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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
DIANA MARQUES MARTINS CHACON
ÁLCOOL E COMPORTAMENTO: EFEITOS NA
APRENDIZAGEM E MEMÓRIA
NATAL 2013
DIANA MARQUES MARTINS CHACON
ÁLCOOL E COMPORTAMENTO: EFEITOS NA
APRENDIZAGEM E MEMÓRIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
APRESENTADA AO PROGRAMA DE
PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
COMO REQUISITO PARA OBTENÇÃO DO
TÍTULO DE MESTRE EM
PSICOBIOLOGIA (ÁREA DE
CONCENTRAÇÃO: COMPORTAMENTO
ANIMAL).
Orientadora:
Profa. Dra. Ana Carolina Luchiari
Banca Examinadora:
Professora Doutora: MÔNICA RYFF MOREIRA ROCA VIANNA (PUCRS)
Professor Doutor: MARCOS COSTA (PGNEURO UFRN)
Professora Doutora: ANA CAROLINA LUCHIARI (ORIENTADORA)
NATAL 2013
AGRADECIMENTOS
Ao Eterno Criador da natureza e meu Amigo Consolador, porque sem Ele não
existiria nada para ser estudado pela ciência.
Á professora Ana Carolina Luchiari, por ser a mais paciente, prestativa e
interessada orientadora do mundo, agradeço também por sua amizade e confiança.
Á Luana, Jéssica, Mayara, Leonardo e todos os colegas do Laboratório de Peixes
Ornamentais, pela ajuda na montagem e realização dos experimentos, pelas horas
passadas analisando vídeos, pela colaboração na revisão dos artigos; agradeço pelo
compromisso, apoio e amizade. Este trabalho é de vocês também!
Aos meus pais, irmãos e amigos pelas palavras de apoio, paciência e boa vontade
em tornar este trabalho legível e interessante para pessoas de outras áreas de estudo.
Aos professores Mônica Vianna e Marcos Costa, por aceitarem participar da
banca examinadora desta dissertação; e ao professor John Fontenelle pelas correções no
texto.
RESUMO
O consumo excessivo de bebidas alcoólicas é responsável por inúmeros efeitos
prejudiciais aos indivíduos e à sociedade. Apesar de anos de pesquisa, ainda é pouco o
conhecimento sobre os mecanismos pelos quais o álcool afeta as funções neurológicas e
quais seriam as causas exatas das deficiências cognitivas e de memória relacionadas ao
seu uso em longo prazo. Neste sentido, este trabalho propôs observar como diferentes
doses de álcool interferem na capacidade de aprendizagem de duas espécies de peixes:
Betta splendens e Danio rerio, este último um modelo bastante utilizado devido às
características organizacionais e funcionais que compartilha com mamíferos. Para isto,
diferentes concentrações de álcool (0%, 0,1%, 0,25%, 1% e 1,5%) foram usadas em
doses agudas e crônicas e os animais, alcoolizados ou em fase de abstinência, foram
testados em três protocolos experimentais: 1) Condicionamento associativo apetitivo –
os resultados encontrados mostram que os grupos submetidos à dose baixa (0,1%), tanto
em tratamento crônico quanto em abstinência, aprendem a tarefa mais rapidamente que
o controle; os grupos em abstinência das doses 0,25 e 1% de álcool apresentaram
aprendizagem após o controle; e os grupos alcoolizados cronicamente nestas doses não
aprendem a tarefa. 2) Aprendizagem espacial - nesta tarefa o peixe foi testado quanto ao
desempenho em um labirinto sem dicas ambientais. Os resultados obtidos demonstram
que, embora todos os grupos submetidos ao tratamento agudo e crônico diminuíram o
tempo de saída do labirinto ao longo dos dias, houve diferenças significativas no
desempenho dos animais de forma dose-dependente. Tal diferença não foi observada no
tratamento abstinência. 3) Preferência ambiental – foi testada a preferência por dois
ambientes (base quadriculada X base branca) em um aquário do tipo shuttle box, e
posteriormente à alcoolização no ambiente não preferido, foi observada novamente a
preferência do animal. Neste teste, os animais alcoolizados em 0,1% não tiveram
alteração comportamental, enquanto animais que receberam 1% e 1,5% de álcool
alteraram sua preferência para o lado onde haviam sido alcoolizados, mantido por todo
o período experimental. Tendo em vista os resultados encontrados, podemos concluir
que os efeitos do álcool na aprendizagem são dependentes da dosagem. Alem disso,
doses baixas de álcool parecem maximizar o desempenho do animal em tarefas de
aprendizagem, mesmo não alterando sua preferência, enquanto as doses mais elevadas
produzem efeito de adição e prejudicam a aprendizagem dos animais.
Palavras-chaves: Peixe. Etanol. Condicionamento. Labirinto. Adição.
ABSTRACT
Excessive alcohol consumption is responsible for many harmful effects on individuals
and society. Despite years of research, the mechanisms by which alcohol affects
neurological functions and the exact causes of cognitive impairment related to long-
term use are unknown. In this sense, this master study proposed to observe how
different doses of alcohol affect the addiction response and the learning ability of two
fish species: Betta splendens and Danio rerio, the latter a commonly model due to
organizational and functional characteristics shared with mammals. For this, different
concentrations of ethanol (0%, 0.1%, 0.25%, 1% and 1.5%) were used in acute, chronic
and withdrawal treatments. We tested the fish in three experimental protocols: 1)
alcohol addiction potential using conditioned place preference, 2) associative
conditioning using light as unconditioned stimulus and food as conditioned stimulus and
3) spatial learning using a maze without cues. For the alcohol addiction potential,
preference between two different places in a shuttle box was tested before and after
alcohol exposure (chronic and acute). In this test, the animals intoxicated by 0.1% did
not change behavior, while animals receiving 1% and 1.5% alcohol changed the initial
preference to the side where they received alcohol For the associative conditioning, the
results show that the groups undergoing low dose (0.1%), both in chronic and
withdrawal treatment, learned the task faster than control; groups under 0.25 and 1%
alcohol withdrawal learned the task after control; groups chronically intoxicated with
these doses did not learn the task. For the spatial learning test, fish submitted to acute
and chronic treatments decreased the time to exit the maze; there were significant
differences in the animal’s performance in a dose-dependent pattern. This difference
was not observed for the withdrawal treatment. Given these results, we conclude that
the effects of alcohol on learning are dependent on the dosage. Furthermore, low doses
of alcohol seem to maximize animal performance on learning tasks and do not alter their
seeking behavior, while higher doses induced addition and hinder learning.
Keywords: Fish. Ethanol. Conditioning. Maze. Addition.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL.....................................................................................9
1.1 HISTÓRICO...........................................................................................................9
1.2 EFEITOS SISTÊMICOS E NEURAIS DO ÁLCOOL A CURTO E LONGO PRAZO.11
1.3 ABSTINÊNCIA DO ÁLCOOL................................................................................14
1.4 ÁLCOOL E ADIÇÃO...........................................................................................16
1.5 DOSE E EFEITO....................................................................................................17
2. JUSTIFICATIVA.................................................................................................19
3. OBJETIVOS.........................................................................................................20
3.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................20
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS HIPÓTESES E PREDIÇÕES.......................................20
4. ARTIGO 1 “A DOSE FOR THE DRINKER IS ENOUGH: the alcohol benefits
for associative learning in zebrafish”..................................................................... 22
5. ARTIGO 2 “DOES ALCOHOL REALLY IMPAIR FISH SPATIAL
LEARNING?............................................................................................................46
6. CONCLUSÕES GERAIS....................................................................................64
7. REFERÊNCIAS...................................................................................................66
9
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1 HISTÓRICO
A ingestão de álcool é um costume presente desde os primórdios da história da
humanidade, havendo pelo menos alguns milhares de anos de ligação entre as
sociedades e as bebidas alcoólicas (VIALA-ARTIGUES & MECHETTI, 2003). O
registro mais antigo desta parceria são alguns vasos encontrados em Jiahu no norte da
China, datados de meados de 8.000 A.C., nos quais eram armazenadas bebidas
fermentadas a partir de arroz, mel e frutas. Segundo o arqueólogo McGovern (2000),
esta bebida possuía concentração alcoólica entre 4 e 12% e era consumida em diversas
cerimônias. Outros registros arqueológicos indicam que, entre 6.000 e 5.000 A.C., outro
tipo de mistura alcoólica, a base de trigo e cevada, era produzida em larga escala pelos
povos sumérios, egípcios e babilônicos (GATELY, 2008).
Desde então, muitos momentos da história foram regados com diversos tipos de
cervejas e de vinhos, consumidos por todas as classes sociais (GATELY, 2008). No
entanto, o álcool não foi apenas ingrediente de bebidas, mas também teve papel
relevante como antisséptico e veículo de xaropes contra diversos males durante a Idade
Média (VALLEE, 1998; JACKSON, 1998).
Em meados do século 17, os senhores de engenho começaram a produzir cachaça
no Brasil, misturando o caldo de cana fermentado com melaço e água (CAVALCANTE,
2011). Diversas bebidas alcoólicas surgiram em seguida (GATELY, 2008), entre elas
podemos citar o gim holandês, destilado de cereais com altíssimo teor alcoólico (45%),
responsável por provocar o aumento vertiginoso de alcoolismo na Europa do século 17.
Já no século 19, após a revolução industrial, as novas tecnologias e a produção em larga
escala baratearam a cerveja, o que contribuiu para aumentar os problemas sociais
relacionados ao uso indiscriminado de bebida.
Entre os anos de 1650 e 1750, a produção e comércio de bebidas chegou a ser a
principal fonte de renda da nobreza européia (HECKSCHER, 1943). Portanto, o álcool
assumiu um papel importante na formação de um sistema tributário, através de impostos
elevados sobre a cerveja e o vinho. Nas Américas, o rum e a cachaça prosperavam, e o
interesse nestas bebidas pelos povos africanos estimulou o comércio clandestino
(ALENCASTRO, 2000).
10
Muitos estudos sobre o papel do álcool na sociedade foram produzidos, mostrando
a bebida como principal responsável pela pobreza, danos ao patrimônio público e
diversos outros problemas sociais (MIRON E ZWIEBEL, 1991; CARNEIRO, 2004).
No início do século 20, a visão antiálcool atingiu o seu auge com a instituição da Lei
Seca nos EUA – tentativa de minimizar os efeitos da droga sobre a sociedade e
reestabelecer a ordem (CARNEIRO, 2004). Mas essa nova regra durou pouco, já que o
comércio ilegal tomou espaço rapidamente.
O tempo passou e a bebida alcoólica (juntamente com o tabaco) se firmou como
item valioso na economia mundial. Um pico na produção vinícola ocorreu nos anos 60
(28 bilhões de litros), e hoje este comércio gira em torno dos 25 bilhões de litros anuais
(MELO, 2012). Já a cerveja ocupa o primeiro lugar das bebidas alcoólicas mais
consumidas, sendo o Brasil o seu quinto maior produtor – após EUA, Alemanha, China
e Japão; e ocupa o primeiro lugar na produção de cachaça (1 bilhão de litros/ano)
(CARNEIRO, 2004).
Entretanto, o consumo continuado e excessivo de álcool, conhecido como
alcoolismo, é um dos problemas de abuso de drogas mais custoso para a sociedade,
sendo considerado mais dispendioso do que os problemas causados por todas as drogas
ilícitas combinadas. No Reino Unido, estima-se que o valor arrecadado por impostos de
bebidas alcoólicas seja de 7 bilhões de libras, enquanto o gasto com a saúde de pessoas
debilitadas pelo consumo de álcool seja de 3 bilhões (LIMA, 2003). No Brasil, as
pesquisas mais recentes estimam que o país arrecada 2,8% do PIB (Produto Interno
Bruto) com impostos sobre o fabrico e venda de bebidas alcoólicas (MELO, 2005),
enquanto os custos gerais do alcoolismo superam 100 bilhões de reais, equivalente a 7%
do PIB (LIMA, 2003). O gasto brasileiro é bastante elevado, visto que a França gasta
1,5% e os EUA 3% de seus PIB para reparar os estragos que a bebida provoca (LIMA,
2003). Embora sejam conhecidos os prejuízos associados ao uso abusivo, as bebidas
alcoólicas são consideradas por muitos um produto insubstituível, servindo como
elemento de uso religioso, medicinal, lúdico, apaziguador e confortador (SOUZA,
1997).
11
1.2 EFEITOS SISTÊMICOS E NEURAIS DO ÁLCOOL A CURTO E LONGO PRAZO
As bebidas denominadas alcoólicas contêm etanol (CH3CH2OH, também
conhecido como álcool) derivado da fermentação de açúcares e disponível em
concentrações que podem variar de 4 a 75% dependendo do tipo de bebida. O álcool
ingerido é absorvido pelo estômago e intestino, atingindo rapidamente a corrente
sanguínea e alcançando todos os órgãos, principalmente o fígado e o cérebro em cerca
de 20 minutos (MELO, 2005). O fígado pode metabolizar até 90% do álcool consumido
através da enzima álcool-desidrogenase, produzindo como subproduto acetaldeído
(responsável pela maioria dos efeitos adversos), enquanto o restante é metabolizado
pelos rins, tecido epidérmico e cérebro. O excesso de acetaldeído no sangue provoca
alterações sistêmicas como taquicardia, hipertensão, enxaqueca, náuseas e vômito.
O álcool é uma droga psicotrópica, isto é, uma substância que atua no sistema
nervoso central (SNC), causando modificações fisiológicas e comportamentais,
podendo desencadear dependência. O álcool possui efeitos neurológicos e psicológicos
tanto a curto (uso agudo) quanto a longo prazo (uso crônico).
Em relação aos efeitos agudos, é considerado uma droga dose-dependente por
apresentar diferentes ações em diferentes dosagens. Em quantidades baixas à moderadas
(0,04 g/100mL a 0,25 g/100mL sangue; 1% álcool= 1 g/100mL sangue) essa droga
apresenta função estimulante, causando sensações de euforia e desinibição pela redução
do desconforto da ansiedade – o conhecido efeito ansiolítico. Porém, em doses elevadas
(> 0,25 g/100mL) produz perda de controle motor e sedação. Por isso, é
especificamente classificada como uma substância psicoléptica, pois deprime o
funcionamento normal do SNC (CARLSON, 2001). Quando a ingestão do álcool chega
a concentrações bastante elevadas (> 0,35 g/100mL) pode provocar coma e morte (THE
AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, 1997).
O sistema nervoso funciona, metaforicamente, como uma balança em equilíbrio,
com neurotransmissores excitatórios de um lado e neurotransmissores inibitórios do
outro. O álcool, assim como outras drogas, é um potencial desregulador dessa balança,
pois tende a aumentar as neurotransmissões inibitórias ao mesmo tempo que diminui as
excitatórias. As ações iniciais excitatórias do álcool, representadas pela desinibição que
os usuários experimentam, parecem estar associadas à supressão de sistemas inibitórios
centrais. Esta resposta foi observada em um estudo clássico de Koob et al. (1984), no
qual os pesquisadores aplicavam choque elétrico em ratos sempre que estes
12
pressionavam uma alavanca para obter alimento ou água no momento errado, até o
ponto em que eles reduziram a frequência de pressões. Entretanto, quando alguns
animais receberam um pouco de álcool, voltaram a executar a ação após o período de
treino. Este resultado é comparável a desinibição que acontece nos indivíduos
alcoolizados, porque o álcool remove o efeito inibitório de controles sociais e punições
sobre o comportamento (CARLSON, 2001).
O etanol é capaz de afetar todas as células do organismo, mas grande parte de suas
ações ocorrem em neurônios. Muitos estudos contemplam a influência do álcool na
liberação de neurotransmissores como dopamina, serotonina, noradrenalina e peptídeos
opióides (BROADBENT ET AL., 1995; HERZ, 1997; BADAWY, 1998; LE ET AL.,
2005). Uma de suas propriedades é interagir com os lipídios da membrana neuronal,
alterando sua permeabilidade, fluidez e função de suas proteínas. Essas alterações
podem prejudicar o funcionamento de ATPases, principalmente da bomba de Na+/K
+, o
que compromete a condução elétrica (ALOIA ET AL., 1985).
Após atingir o SNC, ultrapassando a barreira hematoencefálica, o etanol atua
aumentando a ação do neurotransmissor GABA, de forma similar ao efeito de
benzodiazepínicos, e inibindo o neurotransmissor glutamato (WONG ET AL., 2008).
Outro efeito depressor decorre da inibição da abertura de canais de cálcio voltagem
dependentes, o que impede a liberação de neurotransmissores após despolarização.
Também há indicativos de efeitos inibitórios sobre receptores NMDA e sobre o
transporte de adenosina para o meio intracelular (MELENDEZ E KALIVAS, 2004).
O GABA é o principal neurotransmissor inibitório do cérebro e um dos mais
afetados com a ingestão de álcool. A molécula de etanol é capaz de se ligar ao receptor
GABAérgico A (GABAA), facilitando os efeitos inibitórios, principalmente no córtex
cerebral. Esse aumento da inibição cortical provoca a sensação de diminuição da
ansiedade e de relaxamento no organismo (PAUL, 2006). Além deste efeito, o etanol
também atua como agonista em um tipo específico de canal iônico, chamado GIRK, que
quando aberto, permite o efluxo de íons potássio e reduz a atividade neuronal (ARYAL
ET AL., 2009).
O álcool também pode bloquear o sistema excitatório, através de alterações na ação
sináptica do glutamato, principal neurotransmissor excitatório em mamíferos
(BITTENCOURT, 2008). Os receptores glutamatérgicos NMDA (n-metil-D-aspartato)
desempenham papel importante na plasticidade sináptica envolvida em processos de
13
aprendizagem e formação de memória (NELSON E COX, 2002; CARLSON, 2001).
Estes receptores são afetados diretamente pelo álcool (CHANDLER ET AL.; 1998).
Outros antagonistas de NMDA são conhecidos por produzirem efeitos sedativos,
hipnóticos, ansiolíticos e interferirem no desempenho cognitivo (TABAKOFF E
HOFFMAN, 1996). Este mesmo receptor é sensível à administração aguda de 5 a 100
mM (0,23 a 4,6g) de etanol (BHAVE ET AL., 1996), correspondente ao limite mínimo
para produzir intoxicação in vivo. No entanto, o uso crônico de etanol parece induzir
aumento adaptativo na função do receptor NMDA, através de alterações na composição
das suas subunidades (AHERN ET AL., 1994; BLEVINS ET AL., 1995) ; ou a partir
da resposta de hiperregulação (upregulation) derivada da supressão a longo prazo desse
receptor, ou seja, um aumento compensatório na sensibilidade ao neurotransmissor
(CARLSON, 2001).
O uso crônico de doses elevadas de álcool produz inúmeros problemas de saúde,
como cirrose hepática, pancreatite, epilepsia, doenças cardiovasculares, úlceras, entre
outros danos (OMS, 2003). Uma das consequências mais perigosas do abuso do álcool a
longo prazo são seus efeitos na perda cognitiva. Givens e McMahon (1995) apontam
que o álcool pode prejudicar a potenciação a longo prazo e interferir nas células de lugar
do hipocampo, através da capacidade de bloquear receptores NMDA, o que explica
parcialmente os efeitos deletérios do álcool sobre a memória e outras funções
cognitivas. Além disso, o uso crônico de álcool em doses elevadas provoca danos
neurológicos irreversíveis, causados pelo próprio álcool ou por outros metabólitos,
como acetaldeído e ésteres de ácidos graxos (HARPER E MATSUMOTO, 2005).
Dentre os danos, podemos citar: a perda de massa cortical e aumento de volume
ventricular, que levam à demência irreversível, conhecida por Síndrome de Wernick-
Korsakoff, comprometimento motor e neuropatias periféricas (CENTERWALL E
CRIQUI, 1978).
A demência está relacionada ao uso de álcool de diferentes formas: 1) Alcoolistas
de longa data que, pela exposição continuada do SNC aos efeitos neurotóxicos do
etanol, iniciam paulatinamente distúrbios cognitivos e comportamentais, geralmente
irreversíveis, e que tenderão a evoluir progressivamente, e 2) Alcoolistas que
desenvolvem encefalopatias agudas a partir de deficiências metabólicas ou
hidroeletrolíticas que resultam em alterações cognitivas e comportamentais, tendo como
principais exemplos a encefalopatia de Wernicke e psicose de Korsakoff, a mielinólise
14
pontina central (relacionada a distúrbio da concentração de sódio plasmático), e a
doença de Marchiafava-Bignami (relacionada à necrose das porções centrais do corpo
caloso) (THOMSON E MARSHAL, 2006; GERMINIANI ET AL. 2002; CHANG ET
AL., 1992). De acordo com Snowden et al. (1996), as principais causas físicas dessas
demências seriam as perdas sinápticas nas lâminas corticais frontais superiores, bem
como perda neuronal significativa também no córtex frontal, traduzida por atrofia,
possível de ser observada no exame anatomopatológico.
Estudos recentes indicam que o consumo, mesmo em doses baixas, parece estar
associado à incidência de diversos tipos de câncer, como mama, fígado, intestino e
cérebro (ZHAO ET AL., 2012). Isto ocorre devido à ação do acetaldeído sobre a
reparação do DNA, além do potencial carcinogênico dos radicais livres liberados do
metabolismo do álcool (HOMANN ET AL., 2006; VÄKEVÄINEN ET AL., 2000;
SIMONETTA ET AL., 2006). Por esses motivos, é importante ressaltar que o consumo
de doses elevadas de álcool com freqüência é elemento promotor de doenças sistêmicas,
mentais e psicológicas.
1.3 ABSTINÊNCIA DO ÁLCOOL
Pessoas que bebem de forma excessiva, quando diminuem o consumo ou se
abstém completamente, podem apresentar um conjunto de sintomas e sinais,
denominado Síndrome de Abstinência do Álcool (SAA). Uma série de fatores
influenciam no aparecimento e na evolução dessa síndrome, entre eles a vulnerabilidade
genética, o gênero, o padrão de consumo, as características individuais biológicas e
psicológicas e fatores socioculturais. Os sintomas e sinais variam também quanto à
intensidade e à gravidade, podendo aparecer após uma redução parcial ou total da dose
usualmente utilizada. Os sintomas mais comuns da SAA são agitação, ansiedade,
alterações de humor (irritabilidade, disforia), tremores, náuseas, vômitos, taquicardia e
hipertensão arterial. Também podem ocorrer complicações como alucinações, Delirium
Tremens (DT), e convulsões.
O que se conhece dos sintomas da SAA tem sido explicado pelo fenômeno de
neuroadaptação que ocorre no SNC quando há exposição crônica ao etanol. As
principais alterações presentes, que causariam estes sintomas, seriam a hiperestimulação
noradrenérgica e glutamatérgica, a hipoatividade dopaminérgica e GABAérgica e
15
também a inibição de canais cálcio tipo L (LARANJEIRA, 2000). A hiperestimulação
adrenérgica deve-se a uma redução da atividade de adrenoceptores inibitórios pré-
sinápticos do subtipo α2 (NUTT ET AL., 1988), em um fenômeno conhecido como
down–regulation, processo pelo qual a célula diminui a sua reatividade ao
neurotransmissor. Rossetti e Carboni (1995) demonstraram, em seu estudo que o uso
crônico do etanol seguido de abstinência também provoca aumento na densidade de
receptores NMDA no SNC e que esse aumento persiste por cerca de 36 horas após a
retirada do etanol, período que coincide com o aparecimento das crises convulsivas,
fenômeno neurotóxico relacionado à hiperatividade glutamatérgica. Já a hipoatividade
GABAérgica é funcional, pois não há evidências de alteração na densidade de
receptores GABAA após a utilização crônica de bebidas alcoólicas (DEVAUD ET AL.,
1997), todavia esta hipoatividade é responsável por uma forte estimulação do SNC. Por
outro lado, a queda nos níveis de dopamina, durante o período de abstinência,
provavelmente é causada pela cessação de liberação dopaminérgica na área tegmentar
ventral (DIANA ET AL., 1992). A exposição crônica ao álcool também leva a uma
redução na atividade dos canais de cálcio tipo L, reduzindo a atividade elétrica dentro
do neurônio, resultando na baixa liberação de neurotransmissores nas fendas sinápticas,
prejudicando as transmissões eletroquímicas (LOVINGEr, 1997).
O uso crônico de álcool também é frequentemente associado a prejuízos nas áreas
motora e cognitiva (BROWN, ET AL., 2001; ZLOTNICK & AGNEW, 1997). A
memória de indivíduos com a síndrome da dependência alcoólica apresenta-se
prejudicada (ARIAS ET AL, 2000), porém, assim como as outras funções cognitivas
(ACKERMANN ET AL. 1999), tende a melhorar já nas primeiras semanas de
abstinência. No entanto, pode ocorrer estabelecimento permanente destes déficits. Este
é o caso quando se instala a síndrome de Korsakoff, que se caracteriza por perdas
significativas na memória anterógrada, isto é, inabilidade em lembrar novas
informações por mais de alguns segundos, assim como deficiência na abstração e na
capacidade de resolução de problemas (PFEFFERBAUM ET AL., 2000). Esta síndrome
esta relacionada à deficiência em uma enzima que metaboliza a tiamina (vitamina B) em
pacientes alcoólicos (LANGLAIS E CICCIA, 2000). Outra patologia que também é
resultado de um uso prolongado de álcool é a demência alcoólica, que acarreta o
comprometimento na realização de testes neuropsicológicos e pode ocasionar atrofia
cortical.
16
Estudos de neuroimagem têm confirmado que disfunções cerebrais ligadas ao
álcool são reversíveis em muitas pessoas, após o tempo da abstinência do álcool
(BROWN ET AL, 2001). No entanto, existem substanciais diferenças individuais
(BROWN E TAPERT, 2000), dependendo da habilidade neurocognitiva específica que
está prejudicada, da extensão do prejuízo e da velocidade da recuperação (HOHMANN
ET AL., 2000). SANHUEZA (2011) realizou estudos neurocognitivos (utilizando
técnicas de neuroimagem) que compararam a resposta cerebral de jovens em atividades
de memória operacional e mostrou que adolescentes com transtornos relacionados ao
uso de álcool apresentam maior atividade em certas regiões do cérebro do que os
adolescentes sem essa condição. Esses dados sugerem que nos estágios iniciais dos
transtornos relacionados ao uso de álcool, o cérebro pode compensar os danos causados
por essa substância por meio do “recrutamento” de outras áreas neurais. Com o passar
dos anos e a manutenção do padrão de uso de álcool, nota-se que os danos tendem a
aumentar, assim como o desempenho neuropsicológico tende a piorar e o cérebro perde
sua capacidade de compensar as perdas.
1.4 ÁLCOOL E ADIÇÃO
O álcool aumenta a atividade de neurônios dopaminérgicos no sistema mesolímbico
e a liberação de dopamina no núcleo acumbens, gerando sensação de bem-estar
(GESSA ET AL., 1985). O sistema mesolímbico dopaminérgico é responsável por
produzir o fenômeno do reforço positivo. Quando um comportamento é seguido
regularmente por um estímulo apetitivo, do qual o organismo tende a se aproximar, é
ativado o sistema de reforço cerebral, levando à repetição do comportamento inicial
com crescente freqüência (CARLSON, 2001).
Muitas drogas que geram adição produzem reforço positivo e induzem o desejo de
repetir o comportamento de ingerir a droga. Quanto mais rápido a droga produzir seus
efeitos, mais rapidamente se estabelecerá a dependência. Sendo o álcool uma substância
ingerida oralmente, seus efeitos reforçadores começam a ocorrer depois de vários
minutos após a primeira ingestão, contudo seu efeito ansiolítico combinado com a
sensação de euforia resultam em potencial aditivo alto (CARLSON, 2001). O uso de
etanol excede bastante o consumo de qualquer outra droga, sendo estimado o número de
dependentes de álcool em 140 milhões de pessoas em todo mundo, de acordo com a
Organização Mundial de Saúde (OMS, 2003).
17
O alcoolismo é uma doença crônica e progressiva que se apresenta em pelo menos
três estágios, de acordo com Graham e Campbell (1991). No estágio inicial, o alcoolista
bebe socialmente e demonstra autocontrole e alguma desinibição, porém sente a
necessidade da ingestão frequente de álcool e o rendimento profissional já se encontra
prejudicado. No estágio intermediário, o doente já não consegue manter a atenção,
controlar a coordenação e ter bom desempenho em tarefas. Os níveis hormonais e a
produção de neurotransmissores no cérebro tornam-se alterados. No estágio final, o
indivíduo apresenta completa dependência, não conseguindo desenvolver tarefas sem o
uso da droga.
Para muitas pessoas, o consumo moderado de álcool gera pouco ou nenhum risco
de adição e prejuízos à saúde; porém fatores como o ambiente social, a saúde emocional
e psíquica, e a predisposição genética podem influenciar no desenvolvimento do
alcoolismo.
1.5 DOSE E EFEITO
Embora muitos estudos versem sobre os efeitos prejudiciais do álcool sobre o
organismo, principalmente sobre o SNC, dados indicativos de efeitos benéficos da
ingestão de doses baixas por períodos prolongados, já são encontrados na literatura. Por
exemplo, o vinho pode trazer benefícios ao coração (CAHILL E REDMOND, 2012), a
cerveja prevenir o ganho de peso (WANG ET AL., 2010) e o consumo de bebidas
alcoólicas em geral prevenir a demência senil (WEYERER ET AL., 2011).
Os estudos que recomendam o uso de vinho em uma ou duas doses diárias para
prevenir doenças coronarianas são baseados nos benéfícios antioxidantes dos polifenóis
flavonóides (elementos contidos na casca da uva) (GAZIANO ET AL., 1999;
MUKAMAL ET AL., 2003; TOUSOULIS ET AL., 2008; CHIVA-BLANCH ET AL.,
2012), associados ao aumento na concentração de lipoproteínas plasmáticas de alta
densidade (MILLER ET AL., 1988), que agem como proteção contra a formação de
ateromas e agregação plaquetária (FENN E LITTLETON, 1982). As pesquisas que
afirmam que o álcool diminui o risco de obesidade também correlacionam o uso de
doses baixas a esta resposta (WANG ET AL., 2010).
Outros estudos abordam a diminuição na incidência de demência senil e doença de
Alzheimer em pacientes idosos com hábito de consumir álcool moderamente
18
(RUITENBERG ET AL., 2002; WEYERER ET AL., 2011). Ruitenberg et al. (2002)
sugerem que a menor incidência de demência deve estar relacionada à secreção de
acetilcolina na região do hipocampo, que é estimulada com baixas concentrações de
álcool (HENN ET AL., 1998). Desta forma, o álcool pode afetar positivamente
processos cognitivos, já que a acetilcolina é tida como facilitador do processo de
aprendizagem e memória (PERRY ET AL., 1999). Ademais, o aumento de
lipoproteínas plasmáticas provocado pelo consumo moderado de álcool também foi
sugerido como elemento estimulador de funções cognitivas (CARMELLI ET AL.,
1999). No entanto, é evidenciado por muitos estudos que a superdosagem de álcool
causa efeito inverso, provocando degeneração neural em larga escala (KOOB, 1992;
BITTENCOURT, 2000; MACIEL E KERR-CORRÊA, 2004).
Desta forma, observamos duas respostas orgânicas ao consumo de álcool: uma
resposta positiva e benéfica a partir do consumo crônico de doses baixas, e outra,
prejudicial e deletéria, decorrente do abuso da substância. Vale salientar que a diferença
entre um remédio e uma droga baseia-se na concentração aplicada e muitas drogas hoje
ilícitas já foram usadas como remédios no passado, como cocaína, heroína e ópio
(CABALEIRO E ABAD-SANTOS, 2011; BROWNSTEIN, 1993; DUARTE, 2005;
BLEJER-PRIETO, 1965; KARCH, 1999).
Ainda assim, apesar de indícios a favor do uso moderado de álcool, não há, até o
presente momento, justificativa para a recomendação do consumo de bebidas alcoólicas
como elemento medicinal (COSTA ET AL., 2004). Ademais, muitas pessoas
ultrapassam o limiar entre o uso moderado e o abuso.
19
2. JUSTIFICATIVA
Embora diversos efeitos prejudiciais do álcool coloquem a droga como a principal
vilã da sociedade moderna, doses homeopáticas deste psicotrópico podem trazer
benefícios ainda não explorados aos usuários. As maneiras de prevenir ou melhorar o
declínio cognitivo decorrente da idade são hoje imperativos da saúde pública, e, desta
forma, o uso de álcool na dosagem correta parece ter potencial benéfico não apenas em
termos de diminuição dos custos com o cuidado de doenças da senilidade, mas também
na melhoria do bem estar e da qualidade de vida em um segmento crescente da
sociedade.
Apesar de toda a resistência (bem compreendida) em considerar o consumo do
álcool, mesmo em baixas concentrações, como um possível hábito benéfico, é
necessário que se façam mais pesquisas, no intuito de investigar de que forma a
presença de etanol no SNC pode estar influenciando, alterando e prejudicando, no
âmbito neurofisiológico, celular e molecular. As principais perguntas a serem
respondidas compreendem principalmente: qual o limiar de neurotoxicidade do álcool
suportado pelo cérebro, a partir do qual este se torna um agente nocivo? Como
exatamente se dão os processos de neuroadaptação ao álcool e como estes podem
auxiliar no aumento das funções cognitivas, como aprendizagem e memória, e mesmo
atuar como prevenção ao desenvolvimento de demências senis? Como o consumo de
álcool afeta o desenvolvimento cognitivo de jovens? Como levar em consideração a
dependência química do álcool, e outros problemas de saúde, no contexto da formação
de um hábito de “consumo saudável”? Estas e outras perguntas precisam ser mais
discutidas e pesquisadas, se quisermos entender de forma global esta substância tão
presente em nosso cotidiano.
20
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho teve por objetivo estudar o efeito do uso agudo e crônico de
diferentes dosagens de álcool e abstinência da droga no desempenho em tarefas de
aprendizagem, utilizando como modelos os peixes paulistinha (Danio rerio) e beta
(Betta splendens). Também foi verificado o poder aditivo de diferentes concentrações
de álcool em exposição aguda e crônica.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS HIPÓTESES E PREDIÇÕES
Objetivo 1 – Testar o desempenho do peixe paulistinha (Danio rerio) em tarefa de
condicionamento associativo (Pavloviano) após tratamento crônico em diferentes
dosagens de álcool e após abstinência da droga.
Hipótese 1 – O álcool altera o desempenho do peixe paulistinha na tarefa de
aprendizagem associativa, mas essa alteração é dependente da dose experimentada.
Predição 1a – Animais submetidos a concentração baixa de álcool apresentam
aprendizagem e têm o desempenho melhor do que aqueles que receberam doses
elevadas.
Predição 1b – Animais submetidos a concentrações elevadas de álcool apresentam
prejuízos de aprendizagem associativa nesta tarefa.
Objetivo 2 – Testar o desempenho do peixe beta (Betta splendens) em teste de
aprendizagem espacial sob administração aguda, crônica e em abstinência de diferentes
dosagens de álcool.
Hipótese 2 - O álcool altera o desempenho do peixe beta na tarefa de
aprendizagem espacial, mas essa alteração é dependente da dose.
Predição 2a – Animais submetidos à concentração baixa de álcool no tratamento
crônico conseguem sair mais rápido do labirinto do que aqueles alcoolizados em
tratamento agudo e aqueles submetidos as concentrações maiores no tratamento crônico.
Predição 2b - Animais submetidos a concentrações elevadas de álcool nos dois
tratamentos apresentam prejuízos de aprendizagem espacial nesta tarefa.
21
Objetivo 3 – Estudar o potencial aditivo de diferentes concentrações de álcool
oferecidas de forma aguda e crônica para os peixes paulistinha e beta.
Hipótese 3 – O álcool é capaz de causar dependencia no peixe paulistinha e no
peixe beta, entretanto o grau de adição causado é dependente da dose.
Predição 3a – A concentração mais baixa de álcool não é capaz de produzir adição
nos animais, mesmo com o uso crônico.
Predição 3b – A concentração mais elevada causa dependencia severa nos
animais.
22
ARTIGO 1
A DOSE FOR THE DRINKER IS ENOUGH: the alcohol benefits for associative
learning in zebrafish
Diana M. M. Chacona and Ana Carolina Luchiari
a*
a Departamento de Fisiologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, PO
BOX 1510, 59078-970 Natal, Rio Grande do Norte, Brazil.
*Corresponding author. Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, PO BOX
1510, 59078-970 Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. Phone: +55 84 32153409, Fax: +55 84 32119206,
E-mail: [email protected]
Abstract
This study aimed to test the addictive potential of alcohol doses and the effects on
conditioned learning in the zebrafish, Danio rerio. Three treatments were conducted:
acute, chronical and withdrawal, using 0.1%, 0.25% 1.0% alcohol and control (0%). For
addiction test, place preference was observed in a shuttle box tank before and after
alcohol exposure. We observed a change in the initial preference due to the association
with alcohol only at 0.25 and 1.0% doses in both acute and chronical offering,
indicating an alcohol-seeking behaviour after exposition to the drug, characteristic of
addiction. This change was maintained throughout the test days. For the conditioning
task, fish received light stimulus followed by food in a pre-defined area of the tank for 8
consecutive days. The low dose group (0.1%) learned the task at day 3 both for
chronical and withdrawal, but withdraw animals improved learning at the end of the
test. The other doses (0.25 and 1.0%) caused learning impairment in chronical
treatment, but at withdrawal fish learned on the last 2 days of test. Thus, high doses
cause learning impairment and addiction, even after drug cessation, while low doses
positively affect learning and do not cause addiction.
Keywords: ethanol, central nervous system, addition, conditioning, fish
23
1.Introdução
A aprendizagem e a consolidação de memória são influenciadas por mudanças
fisiológicas e neurais causadas por substâncias psicoativas (GOODWIN E HILL, 1975).
Dentre estas, o álcool vem sendo bastante investigado por ser a droga lícita de maior
consumo mundial e de maior impacto sobre a saúde da sociedade (LIMA, 2003; OMS,
2003). Esta substância possui efeitos neurológicos e psicológicos tanto a curto quanto
longo prazo e é considerada uma droga de efeito dose-dependente por apresentar
diferentes ações em diferentes dosagens. Em quantidades moderadas, o álcool é
estimulante e ansiolítico, fatores envolvidos na promoção da dependência (CARLSON,
2001). Já em doses elevadas (>0,25% de álcool na corrente sanguínea), a droga produz
perda de controle motor, desorientação e sedação, sendo estas consideradas ações
depressoras (CHARNESS, 1989).
O uso crônico de doses elevadas de álcool, além de causar dependência, produz
inúmeros problemas sistêmicos (AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, 2003) e
neurológicos (GIVENS E MCMAHON, 1995), como perda de massa cortical, aumento
ventricular e demência (CENTERWALL E CRIQUE, 1978). No entanto, após a
interrupção do consumo abusivo, pode haver diminuição dos prejuízos nas funções
cognitivas, principalmente após a atenuação dos sintomas de abstinência alcoólica
(ACKERMANN ET AL. 1999).
Muitos pesquisadores (FULLER E HILLER-STURNHÖFEL, 1999;
VENGELIENE ET AL., 2008; GERLAI ET AL, 2009) apontam a necessidade de se
investigar os efeitos do álcool em várias concentrações, com o objetivo de se determinar
as vias de ação desta substância no cérebro (GERLAI ET AL., 2009). Estudos
demonstram existir efeitos prejudiciais ou benéficos no funcionamento encefálico,
dependendo da dose experimentada (KALEV E DURING, 2007; CRUZ ET AL. 2009).
Ademais, trabalhos que investiguem o efeito do álcool em dosagens baixas na cognição
são escassos e insuficientes.
Embora o estudo com roedores e primatas seja mais facilmente extrapolado para a
aplicação em humanos, a complexidade dos mecanismos neurais torna a pesquisa com
mamíferos bastante complicada. Neste sentido, o organismo modelo que vem recebendo
notável atenção é o peixe paulistinha (Danio rerio). De fato, a facilidade de manter
esses animais em laboratório, baixo custo de manutenção, organização do sistema
24
nervoso central semelhante ao de mamíferos e a possibilidade de ficarem imersos em
álcool por longos períodos (GRUNWALD E EISEN, 2002), formam uma condição
ideal entre a complexidade do sistema estudado e a simplicidade prática do recurso
(GÓMEZ-LAPLAZA E GERLAI, 2010). Além disso, os estados comportamentais após
o uso de álcool, caracterizados no peixe paulistinha por GERLAI ET AL. (2000),
assemelham-se a outros grupos de vertebrados, incluindo o homem. De fato, baseado no
que se sabe sobre este animal, percebe-se que esta espécie é modelo para estudos
biológicos dos efeitos do álcool e adição (DARLAND E DOWLING, 2001; LAU ET
AL., 2006; NINKOVIC ET AL., 2006; MATHUR ET AL., 2011) e síndrome de
abstinência (CACHAT ET AL., 2010). Assim, buscamos neste trabalho 1) testar o
potencial aditivo de diferentes doses de álcool em uso agudo e crônico e 2) testar os
efeitos dessas doses na aprendizagem associativa do peixe paulistinha durante e após o
uso da droga.
2. Metodologia
2.1 Procedimentos gerais
Peixes paulistinhas, Danio rerio (HAMILTON, 1822) adultos foram adquiridos
através do comércio local (Natal, RN) e transferidos para aquários de estocagem
(50x40x30cm, 50 L) mantidos no Laboratório de Peixes Ornamentais do Departamento
de Fisiologia (DFS) da UFRN, Natal, RN. Cerca de 75 animais foram mantidos em cada
tanque estoque (1,5 peixe por litro) com água constantemente renovada através de um
sistema fechado de recirculação de água com um filtro mecânico, um filtro biológico e
um filtro com lâmpada UV. A água foi mantida em temperatura de cerca de 26 °C, pH
de 7,2 e fotoperíodo controlado em 12L:12E. A água foi trocada em 30% a cada 10
dias e mantida com aeração constante. Os animais foram alimentados diariamente ad
libitum com ração comercial peletizada (38% proteína e 4% lipídeo, Nutricom Pet).A
fase experimental foi desenvolvida no mesmo ambiente citado acima e os aquários
experimentais mantidos às mesmas condições de qualidade de água.
25
2.2. Potencial aditivo do álcool
A estratégia experimental consistiu em avaliar o poder para causar adição de
diferentes doses de álcool utilizando o paradigma de preferência condicionada por local,
onde o animal passa a associar o ambiente com as propriedades reforçadoras da droga e
desenvolve preferência pelo próprio local (TZSCHENTKE, 2007; MATHUR ET AL.,
2011).
Nosso experimento foi realizado num aquário tipo shuttle box, que consiste de um
aquário de vidro (40x25x20cm) dividido ao meio por uma placa opaca, porém com uma
abertura inferior (na base da placa) de 2cm de altura, que permitia ao peixe acesso aos
dois lados do aquário. Cada lado do shuttle box tinha o fundo diferenciado, sendo um
lado com o fundo branco e outro lado com o fundo quadriculado em preto e branco (2x2
cm), conforme figura 1 abaixo.
Figura 1. Desenho esquemático do aquário tipo shuttle box utilizado nesse estudo.
Fonte: Autoria própria.
Os peixes foram colocados individualmente no shuttle box e após 2 minutos para
habituação, foram filmados por 5 minutos para verificação da preferência inicial dos
animais por um dos lados. Para isso, foi registrado o tempo de permanência do animal
em cada lado, e considerado preferido o lado no qual o peixe permaneceu mais de 60%
do tempo total. Em seguida ao teste de preferência, os animais foram mantidos em
aquários residência individuais.
Passadas 24h do teste de preferência, cada animal foi individualmente submetido
ao álcool por 20 minutos no lado que passaram a menor parte do tempo (lado não
preferido). Dois tratamentos com álcool foram testados (agudo e crônico), utilizando-se
as concentrações de 0,1%; 0,25% e 1,0% de álcool etílico (P.A. 99,5%) diluído em
água, com pH de 6,6 respectivamente. O grupo controle foi mantido sempre em 0% de
álcool (n=8; pH de 7,2). A submissão ao álcool aconteceu em um aquário menor
26
(20x20x10cm, 2L), que era posicionado dentro do lado não preferido. Esse
procedimento foi realizado para assegurar que o animal fosse alcoolizado somente no
ambiente não preferido. Após a submissão ao álcool, os peixes foram mantidos por mais
20 min em um aquário de mesmas dimensões, no lado preferido inicialmente pelo
animal, porém submetidos à água apenas. Em seguida, cada animal foi retornado ao seu
aquário residência.
Os animais submetidos ao tratamento agudo com álcool foram colocados em
contato com álcool apenas no dia subsequente ao teste de preferência (0,1% = 10
animais; 0,25% = 11 animais; 1,0% = 13 animais). Já os animais do tratamento crônico
foram submetidos ao álcool durante 7 dias consecutivos, sempre no ambiente não
preferido inicialmente (0,1% = 8 animais; 0,25% = 9 animais; 1,0% = 8 animais).
Após o final do tratamento com a solução de álcool, cada animal foi novamente
testado quanto à preferência no shuttle box, desta vez por 5 dias consecutivos. Neste
teste, cada animal foi filmado por 5 minutos, conforme ocorreu no primeiro dia do teste
de preferência, com o objetivo de observar se houve mudança na preferência inicial para
o lado no qual os animais experimentaram álcool. Essa metodologia, inclusive as doses
utilizadas, foi baseada no trabalho de Marthur et al. (2011). As filmagens foram
analisadas com o auxilio do programa ANY-maze™ Video Tracking System, o qual
rastreou o peixe e calculou o tempo que o animal permaneceu em cada compartimento
do aquário shuttle box.
As porcentagens de tempo em cada lado do shuttle box foram comparados entre a
preferência inicial e os 5 dias de teste de preferência após submissão ao álcool,
considerando cada dosagem e cada tratamento. Foi utilizado teste de Anova para
medidas repetidas ou teste de Friedman quando os dados não passaram no teste de
normalidade ou homocedasticidade. Quando observado diferença estatística, foi
utilizado teste post hoc de Student-Newman-Kuels. Os resultados de preferência
ambientais entre o tratamento crônico e agudo foram comparado através de teste t de
Student para dados independentes. Em todos os casos, foi usado como valor de
referência = 0,05.
2.3. Condicionamento associativo
A estratégia experimental utilizada consistiu em avaliar a influência do uso de
diferentes dosagens de álcool na capacidade de aprendizagem associativa, quatro grupos
27
experimentais foram testados em tratamentos diferentes: 1) tratamento crônico:
alcoolização por 18 dias prévios + 8 dias de teste de aprendizagem, e 2) tratamento
abstinência: alcoolização por 15 dias seguidos de 3 dias de aclimatação + 8 dias de teste
de aprendizagem em abstinência da droga. As doses de álcool utilizadas foram baseadas
em estudos prévios com peixes (GERLAI ET AL, 2000; MATHUR ET AL., 2011),
sendo 0,1%; 0,25% e 1,0% de álcool mais o grupo controle (dose 0%). A alcoolização
foi realizada diariamente (15 dias iniciais) pela imersão em diferentes doses de álcool
etílico (P.A. 99,5%) preparadas em aquários (40x20x25cm) contendo 10L de água, com
pH de 6,6. Após o tempo de exposição ao álcool, os animais retornaram para os
respectivos aquários residência, onde permaneceram em água limpa até o próximo
período de alcoolização. O grupo controle foi apenas manipulado para aquário contendo
água (10L). Durante a fase de teste de aprendizagem, apenas o grupo em tratamento
crônico continuou a ser alcoolizado diariamente. No tratamento crônico foram testados
10 indivíduos por dose; enquanto no tratamento abstinência foram testados 12
indivíduos.
Este estudo consistiu em avaliar o desempenho do peixe paulistinha em associar um
estímulo não condicionado (alimentação) a um estímulo condicionado (luz). No teste de
condicionamento apetitivo, peixes paulistinha dos tratamentos acima descritos foram
individualmente isolados química, visual e acusticamente, em aquários de 40x20x25cm,
com 15L de água nas mesmas condições do tanque estoque. Os aquários receberam um
pequeno anteparo na região superior esquerda (25x2cm), onde o alimento foi
disponibilizado (área de alimentação). Na região superior central do aquário foi
colocada uma lâmpada que serviu como estímulo condicionado. O modelo deste aquário
pode ser visualizado na figura 2.
Figura 2. Desenho esquemático do aquário usado para os animais no estudo de condicionamento clássico
com reforço alimentar. Na região superior esquerda encontra-se o sítio de alimentação e acima a lâmpada
para o estímulo condicionado.
Fonte: Autoria própria.
28
Os aquários foram posicionados atrás de uma cortina opaca e o observador
desenvolveu o experimento através de aberturas na cortina, de modo que os animais não
mantinham contato visual com o observador para não associá-lo como um estímulo. A
alimentação (ração comercial peletizada usada para os animais estoque) foi oferecida
através das aberturas na cortina, logo após o estímulo condicionado. Para isso foi
utilizado um alimentador manual, um pequeno pote conectado a um tubo longo, para se
disponibilizar o alimento na região de sítio alimentar dos aquários. A alimentação foi
sempre oferecida aquém da saciedade (3-4 peletes) para manter o animal motivado a
buscar alimento quando oferecido.
Após aclimatização de 3 dias no aquário experimental, teve início a fase de
condicionamento. Cada animal foi filmado por 2 minutos, sendo um minuto anterior ao
estímulo condicionado (luz) e 1 minuto após o estímulo. O estímulo luminoso era
oferecido por 10 segundos, seguido pela oferta alimentar. O comportamento dos peixes
foi registrado através de filmagens diárias durante 8 dias consecutivos, entre as 11:00 e
12:00 h.
Os animais do tratamento crônico com álcool foram submetidos individualmente à
dose da droga durante todo o período experimental, incluindo os 3 dias de ajuste e os 8
dias de teste. Para isso, um aquário pequeno (20x20x10cm) contendo 2L de solução de
álcool foi posicionado ao lado de cada aquário experimental para alcoolização do peixe.
A solução foi renovada diariamente e a alcoolização aconteceu sempre no período
vespertino. O grupo controle foi imerso em água no mesmo tipo de procedimento. Para
os grupos experimentais incluídos no tratamento abstinência, este procedimento não
ocorreu.
As filmagens feitas durante os 8 dias de teste de condicionamento foram
observadas para a análise do comportamento de dispersão e aproximação da área
alimentar antes e depois do estímulo não condicionado. Para isso, a parede frontal (40 x
20 cm) do aquário ocupado pelo peixe foco foi quadriculada (2x2 cm) para avaliarmos a
localização do animal, registradas a cada 10 segundos. Os pontos estavam dispostos
num sistema de eixos cartesianos (x-y) e, a cada 1 min de filmagem (6 pontos),
calculamos a coordenada correspondente ao baricentro (média de x e média de y). A
média dos pontos de cada minuto foi usada como indicador da dispersão do animal.A
distância do animal ao sítio de alimentação (x1 e y7) foi calculada através da equação
29
do teorema de Pitágoras (c2=a
2+b
2), para os tempos antes e depois do estímulo.O Índice
de aproximação do animal ao sítio de alimentação foi calculado através da diferença
entre distância do sítio de alimentação no 2º minuto e no 1º minuto [IA= (distância 2 –
distancia 1)]. Os dados do índice de aproximação dos 8 dias de teste foram agrupados
em blocos de 2 dias para posterior análise. Para validar o índice usado, foi comparada a
posição do peixe antes do estímulo luminoso em cada condição experimental. O
aprendizado foi inferido pelo índice ao longo dos dias. Quanto mais negativo, mais
perto do sítio de alimentação o animal esteve no segundo minuto.
Paralelamente ao teste de condicionamento, verificamos se o álcool interfere na
locomoção dos peixes, influenciando seu desempenho. Seis peixes paulistinha foram
alcoolizados por 20 min em cada concentração de álcool (0; 0,1; 0,25; 1,0%), e
posteriormente relocadas, individualmente, em aquário (40x25x20cm, 15L) para
registro da velocidade média 05 min. Os dados foram analisados no programa ANY-
maze™ Video Tracking System.
Os dados foram analisados quanto à normalidade (Teste de Kolmogorov-
Smirnov) e, em seguida, utilizado teste de Anova para medidas repetidas, seguido de
teste post-hoc de Student Newman-Keuls. Em todos os casos, foi usado como valor de
referência p= 0,05.
3. Resultados
3.1.Potencial aditivo do álcool
O grupo controle (no qual os animais foram expostos aos dois ambientes do
shuttle box imersos apenas em água) não mostrou mudança significativa de preferência
ambiental, permanecendo mais tempo no ambiente preferido inicialmente (RM Anova,
F=0,87 p=0,51). Resultados semelhantes foram encontrados para o grupo controle em
tratamento crônico, no qual os animais foram manipulados por 7 dias, sempre
submetidos a condição com água pura, e tiveram sua preferência novamente registrada
(RM Anova, F=1,70 p=0,15).
Os animais submetidos às doses agudas de álcool mostraram variação na
resposta de preferência condicionada dependente da dose, como pode ser observado na
30
Figura 3. Observamos que 13 animais do tratamento agudo preferiram inicialmente o
lado branco da shuttle box, enquanto 22 animais preferiram o lado quadriculado.
Animais que foram submetidos a 0,1% de álcool não tiveram sua preferência inicial
alterada, mantendo a maior visitação ao mesmo ambiente preferido inicialmente (RM
Anova, F=1,99 p=0,10). No entanto, os animais que receberam dose aguda de álcool nas
concentrações 0,25 e 1% tiveram suas preferências alteradas. Os animais da dose 0,25%
permaneceram mais tempo no ambiente não preferido nos dias 2, 4 e 5 (RM Anova,
F=4,05 p=0,005). Já os animais submetidos à dose de 1% de álcool alteraram
completamente a preferência ambiental, permanecendo durante os 5 dias pós-álcool no
compartimento não preferido inicialmente (RM Anova, F=2,73 p=0,02).
Figura 3 Comportamento de preferência por álcool em teste de preferência ambiental condicionada em
shuttle box após exposição aguda à droga. As barras indicam a porcentagem media de tempo no ambiente
não preferido ± dp. A preferência inicial indica o tempo no ambiente não preferido (menos de 55% do
tempo total). Os dados dos dias 1 a 5 representam o tempo despedido pelo peixe no ambiente não
preferido, onde houve exposição aguda ao álcool, nas doses 0% (controle, n=8), 0,1% (n=8), 0,25% (n=9)
e 1% (n=8). Letra a minúscula indica diferença estatística ao longo dos dias de exposição em relação à
preferência inicial para o grupo 0,25%; e letra b minúscula indica diferença estatística ao longo dos dias
de exposição em relação à preferência inicial para o grupo 1%. Houve diferença significativa no grupo
exposto de forma aguda a 0,25% de álcool (RM Anova, p=0,005) e a 1% de álcool (RM Anova, p=0,028).
Nos grupos controle (RM Anova, p=0,51) e 0,1% de álcool (RM Anova, p=0,10), o animal não mostrou
mudança de preferência ao longo dos dias.
Fonte: Autoria própria.
0
25
50
75
100
Teste de preferência
inicial
dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5
Preferência após exposição aguda ao álcool
Tem
po
no
am
bie
nte
não
pre
feri
do
(%
)
controle 0,1% álcool 0,25% álcool 1% álcool
a a
b b b b
b
31
Nos peixes tratados de forma crônica, o comportamento geral assemelhou-se aos
animais do tratamento agudo, como é mostrado na Fig. 4. Observamos que 6 animais do
tratamento crônico preferiram inicialmente o lado branco da shuttle box, enquanto 19
animais preferiram o lado quadriculado. O grupo 0,1% de álcool não teve a preferência
inicial alterada pela exposição ao álcool, mantendo a preferência mostrada inicialmente
(Friedman, χ2=7,28 p=0,20). Novamente apenas os grupos submetidos a 0,25 e 1,0% de
álcool mostraram resultados significativos de mudança comportamental. Os peixes
submetidos a 0,25% de álcool por 7 dias permaneceram mais tempo no ambiente não
preferido inicialmente nos dias 1, 2, 3 e 5 pós-álcool (RM Anova, F=2,35 p=0,049). Já
os animais que foram submetidos à dose de 1% de álcool de forma crônica
permaneceram mais tempo no ambiente de alcoolização nos dias 2, 4 e 5 (RM Anova
F=3,49 p=0,012).
Figura 4. Comportamento de preferência por álcool em teste de preferência ambiental condicionada em
shuttle box após exposição crônica à droga. As barras indicam a porcentagem media de tempo no
ambiente não preferido ± dp. A preferência inicial indica o tempo no ambiente não preferido (menos de
55% do tempo total). Os dados dos dias 1 a 5 representam o tempo despedido pelo peixe no
compartimento não preferido, onde houve exposição crônica ao álcool, nas doses 0% (controle, n=8),
0,1% (n=10), 0,25% (n=10) e 1% (n=10), por 7 dias consecutivos. Letra a minúscula indica diferença
estatística ao longo dos dias de exposição em relação à preferência inicial para o grupo 0,25%; e letra b
minúscula indica diferença estatística ao longo dos dias de exposição em relação à preferência inicial para
o grupo 1%. . Houve diferença significativa no grupo exposto de forma crônica a 0,25% de álcool (RM
Anova, p=0,04) e a 1% de álcool (RM Anova, p=0,01). Nos grupos controle (RM Anova, p=0,51) e 0,1%
de álcool (RM Anova, p=0,43), o animal não mostrou mudança de preferência ao longo dos dias.
Fonte: Autoria própria.
0
25
50
75
100
Teste de preferência
inicial
dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5
Preferência após exposição crônica ao álcool
Tem
po
no
am
bie
nte
não
pre
feri
do
(%
)
controle 0,1% álcool 0,25% álcool 1% álcool
b b a b
a a a
32
A comparação entre a preferência dos animais sob tratamento agudo e crônico
em cada concentração de álcool não mostrou diferença significativa em qualquer dia de
teste (teste t Student, p>0,05).
3.2. Condicionamento associativo
A velocidade média dos grupos foi 0%: 0,07±0,031 m/s; 0,1%: 0,08±0,031 m/s;
0,25%: 0,11±0,009 m/s; 1%: 0,08±0,008 m/s. Houve diferença significativa na
velocidade média entre os grupos (Kruskal-Wallis, H=10,2 p=0,017), porém a
alcoolização alterou a atividade natatória somente dos animais submetidos à dose
0,25%.
Tratamento crônico
A dispersão dos animais não variou ao longo dos dias (0%: RM Anova, F= 0,837
p= 0,479; 0,1%: RM Anova, F= 1,261 p= 0,297; 0,25%: RM Anova, F= 0,238 p=0,869;
1%: RM Anova, F= 2,173 p= 0,101). A aproximação dos peixes ao local de alimentação
antes do estímulo luminoso diferiu entre os grupos. Os animais sob 0,25% de álcool
crônico apresentaram maior aproximação prévia do que os grupos 1% e 0% (RM
Anova, F=3,46 p=0,017).
Em relação ao índice de aproximação, houve diminuição ao longo dos dias para os
grupos controle e dose 0,1%, porém não houve resultado para os grupos submetidos às
doses 0,25% e 1,0% (Fig. 5). O grupo controle aproximou-se significativamente da área
alimentar no 3º bloco de dias (dias 5 e 6; RM Anova, F=3,495 p=0,021, Fig. 5a). O
grupo dose 0,1% aproxima-se muito significativamente do sítio de alimentação já no 2º.
Bloco de Dias, anteriormente ao grupo controle (dias 3 e 4; RM Anova, F=2,942
p=0,041, Fig. 5b). Entretanto não encontramos resultados significativos para o grupo
dose 0,25% (RM Anova F=0,973 p=0,412, Fig. 5c) e nem para o grupo dose 1,0% (RM
Anova, F=0,807 p=0,496, Fig. 5d).
33
-4,5
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5
1 2 3 4
b) álcool crônico 0,1%
a c b c
-4,5
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5
1 2 3 4
Blocos de 2 dias
d) álcool crônico 1%
Tratamento abstinência
Somente o grupo controle (dose 0%) variou a dispersão ao longo dos dias (0%:
RM Anova, F= 5,115 p=0,003; 0,1%: RM Anova, F= 1,295 p=0,284; 0,25%: Friedman,
x2=1,850 p=0,604; 1,0%: RM Anova, F=1,93 p=0,134). A posição dos peixes antes do
sinal luminoso não diferiu entre os grupos experimentais em abstinência de 0, 0,1, 0,25
e 1% de álcool (Kruskal-Wallis, H=1,76 p=0,41).
Figura 5. Índice de aproximação do sítio de alimentação (distancia no 2º min – distancia no 1º min)± ep
do peixe paulistinha durante teste de condicionamento com reforço alimentar, em condição de uso
crônico de álcool. Quanto mais negativo o valor do índice, menor a distância do peixe em relação à área
de alimentação após o sinal luminoso. Os animais de cada grupo (n=10) foram alcoolizados por 26 dias,
incluindo 3 dias de aclimatação e mais 8 dias de teste de aprendizagem. As doses de álcool utilizadas
foram 0,1%; 0,25% e 1,0% de álcool, e o grupo controle recebeu apenas água (0%). Os dados de 8 dias
de teste foram blocados em 2 dias para as análises. Letras minúsculas diferentes indicam diferença
estatística entre os blocos de dias em cada grupo (RM Anova, p<0,05).
Fonte: Autoria própria.
Em relação ao índice de aproximação ao sítio alimentar, houve diminuição
crescente ao longo dos dias, para todos os grupos experimentais (Fig. 6). O grupo
controle mostrou aproximação significativa da área de alimentação a partir do 3º bloco
de dias (dias 5 e 6) e manteve esta aproximação até o final do teste (RM Anova, F=9,46
-4,5
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5
1 2 3 4
Índ
ice
de
apro
xim
ação
a) álcool crônico 0% - controle
a b b
a
-4,5
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5
1 2 3 4
Índ
ice
de
apro
xim
ação
Blocos de 2 dias
c) álcool crônico 0,25%
34
p<0,001, Fig. 6a). Já o grupo em abstinência de 0,1% de álcool mostrou aproximação da
área de alimentação após o sinal luminoso no segundo bloco de dias (dias 3 e 4) e
aumentou esta resposta no último bloco de dias (dias 7 e 8) (RM Anova, F=25,25
p<0,001, Fig. 6b). Os grupos experimentais que estavam em abstinência das doses de
0,25 e 1% de álcool apresentaram aproximação significativa apenas no último bloco de
dias (dias 7 e 8) (RM Anova 0,25%: F=16,78 p<0,001, Fig. 6c; e 1%: F=17,09 p<0,001,
Fig. 6d).
Figura 6. Índice de aproximação do sítio de alimentação (distancia no 2º min – distancia no 1º min)± ep do
peixe paulistinha durante teste de condicionamento com reforço alimentar, em condição de abstinência
de álcool. Quanto mais negativo o valor do índice, menor a distância do peixe em relação à área de
alimentação após o sinal luminoso. Os animais de cada grupo (n=12) foram alcoolizados por 15 dias,
seguidos de 3 dias de ajuste sem a droga e mais 8 dias de teste de aprendizagem em abstinência da droga.
As doses de álcool utilizadas foram 0,1%; 0,25% e 1,0% de álcool, e o grupo controle recebeu apenas
água (0%). Os dados de 8 dias de teste foram blocados em 2 dias para as análises. Letras minúsculas
diferentes indicam diferença estatística entre os blocos de dias em cada grupo (RM Anova, p<0,05).
Fonte: Autoria própria.
4. Discussão
Nós observamos que o álcool altera a aprendizagem condicionada do peixe
paulistinha de forma dose-dependente. A dose baixa da droga (0,1%) melhora a resposta
-4,5
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5
1 2 3 4
Índ
ice
de
apro
xim
ação
a) Abstinência de álcool 0% - controle
b b
a
a
-4,5
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5
1 2 3 4
a
b) Abstinência de álcool 0,1%
c b b c b b
-4,5
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5
1 2 3 4
Índ
ice
de
apro
xim
ação
Blocos de 2 dias
c) Abstinência de álcool 0,25% a
b ab ab
-4,5
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5
1 2 3 4
Blocos de 2 dias
d) Abstinência de álcool 1%
a
b ab a
35
de aprendizagem e não gera efeito de dependência, enquanto doses mais elevadas (0,25
e 1%) prejudicam o desempenho associativo e têm potencial aditivo.
Embora sem a ação do álcool (grupo controle), o peixe paulistinha mostre
aprendizagem associativa, ratificando os resultados de Al-Imari e Gerlai (2008),
Braubach et al. (2009), Gomez-Laplaza e Gerlai (2010) e Karnik e Gerlai (2012),
animais tratados com 0,1% de álcool aprenderam a associar os estímulos com pelo
menos 2 dias de antecedência. Por outro lado, 0,25 e 1% de álcool impediram a
aprendizagem, porém durante a fase de abstinência dessas doses houve resposta
associativa (mesmo que tardia), indicando haver recuperação dos efeitos nocivos da
droga. Ademais, observamos que apenas 0,25 e 1%, tanto de forma aguda como crônica,
geram adição à droga.
O álcool é uma droga depressora do SNC (CHARNESS, 1989) e suas ações
inibitórias são responsáveis pela redução dos reflexos e processos cognitivos
(MAWDSLEY E MAYER, 1965; VITTADINI ET AL., 2001; KOIKE E SOBUE,
2006). O álcool reduz a atividade elétrica neuronal (LOVINGER, 1997) e seu consumo
em longo prazo provoca graves problemas de aprendizagem (LITTLE, 1991),
decorrentes das ações imediatas do próprio etanol ou da perda neuronal causada pelo
produto da digestão alcoólica, o acetaldeído (HARPER E MATSUMOTO, 2005)
.Nossos resultados corroboram a ideia de que altas doses de álcool interferem na
capacidade cognitiva e aprendizagem.
A exposição ao álcool afeta significativamente quase todo o repertório
comportamental do peixe paulistinha. A presença de álcool no sangue altera o
comportamento social (GERLAI ET AL., 2009), reduzindo a formação de cardumes
(BUSKE E GERLAI, 2011) e tornando os animais mais agressivos (GERLAI ET AL.,
2000). A influencia do etanol no comportamento agonístico de peixes (PEEKE ET AL.,
1975; PEEKE E FIGLER, 1981) assemelha-se bastante com o comportamento de
roedores e primatas (MICZEK ET AL., 1993), inclusive humanos. A própria percepção
do ambiente e da presença de predador é comprometida quando o peixe esta alcoolizado
(GERLAI ET AL., 2000, 2009).
Gerlai et al. (2000) também observaram que o álcool altera o padrão de atividade
natatória do peixe, que é aumentada em doses baixas enquanto doses altas provocam
depressão. Esta resposta ao álcool poderia interferir na resposta de aproximação da área
36
alimentar no teste de condicionamento, favorecendo animais das doses baixas, o que
não foi observado. A validação do índice de aproximação (comparação da localização
dos animais antes do estimulo) mostrou haver diferença no posicionamento dos animais
antes do estímulo luminoso – 0,25% crônico estava mais próximo. No entanto, o
desempenho na aprendizagem deste grupo foi inferior ao controle e 0,1% de álcool.
Além disso, as análises de dispersão mostram que não houve diferença no padrão motor
entre os grupos alcoolizados, reforçando a ideia de que o paulistinha melhora seu
aprendizado exclusivamente pelo efeito da baixa dose de álcool, corroborando estudos
de Ruitenberg et al. (2002) e Weyerer et al. (2011).
Alguns mecanismos foram propostos como explicação para o efeito benéfico de
doses subclínicas de álcool na aprendizagem. Parker et al. (1981) sugeriram que os
níveis de vasopressina, catecolaminas e corticosteroides aumentados no cérebro com a
ingestão de álcool podem facilitar a formação de memórias de longo-prazo. O estudo de
Ruitenberg et al. (2002) também aponta o uso de doses baixas a moderadas de álcool
em longo prazo como responsável por benefícios à saúde mental da população idosa.
Embora estes e outros autores (HENN ET AL., 1998; CARMELLI ET AL., 1999)
responsabilizem secreção de acetilcolina na região do hipocampo como principal
colaborador da melhoria cognitiva,esta sugestão é ainda especulativa e ainda precisa ser
confirmada.
Em peixes teleósteos, neurogênese intensa ocorre continuamente ao longo da vida
(ZUPANC E HORSCHKE, 1995; ZUPANC, 2006). Estudos que abordam a
proliferação celular no telencéfalo dorsal de peixes – considerado o precursor evolutivo
do hipocampo de mamíferos (FRIEDRICH ET AL., 2010) – relacionam este fenômeno
a diversos estressores (GOULD ET AL., 1997; MIRESCU AND GOULD, 2006; VON
KROGH ET AL., 2010). De fato, Kalev e During (2007) observaram que o consumo
crônico de doses baixas de álcool melhoram a aprendizagem em ratos pela expressão
aumentada de receptores N-metil-D-aspartato, ou NMDA,no hipocampo. Estes autores
sugerem que a exposição ao álcool em doses reduzidas é suficiente para induzir um
estado de neuroproteção adaptativa no cérebro, semelhante ao estado conhecido por
“pré-condicionamento cerebral” que pode ser iniciado por uma variedade de estímulos
potencialmente prejudiciais em doses subtóxicas (DIRNAGL ET AL., 2003).
37
Além de todas as alterações comportamentais por ação do álcool, acima
relacionadas, Cachat et al. (2010) mostram que a abstinência de álcool também afeta o
paulistinha, indicando-o como modelo de estudos desta síndrome. Sabe-se que a
interrupção do uso abusivo de álcool trás recuperação nas funções cognitivas em
pacientes alcoolistas. Estudos de neuroimagem têm confirmado que disfunções
cerebrais ligadas ao álcool podem ser reversíveis ao longo do tempo de abstinência
(BROWN ET AL, 2001). No entanto, existem diferenças de recuperação de acordo com
a habilidade neurocognitiva afetada, o tempo de exposição à droga e a extensão do
prejuízo (HOHMANN ET AL., 2000). O quadro pode ser tornar irreversível, como na
demência alcoólica de Wernick, após anos de consumo abusivo da substância
(HOHMANN ET AL., 2000). Em nosso estudo, o período de submissão ao álcool
provavelmente não foi extenso o suficiente para deflagrar grandes perdas neuronais,
facilitando a pronta recuperação da capacidade cognitiva após curto período de
abstinência. Crews e Nixon (2008) observaram que na abstinência, a ação do glutamato
sobre os receptores NMDA sinápticos e o aumento na transcrição de pCREB favorece o
retorno da plasticidade e aumento da neurogênese. Estudos adicionais são necessários
para definir em quais doses alcoolicas e tempo de abstinência estes efeitos são
observados.
Em mamíferos, sabe-se que o sistema mesolímbico dopaminérgico tem importante
papel no reforço dado pelas drogas de abuso (O’BRIEN E GARDNER, 2005). No peixe
paulistinha foram identificados neurônios dopaminérgicos na zona média do telencéfalo
dorsal que se projetam para o núcleo dorsal da área telencefálica ventral, áreas
homólogas a amígdala e corpo estriado de mamíferos (LAU ET AL., 2011). No
presente estudo, observamos que dose média (0,25%) e dose alta (1%) de álcool
oferecidas uma única vez ou por 7 dias consecutivos aumentam a preferência por lugar
no peixe paulistinha, indicando comportamento de busca pela droga. Este resultado é
consistente com o estudo de Brennan et al. (2011) usando apenas a dose 1% aguda e
crônica e de Mathur et al. (2011) usando 1 e 1,5% somente em exposição aguda. Estes
autores propõem que apenas uma exposição a doses elevadas é suficiente para causar
adição, que permanece até 4 semanas, provavelmente porque modifica padrões
secretórios da via dopaminérgica, o que parece não ocorrer no uso de doses baixas.
Nosso estudo também confirma o peixe paulistinha como importante modelo de
análise. Em estudos futuros, sugerimos o uso deste modelo para a busca de estimulos
38
que possam reverter o comportamento aditivo a drogas, tais como punições em
associação ao uso ou reforços positivos em associação com abstenção, a fim de
enfraquecer o sistema de recompensa cerebral.
Concluímos assim, que o uso de doses subclínicas de álcool, representado pela
concentração de 0,1%, é incapaz de causar dependência e interfere positivamente no
desempenho do peixe paulistinha em tarefas de condicionamento com reforço alimentar.
Portanto, doses baixas de álcool podem alterar a comunicação neuronal, a relação entre
neurônios ou as vias bioquímicas intracelulares que culminam com a melhoria da
aprendizagem.
39
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46
ARTIGO 2
DOES ALCOHOL REALLY IMPAIR FISH SPATIAL LEARNING?
Diana Marques Martins Chacon; Ana Carolina Luchiari
Departamento de Fisiologia, Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia, Centro de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal-RN
Abstract
This study aimed to test the performance of the fish Betta splendens in a spatial learning
task on acute, chronic al and withdrawal treatments, using different alcohol
concentrations (0%, 0.1%, 0.25%, 1% and 1.5%) and test the alcohol potential to induce
addiction. The results demonstrate that all the experimental groups show spatial
learning, reducing their time to exit the maze during the test (RM Anova, p<0,05). The
performance of the animals showed a dose-dependent patter, for both the acute and
chronical treatments. High alcohol doses (1 and 1.5%) impaired the animal spatial
learning, while low alcohol doses (0.1%) improved learning. Differences in learning
were not observed for the withdrawal group. Higher doses also produced addiction and
lower and medium doses (0.25%) did not. Therefore, we concluded that low alcohol
dose favor spatial learning and do not cause addiction while high dose impairs learning
and induce addiction.
Keywords: spatial orientation, maze, alcoholism, abstinence, fish
47
1.Introdução
Drogas psicotrópicas são substâncias que atuam no sistema nervosos central
provocando alterações fisiológicas e comportamentais. Dentre estas substâncias, o
álcool é a droga de abuso mais consumida mundialmente e causa inúmeros prejuízos
neurais, como a dependência física e psicológica (GIVENS E MCMAHON, 1995), a
perda de massa cortical e demência (CENTERWALL E CRIQUE, 1978) e a
desorientação espacial (UCKER E NADEL, 1996). Esta última refere-se à perda da
capacidade de registrar informações sobre um ambiente e sua orientação/localização
espacial. De fato, a administração aguda de álcool a roedores reduz o desempenho em
tarefas de aprendizagem que requerem formação de mapas mentais, processo mediado
pelo hipocampo (MATHEWS ET AL., 1995; JOHNSON E ADAMO-VILLANI, 2010).
A teoria de mapas mentais aborda principalmente os mecanismos de aprendizagem
espacial, nos quais o animal cria um mapa contendo itens representativos da localização
do ambiente (O'KEEFE E NADEL, 1978; NEWMAN ET AL., 2007). Peixes
teleósteos apresentam capacidade de aprendizagem e memória espacial comparáveis
com mamíferos, empregando variados sistemas neurais para traçar diferentes estratégias
de navegação nos ambientes que ocupam (ODLING-SMEE E BRAITHWAITE, 2003).
A maior parte do conhecimento sobre o papel da aprendizagem e da memória na
orientação de peixes vem de experimentos que envolvem tarefas de associação entre
sinais do ambiente e localização de recompensas (RODRÍGUEZ ET AL., 1994, 2002;
PORTAVELLA ET AL., 2002; BROGLIO ET AL., 2003; VARGAS ET AL., 2004;
SALAS ET AL., 2006; SOVRANO ET AL., 2007; KARNIK E GERLAI, 2012). Sabe-
se que peixes aprendem e também se recordam de rotas e localizações específicas pelo
uso de informações provenientes de diferentes fontes, como marcos ambientais,
compasso solar e imitação de coespecíficos (ODLING-SMEE E BRAITHWAITE,
2003). No entanto, a navegação em ambiente sem quaisquer dicas externas requer
orientação baseada exclusivamente em mapas mentais, podendo ser afetada pela ação de
drogas de abuso.
O peixe Betta splendens, nativo de campos de arrozais, regatos e pequenos lagos
do Sudeste Asiático, requer localização espacial elaborada para navegação e
reconhecimento de áreas onde pode encontrar alimentos, coespecíficos (oponentes e
parceiros sexuais) e predadores (GIANNECCHINI, 2010). Tais características
48
ambientais, ecológicas e sociais parecem ter favorecido a seleção de habilidades
espaciais elaboradas nesta espécie. Portanto, objetivamos testar (1) se o álcool é capaz
de provocar adição no peixe Betta splendens e (2) como diferentes concentrações
interferem no aprendizado espacial, com o objetivo de compreender melhor os efeitos
do álcool sobre o desempenho espacial do peixe, em dois paradigmas envolvendo
memória e aprendizagem (preferência condicionada por local e labirinto sem dicas
ambientais).
2. Metodologia
No presente estudo foram utilizados peixes da espécie Betta splendens, obtidos no
comercio local, e mantidos em aquários de estocagem (50x40x30cm, 50 L; 1 peixe por
litro) no Laboratório de Peixes Ornamentais do Departamento de Fisiologia da UFRN,
Natal, Brasil. A água destes aquários foi mantida com temperatura de ± 26°C, e
oxigenação constante, havendo troca de 30% a cada 10 dias. O fotoperíodo foi ajustado
em 12L:12E. Os animais foram alimentados diariamente ad libitum com ração
comercial peletizada (38% proteína e 4% lipídeo, Nutricom Pet). Somente betas fêmeas
adultas foram utilizadas, pois são menos agressivas e exploram mais o ambiente na
ausência do macho (GIANNECCHINI, 2010).
2.1. Preferência Condicionada por Local
Foi avaliada a preferência ambiental e a possibilidade de mudança na
preferência decorrente da submissão à diferentes doses de álcool.
O aquário teste (shuttle box) consistia em uma arena (40x25x20cm) dividida ao
meio por uma placa opaca com abertura inferior (2cm), que permitia ao peixe acesso
aos dois lados. O fundo de cada lado foi diferenciado em branco ou xadrez (2x2 cm),
conforme figura 1 abaixo.
49
Figura 1. Desenho esquemático do aquário tipo shuttle box.
Fonte: Autoria própria.
Cada peixe foi colocado aleatoreamente em um dos lados do shuttle box e após 2
minutos de habituação, filmado por 5 min para verificação da preferência inicial por um
dos lados. Para isso, registramos o tempo de permanência do animal em cada lado, e
consideramos preferido o lado onde o peixe permaneceu mais de 55% do tempo total.
Passadas 24h do teste de preferência, cada animal foi individualmente alcoolizado
por 20 min no lado não preferido. Quatro doses de álcool etílico (P.A. 99,5%) foram
utilizadas: 0,1% (n=9); 0,25% (n=8); 1,0% (n=10) e 1,5% (n=10). Estas doses foram
baseadas em estudos prévios com peixes (GERLAI ET AL., 2000; MATHUR ET AL.,
2011). A solução para alcoolização foi diluída em aquários com 2 litros de água
(20x20x10 cm), tendo pH de 6,6, posicionados em cada lado, dentro do shuttle box.
Em seguida, os animais foram submetidos por 20 min a água no lado preferido. O grupo
controle foi submetido a água nos dois compartimentos (n=9).
Cada animal foi novamente testado no shuttle box por 5 dias consecutivos, após a
alcoolização. Neste teste, os animais foram filmados, individualmente, por 5 minutos e
as filmagens analisadas no programa ANY-maze™ Video Tracking System, que
calculou o tempo do animal em cada compartimento do aquário, com o objetivo de
observar se houve mudança na preferência inicial para o lado no qual os animais
experimentaram álcool.
Para as análises estáticas foram utilizados Teste de Anova ou Kruskal-Wallis,
dependendo da homogeneidade e homocedasticidade dos dados, seguido de teste de
Student Newman-Kuels. Foi comparado o tempo de permanência nos lados do shuttle
box ao longo dos dias e entre os grupos experimentais. Em todos os casos, foi usado
como valor de referência = 0,05.
50
2.2. Aprendizagem espacial
Foi avaliada a influencia de diferentes doses de álcool na aprendizagem espacial do
peixe beta. Para isto, utilizamos um labirinto sem dicas ambientais, feito em plástico
tipo PVC, com saída somente em um dos braços, conforme figura 2 abaixo. Este aparato
foi disposto dentro de um aquário (50x50x30 cm), envolto por tecido preto para evitar
interferências externas.
Figura 2. Desenho esquemático do labirinto utilizado nesse estudo. * é o local onde o peixe foi colocado
inicialmente e apenas um dos lados foi usado como saída (lado aberto). Após alcançar a saída do labirinto
o peixe recebia recompensa (artêmia).
Fonte: Autoria própria.
Foram testadas quatro concentrações de álcool etílico (P.A. 99,5%): 0,1%; 0,25%,
1,0% e 1,5% mais o grupo controle (0%). Os animais foram imersos individualmente
nessas concentrações preparadas em aquários (20x20x10 cm) contendo 2L de água, por
20 min no período vespertino; com exceção do grupo controle (0%), que sofreu
manipulação nas mesmas condições, porém submetido a apenas água.
A alcoolização ou manipulação dos peixes foi realizada em 3 diferentes
tratamentos: 1. tratamento agudo, 2. tratamento crônico e 3. tratamento abstinência. No
tratamento agudo, os animais (n=12) foram testados logo após a alcoolização (ou
manipulação), de forma que sempre estavam sob ação do nível alcoólico do respectivo
grupo experimental. No tratamento crônico, os animais (n=12) foram previamente
alcoolizados por 15 dias consecutivos e então teve início a fase experimental. Neste
período, os animais continuaram sendo expostos ao álcool sempre em intervalo de
tempo de no mínimo duas horas antes de iniciarem a tarefa no labirinto, para garantir
que os animais não estivessem alcoolizados durante os testes. Já no tratamento
abstinência, os animais (n=12) foram previamente tratados com álcool por 15 dias
consecutivos, permaneceram 2 dias sem receber álcool, tempo de início do período de
51
abstinência, e a tarefa de aprendizagem foi conduzida na sequência, por 5 dias durante
os quais os animais não foram alcoolizados.
No teste de aprendizagem, os animais foram posicionados individualmente no
início do labirinto e o tempo para saída registrado. Os animais não foram alimentados
por 2 dias antes de iniciarem a fase de teste e durante os 5 dias de experimento
receberam apenas 1 artêmia (Artemia salina) como recompensa ao sair do labirinto. Não
houve oferta de outro alimento durante este período.
Paralelamente aos testes de aprendizagem, verificamos se o álcool interfere na
locomoção dos peixes, influenciando seu desempenho no labirinto. Dez betas foram
alcoolizadas por 20 min em cada concentração de álcool (0; 0,1; 0,25; 1,0 e 1,5%),
colocadas, individualmente, em aquário (40x25x20cm, 15L) para registro da velocidade
média e máxima por 10 min. Os dados foram analisados no programa ANY-maze™
Video Tracking System.
O desempenho dos animais ao longo dos dias de teste foi comparado usando RM
Anova ou teste de Friedman, dependendo da normalidade e homocedasticidade dos
dados. O desempenho dos animais de diferentes tratamentos foi comparado através de
Anova ou Kruskal-wallis, de modo a demonstrar diferenças no tempo de saída do
labirinto. O tempo total para saída do labirinto (soma do tempo nos 5 dias), a velocidade
média e máxima foram comparados entre os grupos através do Teste Anova/Kruskal-
Wallis. Em todos os casos foi usado como valor de referência p ≤ 0,05.
3. Resultados
3.1. Potencial aditivo do álcool
O álcool alterou a preferência inicial dos animais de forma dose-dependente,
como observado na Figura 3. Observamos que 25 animais do tratamento agudo
preferiram inicialmente o lado branco da shuttle box, enquanto 21 animais preferiram o
lado quadriculado O grupo controle (0%) não modificou sua preferência ao longo do
teste (Friedman, x2=10,3 p=0,068). Animais submetidos a 0,1% tiveram mudança na
preferência inicial, porém não houve diferença nos outros dias (RM Anova, F=3,0
52
p=0,02; fig. 3). Sob 0,25% de álcool, os animais mantiveram sua preferência inicial
(RM Anova, F=2,3 p=0,066). Animais que receberam álcool nas concentrações 1,0 e
1,5% alteraram completamente suas preferências permanecendo durante os 5 dias pós-
álcool no compartimento não preferido inicialmente (1,0%: Friedman, x2 =15,9
p=0,007; 1,5%: Anova, F=15,6 p<0,001).
Figura 3. Tempo de permanência (%) no lado não-preferido em um shuttle box (branco X xadrez) antes e
depois da alcoolização neste ambiente. As barras indicam a porcentagem média de tempo no ambiente ±
dp. O teste inicial indica o tempo no ambiente não preferido (menos de 55% do tempo total, indicado pela
linha tracejada). Os dados dos dias 1 a 5 representam o tempo dispendido pelo peixe no compartimento
onde foi alcoolizado nas concentrações 0% (controle, n=9), 0,1% (n=9), 0,25% (n=8), 1% (n=10) e 1,5%
(n=10). Letra b minúscula indica diferença estatística no dia 3 em relação à preferência inicial para o
grupo 0,1%; * indicam diferença estatística da preferência inicial em relação aos demais dias de
exposição para os grupos 1% e 1,50% (RM Anova p<0,05).
Fonte: Autoria própria.
3.2. Aprendizagem espacial
O peixe B. splendens submetido ao tratamento agudo (concentrações: 0%, 0,1%,
0,25%, 1% e 1,5%) apresenta aprendizagem espacial, diminuindo o tempo de saída do
labirinto ao longo dos dias (RM Anova, p<0,05). O grupo controle (0%) mostrou
diminuição significativa no tempo para saída do labirinto no 3º dia de teste, e manteve
este desempenho até o final (Friedman, x2=23,1 p=0,001; Fig. 4a). O grupo de dose
baixa de álcool (0,1%) também reduziu significativamente o tempo de saída no 3º dia de
teste, e novamente no 5º dia (Friedman, x2=35,4 p=0,001; Fig. 4a). O desempenho dos
grupos de dose média e alta (0,25% e 1%) melhorou a partir do 3º dia e permaneceu
igual até o último dia (Friedman, 0,25%: x2=15,0 p=0,005; 1%: x
2=30,1 p<0,001; Fig.
0
25
50
75
100
teste inicial dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5
Preferência após exposição aguda
Tem
po
no
lad
o n
ão-p
refe
rid
o (
%)
0% 0,10% 0,25% 1% 1,50%
b
* *
53
4a). Já o grupo de dose mais alta (1,5%) apresentou melhora do tempo de saída no 3º
dia e novamente no 5º dia de teste (Friedman, x2=29,7 p<0,001; Fig. 4a). A comparação
do desempenho dos animais no mesmo dia de teste indica que houve diferença
significativa entre os grupos nos dias 1 (Kruskal-Wallis, H=19,6 p<0,001) e 3 (Kruskal-
Wallis, H=17,3 p=0,002), porém todos os animais apresentaram desempenho
semelhante no 5º dia de teste de aprendizagem espacial (Kruskal-Wallis, H=7,7
p=0,102; Fig.4a).
Os animais submetidos ao tratamento crônico apresentaram aprendizagem
significativa, melhorando o desempenho na tarefa a partir do 3º dia de teste (0%: RM
Anova, F= 63,6 p=0,001; 0,25%: Friedman, x2 = 15,2 p=0,001; 1,0%: RM Anova,
F=5,5 p=0,013; 1,5%: RM Anova, F=26,6 p=0,001; Figura 4b.). O grupo submetido a
0,1% de álcool diminuiu o tempo de saída novamente no 5º dia, sendo o grupo mais
rápido em alcançar a saída do labirinto (RM Anova, F=16,2 p=0,001; Fig. 4b). Houve
diferença de desempenho na tarefa entre os grupos nos dias 1(Anova, F=3,3 p=0,02) e 5
(Anova, F=4,1 p=0,006), mas não no 3º dia (Anova F=2,17 p=0,084).
Os animais testados durante o período de abstinência de álcool mostraram
aprendizagem da tarefa espacial no 3º dia de teste e mantiveram o mesmo desempenho
até o final dos testes experimentais, em todas as concentrações de álcool testadas (0%:
Friedman, x2=16,8 p=0,002; 0,1%: RM Anova, F=8,9 p<0,001; 0,25%: Friedman,
x2=31,7 p<0,001; 1%: RM Anova, F=4,4 p=0,005; 1,5%: Friedman, x
2=29,7 p<0,001;
Fig. 4c). Houve diferença entre o desempenho dos animais em abstinência de diferentes
doses no 5º dia de teste, sendo o grupo em abstinência de 1% de álcool o mais
demorado em cumprir a tarefa (Kruskal-Wallis, H=18,0 p=0,001; Fig. 4c).
54
Figura 4. Tempo de saída do labirinto sem dicas ambientais (teste de aprendizagem espacial) do peixe
Betta splendens sob ação de álcool. Os animais foram submetidos a diferentes concentrações de álcool (0,
0,1, 0,25, 1 e 1,5%) em três tratamentos. a) Tratamento agudo: submissão única por 20 min (n=12); b)
Tratamento crônico: submissão por 15 dias antes e durante os testes experimentais, 20 min por dia
(n=12); c) Tratamento abstinência: submissão por 15 antes dos testes experimentais, 20 mim por dia
(n=12). As barras mostram a média de tempo para saída do labirinto nos dias 1, 3 e 5 do treinamento de 5
dias. Os dias 2 e 4 foram ocultados. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa nos
tempos do mesmo grupo ao longo dos dias (Friedman Anova, p<0,05). Letras maiúsculas diferentes e *
indicam diferenças significativas entres as concentrações alcoólicas no mesmo dia de teste (Anova,
p<0,05). d) Tempo total: soma do tempo que o animal permaneceu dentro do labirinto por 5 dias
consecutivos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística dos tratamentos na mesma
concentração de álcool e letras maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre as
concentrações no mesmo tratamento.
Fonte: Autoria própria.
O tempo total dos animais nos 5 dias de teste é mostrado na figura 4d. Houve
diferença significativa entre os grupos nos tratamentos agudo e crônico (Agudo:
Kruskal-Wallis, H=33,2 p<0,001; Crônico: RM Anova, F=6,68 p<0,001), mas não no
tratamento abstinência (Kruskal-Wallis, H=3,3 p=0,494). A comparação entre os
tratamentos na mesma dosagem indicou diferenças entre os tratamentos crônico e
abstinência nas concentrações 0,1% (Anova, F=3,38 p=0,03) e 0,25% (Anova, F=4,15
p=0,03); e diferenças entre o tratamento agudo e os demais nas concentrações 1,0%
(Kruskal-Wallis, H=17,6 p=0,001) e 1,5% (Anova, F=7,78 p=0,002).
0
5
10
15
20
25
30
0% 0,10% 0,25% 1,00% 1,50%
Tem
po
(min
)
a
a)
A
A A
B
B
*
b b b b b c b a a a a b b c 0
5
10
15
20
25
30
0% 0,10% 0,25% 1,00% 1,50%
AB
b)
A AB AB
B
AB A AB AB
B
a a a a a b b b b b b b b b c
0
5
10
15
20
25
30
0% 0,10% 0,25% 1,00% 1,50%
Tem
po
(min
)
Concentração alcoólica
a a a a a b b b b b b b b b
c)
*
b b 0
20
40
60
80
0% 0,1% 0,25% 1,0% 1,5%
Concentração alcoólica
agudo crônico abstinência
A
B B
A
A
B A A
A A
ab a b ab a b a b b a b b
d)
55
A alcoolização não alterou a atividade natatória dos animais experimentais. A
velocidade média dos grupos foi 0%: 0,01±0,002 m/s; 0,1%: 0,01±0,005 m/s; 0,25%:
0,02±0,014 m/s; 1%: 0,01±0,004 m/s; 1,5%: 0,01±0,004 m/s. Não houve diferença
significativa da velocidade média entre os grupos (Kruskal-Wallis, H=7,2 p=0,12). A
velocidade máxima dos grupos foi 0%: 0,29±0,08 m/s; 0,1%: 0,24±0,17 m/s; 0,25%:
0,35±0,4 m/s; 1%: 0,21±0,07 m/s; 1,5%: 0,27±0,3 m/s. Não houve diferença
significativa na velocidade máxima entre os grupos (Kruskal-Wallis, H=6,3 p=0,17).
4. Discussão
Nós observamos que o peixe Betta splendens apresenta aprendizagem espacial em
labirinto sem dicas ambientais, em todas as condições experimentais, porém o
desempenho foi significativamente melhor sob ação de dose baixa de álcool (0,1%).
Doses agudas elevadas (1,0 e 1,5%) foram prejudiciais, mas em uso crônico provocaram
desempenho semelhante à abstinência. Além disso, observamos que apenas as doses
elevadas de álcool geraram adição neste peixe.
Peixes são capazes de aprender relações espacias complexas, como observado em
nosso trabalho. De fato, outros estudos já relataram que o peixe dourado (Carassius
auratus) é capaz de lembrar da posição espacial de três diferentes sítios de alimentação
distribuídos em uma arena (PITCHER E MARGURAN, 1983), o peixe paulistinha
(Danio rerio) utiliza pistas visuais do ambiente para orientação em tarefas de
aprendizagem espacial (KARNIK E GERLAI, 2012) e o peixe beta apresenta
localização espacial significativa em labirinto radial de oito braços (ROITBLAT ET
AL., 1982). Desta forma, nosso estudo corrobora o fato de que peixes usam a
localização espacial para navegar no meio, porém mostramos que mesmo sem dicas
ambientais os animais podem se localizar. A tarefa espacial utilizada em nosso
experimento requer que o animal recorde-se onde estava localizada a saída do labirinto,
tarefa possível pela formação de um mapa mental representativo do ambiente; o que
difere de uma aprendizagem procedural, em que o comportamento já se mostra
automático graças à repetição de um procedimento motor (BULLEMER ET AL., 1989).
A estratégia utilizada por diversas espécies para orientação em labirintos com
pouco ou nenhum marco ambiental parece ser a construção de mapas cognitivos mentais
(NEWMAN ET AL., 2007). Em amniotas, o hipocampo é a prinicpal região cerebral
56
reponsável por fornecer aos animais um mapa espacial do meio ambiente (O’KEEFE E
DOSTROVSKY, 1971), construído a partir de referências ambientais e da memória
para processar informações sobre localização espacial e orientação (LIU E BILKEY,
2001). Macacos e ratos com lesões nesta área apresentam dificuldades de discriminação
espacial e associação entre objeto e lugar (MORRIS ET AL., 1982; SAVE ET AL.,
1992; SQUIRE, 1992; HOLLUP ET AL., 2001; MUNBY ET AL., 2002). Em humanos,
danos no hipocampo prejudicam o aprendizado e memória espacial e inabilitam a
capacidade de navegação (MORRIS ET AL., 1982; SQUIRE, 1992; HERMANN ET
AL., 1995; ABRAHAMMS ET. AL., 1997, 1999; KESSELS ET AL., 2001, 2004).
Em peixes teleósteos, o telencefalo parece ser a região responsável pela memória
espacial, principalmente aquela relacionada à formação de mapas mentais
(NIEUWENHUYS E MEEK, 1990; BRAFORD, 1995; NORTHCUTT, 1995; LÓPES
ET AL., 2000; BROGLIO ET AL., 2003). López et al. (2000) observaram que peixes
dourados com ablação telencefálica tem prejuízo em tarefas de orientação que requerem
formação de mapas mentais, mas não em tarefas de associação espacial com dicas
ambientais, sugerindo que a utilização de marcos do ambiente deve requerer outras
áreas encefálicas além do telencéfalo.
Em nosso estudo, a utilização de doses altas de álcool (de forma aguda ou
crônica) prejudica o desempenho dos animais, o que corrobora estudos indicativos de
que o álcool afeta a capacidade de formação de mapas mentais, proposto por Mathews
et al. (1995). O trabalho de Hoffman e Mathews (2001) demonstra que a administração
aguda de álcool em ratos induz maior prejuízo de memória espacial mediada pelo
hipocampo do que outros tipos de memórias mediadas por outras regiões.
Embora animais sob ação aguda de 1,5% de álcool tenham melhorado o
desempenho no labirinto no 3º e 5º dias, esta resposta deve estar mais associada aos
efeitos nocivos do álcool no 1º dia de teste (causando dificuldade de navegação) do que
a aprendizagem, como observado nos animais submetidos a 0,1% de álcool. Uma
hipótese seria que o álcool afeta a locomoção, e, portanto, sob ação de 1 e 1,5%, o
animal estivesse mais lento para completar a tarefa. Esta hipótese é rejeitada pelo estudo
da velocidade média e máxima, pois não houve diferença significativa de locomoção
entre os grupos. Portanto, as doses de álcool estudadas parecem agir em áreas
relacionadas à cognição mais do que em áreas motoras.
57
A administração crônica de álcool promoveu diferenças de aprendizagem entre as
concentrações 0,1 e 1,5%. O desempenho dos outros grupos pode estar relacionado à
tolerância que o animal desenvolve à droga, já que a aprendizagem foi efetiva para
todas as doses. Este resultado é concordante com o estudo de Boulouard et al. (2002),
mostrando que a administração crônica produz tolerância aos efeitos adversos do uso
agudo de álcool em ratos. Estes autores sugerem que a melhora de desempenho em
labirinto deve estar associada a mudanças neuroquímicas induzidas pela tolerância ao
álcool no hipocampo, como alterações nos receptores NMDA e GABAA
(BOULOUARD ET AL., 2002). Em peixes, estes mesmos receptores, presentes no
telencéfalo, participam da formação de memória (KARNIK E GERLAI, 2012), sendo
este o mecanismo sugerido para os resultados de aprendizagem do peixe B. splendens
em tratamento crônico.
No entanto, uma explicação alternativa pode ter sido o tempo insuficiente de
alcoolização. Usamos neste estudo 20 min diários, tempo comumente usado para o
peixe paulistinha (GERLAI ET AL., 2000; BUSKE E GERLAI, 2011). Mas, pelo fato
do peixe B. splendens ter tamanho maior, uma possibilidade é que o animal não tenha
sido eficazmente alcoolizado, sendo necessário período prolongado de alcoolização.
Assim, estudos futuros devem abordar esta questão e investigar o nível de álcool
sanguíneo atingido pelo animal a fim de se estabelecer qual dosagem trás efeitos
prejudiciais para a aprendizagem.
Neste estudo, obsevamos que abstinência de 7 dias não interferiu na capacidade de
aprendizagem espacial dos peixes, sendo semelhante ao desempenho do controle. É
provável que o peixe B. splendens apresente tolerância ao álcool e a recuperação da
alcoolização seja mais eficiente do que em outros animais. Há relatos de que os
malefícios causados pelo uso abusivo do álcool em altas doses possam ser revertidos
com a suspensão de seu uso (LARANJEIRA ET AL., 2000). Contudo, as alterações
encefálicas depois do uso prolongado de álcool ainda necessitam de maiores
investigações, enfocando tempo de uso da droga e período de abstinência.
Por outro lado, nossos resultados mostram que doses baixas melhoram o
desempenho no labirinto tanto no tratamento agudo quanto crônico, mas não em
abstinência. Em baixas doses, o álcool pode causar estado excitatório em conjunto com
efeito ansiolítico (GERLAI ET AL., 2000; MATHUR E GUO, 2005). Já que a
58
locomoção não foi alterada pela dose baixa, consequentemente a resposta de
aprendizagem dose-dependente parece estar associada unicamente ao efeito do álcool na
região responsável pela orientação espacial (teléncefalo do peixe).
Além do efeito benéfico da droga em baixa concentração, verificamos que esta
dosagem não gera adição no peixe, enquanto as doses altas provocaram efeito aditivo.
Assim, entendemos que existe um limiar de utilização alcoólica a partir do qual a adição
é instalada no sistema nervoso. Thompson et al. (2012) mediram o risco para
desenvolver dependência em adolescentes e encontraram uma relação linear crescente
entre adição e quantidade de álcool ingerido em um único episódio. Nosso resultado é
consistente com o estudo de Brennan et al. (2011) usando apenas a dose 1% aguda e
crônica e Mathur et al.. (2011) usando 1 e 1,5% somente em exposição aguda, ambos
com peixe paulistinha. Estes autores propõem que apenas uma exposição a doses
elevadas é suficiente para causar adição, que permanece até 4 semanas após
alcoolização. Provavelmente isto ocorre porque modifica padrões secretórios da via
dopaminérgica, o que parece não ocorrer no uso de doses baixas (O’BRIEN E
GARDNER, 2005).
Em conclusão, nosso estudo indica que o peixe beta é capaz de se orientar através
da formação de mapa mental do ambiente, e corrobora o fato que o álcool interfere
positivamente ou negativamente na aprendizagem, dependendo da dose experimentada:
doses baixas de álcool podem favorecer o desempenho em tarefas de aprendizagem
espacial, sem causar problemas de adição, enquanto que doses elevadas prejudicam a
aprendizagem e causam dependência. Parafraseando Paracelso (médico e físico do séc.
XVI): “a diferença entre um remédio e um veneno esta só na dosagem”.
59
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64
6. CONCLUSÕES GERAIS
Os principais tópicos e resultados encontrados neste trabalho de Mestrado estão
resumidos abaixo:
a. Testamos o desempenho do peixe paulistinha (Danio rerio) em tarefa de
condicionamento associativo (Pavloviano) após tratamento crônico e em
abstinência da droga, e observamos que o álcool foi capaz de causar alterações
no desempenho de aprendizagem associativa do peixe paulistinha, porém essa
alteração foi dependente da dose experimentada (dose dependente). Os animais
submetidos a concentração baixa de álcool (0,1%) apresentaram o desempenho
melhor do que o grupo controle; e aqueles que receberam doses elevadas (0,25 e
1%) apresentaram prejuízos de aprendizagem na tarefa.
b. Testamos o desempenho do peixe beta (Betta splendens) em teste de
aprendizagem espacial sob administração aguda, crônica e em abstinência de
diferentes dosagens de álcool. Observamos que o álcool pode alterar o
desempenho de aprendizagem espacial do peixe, porém essa alteração foi
dependente da dose. Animais submetidos à concentração baixa de álcool no
tratamento crônico e agudo alcançaram a saída do labirinto mais rapidamente do
que o grupo controle. Enquanto os animais submetidos a concentrações elevadas
de álcool nos dois tratamentos apresentaram prejuízos de aprendizagem espacial
no labirinto.
c. Estudamos o potencial aditivo de diferentes concentrações de álcool oferecidas
de forma aguda e crônica para os peixes paulistinha e beta. Observamos que o
álcool foi capaz de causar dependencia no peixe paulistinha e no peixe beta,
entretanto o grau de adição causado é dependente da dose. A concentração mais
baixa de álcool não foi capaz de produzir adição nos animais, mesmo com o uso
crônico, enquanto a concentração mais elevada causa dependencia severa nos
animais.
65
d. Os artigos presentes nesta dissertação de mestrado serão submetidos a
publicação em revistas internacionais.
66
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