AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes€¦ · • État frais. • Coloration de Gram. • Coloration de Ziehl Neelsen. Examen au MO à l'état frais ... levures

AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes

04/05/2016 (10h-11h)PARELLO Prescyllia L2 MédecineCR : NICOLAS MargotAIHPr Florence FENOLLAR12 pages

Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes

A. Généralités

I. Stratégie diagnostique

Le diagnostic non spécifique permet une orientation, un diagnostic vers une maladie infectieusebactérienne ou virale. Puis, on a le diagnostic spécifique ou étiologique qui permet d'identifier le micro-organisme responsable de l'infection.

On peut prendre les exemples suivants :• Hémogramme : on fait une NFS puis on recherche :

◦ Hyperleucocytose à polynucléaires neutrophiles souvent associée aux infections bactériennes.◦ Leuconeutropénie souvent associée aux infections à bactéries intracellulaires et virales.

• Dosage Protéine C-réactive : Élévation en cas d'infection. Dans les infections bactériennes, la protéineC réactive est très élevée alors que dans les infections virales, elle est assez modérée.

• Dosage de la Procalcitonine : Élévation en cas d'infections bactériennes, parasitaires, ou fongiques(mais pas virales).

Le diagnostic spécifique permet d'établir le diagnostic étiologique.

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Plan

A. GénéralitésI. Stratégie diagnostiqueII. Les prélèvementsIII. Les pré-requis pour un prélèvement réussi

B. Diagnostic direct I. Examen microscopique II. Détection immunologique III. Détection moléculaire IV. Isolement bactérienne V. Spectrométrie de masse

C. Diagnostic indirect I. Sérologie par immunofluorescence indirect II. Sérologie par ELISA III. Sérologie par Western Blot


Diagnostic direct • Examen microscopique ++• Détection immunologique• Détection moléculaire• Isolement bactérie (Culture axénique++)• Spectrométrie de masse

Mise en évidence directement dumicro-organisme à partir de

prélèvements

Diagnosticindirect

• Sérologie ++ Mise en évidence à partir du sérumdu patient de la réponse

immunitaire vis à vis d'un micro-organisme

II. Les prélèvements

Ils sont faits en fonction de la symptomatologie et de la symptomatologie clinique.

Les 2 grands types de prélèvements :• Provenant d'un site contaminé : par exemple au niveau de la peau, des selles, de la bouche.• Provenant d'un site stérile : au niveau du cœur, tout ce qui est prélèvement profond.

Les grandes catégories :• Hémocultures.• Fluides biologiques : urines.• Collections (CR : comme un abcès)• Biopsiques.• Cutanéo-muqueux.

Tout type de prélèvement peut être réalisé, mais le type de prélèvement se fait en fonction de ce que l'oncherche et donc de la symptomatologie clinique du patient.

III. Pré-requis pour un prélèvement réussi

• Quand prélever ?◦ Le plus tôt possible, avant tout traitement si possible (sauf en cas de purpura fébrile où il faut traiter

directement).◦ Lors de pic fébrile : quand le patient a de la fièvre.◦ Lors d'échec thérapeutique ou d'évolution défavorable.

• Précautions indispensables :◦ Stérilement (attention à la contamination avec la flore commensale) : par exemple, il faut

désinfecter avant de faire une hémoculture.◦ Transport rapide au laboratoire (il faut choisir une utilisation idéale de milieu de transport).◦ Si écouvillonnage : charger un maximum l'écouvillon.

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B. Diagnostic direct

I. Examen microscopique

La microscopie optique (+) est la base au laboratoire et permet de réaliser :• État frais.• Coloration de Gram.• Coloration de Ziehl Neelsen.

Examen au MO à l'état frais

Pour faire un état frais, on dispose le prélèvement entre lame et lamelle au MO(Grossissement x 100, x 400), il est composé de bactéries vivantes en suspension, delevures et de parasites, ainsi on pourra observer :

• Corps réfringents d'aspects différents suivant les espèces (caractère constant) :cocci, bacilles, cocco-bacilles, vibrions, spirilles, fuseaux...

• Certaines espèces sont mobiles, d'autres immobiles.• Certaines espèces ont des individus isolés et d'autres des bactéries groupées

par deux ou en amas, chaînettes, … La morphologie de la bactérie va nous renseigner sur son type. C'est un examen de routine dans tous les laboratoires.

Coloration de Gram

C'est à partir d'un étalement du prélèvement sur une lame. On fixe puis on fait une coloration. Ensuite, on peutmettre en évidence des bactéries au grossissement x 1000.Cette technique sépare les bactéries en 2 groupes suivant la structure et la composition de la paroi :

• Gram positif (+) colorés en violet.• Gram négatif (-) colorés en rose.

C'est un examen de routine dans tous les laboratoires.

Exemple de prélèvement où réside une flore bactérienne commensale :

Coloration de Gram d’un prélèvement vaginal, on voit une cellule épithéliale et onobserve des bacilles à Gram positif qui est lactobacille, bactérie présente dans laflore bactérienne (polymicrobienne) vaginale.

L'interprétation des colorations de Gram par les techniciens de laboratoire ou les internes sont très mauvaises àl'heure actuelle.

Exemple de prélèvement normalement stérile : Coloration de Gram de liquide céphalo-rachidien.

Méningite à méningocoques car on observe des diplocoques à Gram négatifautour d'un polynucléaire.

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On ne fait plus trop de coloration de Gram, car maintenant, on peut observer que la biologie moléculaire prendle dessus.

Mise en évidence de levures (gros grains violets regroupés) : A ne pas confondre avec des bactéries à Grampositif.

Coloration de Ziehl-Neelsen

Cela permet la mise en évidence de bacilles acido-alcoolo résistants.

Exemple de Myxobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose :La paroi de ces mycobactéries contiennent des acides glycoliques qui fontque la coloration de Gram ne va pas pouvoir pénétrer, ce sont des bacillesacido-alcoolo résistants. Le prélèvement est assez compliqué (CR : c'est un geste très technique),c'est une coloration sur le crachat d'un patient. De ce fait, les laboratoirespréfèrent la biologie moléculaire.

Examen au microscope à fond noir :Exemples de la Mise en évidence de Treponema pallidum, bactérie responsable de la syphilis.

Ici, c'est une infection dans une ulcération génitale.C'est un examen réservé à des laboratoires très spécialisés. Non réalisé en routine. CR : Même sicela donne de jolies images, le geste étant très technique, c'est en train de disparaître.

II. Détection immunologique

On va rechercher l'antigène par technique d'immunochromatographie :On a des anticorps ciblant spécifiquement le microorganisme recherché :

• Présents sur un support inerte.• Et les anticorps sont marqués par des particules permettant de visualiser le résultat.

Intérêts de cette technique : Précocité, simplicité, rapidité (environ 15min), diagnostic tardif. C'est ce qui estutilisé en première intention.

Limites: • Pas d'isolement de la bactérie (CR : on ne peut pas étudier sa sensibilité aux antibiotiques)• Certaines souches ne peuvent pas être détectées (CR : cette technique peut donc manquer de sensibilité)• Positivité pouvant persister plusieurs mois après la guérison : elle manque aussi un peu de spécificité.

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Exemple de recherche d'antigènes par technique d'immunochromatographique :

• Détection d'antigènes urinaires de Legionella pneumophila seulement du sérogroupe 1 ou Streptococcuspneumoniae ++ (CR : manque de sensibilité): rôle dans le diagnostic des pneumopathies àL.pneumophila sérogroupe 1.

• Détection d'antigènes de Streptococcus pyogenes (A) 1 ++ : rôle dans le diagnostic des angines etpharyngites à Streptococcus A. Si c’est positif, on donne une antibiothérapie, si c’est négatif, c’estd’origine virale.

• Détection de toxines de Clostridium difficile à bactérie responsable de diarrhée et colite pseudo-membraneuse, peut entraîner des épidémies, et peut contaminer les personnes âgées et les personnesfragiles.

III. Diagnostic direct par biologie moléculaire

Cela se fait par amplification génique par Polymérase Chain Reaction (PCR) : on extrait l’ADN à partird'un prélèvement de souche et on l’amplifie par PCR. On fait en général 35 à 45 cycles de dénaturation/renaturation.

Amplification génique par PCR :

• Mise en évidence du matériel génétique des bactéries.

• Gènes cibles des réactions de PCR et méthodes d'identification :

◦ Gène "universel" pour les bactéries → c’est l’avantage de l’ARN 16 S ribosomique :Identification précise de presque toutes les bactéries par amplification puis séquençage etcomparaison aux banques de séquences (GenBank). Si la bactérie est connue, on aura sonidentification, mais si elle n’est pas connue dans le GenBank, on a une identification de nouvellesbactéries par séquençage (=Séquence nouvelle).

◦ Gènes spécifiques de bactéries : Identification précise d'une bactérie par séquençage (CR : mais onne le fait plus trop) ou sonde spécifique d'une bactérie (exemple de la méningite à méningocoque).Cela se fait en laboratoire à l’aide d’une sonde spécifique, CR : permettant de faire le diagnostic demanière très rapide.

Site Internet avec démonstration PCR : http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.htmlSéquençage : http://highered.mcgrawhill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter15/animation_quiz_1.html

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On peut soit travailler sur un prélèvement de patient, soit par une souche isolée par gélose.

Une fois l'ADN extrait, on a deux techniques différentes :

• La PCR quantitative spécifique en temps réel (CR : on peut la suivre en temps réel et savoir très vitesi elle est positive ou pas)◦ Amplification dans un système fermé (1h15).◦ Identification avec des sondes spécifiques.

• PCR classique à large spectre ciblant ARN 16S :◦ Amplification par PCR classique (environ 3h).◦ Amplification et révélation du produit amplifié sur gel d’alcalose avec migration (20 mn).◦ Séquençage du produit amplifié par PCR (24h).◦ Au bout de 24h, on fait une analyse information et comparaison de la séquence avec une banque de

données (GenBank). Enfin, on peut identifier la bactérie.

Intérêts :• Utile pour les bactéries difficilement ou non cultivables.

• Intérêt si le patient a eu des antibiotiques.

• Automatisation possible, donc diminution des risques d’erreurs.

• Diagnostic moléculaire rapide (<3h) disponible de nos jours :

◦ Méningite, purpura fulminans (méningocoque et pneumocoque).

◦ Portage vaginal du streptocoque B chez les femmes enceintes (CR : c'est une bactérie responsabled'infections néonatales chez les femmes qui sont porteuses. Avant la 6èmeSA, on doit rechercher lestreptocoque B. Si c'est positif : il faut donner une antibiothérapie au moment de l'accouchement. Siça n'a pas été fait, il faut faire un prélèvement et une PCR en temps réel pour savoir s'il y a besoinde donner une antibiothérapie au moment du travail.)

◦ Neisseria gonorrhae (fragile donc difficile à prélever et à transporter notamment), Chlamydophilatrachomatis (bactéries intracellulaires strict donc difficile à prélever), Treponema pallidum (IST) quiest impossible à prélever et à cultiver.

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Limites :• Risques de contamination pour les techniques de PCR (donc de faux positif).• Coût encore relativement élevé.• Pas réalisé en routine dans la plupart des laboratoires.

IV. Isolement bactérie : Diagnostic direct par culture

• Sur gélose ou milieu liquide (culture axénique) +++ : en routine dans les laboratoires.◦ Milieux solides (= milieux gélosés) : avec milieux sélectifs ou milieux non sélectifs.◦ Milieux liquides.◦ Milieux spéciaux.

Cela se fait selon les bactéries.

• Sur support vivants tels que des cellules (culture xénique).• Sur inoculation animale : non utilisé en routine.

Diagnostic par culture sur gélose (Culture axénique)

Examen de routine dans tous les laboratoires (hôpital + ville).Objectif : isoler les bactéries (levures aussi) présentes dans les prélèvements.

• Gélose non sélective (pour les prélèvements normalement stériles) et riche. ◦ C'est la gélose de base qui isole le plus de bactéries possibles.◦ Exemple : Milieu chocolat au sang cuit, permet d'obtenir des colonies isolées et ainsi pouvoir les

identifier.

• Gélose sélective (Présence d’antibiotiques): elle tue toutes les bactéries que l'on ne veut pas cultiver etpermet la multiplication des bactéries que l'on veut isoler. ◦ Exemple : Milieu CIN (cefsulodine-irgasan novobiocine)◦ Culture de Yersinia enterocolitica à partir de prélèvements de selles. Les antibiotiques permettent de

tuer la flore commensale des selles pour que Yersinia enterocolitica puisse pousser plus facilement.

Ensuite, on fait une incubation des milieux dans une étuve :• Durée : au minimum 24h, parfois plus d'un mois. Par exemple, E. Coli se multiplie en 20 minutes, CR :

mais certaines mettent beaucoup plus de temps à se multiplier. • Température : À 37° le plus souvent, parfois 4°C (Listeria monocytogenes), 30°C (Yersinia sp).

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Une colonie isolée correspond à une espèce bactérienne. A partir d'une colonie isolée : identification phénotypique par galerie biochimique de la bactérie. Onrecherche un certain nombre de réactions biochimiques (ex : consommation des sucres …). Technique qui a étéréalisée depuis des années mais depuis 2010–2011, elle a été abandonnée au profit de la spectrométrie demasse.

On peut aussi faire un compte bactérien (quantifier le nombrede bactéries), on prend l'exemple des urines :

• Seuil de positivité: 105/ml (parfois 103 pour certainesbactéries comme E. Coli par exemple) CR : qui signel'infection bactérienne.

• *UFC= Unité Formant Colonies.

Exemple de la gestion des hémocultures

Elle se fait devant tout patient fébrile ou hypothermique :• Réalisation systématique de la culture du sang des patients = Hémoculture.• Idéalement avant toute antibiothérapie (sauf purpura fébrile).• Prélèvement par ponction veineuse au pli du coude après désinfection de la peau (attention au risque

contamination du prélèvement).• Prélèvement dans les flacons d'hémocultures : aérobies ou en anaérobies. • Puis les flacons d'hémocultures sont dans un automate : quand l'automate détecte la bactérie, on retire le

flacon.

Classiquement, on prélève 3 paires d’hémoculture, soit à 30 mn d’intervalle soit à chaque pic fébrile (aprèsdésinfection). CR : 3 hémocultures suffisent, cela ne sert à rien d'en faire plus : le patient risque de deveniranémique et cela n'apporte aucune information supplémentaire. Les flacons sont mis dans des automates qui vont détecter ou non des dégagements de CO2 (qui peut êtresynonyme de croissance bactérienne).

Analyse d'hémoculture après mise en culture :• Hémocultures à E. Coli. (1)• Hémocultures à Staphylocoques. (2)• Hémocultures à Corynébactérium sp. (3)

(1) (2) (3)

CR : Cela ne donne qu'une orientation et rien de définitif.

Interprétation des résultats :

L’intérêt de l'examen se définit par sa valeur prédictive (VP) incriminant une bactérie dans la fièvre.• Une hémoculture unique positive à Staphylococcus épidermidis : très faible VP le plus souvent

contaminant et il y a une meilleur VP chez les patients avec un cathéter ou porteur d'une prothèsecardiaque.

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• Staphylococcus aureus : VP de 70%.• Salmonella enterica Typhi : VP de 100%.

3 paires d’hémocultures positives sur 3 positives, il faut alors rechercher une prolifération endovasculaire :infection sur cathéter, infection de valve cardiaque, une endocardite, … Il existe des automates (qui permettent de faire l’identification des bactéries + Antibiogramme) :

• Identification des bactéries isolées par automate.• Permettant la réalisation de la sensibilité aux antibiotiques.

Culture cellulaire

On peut aussi faire de la culture cellulaire : qui est nécessaire pour les bactéries intracellulaires strictes.• Technique de microculture cellulaire.• Le support de culture est souvent les fibroblastes humains par exemple, on les incube, puis pour la

détection de croissance et identification des bactéries, on fait :◦ Coloration de Gimenez.◦ Immunofluorescence (IFI) : si on possède l’Ac ciblant la bactérie que l’on recherche.◦ PCR ciblant l’ARNr 16S.

Poste de travail pour les cultures cellulaires : Hotte à flux laminaire, matériel jetable et stérile.On fait l'observation de cultures cellulaires (tubes, boîtes multi-puits de plastique et flacons) au microscopeoptique inversé. CR : C'est réalisé dans très peu de laboratoires.

Intérêts de la culture cellulaire :

• Isolement de microorganismes intracellulaires stricts (certaines bactéries = Coxiella burnetii, Rickettsiasp, Chlamydophyla sp) et des bactéries de culture fastidieuse (Brucella sp, Francisella tularensis)

• Étude de leur résistance aux antibiotiques !! Si on arrive à isoler une bactérie, on peut lui fairel’antibiogramme et ainsi savoir si elle est résistante ou sensible aux antibiotiques. CR : Cela permetalors d'optimiser la prise en charge du patient.

Limites :• Délai usuel d’obtention du résultat (variable selon les microorganismes)• Culture cellulaire est pratiquée dans des laboratoires spécialisés.

Exemple de microorganismes hautement pathogènes (+/- agents de bioterrorisme) : Coxiella burnetii, Rickettsiaprowazekii. Il faut faire une culture dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique III

À titre indicatif, il y a des inoculations animales, 2 exemples :

è Treponema pallidum : Agent de la syphilis.Non cultivable pour le moment en milieux axénique ou cellulaire Injection intra-testiculaire chez un lapinEn quelques jours une orchite riche en tréponèmes

è Mycobacterium lepraeAgent de la lèpreNon cultivable pour le moment en milieux axénique ou cellulaire Injection dans le coussinet du Tatou à 9 bandes

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Ces techniques ne sont pas réalisées en routine.

V. Spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) :

Principe :➔ Identification bactérienne par une lyse acide des protéines (par l'acide formique (technique abandonnée

car dangereux), acide trifluoro-acétique, les 2, ...) et une matrice (acide cinnamique) qui fournitl'énergie pour ioniser les protéines quand on envoie le laser.

➔ Ionisation essentiellement de protéines par un laser → obtention de spectres.

Les peptides vont s’accélérer et les particules lysées vont voler dans un tube et suivant leur masse / charge, ellesvont avoir un temps de vol différent : les petites particules vont arriver les premières, les plus grosses seront lesdernières. Grâce au détecteur, il envoie un signal et on obtient un spectre en fonction de la masse sur charge(un électrophorigramme), on va avoir l'identification de la bactérie en comparant le spectre avec des bases dedonnées.

Chaque échantillon est étalé sur la cible et recouvert de 2µL de solution de matrice + lyse.CR : L'identification phénotypique est parfois pas très bonne. Avec la spectrométrie de masse, les résultats sontdirectement sur le flacon d'hémoculture, on gagne ainsi au moins 24h. C'est une révolution en bactériologie etc'est vraiment réalisé dans de plus en plus de labos.

B. Diagnostic indirect (Sérologie ++):

➔ Le prélèvement : sérum +++ (sang sur tube sec, ce sont les tubes rouges).➔ On recherche le type d'antigène : bactéries totales, antigènes ou épitopes isolés.

Les principales techniques :• Screening : immunofluorescence indirecte ou ELISA.• Techniques de confirmation : Western Blot.

On recherche la présence d’IgM qui signe une infection précoce le plus souvent et d'IgG qui persiste trèslongtemps.

Dans une interprétation, il faut 2 prélèvements consécutifs à 2 semaines minimum d’intervalle, afin derechercher l'élévation des anticorps et rechercher une séroconversion (donc apparition d'immunoglobulinesqui n'étaient pas présentes avant).

Limite : Manque de spécificité avec possibilité de faux positifs à cause d’une réaction croisée entre bactérieset faux positifs lors d'une infection virale ou après transfusion sanguine.

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I. Sérologie par immunofluorescence indirecte

On a une lame où on dépose l’antigène de la bactérie que l’on recherche puis incubation avec le sérum dupatient, pendant 30 minutes. Si le sérum du patient possède des anticorps contre l'antigène que l'on recherche, ilva s'accrocher.

On faut une deuxième incubation avec les anticorps dirigés contre les Ig humaines (M ou G) et marqués à lafluoroscéine. On observe au microscope à fluorescence (UV). Donc, cette technique est lecteur dépendant,donc c’est un inconvénient. De plus, ce n'est pas évident à lire au microscope.

II. Sérologie par ELISA

On met l’antigène microbien sur un support, puis le sérum du patient et enfin l’anticorps ciblant l’Ig humaineque l’on recherche couplé cette fois ci à une enzyme. Ensuite, on rajoute le substrat, si les anticorps du patient sont fixés, il y a une coloration qui apparaît.

Mesure de la densité optique par lecture avec un automate.

III. Sérologie par Western Blot

C’est une technique de confirmation.1. Séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaire sur gel de polyacrylamide :

électrophorèse de type SDS-PAGE.2. Transfert sur une feuille de nitrocellulose.3. Incubation avec le sérum du patient.4. Incubation avec anticorps ciblant les Ig humaines et couplés à une enzyme.5. Révélation par un substrat.

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Intérêt principal : Diagnostic sérologique spécifique, c’est une technique de confirmation donc c’est plusspécifique que ELISA ou immunofluorescence.

Très grande utilisation du WB pour la maladie de Lyme, infection due à une bactérie Borrelia burgdorferi.CR : C'est une pathologie que l'on retrouve surtout en Alsace et en Auvergne (pour la France), elle esttransmise par les tiques. La symptomatologie clinique n'est pas du tout spécifique. ELISA ou l'immunofluorescence manquent de spécificité. On les fait en premier puis on réalise la confirmationsystématique du dépistage par ELISA avec le Western Blot.

Principales sérologies d'intérêt dans le diagnostic des infections bactériennes

Bactéries responsables d'infections pulmonaires :• Coxiella burnetii.• Chlamydiophila pneumoniae.• Mycoplasma pneumoniae.• Legionella spp

Bactéries responsables d'infections génitales : Treponema pallidum.

Bactéries responsables de maladies disséminées :• Brucellose.• Maladie de Lyme.• Rickettsioses.

Bactéries responsables d’endocardites à hémocultures négatives :• Coxiella burnetii.• Bartonella sp.

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