias que presenten potencialidad

mutagénica

b) Tratar de establecer el mecanismo de acción y las consecuencias

fenotípicas de los agentes que provocan mutaciones

c) Establecer los parámetros o condiciones necesarias para minimizar

la exposición humana a los mutágenos, con el propósito de evitar

alteraciones en la información hereditaria que ya posee el individuo

La probabilidad de que un xenobiótico pueda causar daño genético

es afectado por su concentración en el medio ambiente; su ingreso y

distribución corporal; el sistema metabólico del tejido en el cual el

compuesto es distribuido; la reactividad del xenobióticos o sus metabolitos

con las macromoléculas, especialmente con el ADN; la capacidad de la

célula para rectificar o amplificar el daño; la oportunidad de que el daño

causado se exprese; y la capacidad del tejido para reconocer y suprimir la

multiplicación de las células con propiedades aberrrantes. Por todos estos

factores, es importante tener en cuenta que para que un compuesto

presente en el medio ambiente, afecte al material genético no es un evento

simple y fácil de llevar a cabo.

Figura 4-1. Paradigma toxicológico

Niveles de acción de mutágenos

Las consecuencias de la mutagénesis se pueden esquematizar en

la siguiente forma según sea afectada una célula somática o una célula

germinal.

excreción

aproximación al ADNtraslado por la membrana

del núcleo

riesgo de exposición

ruta de ingreso y

distribución fisiológica

biotransformación

reacción con el ADN

(mutación)

procesos de

reparación

expresión

trastorno biológico

(reacción adversa)

traslado por membranas

celulares

etapa

toxocinética etapa

toxodinámica



Figura 4-2. Consecuencias de mutaciones en células somáticas y germinales

Es importante señalar la diferencia entre dos términos que con

frecuencia suelen utilizarse como sinónimos: mutagenicidad y

genotoxicidad. La mutagenicidad es la capacidad de un xenobiótico para

causar alteraciones en el material genético que lleguen a ser transmisible a

la progenie celular. La genotoxicidad implica un término más amplio, ya que

incluye alteraciones al material genético, tales como intercambio de

cromátidas hermanas o rupturas de hebras de ADN, que no

necesariamente son transmitidas a la decendencia Klaassen C.D., 2001)

Interacción de xenobióticos con el DNA

Cambio de grupo funcional

Un ejemplo de transformación química de bases es provocada por

el ácido nitroso, HNO2, el cual provoca la transformación de citosina a

uracilo o de la adenina a hipoxantina. El ácido nitroso puede ser formado,

en el cuerpo humano, por la reacción de nitritos con compuestos orgánicos

(aminas secundarias) en las condiciones ácidas del estómago.

Figura 4-3. Deaminación de la citidina para dar uridina por acción del HNO2

Alquilaciones

Alquilación intracatenaria Alquilación intercatenaria

Figura 4-4. Tipos de alquilaciones en las hebras de ADN

Características de los agentes alquilantes

- Son de naturaleza electrofílica

- Altamente reactivos

- Formación de enlaces covalentes

- Reemplazan H por un grupo alquilo

- Interrupción de la función del ADN y muerte celular

- Escasa selectividad (antineoplásicos (antiproloferativos) y

carcinógenos)

transmisible a

la progenie

recesivodominante viablemuerte fetal

cáncer

cambio recesivo

muerte celular

célula germinalcélula somática

evento mutagénico

odominante

mutágeno

N

N

NH2

O

ribosa

N

N

ribosa

O

O

HNO2

Citidina Uridina



- En general todos son depresores de la médula ósea

Figura 4-5. Alquilacion del ADN, monofuncional y bifuncional

Intercalaciones al ADN

A continuación se ilustra el fenómeno de la intercalación en el ADN.

Figura 4-6. Alquilación del ADN

Figura 4-7. Diagrama que muestra dos moléculas de doxorrubicina

intercalándose en el ADN

Los agentes intercalantes son un importante grupo de mutágenos

utilizados en los laboratorios de investigación. La intercalación fué primero

descrita por Lerman en 1961 como una interacción no covalente en la cual

el agente intercalante se coloca de forma perpendicular al eje de la doble

hélice. Algunos ejemplos de agentes intercalantes se presentan en la figura

4-8.

Los compuestos intercalantes se caracterizan por su dimensión,

que corresponde a 3 anillos aromáticos condensados (o heterocíclicos), la

cual es semejante al diámetro de la doble hélice del ADN. La intercalación

provoca una separación vertical de los pares de bases, distorsionando la

conformación del enlace azucar-fosfato y una distorsión de la hélice tal que

la longitud de la misma se incrementará. La intercalación ocurre

agente alquilante bifuncional

+

ADN

proteína

OH

alquilantehidrolizado

alquilacióndos hebras

alquilaciónuna hebra

alquilaciónADN-proteína

alquilacióndos ADN



preferentemente en la secuencia pirimidina-3´-5´-purina que dentro de la

secuencia purina-3´-5´-pirimidina.

Figura 4-8. Agentes intercalantes del DNA

Las investigaciones señalan que los agentes intercalantes

interfieren con la topoisomerasa II. Esta enzima cataliza la ruptura

pasajera de la doble hélice de ADN para propósitos tales como replicación

o transcripción. Aunque la separación ocurre en presencia de los

intercaladores, la topoisomerasa II permanece firmemente unida en el punto

dañado y entonces previene el acoplamiento de las hebras nuevamente.

Actualmente, se piensa que la intercalación es la primera etapa en una

serie de eventos que provocarán daño al ADN por otros mecanismos.

Figura 4-9. Afectación de la topoisomerasa

Tabla 4-1. Mutágenos y sus mecanismos de acción

Tipo de mutágeno

Mecanismo Ejemplo Mutación

Agentes alquilantes

Forman enlaces covalentes con las purinas y pirimidinas provocando los sitios apúricos

Sulfato de alquilo, mostazas nitrogenadas, nitrosourea

Transición, transversión

Agentes desaminantes

Desaminan adenina y la transforman en hipoxantina; y a la citosina en uracilo

Ácido nitroso Transición

Análogos de base

Sustituyen a las bases púricas y pirimidínicas normales durante la replicación del ADN

2-aminopurina Transición

Agentes intercalantes

Se intercalan en las hebras de ADN.

Acridinas, antraciclinas

Corrimiento que altera la lectura en el ADN

Tabla 4-2. Ejemplos de acción mutagénica y aberración cromosómica

Xenobiótico Actividad de microlesión relativa

Actividad de macrolesión relativa

Sulfato de dimetilo 100 100 Metilnitrosoguanidina 27 710 Cafeína 0 340 Hidroxilamina 0 88

quinacrina

N

OCH3

Cl

NHN

C2H5

C2H5

P = pépt ido

actinomicina

PP

O

N

O

CH3 CH3

C CO O

bromuro de etidium

+ -Br N

NH2H2N

C2H5

acriflavina

NH2N NH2



4.2 Evaluación de la actividad mutagénica de

xenobióticos

Muchas sustancias químicas y agentes físicos pueden provocar

citotoxicidad por diferentes mecanismos, uno de los cuales involucra la

interacción con los ácidos nucléicos con la alteración en la información

genética, con la consecuente producción, ya sea, de un efecto letal para la

célula o daños débiles o severos a una o más de las funciones celulares a

nivel de ARN, membranas, proteínas y enzimas. Los experimentos para

poder evaluar estos efectos llegan a ser complejos y prolongados ya que

implican animales completos, y estudios a través de varias generaciones.

Ante tal situación, se han desarrollado una serie de pruebas in vitro de corta

duración (short-term) utilizando microorganismos, plantas, insectos y

cultivos celulares de mamíferos. Estas pruebas sirven para monitorear

(screening) posibles agentes con actividad mutagénica, teratogénica y/o

carcinogénica.

Pruebas para la evaluación de actividad mutagénica en procariotes

Basados en la hipótesis de que los carcinógenos son inicialmente

mutágenos, Ames y colaboradores en la década de los 70´s, realizaron

experimentos con varios microorganismos para encontrar sustancias con

actividad mutagénica. La cepa bacteriana que mejores resultados

proporcionó fué la Salmonella typhimurium. (En la actualidad también se

utiliza Escherichia coli WP2 uvr A-). Las cepas originales fueron

genéticamente incapaces de sintetizar histidina (his-). En este ensayo, se

incuban cepas de esta bacteria con algún xenobiótico y en medio de cultivo

sin histidina. En estas circunstancias, un crecimiento de colonias es

indicativo de acción mutagénica del compuesto estudiado, al convertir un

organismo auxotrófico que requiere de un nutriente específico para subsistir

(histidina) hacia un organismo prototrófico, que puede sintetizar el nutriente

requerido desde un precursor más simple presente el medio de cultivo.

Figura 4-10. Prueba de Ames

www.bioreliance.com/AMES_assay.html

Dos variantes de esta técnica, se utilizan al verter las mezclas de

microorganismos y xenobióticos, a las cajas de petri para posterior

incubación. Estas variantes son: la incorporación inmediata y la

preincubación.

En la incorporación inmediata, el control, el microorganismo y el

xenobiótico, una vez que han sido mezclados, se vierten inmediatamente a

las cajas de Petri, para enseguida incubarlas a 37 °C durante 48 h. Ésta

variante se presenta esquemáticamente en la figura 4-11.

http://www.bioreliance.com/AMES_assay.html



Figura 4-11. Pruebas para la actividad mutagénica en bacterias

Un aspecto adicional a considerar es la adición de la fracción S9.

Esta fracción se obtiene del hígado de mamíferos (usualmente ratas), a las

cuales se les administra previamente Aroclor 1254 (en la actualidad se

prefiere una mezcla de fenobarbital y 5,6-benzoflavona) para inducir las

enzimas que metabolizan xenobióticos.

Figura 4-12. Obtención de la fracción S9

Para mejores resultados, se prepara la mezcla S9 que consiste en

fracción S9 (0.1-0.3 mL), MgCl2 (0.4 M, 0.02 mL), KCl (1.65 M, 0.02 mL),

glucosa 6-fosfato(1M, 0.005 mL), NADPH (0.1 M, 0.04 mL), NADH (0.1M,

0.04 mL), amortiguador de fosfato de sodio (0.2M, 0.5 mL). Todo esto se

afora a 1 mL.

La variante de preincubación se describe a continuación.

Cantidades disponibles (108 microorganismos/ mL) de microorganismo

mutante, son incubados en tubos de ensayo por 30 o 60 min, con medios

pocos nutritivos, una capa de agar y en presencia o ausencia del

xenobiótico a evaluar. Transcurrido el tiempo, el contenido de los tubos se

vierte sobre cajas de petri que contiene una cantidad mínima de medio de

cultivo y son incubadas a 37 °C por 48 h.

rataadministración

del inductor

sacrificar y

extraer el

hígado

homogeneizar

en frío con

solución salina

centrifugar

a 10, 000 g

el sobrenanante

se centrifuga a

102 000 g

al precipitado

se le denomina

fracción micro-

somal S9

al sobrenadante

se le llama fración

citosólica S100



Los tubos de ensayo deben presentar 10

8 organismos por mL. En el tubo (A) se presenta

medio de cultivo más agar, en el tubo (B) se presenta el medio de cultivo más la fracción S-9 del hígado de rata inducido por Aroclor 1254; el tubo (C) presenta el medio de cultivo, la fracción S-9 y el compuesto químico que se va a evaluar. Los tubos se incuban a 37 °C por 48 Hr. Sobre un rango de concentraciones del compuesto de prueba, el número de colonias debe incrementarse al aumentar la cantidad de sustancia.

Figura 4-13. Pasos generales de la prueba de Ames

Un aspecto importante a considerar es la concentración del

xenobiótico que se va a estudiar. Por esta razón, primero se lleva a cabo un

estudio de sensibilidad de la cepa a diferentes concentraciones del

xenobiótico. Las concentraciones tóxicas (pendientes negativas, Figura

siguiente) de entrada se rechazan.

Para cada estudio se recomienda de 5 a 6 concentraciones diluidas

a una relación del doble o triple. Cada estudio por duplicado. En la gráfica

siguiente, la recta de pendiente positiva es la de utilidad. De esta parte se

determina el valor de dicha pendiente (m) que se interpreta como la

actividad mutagénica específica, parámetro que nos sirve para evaluar la

actividad mutagénica del xenobiótico estudiado.

m = actividad mutagénica específica (n.c./mg) n.c. : número de colonias

Figura 4-14. Consideraciones para la prueba de Ames

En la actualidad se disponen de varias cepas de Salmonella

typhimurium para realizar las evaluaciones de actividad mutagénica.

Algunas de ellas se presentan en la siguiente tabla.

Tabla 4-3. Algunas cepas de salmonella utilizadas para la prueba de Ames

Cepas de Salmonella typhimurium

Tipos de mutaciones detectadas

TA 1535 Detecta mutaciones por sustitución de pares de bases

TA 100 Es derivada de la TA 1535, pero contiene el plásmido pKM101, el cual incrementa la sensibilidad al provocar fallas en los procesos de reparación del ADN.

TA 102, TA 104 Detectan mutaciones por sustitución de pares de bases que no detectan las cepas TA 1535 y TA 100.

TA 1537 Detecta mutaciones por adición de bases. Presenta una mutación en el gen hisC3076

n.c./caja

mg/caja

0

0 | | | |

efecto tóxico

sobre el

microorganismom

10 20 30 40

_

_

_

_

_

100

200

300

400

500



TA 1538 Detecta mutaciones por adición de bases. Presenta la mutación en el gen hisD3052

TA 98 Es derivada de la TA 1538, presenta el plásmido pKM101

TA 1535 Detecta mutaciones por deleción de bases

YG 1024 Cepa sensible a aminas aromáticas heterocíclicas Claxton, L.D.; Allen, J.; Autetta, A.; Mortelmans, K.; Nestmann, E.; Zeiger, E. Guide for the Salmonella thyphimurium/mammalian microsome tests for bacterial mutagenicity. Muatation Research 1987, 189, 83-91.

Para ilustrar la aplicación de la prueba de Ames, se presenta a

continuación los resultados obtenidos al evaluar al café soluble (Nescafé)

con este procedimiento.

Tabla 4-4. Actividad mutagénica específica (n.c./mg) del café soluble

Incorporación inmediata Preincubación

Cepa Sin S9 Con S9 Sin S9 Con S9

TA 98 1.92 ± 0.91 negativo 9.15 ± 0.90 2.43 ± 0.24 TA 100 5.02 ± 0.70 negativo 28.11 ± 2.85 6.66 ± 0.94 TA 102 15.05 ± 0.61 9.83 ± 0.57 30.38 ± 2.87 26.70 ± 2.87 TA 104 negativo negativo 34.10 ± 2.28 negativo YG 1024

negativo negativo 14.47 ± 3.77 negativo

Duarte, M.P.; Laires, A.; Gaspar, J.; Le o, D.; Oliveira, J.S.; Rueff, J. Genotoxicity of instand cofee: possible involvement og phenolic compounds. Mutation Research 1999, 442, 43-51

Los resultados obtenidos con cepas de distintas sensibilidades a

compuestos genotóxicos, sugieren que los componentes del café soluble

lesionaron al ADN por mecanismos diferentes. En este estudio, el procedimiento

de preincubación previa fue más eficiente en detectar la actividad mutagénica

que el de incorporación inmediata. En ambos casos, la adición de la fracción

S9, disminuyó la actividad mutagénica del café, lo que indica que los

compuestos responsables, al metabolizarse perdieron sus características

genotóxicas.

Pruebas de mutagenicidad con células eucariotas in vitro

Intercambio de cromátides hermanas (SCE)

Esta prueba ha sido utilizada para detectar rupturas cromosómicas

por xenobióticos

CélulaXenobiótico

Fracción S-9

.

lavar BrdU Colchicina

Replicaciones

No 1 No 2

ausencia de luz

Cromosomas en metafase

Preparación de cortes

Teñir

Observación de

cromosomas

"arlequines"

Figura 4-15. Pasos generales para la prueba de intercambio de cromátidas

Del cultivo celular de ovario de hamster (CHO) o pulmonares (V79)

se toman muestras que se incuban con el xenobiótico en presencia y en

ausencia de alícuotas de la fracción S-9 durante 2 h. En seguida, se lava

para remover el compuesto que no haya sido absorbido; las células son

transferidas a un medio que contiene 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU) y se

permite que ocurran dos replicaciones de ADN (24 o 30 Hr). Transcurrido el

tiempo, se adiciona colchicina para detener el proceso de reproducción en

la etapa de metafase. Cortes son preparados y teñidos con colorantes

fluorescentes, expuestos a la luz ultravioleta, y fijados con Giemsa. Los

daños causados por la exposición al xenobiótico (rupturas,



fragmentaciones, etc.) se verán reflejados en el intercambio de piezas entre

cromosomas. Este efecto se observará en el microscopio por la presencia

de una variedad de patrones luminosos y obscuros en los cromosomas,

quienes reciben el nombre de arlequines.

Pruebas de mutagenicidad con células eucariotas in vivo

Pruebas con Drosophila melanogaster

La mayor ventaja de la mosca de la fruta (Drosophila

melanogaster) como un organismo de prueba en estudios toxicológicos se

enlistan a continuación:

- Una especie eucariota de reproducción sexual

- Paralelismo entre sus células germinales con las del ser humano

- Genéticamente bien conocido

- Presenta tres cromosomas grandes

- Muchas mutaciones con efectos visibles son marcadores útiles

- Presenta cromosomas especiales combinados con marcadores y

rearreglos

- Tiempo de generación corto y gran número de progenie

- Es capaz de metabolizar una gran cantidad de xenobióticos, lo que

resulta conveniente en la transformación de promutágenos a

mutágenos.

Uno de los sistemas de prueba se basa en que los machos de una

especie tienen un gen ligado al cromosoma X, que le da un color amarillo a

su cuerpo. Los machos de 2 días de edad son expuestos al xenobiótico a

probar, disuelto a diferentes concentraciones en agua con azúcar. Los

machos sobrevivientes son apareados con hembras. Si no hay machos de

cuerpo amarillo en la progenie, se asume que ha ocurrido una mutación

letal. Con cantidades menores a la concentración letal, se podrán observar

algunos machos de cuerpo amarillo, cuyo número guardará una relación

inversa con la concentración de xenobiótico a la que los progenitores han

sido expuestos.

Cuando se quiere monitorear un gran número de sustancias, para

evaluar los daños letales recesivos ligados al sexo (SLRL), la Drosophila

melanogaster es la mejor elección. En este ensayo se detectan efectos

letales asociados con mutaciones como microlesiones, deleciones, o

rearreglos cromosómicos. Los parámetros estudiados en células germinales

de las Drosophila son:

- Inducción de mutaciones relativas a citotoxicidad

- La proporción de aberraciones cromosómicas para las mutaciones

letales recesivas

- El papel de los procesos de reparación

- La influencia del tiempo de expresión en la formación de

aberraciones cromosómicas

- La inducción de mutaciones relativas a uniones cuantitativas al

ADN

Prueba de micronúcleos

Un micronúcleo (MN) se forma durante la transición

metafase/anafase del proceso mitótico. Surge de: a) un cromosoma entero

o b) de un pedazo del mismo. Éstos no se incorporan al núcleo de las

células hijas por carecer de un centrómero. El primer caso es ocasionado

por una sustancia aneugénica y el segundo, por una sustancia

clastogénica.



Figura 4-16. Micronúcleos ocasionados por a) daño aneugénico y por b) daño

clastogénico

Figura 4-17. Micronúcleo

Los micronúcleos se pueden presentar en cualquier tipo de células

de tejidos proliferativos (tejido hepático, eritrocitos en médula ósea,

linfocitos). Estas células, recolectadas de animales expuestos a

xenobióticos, pueden ser utilizadas para este ensayo. El ratón es la especie

preferida para este tipo de estudios. Recientes reportes han señalado el

uso de peces, los cuales tienen eritrocitos nucleados, como especies

disponibles para el monitoreo de daño mutagénico por contaminantes de

cuerpos de aguas. Así mismo, se han utilizado algunas especies vegetales

como Tradescantia spp y Vicia faba, para evaluar la actividad mutagénica

de algunos contaminantes y fármacos.

El ensayo permite la detección de:

- Clastógenos (sustancia que rompe los cromosomas)

- Aneugenos (sustancias que afectan el huso mitótico)

- Apoptosis

- Retraso mitótico

- Ruptura de cromosomas

- Pérdida de cromosomas

- No disyunción de cromosomas

Ventajas del ensayo de micronúcleos

- El ensayo de MN es una alternativa al test de aberraciones

cromosómicas convencional.

- Se analizan las alteraciones presentes en metafases mitóticas

- Permite detectar aberraciones cromosómicas que responden a

alteraciones de tipo estructural (efecto clastogénico) o alteraciones

numéricas (efecto aneugénico) del agente en estudio.

El ensayo Cometa

Utilizado para evaluar el potencial genotóxico de diversas

sustancias químicas.



Figura 4-18. Representación de ensayo cometa

Está basado en la migración de fragmentos rotos de ADN durante

un proceso electroforético, el cual es una técnica sensible que detecta:

- Rompimiento de cadenas sencillas

- Sitios álcali-lábiles

- Sitios de reparación por escisión de bases nitrogenadas

Las principales ventajas del ensayo cometa incluyen:

- La obtención de datos genéticos a nivel de células individuales, lo

que permite que el estudio estadístico sea robusto

- La necesidad de un pequeño número de células (<10000) por cada

compuesto a evaluar

- Uso de cualquier población de células eucariotas

De manera general se procede de la siguiente manera:

a) Se mezclan linfocitos, u otras células, con microgeles de agarosa

extendida sobre placas portaobjetos sumergidos en solución de

lisis y luego el ADN es desnaturalizado con NaOH.

b) Se realiza un corrido electroforético después de lisar las células en

el microgel de agarosa.

c) Se colorea el ADN con Bromuro de etidio y se estima el daño

mediante la visualización de la fluorescencia del ADN que migra.

Figura 4-19. Referencia para las mediciones en el ensayo cometa

La cola del cometa representa la migración del ADN. La longitud se

mide en micras desde el centro del núcleo hasta el último punto de

fluorescencia.

Bibliografía

1. Klaassen C.D. Cassarett and Doull´s Toxicolofy. The basic science

of poisons. Sexta edición. Mc Graw Hill. E.U.A. 2001, pp 31-32,

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2. Frazier, J. In vitro toxicity testing. Marcel dekker Inc. USA. 1992.

3. Brusick, D. Principles of genetic Toxicology. Second Edit. Plenum

Press. USA 1987.

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5. Watson, R.R. In vitro methods of toxicology. CRC Press, USA.

1992.

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