ajo sobre candida

5/10/2018 ajo sobre candida

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FREDDY DANIEL PEREZ GARCIA

\'1EfECTO INHIBITORIO DE UN EXTRACTOACUOSO DE AlO SOBRE El CRECIMIENTO IN VITRO

DE CANDIDA ALBICANS/'

UN IVERS IDAD FRANC ISCO MARROQU INFACULTAD DE ODONTOLOG IA

Guatemala 2002


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Guatemala, 23 de Septiembre del 2001... . . . .

. .Junta DirectivaFacultad de OdontologlaUniversidad Francisco MarroquInPresente.

Respetable Junta Directiva:

Por medio de la presente establezco que la tesis "Efecto Inhibitoriode un Extracto Acuoso de Aio Sobre el Crecimiento In VitrodeCandida Albicans", desarrollada por el bachiller Freddy Daniel PerezGarcIa, cum pie con todos los requisitos necesarios de aceptacion por partede la universidad. Esto 1 0 establezco como asesor de dicho trabajo.

Agradeciendo su fina colaboraclon, se despide su servidor.

Atentamente,


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UNNERSID AD FRANC IS CO MARROQUINFACULTAD DE ODONTOLOG IA

ESTA TES IS FUE ELABO RADA PO R EL AU TO R PARA O BTENER ELTITULO DE C IRUJANO DENTISTA EN EL G RAD O DE LICENCIADO "

GUA TEMA LA , OCTUBRE DEL 2001.


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UNIV ERSID AD FRANCISCO MARROQU INFACUL TAD DE ODONTOLOG IA9648-02

Guatemala,19 de rnarzo dol 2,002

La Facultad de Odontologia de la Universidad Francisco Marroquin,autoriza la publicaci6n de Tesis "EFECTO INHIDITORIO DE UNEXTRACTOACUOSODE AJO SOBRE EL CRECIMIENTOIN VITRO DECANDIDAALBICANS",presentado por el Sr. Freddy Daniel PerezGarcia, previo a obtener el grado acadernico de Ciruiano Dentists en.el Grado de Licenciado.

Atentamente,

AHE/kmccc. Consejo Academico

6a. Calle 711 Zona 10.Guatemala. C.A. TelcHonos (502) 361 2291 /331 0360.Fax (502)361 2281. e-mail: odontologla @ ufm.edu.gt.


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DEDICATORIA

A Dios, por ser la luz que ilum ina e l sendero de m i vida.A m is padres, Luis E duardo P erez y O lga Jud ith de P erez , com orecompensade sus multip le s s acrificios e n pro de m i s upe rac ion,A m is herm anos, Luis E duardo y A na Lucia, por ser tan especiales yb rin da rme s iempre su in co nd ic io na l a po yo .A m i novia, C laudia G om ez por su ardua colaboracion y apoyo.A m is c ate dra ticos , c ornpafie ros y amigos , p or e star s iemp re ce rca.


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AGRADECIMIENTO

A I D r. Juan C arlos L lare na, por e l tie mpo de dicado a la elaboracion ya se so rfa d e e sta te sis .A I L ie . A rm ando C ace re s y lab orato rio clinico d el D ep artam ento d eC ito histo io gfa , F ac ulta d d e F armacia , U nive rsid ad San Carlo s d e Guatemalapor su quia en la elaboracion de la fase cientffica de ' e sta tesis.A todos m is catedraticos, por brindarm e la m ejor educacion y e l m ejore jemp lo d e e tica p ro fe sio na l.


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IN DICE':

P21g",I. INTRODUCCION 1

II. P LA NT EAM IE NTO DEL PROB LEMA 2III. F UNDAMENTOSTEOR ICOSA . H is to ria 3B . Taxonomfa 4C. Or igen Descnpclon y cultivo 4D . Quimlca de l A jo 5E . E squem a de accion de l A jo 7F . Usos Med ic inale s A trib uidos 8G. Fa rmacolog fa 8H . C an dida A lbica ns 91. Mor fo log fa e Identifi cac i6n 9J. Patoqenia y Patologfa 10K . Da tos C lfn ic os 10L . P ruebas D laqnos tic as de Laborato rio 11M. Inmunidad 12

N. Ep idemio log fa y Control 13O. C la sific ac ion de Cand idos is 13P . D ia gnos tico d e Candid os is O ra l 14Q. Dlaqnostrcc de Labo ra to rio 15R. Tra tamiento 16

V I. M E TODOLOG IAA . Obje tivo s 19B . H ip ote sls 19;:: C. Variables 19D . D efinicion de V aria ble s 2 0E . E scala de M e dicion 2 1 .F . Ma te ria le s y Metodos 2 1 .G . D is efio d e In ve stiq ac io n 2 ' " ' 1..H . R ecurso s 2 4I. Mater iales 2 4


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J. Procedi miento 25K . Analisis Estadistico 30

:: V . RESULTADOS 32,V I. DISCUSION DE RESULTADOS 37

V II. CONCLUS IONES 39,V III. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 40

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I. INTRODUCCIONEI tratarniento de enfermedades a traves de plantas es tan antiguo

como la propia historia del hombre y dio origen a la medicina actual.Muchos medicamentos indispensables tienen principios actives extraidos deplantas. De la amapola, por ejemplo, se extrae la morfina para laproduccion de sedantes.[5]

EI uso de corticosteroides, antibioticos de amplio espectro y droqascitotoxlcas ha incrementado el nurnero absoluto de infecciones funqicas,por diversos qeneros de hongos del tipo levadura, en humanos. Miernbrosdel qenero Candida han sido reconocidos como los oportunistas funqlcosmas frecuentes.[18,25]

Los hongos de tipo levadura son resistentes a la gran mayori'a deagentes antibacterianos y hay pocos agentes antirnlcoticos utiles en eltratamiento de enfermedades causadas por hongos. Adernas, estos ultimosson poco efectivos y bastante caros. Existe la necesidad de crear unavariedad de compuestos antimlcotlcos que sean mas efectivos y rnenostoxlcos.Hs]

EI Allium Sativum (ajo) ha sido utilizado como una medicina populardesde tiempos ancestrales para una variedad de malestares que incluyen:mordeduras de culebras, hemorroides, reumatismo, dolores abdominales einfecciones parasitarias. El ajo se utiliza hoy en d ia en varios palses paratratar varias enfermedades. Se Ie han atribuido propiedades medicinales,antibacterianas, antiprotozoarias y antifunqicas. Recientemente ha existidoun renovado interes en el ajo como un agente antimicotico. Kabelic hademostrado que el extracto de ajo es mas efectivo contra honqospatoqenlcos, especialmente la Candida Albicans, que la Nistatina, Violetade Genciana 0 Azul de Metileno.[18]

Como la aplicaclon de este extracto ha sido poco investigada hastahoy, el estudio de este materia! promete suministrar resultados utiles parala ciencia.[5]


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II. PLANTEAM IENTO DEL PROBLEM A

En la rama de la farmacologfa y el campo de la investlqaoonexperimental las plantas han despertado un amplio lnteres en la obtencionde compuestos antirnlcotlcos efectivos. Estudios recientes han demostradoque el ajo muestra un ampllo espectro de actividad contra hongoszoopatoqenlcos y muchas cepas de levaduras incluyendo CandidaAlbicans.[7,24,10]

Esto es importante en el campo de la Odontologla, puesto que CandidaAlbicans es un microorganismo que habita cornunmente en la cavidadbucal, y que bajo ciertas condiciones produce una de las enfermedadesinfecciosas oportunistas de mayor frecuencia en el mundo.[18,25]

Los estudios realizados sobre el ajo han permitido conocer lacornposiclon qufmica y su componente activo que es un cornpuestoazufrado conocido como alicina. Los investigadores han demostrado lasensibilidad de la C Albicans a extractos acuosos de ajo, masespedficamente al compuesto alicina.[12]

Esto permite la realizaci6n de este estudio, para establecer si el ajocomo extracto acuoso, a una concentracion de Imq/rnl, posee un efectoinhibitorio sobre el crecimiento in vitro de Candida Albicans.

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III. fUNDAMENTOS TEORICOSA. Hlstorla

La humanidad desde los tiempos de las dinastfas egipcias (40 siglosA.C.) se dividio en dos grupos: quienes gustaban de la ingesta del ajo yquienes loaborredan. Entre los primeros se incluyen a los faraones deEgipto a quienes enterraban con ceramlcas y tallas de madera, junto abulbos de ajos y cebollas para asegurar que sus comidas de ultraturnbaestuvieran bien sazonadas; los judios que deambularon 40 afios por eldesierto de Sinal afiorando "el pescado que tan abundantemente quecomfamos en Egipto y las calabazas y melones y los puerros, ajo ycebollas". Tarnblen se menciona a Sidney Smith, el ensayista de~ siglopasado quien reconoce al ajo como fuente de salud.[S]

En el grupo de los que aborrecen el ajo se menciona a los sacerdotesegipcios, quienes sequn Plutarco afirman que "no es bueno para 1 1 0 5 eliasde ayuno ni para las celebraciones festivas, ya que produce sed". Tarnblenhabrfa que mencionar a los griegos, que consideraban vulgar el olor del ajoy prohibfan a los que 1 0 cornian asistir a los cultos en el templo deCibeles.[S]

EI Codex Ebers, un papiro medico egipcio de alrededor de 1550 A.C.,contiene mas de 800 formulas terapeuticas, de las que 22 mencionan alajo como tratamiento eficaz en varias afecciones tales como cefalea,problemas cardfacos y del parto, debilidad y tumores. [7,2] Ademas delos egipcios, Artstoteles, Hlpocrates, Arlstofanes, Plinio, el Viejo (naturalistaromano), Dioscorides (medico jefe de las legiones romanas en el siglo I denuestra era) recomendaron el ajo per sus efectos medicinales. [5,2] EIajo fue ampliamente utilizado en la medicina India como una leetonantiseptica para tratar ulceras y heridas infectadas. Tambien fue utilizado,con alqun exito, durante la segunda guerra mundial como un antisepticopara la prevencion de gangrena. [24,2]

Es asi, que de pueblo en pueblo, de qeneracion en generaci6n SE ~ hatransmitido el valor del ajo y con ello estimulado el estudio e investiqacionde sus propiedades.[S]


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B . Taxonomia~- Nombre Cientffico: Allium Sativum[26]Filo: Tracheophyta

Subfilo: PterosidaClase: AngiospermaeSubclase: MonocotiledoneaFamilia: Liliacea[8]Sinonimia: Ajo (Castellano)Anxa (Cakchiquel)

Axu'x (Quiche)Anx (Quekchf)Anxu'x (Tzutuhil)[ll]Knoblauch (Aleman)Ail (Frances)Garlic (Ingles)Anglio (Italiano )[26]

c . Origen, descrlpclon y cultivoOriginario de Kirgiz, Siberia y domesticado en Asia Central a partir de

A. Lingicupis Regel. Diseminado por las tribus nornadas al este y oeste, dedonde se ha cultivado y usado ampliamente en casi todas las culturesdesde hace mas de 5,000 afios, A sido cultivado en los palsesrnediterraneos, Egipto, China e India desde la mas remota antiquedad,tleqo a America a traves de Europa en el siglo XV.[7]

EI ajo es una hierba culinaria y medicinal conocida en todo el mundlocon una altura de hasta 70 ems. Sus flores son pequefias, blaneas y pocoolorosas, nacen en la parte terminal del tallo y reunidas forman unaespeeie de pequef io parasol. EI bulbo es un cuerpo oval, forrnado poralgunos gajos 0 dientes, eada uno de los euales esta constituido por unamasa eonsistente y acuosa, de olor y sabor muy fuertes.[5]

En cuanto a su cultivo, se planta por medio de los gajos al final delverano en tierra blanda y con humus. La eosecha oeurre general mente,

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despues de seis meses. La distancia entre planta y planta debe ser 0.3 par0.5 mts.[26]En Guatemala, el ajo se cultiva principal mente en las regiones de clima

templado como Aguacatim y la region del lago de Atltlan, Huehuetenanqoy 5 0 1 0 1 < 3 . [ 1 1 , 7 ]D. Quimica del ajo

Las investigaciones qufmicas realizadas a 1 0 largo de una centuria handemostrado que al cortar un bulbo de ajo, se liberan ciertas moleculesorqantcas de bajo peso molecular que contienen atornos de azufre unidosde una forma encontrada raramente en la naturaleza. Estas molecules muyreactivas se transforman espontanearnente en otros compuestos orqanicosazufrados que participan en transformaciones ulteriores.[S,19]

En un articulo de Block hace mendon a varios investigadores, quienesse dedicaron al anal isis qufmico del ajo, por ejemplo en 1884, etta alqufmico aleman Theodor Wertheim, quien centro sus estudios en el nivelmolecular de las sustancias que componen el ajo. Atribuvo el atractivo dellmismo a la presencia de un cuerpo azufrado Ifquido, el lIamado aceite deajo. Todo 1 0 que se sabe de este material se limita a unos pocos hechossobre el producto puro que se obtiene per destllacion al vapor de bulbosde Allium Sativum.[S]

Wertheim ernpleo la destilaclon del vapor para la obtencion de dichoaceite. Colcco ajos en agua hirviendo y el vapor desprendido contenfapequefias cantidades de aceite de ajo. AI destilar este aceite se obtuvieronalgunas sustancias volatiles de olor fuerte; a las cuales nornbro sulfoalilo ya las del grupo hidrocrburo les propuso el nombre de alilo (de allium).[S]

EI articulo de Block menciona que en 1892 otro investigador aleman, elqufmico F. W. Semler, apllco la destiladon al vapor de los gajos de ajo,obteniendo uno 0 dos gramos de un aceite maloliente por kilo de ajo, Esteaceite produjo a su vez disulfuro, trisulfuro y tetrasulfuro de dialilo.Ademas describe que el siguiente descubrimiento clave en la qufrnica delajo fue realizado en 1944 por Chester J. Cavallito y sus colaboradores en laempresa qufmica Starling - Winthorp en Rensselaer, New York.Descubrieron que aplicando metodos mas suaves que la desnlacion alvapor se obtenfan sustancias algo diferentes. Cavallito trato 4 kgs. die ajos

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con alcohol etilico a temperatura ambiente y obtuvo como producto finalseis gramos de aceite dotado de propiedades antibacterianas yantifunqicas. Este aceite era el disulfuro oxido de dialilo, la sustanciaprincipal aislada p~r Semler medio siglo antes. Cavallito la denomin6alicina, un liquido incoloro, qufmicamente inestable, al que se debe el olordel ajo mucho mas que a los sulfuros de dialilo. Esta registrada en dospatentes estadounidenses a nombre de Cavallito.[S]

EI aceite esencial es un liquido claro, amarillo palido, olor intense amercaptano, picante acrtdo: densidad 1.046 - 1.057. se utllizan variasformas de presentacion, como aceite, extracto, maceracion, tintura, polvo,capsula, gragea, jarabe y unquento.FZ]

Los polvos de ajo, de los cuales se ha reportado que poseen actividadantlmicotica detectada por investigaciones preliminares, se obtienen porpulvenzacion de plantas desecadas (en hornos a temperaturas por arribade los 1200 C), seguido de tamizaje y retriturado hasta obtener un polvode tamafio controlado; los micropolvos son partkulas de I-Sum. Los pelvesvegetales son faciles de manejar, formular y posterior acondicionamientoen preparados fitofarrnaceuticos (mezclado, encapsulado, cornpresion,etc.). Existen dudas acerca de la biodisponibilidad de los principios activosmedicinales extraibles naturalmente de polvos de plantas secas que setoman en capsules 0 tabletas, ya que la absorcion en esta forma esminima; en el caso de los polvos diluidos en Ifquidos 0 esparcidos enalimentos solidos es posible que la absorcion sea mayor.[7]

Si bien la alicina es la sustancia responsable del olor del ajo, un bulbode esta planta no huele 0 huele muy poco hasta cortarla 0 machacarlo. En1948 Stoll y Seebeck de laboratorios Sandoz de Basilea descubrieron que laalicina se origina en el ajo cuando una enzima inicia su formacion a partirde una molecule precursora medora. Evidentemente al cortar 0 machac:arun ajo se posibilita el contacto entre la enzima Ilamada alifnasa y elprecursor de la alicina a la que se denornlno aliina, que representaaproxlmadamente el 0.24% del peso de un bulbo tipico de ajo.[24,5,4]

La alicina es un sulfoxide neutro, peso molecular 162, IIquido blanco-amarillento, olor a ajo, densidad 1.112, fndice de rerracclorr t.Sst. solubleen agua y etanol, con actividad contra virus, bacterias, rniobacterias,levaduras y hongos. La' aliina es un sulfoxide atifatico basico, peso

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molecular 177, cristal blanco inodoro, punto de fusi6n 164 - 1660 C,soluble en agua y metanol, insoluble en etanol absoluto, es activo contrabacterias gram - positivo.[7,10]

En el ajo, por 1 0 tanto, una linasa convierte enzimatlcarnente la alifnaen alicina. Esta enzima adernas actua sobre substratos azufrado que sonsintetizados a partir del arnlnoacldo cisterna. Como producto se obtienevarios tipos de acidos sulfenlcos, siendo los subproductos de estes elpiruvato y el arnoniaco. (NH3).[5]

Un bulbo de ajo contiene: aceite volatil sulfurado (33 compuestos comodi, tri y tetrasulfuros), mudlago, esteroides (alifna, alicina), gluc6sidos(fructosanas), minerales (cinc, cobre, germanio, magnesio, selenio),fosfolfpidos, vitaminas (A, 81, C), nicotinamida, 17 arninoacidos (derivadosde cisterna, cisteinglicina) y antocianinas (gluc6sido 3 de cianidina).[7]E. Esquema de acclon del ajo

Schweitzer utiliz6 el ajo para el tratamiento de Disenterfa amebi6tica,C61eray Tifus en Africa. Por otro lado, estudios recientes han demostradoque el juga de ajo inhibe el crecimiento de bacterias del qeneroEstafi lococo/ Estreptococo. Bacillus (incluyendo B . d ysen teriae y B.enterit idis) y Vibrio (incluyendo V . Cholerae) diluido a 1: 125,000 ymuestra un amplio espectro de actividad contra hongos zoopatoqenicos ymuchas sepas de levaduras (Candid a A lb ic an s) incluyendo algunas quecausan vaginitis.[24] .

Se han hecho publicaciones en las cuales se mencionan multiplesefectos del ajo en varios sistemas del cuerpo humano, entre ellos tenemoslos siguientes:I. Accion sa bre los o ra en os d e la d ige stion :

a. Efecto bacteriostatico y antit6xico.b. Aumenta la secreci6n de acido clorhfdrico.c. Influye en la peristalsis intestinal.

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2. Accion sabre el sistema vascular y la sangre:a. Efecto cronotr6pico positive a nivel cardlaco,b. Efecto dluretico y broncolItico.c. Efecto antihipertensivo.H l]

F. Usos medlcinales atribuidosT6picamente se utilize en compresas y cataplasmas para tratar

afecciones de la piel (escr6fulas, piodermia, ulceras, tina), leucorrea,reumatismo, vaginitis, induraciones, verrugas y tumores; se aplica comoungi.iento para eliminar callosidades.[7]

Oralmente se Ie atribuye propiedad antihelmfntica, antiseptica,dleforetica, emenagoga, espasmolltica, estimulante, expectorante,hlpoqlicernlca, hipotensora, secretora, t6nica, vasodilatadora, vermffuga yvirucida. T6picamente se Ie atribuye propiedad analqesica, antiseptlcadesinfectante, rubefaciente y vesicante.[7]G. Farrnacolcqia

Pasteur mencion6 algunas propiedades medicinales y antibacterianasdel ajo en 1858; la tintura y decocci6n del bulbo tiene amplio espectro deactividad antibacteriana (gram-positivo y gram-negativo), antiviral (Herpessimplex, influenza B parainfluenza 3, estomatitis vesicular, vacdnea),antifunqica ( C. Albicans y dermatofitos) y antiprotozoario (E. histolltica, T.Yaginalis). Los extractos etan6licos y acuosos inhiben el crecimiento yrespiraci6n de Candida albicans.[7,10]

EI principio con actividad microbiana es la alifna que por acci6n de laaliinasa se convierte en alicina,[ 4] disulfuro de alilo y ajoene, que es unproducto de autocondensaci6n de alicina con actividad virucida.[7]

Se usa como terapia de soporte en el tratamiento de lepra, con francomejoramiento del cuadro cllnlco y disminuci6n del indice de bacterias. En


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los ultimos 20 aries se han publicado mas de mil trabajos sobre la qufmica,farmacologfa y apllcacion cHnica.[7]La administraci6n intravenosa de infusion con 1.5% de aceite se usa

con exito para tratar cancer de la laringe; en 4,000 residentes en China eItalia se encontr6 una baja incidencia 60% ) de cancer del estomago enpersonas que 1 0 consumieron el) su dieta diaria por mas de 20 afios, Unestudio piloto de 10 semanas con 10 pacientes con SIDA a los que seadministr6 un extracto afiejado demostr6 aumento de la actividad decelulas NK y rnejoria de la relaci6n linfocitos ayudadores / supresores y delas condiciones asociadas con la enfermedad, como diarrea, herpes genital,candidosis y pansinusitis recurrente con fiebre.[7]H. Candida Albicans

Candida Albicans es un hongo en forma de oval que produce unseudornicelio en cultivo, en los tejidos y exudados. Es miembro de la floranormal de las mucosas de los aparatos respiratorio, digestivo y genitalfemenino. En tales lugares puede ganar dominio y hallarse asociado conotras enfermedades. Algunas .veces produce enfermedad generalprogresiva en enfermos debilitados 0 con inmunosupresi6n, especialmentesi hay trastornos en la inmunidad mediada por celulas, Tarnbien puedeproducir infecci6n en la sangre, tromboflebitis, endocarditis 0 infecci6n enlos ojos y otros 6rganos cuando es introducida por via intravenosa(cateteres, agujas, hiperalimentaci6n, toxicomania, etc.).[14]I. Morfologia e ldentlflcacion

En los frotis de exudados Candida aparece como una levaduragrampositiva en gemaci6n que mide 2 a 3 x 4 a 6 urn y tambien comocelulas grampositivas alargadas en gemaci6n, semejantes a hifas(seudohifas). En agar Sabouraud incubado a temperatura ambiente, sedesarrollan colonias blandas, de color cremoso, que tienen un olor alevadura. EI desarrollo superficial consiste ,de celulas ovales enqeminacion. C. Albicans fermenta la glucosa y la maltosa, produciendoaodo y gas, genera acido de la sacarosa y no ataca la lactosa. Estasfermentaciones de los carbohidratos junto con las caracterfsticasmorfoloqicas y de las colonias distinguen a C. Albicans de otras especies de


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Candida (C krusei, C tropica/is, C seudotropica/is, C guilliermondii, etc.),las cuales tambten son en ocasiones miembros de la flora humana normaly ocasionalmente causan enfermedades en el hombre. Solo las celulas enqernadon de los cultivos de 24 horas de la C. Albicans y C. Stellatoideformaran tubos germinales en dos 0 tres horas cuando se colocan en sueroa 37 C.[14,6]J. Patogenia y patoloqia

Hlstoloqicarnente, las diversas iesiones en el hombre muestran cambiosinflamatorios. Algunos parecen abscesos, otros semejan granulomascr6nicos. Un gran numero de Candida se encuentra a veces en el aparatodigestivo despues de la administraoon bucal de antibioticos, por ejemplo,tetraciclinas, pero esto, por 10 general, no provoca sfntomas. Candidapuede ser transportada por la sangre a muchos orqanos, incluyendo lasmeninges, pero en genera! no esta capacitada para establecerse por sfmisma, y provoca abscesos miliares, excepto en un huesped muydebilitado. Pueden presentarse diseminaci6n y septicemia en enfermos conalteraciones de la inmunidad celular, por ejemplo los que estan recibiendoquimioterapia anticancerosa 0 los que padecen linfomas, SIDA u otrostrastornos.[14]K. Datos clinlcos

Entre los principales factores predisponentes a la infecci6n por C.Albicans, se encuentran los siguientes: diabetes sacarina, debilidadgeneral, inmunodeficiencia, cateterismo urinario 0 intravenoso, laadministraci6n de antibioterapia (que alteran la flora bacteriana normal) ylos corticosteroides.

La infecdon por Candida Albicans puede localizarse en distintos sitioscorporales, dentro de los que se pueden mencionar los siguientes:

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Boca: La infeccion bucal (algodoncillo) ocurre primordiaimente enlos lactantes sobre la mucosa de la boca y aparece como parchesadherentes que consisten primordialmente en seudomicelios yepitelio descamado, con s610mfnimas erosiones de la membrana.


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Genitales femeninos:. La vulvovaginitis se parece al algodoncillo,pero produce irritaci6n, prurito intense y secreci6n. La perdida delpH addo normal de la vagina predispone a la vulvovaginitis porCandida. EI pH acido es conservado normal mente por la florabacteriana residente de la vagina. La diabetes, el embarazo, laprogesterona y la antibioterapia predisponen a la enfermedad.

Pie!: La infecci6n de la piel ocurre principalmente en las parteshurnedas del cuerpo, como las axilas, pliegues interqluteos, ingle 0pliegues submamarios; es muy cornun en los individuos obesos ydiabeticos, Estas zonas se vuelven de color rojizo y exudan Ifquido,pudiendo desarrollar vesiculas.

La infecci6n por Candida de los espacios interdigitales de lasmanes se observa con frecuencia despues de la inmersi6nprolongada en agua; es muy cornun en las amas de casa, cocinerosen los manejadores de verduras y de pescado, etc.

Uiias:. La hinchaz6n enrojecida dolorosa del pliegue engular separece a la paroniquia pi6gena, puede conducir al engrosamiento y ala formaci6n de surcos transversos de la una y finalmente a laperdida de la una.

Pulmones y otros organos:. La infecci6n por Candida puede serun invasor secundario de los pulmones, rlfiones y otros 6rganosdonde alguna enfermedad previa se hallaba presente (por ejemplo,tuberculosis 0 cancer). En la leucemia no controlada y en losenfermos quirurqicos 0 con inrnunosupresion, las lesiones deCandida pueden ocurrir en muchos 6rganos. La endocarditis porCandida ocurre particularmente en los toxic6manos 0 sobre pr6tesisvalvulares. En ocasiones, se desarrolla candiduria despues desondeos urinarios, pero tiende a remitir de manera espontanea,

o Candidiasis cronies muco cutenee: En los nifios este trastornoes un signo de deficiencia de la inmunidad celular.[14]

L. Pruebas diagnosticas de labcratorlo

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Para poder Ilegar al diagnostico de una mfeccion por Candida Albicanses necesario realizar los siguientes procedimientos de laboratorio:o Muestras: Consisten en raspados 0 hisopos tallados sobre laslesiones superficiales, exudados y materiales de cateteresintravenosos que son removidos.

o Examen mtcroscopico: EI esputo, los exudados, los trombos, etc.,pueden estudiarse mediante la tincion de Gram buscando seudohifasy celulas en jjernadon. Los raspados cutaneos 0 ungulares secolocan primero en una gota de hidroxido de potasio (KOH) al10%.[14] Se pueden hacer frotes con acido pery6dico de Shiff (PAS)el cual puede ser almacenado indefinidamente.[21]

... cutttvo: Todas las muestras se cultivan en agar de Sabouraud a latemperatura ambiente y a 37C. Las colonias tiplcas son examinadasbuscando celulas y seudomicelios gemantes. la producdon declamidosporas (conidios) de C. Albicans constituye una pruebadiferencial importante; estas pueden ser producidas sobre agar-maiz-carne 0 sobre otros medios para estirnular el desarrollo deconidios.

Serologia: Un extracto de carbohidratos de Candida Albicans delgrupo A, proporciona reacciones positivas de precipitacion con lossueros de 50% de las personas normales y con 70% de las personascon candidosis mucocutanea. En la candidosis generalizada, laelevaoon del titulo de anticuerpos al hongo se puede detectar porvarias pruebas. La interpretacion de los resultados de la pruebaserol6gica aun es problernatica.

Prueba cutsnee: Una prueba cutanea con Candida casi siempre espositive en adultos normales, Por 1 0 tanto, se usa como indicador deinmunidad celular competente.[14]

M. InmunldadLos animales pueden ser inrnunizados activamente y entonces sonresistentes a la candidosis diseminada. Los sueros humanos a menudo

contienen antisueros IgG que aglutinan Candida in vitro y pueden ser

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candidiacidas, La base de la resistencia a la candidosis es compleja y no secomprende por completo.[14]N. Epidemiologia y control

La medida preventiva mas importante es evitar la interferencia en elequilibrio normal de la flora microbiana y las defensas del huesped. Lainfecclon por Candida no es transmisible ya que la mayorfa de losindividuos (600/0 de la poblaci6n) albergan al microorganismo encircunstancias normales.[14]

Se ha demostrado que este microorganismo habita cornunrnente en lacavidad oral, aparato digestivo, aparato respiratorio y vagina de personasque cllnicamente no estan afectadas. De esta manera, parece que la solapresencia del hongo no es suficiente para producir la enfermedad. Deheche debe de existir una penetracion de los tejidos, aunque tal invasionpor 1 0 regular es superficial y solo se presenta en ciertascircunstancias. [9]

Se dice que esta enfermedad es la infecci6n mas oportunista delrnundo.[14,16,22,9,23] Todas las formas de candidosis oral han sidodescritas como infecciones oportunistas en las cuales el balance de la floraoral ha cambiado para permitir el crecimiento de las levaduras, 1 0 cualconlleva a otras infecciones. Esto es cierto para todo tipo de candidosisoral, pero a menudo es diffcil identificar la condici6n exacta 'predisponente.Todas las formas de candidosis se desarrollan en un desbalance delhuesped, hongo y otra flora oral. Esta es una situacion dinarruca y debetenerse cuidado en el tratamiento para eliminar todos Tos factorespredisponentes para que el balance de la flora oral regrese a sunormalidad y as! prevenir recurrencias. [4,16]o. Clasiflcacion de candidosis

Hay diferentes clasificaciones de Candidosis oral que pueden serconfusas y son de alguna manera contradictorias, particularmente cuandonuevas formas de la enfermedad son descritas. Sin embargo, Lehnerpropuso dividir Candidosis oral inicialrnente en Candidosis por condicionesagudas y cr6nicas y despues subdividirlas como sigue:

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- Agudas: Csndidosis pseudomembranosa aguda (afta).Candidosis atr6fica aguda.- Cr6nicas: Candidosis atr6fica cr6nica.

Candidosis hiperp!iJsica cr6nica.Cendidosis mucocutenee cr6nica.[16,23]

En la actualidad existen otras condiciones que han sido propuestascomo nuevas formas de la enfermedad (ej: Cheilo - Candidosis), pero 5610son variantes de las cinco formas basicas de Candidosis. En la practica,esta simple c1asificaci6n, si es usada correctamente, deberfa formar lasbases para una terapia efectiva.[16]Pl. Diaqnostico de candidosis oral

E I diagn6stico de candidosis esta basado como en todas lasenfermedades, en una historia completa y en un examen amplio.Exarnenes suplementarios (ej: hematol6gicos) son con frecuencianecesarios y una evaluaci6n microbiol6gica es siempre obligatoria. Losfactores individuales que pueden ser presentados en la historia, son losque seran tratados luego. Una investigaci6n de la historia social delpaciente tarnbien puede ser necesaria, particularmente si se sospecha queel paciente sufre de SIDA.[16]

E I examen del paciente debe incluir tanto tejidos extra - orales comointra- orales.III Examen Extra - Oral:Es una equivocacion comun que candidosis oral sea una infecci6n

relativamente superficial. Pacientes que sufren de candidosispseudomembranosa aguda, pueden mostrar marcados signos de pirexia.En algunos casos los pacientes pueden estar severamente enfermos. Hayevidencia de especies de Candida que pueden liberar una toxina potenteque puede causar efectos sisternlcos profundos. De cualquier modo, lospacientes que estan inicialmente enferrnizos, pueden ser, por ejemplo: unadiscrasia sangufnea, el factor fundamental de la enfermedad, es la que es

It)


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diffcil distinguir los efectos causados por la infecci6n de Candida. Adernasde la apariencia extraoral general del paciente, puede ser necesarioexaminar otras areas (ej: tronco y miembros), para cualquier evidencia deinfecdon del hongo. Por ejemplo: Quelitis angular y candidosismucocutanea cronlca que pueden comenzar intraoral mente, seguidas

- despuespor-cambiGsextra~or-ales,part1cularment en la capa de lasunas.[16] .lit Examen Intra - Oral:Cambios intraorales en el color y Ia textura de la mucosa sonusualmente aparentes y pueden haber factores concomitantes como el olor

de la levadura, aunque una fetidez de aliento, no es espedficamentecausada por estancacion. Es una equivocacion cornun que todas las formasde candidosis causan un cambio en el color de la mucosa a blanco. EIenrojecimiento, que es indicativo de inflamaci6n, es el signo mas cornun.Igualmente es un error asumir que todas las lesiones blancas de la mucosaoral son causadas por infecciones candidlasicas, Esta suposldon es debidaa la proporcion de diaqnostlcos iniciales equivocados, de pacientes queeventualmente tenian liquen plano, leucoplasia 0 lesiones similares. Lamucosa oral varia en apariencia de individuo a individuo, aSI pues unacomparaci6n de areas afectadas y no afectadas en la boca del paciente esbeneficiosa. La adhesi6n del epitelio al tejido conectivo, es un test simple ydiscriminatorio para diferenciar entre candidosis pseudomembranosaaguda y candidosis htperplasica cr6nica. Algunos pacientes reportanalteracion de la sensaci6n del gusto. Aunque esto puede ser examinadocon varias soluciones (dulce, amargo, etc.) en la practice su valor dediagn6stico es mfnimo.[16]IQ . Diagnostico de laboratorio

EI diagn6stico, cuando. se sospecha candidosis, debe ser lIevado por lafase de confirmaci6n de cultivo en el laboratorio debido a los posiblesfactores predisponentes u otros procesos patol6gicos que semejanCandidosis, entre los cuales se encuentran leucoplaquia, liquen plano 0sifilis terciaria. EI examen rnlcroscopico de la muestra de la lesion debe serhecho solo con especfmenes frescos. Los espedmenes de las lesionescausadas por Candida Albicans, montados en un portaobjetos con tinci6nde PAS Shiff muestran una masa enmarafiada de pseudohifas, aSI como


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un nurnero variable de blastosporas, puesto que la fase pseudohffica es elestado invasivo de este hongo. Este es un punto importante aun si loscultivos son positives para Candida.[21]R. Tratamlento

5610 se han descubierto unos cuantos compuestos quirrucos queinhiben el desarrollo de los hongos pat6genos para los seres humanos, ymuchas de dichas sustancias son relativamente t6xicas. Ha surgido lanecesidad de dlsefiar mejores antimic6ticos debido a las incidencias cadavez mayor de infecciones mic6ticas locales y diseminadas en individuosinmunodeficientes.[15,25]

Ya que los azoles inhiben las enzimas P450 oxidativas en el hfgado ycualquier otro lugar, pueden interferir con el metabolismo de farrnacos y lasfntesis de compuestos end6genos.[15]

A continuaci6n se mencionan los medicamentos antimic6ticos utihzadospara el manejo de candidosis oral, con sus respectivas ventajas ydesventajas: [15,3]

1. Nistatina:Fue el primer tratamiento antibi6tico efectivo en 1950. Es formulado

para administraci6n oral como suspensi6n 0 tableta. Es una droga seguraporque no se absorbe a traves de la piel, membranas mucosas 0 viasgastrointestinales; pero desafortunadamente, para que el farmaco seaefectivo, debe estar en contacto directo con el microorganismo, con 10 quese requiere multiples dosis diarias.[20] Casi toda la Nlstatina, administradapor via oral se excreta en las heces. No existen concentracionessangufneas 0 tisulares importantes despues de la administraci6n oral, y esclemasiado t6xica para proporcionarse por via parenteral. Su modo deacci6n implica la fijaci6n de la Nistatina a los esteroles de la membranarnic6tica.[15] Adernas muchos pacientes refieren que la nistatina posee unsabor muy amargo; este saber debe ser enmascarado por sacarosa yagentes saborizantes, 1 0 que puede reducir la complacencia del paciente. Sila candidosis oral es secundaria a xerostomia, el contenido de sacarosapuede contribuir a un e!evado indice de caries en estos pacientes.[20]

') 1


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2. Agentes Imidazol:Estos fueron desarrollados durante los afios 70 y representaron un

paso mayor para el manejo de candidosis.[20] Inhiben los hongosmediante el bloqueo de la blosintesls de los llpidos micoticos,especialmente el ergosterol en las membranas celulares.[15] Las dosdrogas mas cornunrnente utilizadas de este grupo son Clotrimazol yKetoconazol.

Clotrimazo/: AI igual que la Nistatina, esta droga no se absorbebien per 1 0 que debe administrarse varias veces al dia, Se formulacomo una tableta de buen saber y produce muy pocos efectosadversos.[14] Dosls: tabletas de 10 mgs, cinco veces al dia,pueden suprimir la candidosis oral.[15]

Ketoconazol: Fue la primer droga antifunqica que se absorbi6 porel tracto gastrointestinal, con 1 0 que se logr6 terapia sisternlca poradministraci6n oral. La dosis diaria untca fue mas c6moda para elpaciente, por otro lado, varias desventajas se han detectado. Lospacientes no deben tomar antiacidos 0 agentes bloqueadores de labomba de H 2 por que se requiere de un medio acido para laabsorci6n adecuada de la droga. Si el paciente toma Ketoconazolpor mas de 2 semanas se refieren exarnenes del hiqado porqueaproximadamente 1 de 12{000 individuos experimentan toxicidadidiosincratica del hfgado. Por esta raz6n, The Drug and FoodAdministration ha declarado que el Ketoconazol no debe serutilizado como una terapia inicial para candidosis oral. Por otro ladese han detectado interacciones con farrnacos como Eritromicina(antibi6tico) y Terfenadina (antihistamfnico) produciendo arritmiascardiacas de alto riesgo.[20] Dosis: una sola dosis al dia de 200 a400 mg se toma con los alimentos.[15]

3. Agentes Triazol:Constituyen el grupo mas moderno de drogas antifunqicas.

Fluconazol ha sido aprobado por EE.UU. como droga antifunqica paracandidosis oral y el Itraconazol esta bajo consideraci6n.[20]

')')


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Fluconazol: Aparenta ser mas efectivo que Ketoconazol; es bienabsorbido sisternicarnente, y no requiere de un medio acido, Poseeuna vida media larga 1 0 que permite una sola dosis al dia y latoxicidad hepatica es rara a la dosis utilizada para candidosis oral.Algunos reportes indican que no es conveniente utilizer Fluconazolpara tratamientos preventivos prolongados porque se ha reportadoresistencia a esta droga en algunos casos. Se conoce deinteracciones con farrnacos como Fenitoina, Warfarina ySulfonilureas.[20] Dosis: 100 a 200 mq/dia puede suprimir la. candidosis oral y esofaqica en individuos inmunodeficientes y puedeser eficaz en candidosis sistemica.[15]

Los hongos de tipo levadura son resistentes a la grafl mayorfa deagentes antimic6ticos utiles en el tratamiento de enfermedades causadaspor estos. Adernas, los farrnacos son poco efectivos y bastante caros.Existe la necesidad de crear una variedad de compuestos antirnicoticos quesean mas efectivos y menos t6xicos.[18]

71


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IV . METODOlOGIAA. Objetivos

1. Generales:til Comprobar cientfficamente si el ajo (Allium Sativum) tiene un efectoantimicotico sobre cultivos in vitro de Candida Albicans.2. Espedficos:

Determinar siel extracto acuoso de ajo, a una concentradon delmg/ml, es efectivo como agente antimicotico sobre cultivos in vitro deCandida Albicans.

Determinar que presentacion de Allium Sativum (extracto acuoso, polvoo aceite) posee el mejor potencial antlrnlcotico contra Candida Albicans

C D Comparar la efectividad antimicotica de Ketoconazol y Clotrimazol, conla de! Allium Sativum (Extracto acuosos, Polvo y Aceite) en la inhibici6nde Candida Albicans.

Demostrar la concentracion inhibitoria minima del extracto y/o drogaque resulten efectivos contra candidosis oral.

B. HipotesisEI extracto acuoso de ajo (Allium Sativum) tiene efecto inhibitorio

sobre el crecimiento in vitro de Candida Albicans.c. Variables

Independlentes: Extracto Acuoso de AjoPolvo de AjoAceite de Ajo

til Dependiente: Efecto Inhibitorio del extracto acuoso de ajo sobre elcrecimiento in vitro de Candida Albicans.

' ) . 1


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D. Definicion de variables1. Definicion conceptual:

Extracto acuoso de ajo: consiste en una extracci6n primaria enagua de la planta fresca (ajos macerados) 0 seca con la ayuda decalor (infusi6n 0 decocci6n) la cual posteriormente se filtra. [2]

Polvo de ajo: se obtiene de la pulverizaci6n de la planta seca,seguido de tamizaje y retriturado hasta obtener un polvo detarnafio controlado. [2]

Aceite de ajo: consiste en una extracci6n por prensado de laplanta para obtener el aceite, el cual se calienta y filtra. [2] Candida Albicans: Candida Albicans es una oval que produceun seudomicelio en cultivo, en los tejidos y exudados. Esmiembro de la flora normal de las mucosas de los aparatosrespiratorio, digestivo y genital femenino. En tales lugares puedeganar dominio y hallarse asociado con otras enfermedades. [15]

2. Definicion operacional: Extracto acuoso de ajo: es el resultado de la acci6n delextracto acuoso (diluido en agar) sobre el crecimiento deCandida Albicans in vitro.

Polva de ajo: es el resultado de la acci6n del polvo (diluido enagar) sobre el crecimiento de Candida Albicans in vitro. Aceite de ajo: es el resultado de la acci6n del aceite (diluido enagar) sobre el crecimiento de Candida Albicans in vitro.

Candida Albicans: Inoculaci6n de las cepas (15) en placa yobservaci6n de crecimiento 0 no crecimiento de las mismas.


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& : . , Escala de medici6n de la variable dependiente:Variable binomial: exito = inhibitionfracaso = no inhibicien [13]

IF"Materiales y Metodos1. sustanclas de trabajo:Tres extractos de Allium Sativum (Ajo); uno obtenido por tecnicas de

laboratorio (Extracto Acuoso) y dos proporcionados por empresas delmercado local (Polvo y Aceite).

Extracto acuoso de ajo elaborado en el Laboratorio deCitohistologfa de la Facultad de Farmacia de la Universidad deSan Carlos de Guatemala.

e Extracto de ajo en presentaci6n de polvo proporcionados porAlamsa (Lie. Phillip Lamport).

Extracto de ajo en presentaci6n de aceite proporcionado porExtract (lng. Cesar Vetorazie).

2. Farmacos de control:Los farrnacos utilizados como controles negativos fueron: Ketospor

(Ketoconazol) de laboratories Qualipharm en soluci6n t6pica (20 mls.) yCanesten (Clotrimazol) de Bayer S.A. en soluci6n t6pica (20 mls.).

3. Muestra:

24 cepas de Candida Albicans de orfgenes distintos catalogadas portlpo de muestra, asiqnacion (nombre), edad y departamento(Unidad de Cuidados Intensivos de Pediatrfa, Medicina General,Observaci6nde Adultos, Unidad de CuidadosIntensivos de Mujeres; Primerpiso de Pediatrfa [incluyendo recien nacidos] y Consu/taExterna) obtenidasdel Hospital General Rossevelt y proporcionadas par la llcenciada LilianaAcevedo. Y una Cepa internacional (Center of Disease Control de Atlanta)


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proporcionada por el cepario de la Facultad de Farmacia de la UniversidadSan Carlos de Guatemala (ATCC -American Type Culture Collection-110231).

Las cepas utilizadas se enlistan en la siguiente tabla. Se indica con unasterlsco (*) aquellas que fueron utilizadas en el ensayo antimic6tico.Gi. Disefio de Investlqaclon

EI disefio que se utiliz6 en esta investigaci6n fue de tipo experimental,debido a que la observaci6n de los extractos se lIev6 a cabo ensituaciones controladas y se manipularon sisternatlcarnente lascondiciones, alternativas 0 niveles de las variables independientes;venftcandose las consecuencias de dichas manipulaciones.[l]

De las 24 cepas obtenidas del Hospital General Rossevelt yproporcionadas por la licenciada Liliana Acevedo, se seleccionaron 14cepas con el unico parametro de tlpo de muestra (Boca, Esputo,Aspirado Traqueal, Cultivo de Garganta y Material Bucal), esto con el fin deaplicarlo al area de Estomatologfa. Adernas se utiliz6 una cepainternacional (ATCC -American Type Culture Collection 10231).


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Tabla No. 1 Cepas de Candida Albicans (* cepas utilizadasen ensayo antimicotico)...'i~.~~.~~~~r~i...I!i~.I.~~.~gi....\il~~d' $ e l j i t i . , .i1.(*) Boca Sujeto A 10 a. UC IPi m e d . G t a l J i

UCIP.(*)4 . ( > 1 < )

5 .. 6~(~)"7..

Aspirado T raquea l.Cult.de GargantaHer ida Opera to r ia A $ P i t ~ d 6 t r ~ q t i ~ ~ f i. .Aspirado Gastrico

Sujeto CSuje to . .. .DSujeto E

Sujeto Gsujeto ISuj~Q JSujeto K

Sujeto M

7 a.SQa,73 a .

Co. Ext.Obs. Adulto

Med. G ra l.9.(*)10.

11.(*)

Aspirado T raquea lHe riq aOpera to ria ....Ma te ria l B uca l.' ) \ S p f f a d d i ' f t ~ q u e a l ( " . i . . { i > . ( . > i . l 2 i ; . ' ; ~ ; g ~ A / . . . , . '? i . . . .iii}

Cult. d e Ga rg an ta

25 a.9 a.55.0 ...

Ilhm.1. PediaCo. Ext.....1. Pedia' . ' O b s . . A d t i ! t : o . . .Co. Ext.Co. Ext.Med. G ra l.UMIC.

UMICl.Pedia .

Co. Ext.UMIC

1. PediaObs . AdultoMed. G ra l.

UCIPLab. U SA C

15.. 16.(*)'

17.Aspirado Gas tr lcoAspiradoTraqueal.A rea de Cateter

Sujeto 0

57 a.

43 a.Sujeto Q 56 a.

19.(*)20 .21.22.23.(*)

24.(*)25.( *) Cepa Internac ional

Esputo Sujeto SAsplraddG8$tr ic:o ' < s G j e t o THer ida Opera to r ia sujeto U

44 a.2 0 a . .5 a.43 a.39 a.

ATCC 10231


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lri. Recursos:1. Hurnanos:Investiqador: Freddy PerezAsesor: Dr. Juan Carlos LlarenaCo-Asesor: Lic. Armando Caceres2. Institucionales:

Laboratorio clinlco del Departamento de Citohistologfa, Facultad deFarmacia, Universidad San Carlos de Guatemala.

Hospital General Roosevelt (Unidad de Cuidados Intensivos dePedtstne. Medicina General Observaci6n de Adultos, Unidad de CuidadosIntensivos de Mujere~ Primer Piso de Pediatrfa (incluyendo recien nacidos)y Consu/ta Externa.'I. Materiales:

1. Equipo.Balanza analltica, Campana bacteriol6gica, Vortex, Autoclave,

- __ _._... _. __ .. - .._'[='_lb_~.,..,:> _ .Dnf"iar.)"'~~'T ...__ t;;t;+uf_~_?J";_""rl:ic ..... _JYIr.>cbcro_ I-u If"'t'"'_,.-,,,,I''\.15 cc.

3. ReactivosAgar Sabouraud, Caldo tripticasa soya, Agar mycocelle, Cloruro de

sodio, agua desmineralizada y agua esterll.

')0


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J, Procedlmlento:Para la preparacion del extracto acuoso se investiqo la informacionescrita, nacional e internacional concerniente a las tecnlcas usadas para laextracdon y dernostracion de la bioactividad de productos naturales por

pruebas de farmacologfa experimental in vitro. Para el desarrollo delensayo antimic6tico se utilize "EI Manual de Procedimientos deLaboratorio" de la facultad de Farmacia de la Universidad San Carlos deGuatemala. Sequn la literatura revisada para ensayos experimentales, laconcentraci6n ideal de los agentes antimicrobiana de plantas contra cepasde estudio oscila entre 0.01 y 1 m9/ml.[17] Por 1 0 tanto, la concentraci6nfinal que se utilizo para este estudio fue de 1 mg jm i.

Para la preparaci6n del extracto acuoso, sequn el manual deprocedimientos, es necesario hervir la planta durante algunos minutos yluego filtrarla. Pero en este caso la alicina (molecule activa) estermosensible, 1 0 que significa que a una temperatura mayor de 80 C laalicina pierde su potencial inhibitorio sobre el crecimiento de C. Albicans.Por ello fue necesario ajustar el procedimiento a las cualidades de la plantaen estudio.

La parte experimental se inici6 con la preparaci6n del extracto acuososy obtenci6n de los dernas extractos y drogas utilizadas en el ensayoantimicotico, Cada extracto yjo droga fue utlllzada como unidadexperimental a una concentracion de 1 mgjmil con la tecnica de diluci6n enagar. Por ultimo se determin6 la elM para todo extracto y/o droga quelograra inhibir el crecimiento de las cepas de C. Albicans, preparando tresdiferentes dosis y efectuando el ensayo en triplicado.

1. Preparacion del Extracto Acuoso: Se pelaron 21 cabezas de ajo, reduciendolos totalmente a gajos. Se colocaron en un beaker de vidrio y se pesaron. Luego se congelaron a -900e per 24 hrs... Se trituraron los gajos y acumularon en un beaker con bafio de

hielo para conservar la temperatura.& El ajo triturado se peso (587.46 grs.)" Se combinaron 100 grs. de ajo triturado y 2.5 Its. de agua


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desmineralizada 1 0 cual se calento a 75C por 3 hr. Luego se filtr6 el Ilquido obtenido a traves de papel filtro para evitar

el paso de material solido. Se obtuvo un total de 200 mls. de extracto acuoso, el cual severtio en frascos esteriles V se refriqero hasta el momento de suuso.

2. Preparacion de medias de cultivo (Agar/Planta - Droga)a. Preparar tubos con 9.0 mls. de agar Sabouraud.b. Esterilizar, dejar enfriar a 30C V agregar 1.0 ml. de la solucion

del extracto disuelto 0 farrnaco a probar. Este debe tener unaconcentracion de 10 mg/ml (Dtlucion 1:10). La eoncentraei6n final que seobtiene es de 1mg/ml.

c. Agitar V verter en eajas de petri esteriles, dejar solidifiear eineubar a 36C por 24 hrs., para eomprobar esterihdad.

d. Guardar en refriqeracion hasta el momento de usar.Se procedio a preparar los medios para extractos, farmacos V control

con el objetivo de lograr una concentraclon final de 1 mg/ml esto se loqro dela siguiente manera:

.,Polvo: 60 mgs. de polvo + 60 mls. de agar Sabouraud = 1mg/ rnl,Acei te: 0.75 mls. de aceite + 59.25 mls. de agar Sab. ='lmg/ml. Extracto Acuoso: 0.03 mls. de ext. + 59.97 mls. de agar Sab. =1mg / ml.Ketoconezol: 3 mls. de la soludon + 59 mls. de agar Sab. = 1mg/ml.,.Clotrimazo/: 6 mls. de la soluci6n + 54 mls. de agar Sab. = 1mg/ rnl.4csjes control = 40 mls. de agar Sab. .Se prepare un total de 16 grms. de agar en polvo mas 220 mls. de

agua desmlnerallzada. Con jeringa de 10ee V pipeta se eoloearon lascantidades exactas de agar en 5 Erlen Mevers de 200 mls. cada uno V 4tubos de 20 mls. cada uno. Luego se procedi6 a autodaviar los medics a127C por 10 minutos. Estos medios (estenles) se combinaron con lasmedidas predeterminadas de extractos v/o drogas V se agitaron para crearuna mezcla hornoqenea. Por ultimo se vertieron en las cajas petri,esperando que gelificaran. Estas cajas se incubaron a 37 C por 24 hrs.para veriticar esterilidad. Se prepararon 6 cajas de cada una para


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descartar las contaminadas. Finalmente se refrigeraron hasta el momentode su uso.3. Preparacion del inocula

a. Sembrar en una caja de agar Sabouraud e incubar a 36C por48 hrs.b. Tomar un inoculo del cultivo fresco, sembrar en 5 ml. de caldo

Triptlcasa Soya e incubar 24-48 hrs. Tomar con una pipeta esteril 0.5 ml. ysuspender en 4.5 mls. de soluci6n salina esteril (diluci6n 1:10).

Para comprobar la pureza de las cepas obtenidas se sembraron 20cepas distintas en agar Mycocelle y se incubaron las cajas petri a 37Cpor 48 hrs. Se utilizaron 5 cajas en total y se sembraron 4 cepas por caja

1 2

3 4

Para la obtenci6n del inoculo se prepare caldo Tripticasa soya (T.S.) Ysoluci6n salina para 1 0 que se utiliz6: 80 mls. de caldo T.S. que corresponden a 3 grms. de polvo T.S. y.. 100 mls. de agua desmineralizada.Para la soluci6n salina fisiol6gica se utilizaron:., 0.86 grs. de cloruro de sodio yo 100 mls. de agua desmineralizada; con 1 0 que se obtuvo un total de72 mls.Se autoclaviaron 32 tubos, con tapa cada uno, a 127C. por 15

minutos... 16 tubos de 5 mls. de caldo T.S. 16 tubos con 4.5 mls. de soluci6n salina


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Se trabaj6 un total de 15 cepas incluyendo una cepa internacionalATCC 10231, proporcionada por el cepario del laboratorio del Depto. deCitohistologla de la Facultad de Farmacia de la USAC.

Se identificaron 15 tubos con 5 mls. de caldo T.S. y se procedi6 apreparar el inoculo, tomando una asada de hongo del agar Mycocelle de lacepa correspondiente. Estos in6culos se incubaron a 37 C por 48 hrs.

Se pipetiaron 0.5 mls. de caldo T.S. de los tubos previamenteinoculados (los cuales se vibraron en VORTEX per 2 sgds. para crear unasoluci6n hornoqenea), se vaciaron en 4.5 mls. de soluci6n salina esterilpara lograr una soluci6n 1:10.

4. tnoculaclon de levaduras en placaa. Inocular con asa la suspensi6n de levaduras en cada secci6n

sequn piantitla.b. Incubar a 36C per 48 hrs.c. Para el control positive, sembrar por estrias la levadura en una

c:ajacon agar Sabouraud.

E I in6culo de cada una 'de las cepas a probar se sembr6 con asa sequnplantilla en:* 3 cajas de extracto acuoso* 3 cajas de polvo* 3 cajas de aceite* 3 cajas de Ketoconazol* 3 cajas de Clotri mazol* 3 cajas control. (Agar Sabouraud)Y luego se incubaron a 36C por 48 hrs.5. Interpretacion de los resultados

Se observ6 el crecimiento en las zonas de inoculaci6n y seinterpret6 de la siguiente forma:

Hay inhibici6n del crecimiento: No hay inhibici6n de crecimiento:

Actividad positiva (+)Actividad negativa (-)


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+ Presencia de Microorganismosfuera de la inoculaci6n: Contaminaci6n

6. Determinacion de la Concentraclon Minima Inhibitoria(elM)a. Preparar cajas cuadriplate con las siguientes diluciones delextracto / droga: 3.6 rnl, de agar + 0.4 ml. de la solucion de extracto = 1.0 mg/ml 3.8 ml. de agar + 0.2 ml. de la soluci6n de extracto = 0.5 mg/ml 3.9 mi. de agar + 0.1 ml. de la soluci6n de extracto = 0.25 mg/ml Un cuadrante can 4.0 ml. de agar como control negativo.b. Inocular tres estrfas en cada uno de los cuadrantes e incubar a36 C par 24 hrs.c. Realizer la lectura e interpretar resultados sequn el paso l.S

Para la determinaci6n de la CIM del extracto acuoso de ajo seprepararon 6 cajas cuadriplate con las siguientes concentraciones:III 6 x 3.6 mls. de agar Sab. + 0.4 mls. de extracto diluido =1

mg/ m I.II 6 x 3.8 mls. de agar Sab. + 0.2 mls de ext. diluido = 0.5 mg/ml.II 6 x 3.9 mls. de agar Sab. + 0.1 rnls de ext. diluido = 0.25

mg/ ml.II 6 x 4 mls. de agar Sab. como control negativo.

Esto dio un total de 91.8 mls. de agar 1 0 cual se prepar6 con 6 grs. depolvo de agar Sabouraud y 95 mls. de agua desmineralizada.

Para la determinaci6n de la CIM para Clotrimazol se prepararon 4 cajascuadriplate con las siguientes concentraciones:

iii 4 x 3.2 rnls, de agar Sab. + 0.8 mls. de soluci6n = 2 mg/ ml-D 4 x 3.4 mls. de agar Sab. + 0.6 mls. de solucion = 1.5 mg/ml.ill 4 x 3.6 rnls. de agar Sab. + 0.4 mls. de soluci6n = 1mg/ml.1\ 1 4 x 4 mls. de agar Sab. como control negativo.

Esto dio un total de 56.8 mls. de agar 1 0 cual se prepare con 4 grs. depolvo de agar Sabouraud y 60 mls. de agua desmineralizada.


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Como se requiere de una concentraci6n final de 10 mg/ml para (J.2.b.) lasoluci6n de Clotrimazol, se analiz6 la formula del farrnaco de la siquientemanera: Formula: 20 mls. de soluci6n contienen 0.2 grs. de Clotrimazol.

concentrsdon final: 10mg/ml.EI in6culo de cada una de las cepas a probar se sembr6 en tres estrias

por cada uno de los cuadrantes. Luego estas cajas se incubaron a 36 Cpor 24 hrs. Por ultimo se reportaron e interpretaron los resultados.K. Dlsefio Estadistico:

Los resultados se recopilaron por medio de una escala de medici6nnominal para la variable dependiente en la que los resultados se analizaronde manera binomial:

Variable binomial: exito (-) = inhibici6nfracaso (+) = no inhibici6n [13]1. Hip6tesis Alterna:

Ha: EI extracto si tiene efecto inhibitorio.2. Hip6tesis Nula:Ho: EI extracto no tiene efecto inhibitorio.


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EXTRACTO ACUOSOS~ ~ P E ! ~ 15) 7>8\< > 1 0 12 13 14'.".. , ..... ",,.~l 1 + + + + + + + + + + + +I \ r

' . : > 3 + + + + + + +ACEITE

~~fJf '~ < 1 3 14 1 5 ) ( J ' ) .,


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KETOCONAZOL

CONTROL

1 r i / l tSiO+ + + + + + + + + + +

tS314i S+ + + +

3 + + + + + + + + + + + + + + +Debido a que existe una amplia variabilidad en los resultados de

Extracto Acuoso, Aceite y Clotrimazol, se decidi6 realizar otro ensayototal mente independiente. Para ello fue necesario prepara 3 cajas deExtracto Acuoso, 1 caja de Aceite, 1 caja de Clotrimazol y 3 cajas Control.EI objetivo de este segundo ensayo, fue descartar cualquier probabilidadde error en la tecruca de laboratorio y ademas con estos nuevos resultadosestablecer tres categorfas:

Resistente Sensible Parcialmente sensible

Para este segundo ensayo se utiliz6 un total de 4.14 grs. de polvo Sab.)I 100 mls. de agua desmineralizada.

Para que este segundo ensayo fuera mas espedftco se utilizaronunlcarnente las cepas que presentaron variabilidad y estas fueronensayadas, mas de una vez (en triplicado), en la misma caja de agarextracto / droga. Las cepas fueron respectivamente:


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Extracto Acuoso: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 13 Y15.Clotrimazol: 2, 3, 10, 11, 12, 13Y15.Ace ite : 6, 7 Y 11 .Resultados del segundo ensayo:

EXTRACTO ACUOSOCepas1 ' ; ' 1 ; ; ; , ; 1 ,

CLOTRIMAZOl

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ACEITECepas

CONTROL


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Con la obtenci6n de los resultados se concluy6 que el aceite no poseeuna actividad inhibitoria (antifunqica) a una concentraci6n de 1 mg/ml.Adernas se dedujo que para el analisis de la Concentraci6n MinimaInhibitoria (CIM) del extracto acuoso se utilizarfan las cepas 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 , 8, 10, 11, 13 Y 15.

En cuanto al analisis de Clotrimazol los resultados indican que existeresistencia para las cepas 2 y 13 Y variabilidad para las cepas 3, 11 y 12 auna concentraci6n de 1 mg/ mi. Como el Clotrimazol es uno de los farmacosutilizados como control negativo para este estudio, se consider6conveniente preparar 2 cajas a concentraciones de 1.5 y 2 mg/ mlrespectivamente; esto para controlar la variabilidad de las cepas 3, 11 Y 12Y concluir sobre la resistencia de las cepas 2 y 13. Las cepas fueronensayadas, mas de una vez (ensayo en triplicado), en la misma caja.

Resultados para concentraclones de 1.5 y 2 mgIml deClotrimazol .

ClOTRIMAZOL (1.5 mg/ml)CepasII;~~' LP>

3 + +

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CLOTRIMAZOL (2 mgIml)Cepasll~ : 1 " 1

3 +

10


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Resultados de la CIM para Extracto Acuoso

Concentraciones

+++ +++ +++

Resultados de la elM para ClotrimazolConcentraciones

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V I. D IS CU SION DE RESULTADOSCuando se registraron los resultados de la primera fase experimentaldel ensayo antifunqico, se detecto una amplia variabilidad en los resultados

para el extracto acuoso, aceite de ajo y Clotrimazol, por 1 0 que fuenecesario realizar un segundo ensayo total mente independiente. Esto sedesarrollo con el objetivo de eliminar cualquier error en la tecnica delaboratorio y edemas establecer tres categorfas (Resistente, Sensible,Parcialmente sensible) con las que se puedan clasificar aquellas cepasque insisten en presentar variabilidad. La clasificaci6n de dichas cepas sereportan en el siguiente cuadro:

Clasificacion de cepas segun senslbllldad a 1mgIml(Resistente, Sensible y Parcialmente Sensible)Sensibil idad0 : : , , / , . ; 1 1 , . . . . . . . . . . . . . . . . . ./ . . .

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Clotrimazol 2 y 13 1,4, 5,6, 7,8, 9, 3, 11Y1210 , 14 Y 15

En base a estos resultados se deduce que las cepas parcial mentesensibles a Clotrimazol podrfan tornarse sensibles a concentraclonesmayores; pero que a la vez podrfan ser t6xicas para el paciente. Decualquier manera, se ha .reportado la existencia de cepas de Candidaresistentes al farrnaco,

Por otro lado, el Ketoconazol demostr6 un efecto inhibitorio total sobreel crecimiento de las 15 cepas analizadas. Todo 1 0 contrario sucedi6 con elpolvo, el cual no tuvo ningun efecto inhibitorio en absoluto.

AI analizar los resultados obtenidos del segundo ensayo antifunqico, sedetermin6 que, tanto el polvo como el aceite de ajo, no poseen un efectoinhibitorio sobre el crecimiento de Candida Albicans. Esto puede deberse a

.11


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alqun desperfecto en el proceso de obtenclon del polvo 0 aceite del ajo.Sequn la literatura revisada para la obtenci6n de ambos se requiere detemperaturas elevadas (180 - 200ot) las cuales podrian reducir 0 inhibir elefecto antirnicotlco de la molecule activa (alicina).

Debido a que el Clotrimazol presenta variabilidad en los resultados y esuno de los farmacos utilizados en este estudio como control negativo, fuenecesario utilizar dos concentraciones mayores a la dosis preestablecida;estas fueron 1.5 y 2 m9/ml respectivamente. Sequn los resultados obtenidos,aun a concentraciones de 1.5 y 2 m9/ml, la cepa No. 3 presentavariabilidad. Con esto se confirma que existe resistencia de algunas cepasa Clotrimazol; posiblemente esta cepa sea inhibida por el farrnaco a unaconcentraci6n mayor, pero a la vez, esto presenta un riesgo de toxicidadpara el paciente.

Segun los resultados obtenidos de la Concentracion N i n l m a Inhibitoria(CIM) para el extracto acuoso de ajo, se deduce que a una concentracionde 1 mg/ml este extracto es capaz de inhibir 12 de las 15 cepas analizadas,1 0 que corresponde a un 80 % de efectividad. Esto a la vez nos indica quea una concentraci6n mayor posiblemente la efectividad del extractoaumente.

AI analizar los resultados obtenidos de la Concentraci6n MinimaInhlbitorta (CIM) para el Clotrimazol, no se como con la misma suerte quepara el extracto acuoso, ya que solo loqro inhibir 10 de las 15 cepas enestudio; 1 0 que corresponde a un 6 7 % de efectividad. Esto indjca que, paraeste estudio, el extracto acosos de ajo tuvo un mejor efecto que elClotrimazol al inhibir el crecirnlento de las 15 cepas analizadas.


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VII. CONCLUSIONES

1.- EI ajo posee actividad farmacol6gica (antifUngica) aun cuando se aplicaen pequefias dosis.

2.- Ni el aceite ni el polvo de ajo poseen una actividad inhibitoria(antimic6tica) contra Candida Albicans a una concentraci6n de 1mg/ml.

3.- Los resultados obtenidos revelan que el extracto acuoso de ajo tuvo unmejor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de C. Albicans in vitro que elobtenido con polvo, aceite y Clotrirnazol.

4.- Debido a que existe resistencia por parte de algunas cepas de CandidaAlbicans, el Clotrimazol no se considera un farrnaco recomendable para eltratamiento de candidosis oral.


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V III. RECOMENDAC IONES

Se recomienda realizar un estudio amplio sabre los extractos dedlversas plantas con propiedades antimic6ticas que existen en el mercadopara el tratamiento de candidosis oral.

Incentivar un estudio que identifique la incidencia de candidiosis oralen una poblaci6n guatemalteca versus una poblaci6n asiatica que resida enGuatemala.

Desarrollar un analisis comparativo de la efectividad de un extractoacuoso contra un extracto etan61ico de ajo en la inhibici6n del crecimientoin vitro de Candida Albicans.


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