cryoprotecteurs sur la conservation d’une souche · Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie ... 2.2.2.4.1.2.1Examen à l’état frais 25 ... 3.2.3.2.2Examen après coloration

UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences Biologique

Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de

MASTER ACADEMIQUE

Domaine : Science de la Nature et de la Vie

Filière : Biologie

Spécialité : Microbiologie Appliquée

Présente par : TOUAHRIA Hadjer

Thème

Soutenu publiquement

Le : 10 /06/2015

Devant le jury :

Année universitaire : 2014/2015

UKM Ouargla Présidente Professeur Mme

. SIBOUKEUR.O

UKM Ouargla promotrice M.A.A Mme

. SIBOUKEUR.A

UKM Ouargla Examinatrice M.A.B Melle

. BALLA.A

Effets de quelques cryoprotecteurs sur la conservation d’une souche

de Lactocoques isolée à partir du lait camelin

Remerciement

Avant tout nous remercions Allah le tout puissant

de nous avoir accordé la force, le courage et les

moyens afin de pouvoir accomplir ce modeste

travail.

Je tiens à remercier mon encadreur Mme

SIBOUKEUR Amina , maitre assistante "A" à

université Kasdi Merbah Ouargla qui n’a ménagé

aucun effort pour que ce mémoire puisse voir le

jour. Je lui exprime ma gratitude de m' avoir dirigé, encouragé et surtout aidé afin de

réaliser ce travail.

Je tiens également à présenter mes plus vifs remerciements plus sincères à

SIBOUKEUR Oum-el-kheir, professeur à l'Université Kasdi Merbah d’Ouargla

pour l’honneur qu’elle nous fait en acceptant de présider ce jury.

Je tiens également à présenter mes plus vifs remerciements le A Melle BALLA Asma,

Maitres-assistants B, du Département des Sciences Biologiques ; Faculté des Sciences

de la Nature et de la Vie, Université Kasdi Merbah

d’Ouargla pour l’honneur qu’elle ma fait en

acceptant d’examiner ce travail.

Au personnel de laboratoire, surtout Mr. BEGARI

El Aich, Premier Responsable des laboratoires

pédagogiques,

Enfin, mes remerciements vont à tout (es) ceux qui

ont contribué de près ou de loin à la réalisation de

ce modeste travail .

Dédicace

Je souhaite dédier ce mémoire de fin d’études

A mes chers parents ma mère et mon père qui m’ont toujours

soutenue, encouragée et qui m’ont donné toutes les chances pour

réussir. Merci et mille merci mes parents.

A mes sœur Aicha et Salima et Fatima Zahra

A mes frères Larbi, Abd elbacet , Chick, Mohamed,

Youness, Mustapha.

A mes nièces et neveux Anfall, Israa, Noussiba et Hadj

Anass et Arige

A ma grande famille, grande et petite

A tous mes amis spécialement Sara, Sabrina, Khadra,

Rachida, Hana, Hiba, Nacira, Missou, Intissar, Meriem,

Khaoula, Souhaya et tous mes autres amies

J’aimerai bien leur dire : que je suis très heureuse de

passer tous ces années avec eux, des liens crées, de

nouvelles amitiés, ainsi que, pour tous les moments

Passés ensemble et ceux encore à venir

En fin je dédie ce travail à toute la promotion 2éme

Master

Microbiologie Appliquée 2015.

Liste des abréviations

Concentration

[ ]

Degré Doric

°D

Acide désoxyribonucléique

ADN

Acide ribonucléique ribosomique

ARNr

Bactérie lactique

BL

Carbone dioxygène

CO2

Cryo-protecteur extracellulaire

CPE

Cryo-protecteur intracellulaires

CPI

Dyméthylsulfoxyde

DMSO

Densité optique

DO

Jour J

L'acide lactique

L+

Lactococcus

Lc

Température

T

Liste des figures

page Intitulé

Figures

23 Procédure expérimentale

1

39 Courbe d'étalonnage de la souche isolée

2

40 Evolution de la concentration bactérienne et du pH de la

souche conservée à la réfrigération

3

41 Evolution de la concentration bactérienne et du pH

de milieu de la souche conservée à la congélation sans

cryo-protecteur

4


suspension conservée à la congélation (-20°C) avec

cryo-protecteur DMSO à 5%

5


suspension conservée à la congélation avec cryo-

protecteur Saccharose (12%)

6


suspension conservée à la congélation (-20°C) avec

cryo-protecteur Glycérol (15%)

7

Liste des tableaux

page Titre

N°

05 Production laitière cameline (en tonnes de lait)

I

06 caractères physique du lait cru

II

14 Principaux produits issu de la fermentation des bactéries

lactiques

III

16 Quelques substances utilisés comme cryo-protecteurs

cellulaires d’après

IV

26 Tests d’identification physico-chimiques et

biochimiques des souches, après leur isolement.

V

29 constitution des lots expérimentaux.

VI

30

Caractéristiques physico-chimiques de l'échantillon de

lait camelin

VII

32 Description des colonies isolées à partir du lait camelin

en milieu M17

VIII

35 Caractéristiques morphologiques, biochimique des

souches isolées

IX

Liste des photos

page Titre

Photo N°

32 Colonies isolées sur gélose M17 1

33 Souche de lactocoque après coloration de GRAM (G10x

100)

2

36 Type fermentaire

3

36 Croissance T 10C°

4


5


6

37 Croissance NaCl 2%

7

37 Croissance NaCl 4%

8

37 Croissance NaCl 6,5 % 9

37 Croissance pH=9.2

10

38 Croissance pH =9.6

11

38 Culture sur lait au bleu de Scherham

12

Tableau de matière

Remerciements

Dédicace

Liste des abréviations

Liste des tableaux

Liste des figures

Liste des photos

Introduction 01

I. Partie bibliographique

03 1.1 Le dromadaire

03 1.1.1 Aperçu sur le dromadaire

03 1.1.2Taxonomie

03 1.1.3 Situation de dromadaire

04 1.1.4 Races algériennes

04 1.1.5 Production laitière camelin

04 1.1.5.1 production on mondiale

05 1.1.5.2production on Algérie

06 1.2 Lait de chamelle

06 1.2.1 Généralité sur le lait de chamelle

07 1.2.2Caractéristiques du lait camelin

07 1.2.2.1 Caractéristiques physico-chimiques et organoleptiques

07 1.2.3 Composition chimique

08 1.2.3.1. Fraction azotée

08 1.2.3.2 Matière grasse

08 1.2.3.3Vitamines

09 1.2.4 Propriété technologique et produits fermentés

09 1.2.5 Qualité microbiologique du lait

09 1.2.5.1 Définition

09 1.2.5.2 Microbiologie du lait

10 1.3 Bactéries lactiques

10 1.3.1 Définition

10 1.3.2Caractéristiques générales des bactéries lactiques.

11 1.3.3Propriétés fonctionnelles et technologiques recherchées

11 1.3.3.1Activité acidifiante

11 1.3.3.2Production de métabolites d'intérêt

12 1.3.3.3Propriétés enzymatiques

12 1.3.3.4 Propriétés probiotiques

12 1.3.3.5 Critères de performance

12 1.3.4 Lactocoques

12 1.3.4.1 Définition et caractéristique

13 1.3.4.2 Classification

13 1.3.4.3 Habitat

13 1.3.4.4 Rôles des lactocoques

14 1.4 Conservation et formes commerciales des ferments lactiques

15 1.4.1 Réfrigération

15 1.4.2 Congélation

16 1.4.3 Cryoprotection des bactéries lactiques

17 1.4.3.1 Mécanisme d'action des cryoprotecteur

II. Matériel et méthode

19 2.1 matériel d'étude

19 2.1.1 Lait camelin

19 2.1.2 Milieux utilisées

19 2.1.2.1Milieu M17

19 2.1.2.2 Milieu de conservation

20 2.1.3Appareillage

20 2.1.4 Petit matériel d'étude

21 2.1.5 Produits chimiques et réactifs

21 2.2 Méthodes analytiques

21 2.2.1 Tests physico-chimiques préliminaires du lait

21 2.2.1.1 pH

21 2.2.1.2 Acidité Dornic

22 2.2.2Analyse microbiologiques

22 2.2.2.1Test de la réductase

24 2.2.2.2Isolement de la souche de lactocoque

24 2.2.2.3Ensemencement dans un milieu sélectif

24 2.2.2.4 Pré-Identification de souches isolées

24 2.2.2.4.1Analyses préliminaires

24 2.2.2.4.1.1Observations macroscopiques

24 2.2.2.4.1.1.1Description des colonies

25 2.2.2.4.1.1.2Test de la catalase

25 2.2.2.4.1.2Observations microscopiques

25 2.2.2.4.1.2.1Examen à l’état frais

25 2.2.2.4.1.2.2Examen après coloration de GRAM

26 2.2.2.4.2 Pré-Identification physico-chimique et biochimique des souches isolées

27 2.2.2.4.3Purification par repiquage successif

27 2.2.2.5Propagation de la souche

27 2.2.2.5.1Préparation du pré culture

27 2.2.2.6 Mesure de la croissance

28 2.2.2.6.1 Mesure de la densité optique

28 2.2.2.6.2 Réalisation de la Courbe détalonnage

28 2.2.3 Conservation des souches isolées

28 2.2.3.1 Préparation et inoculation des tubes de conservation

29 2.2.3.2 Mesuré de la croissance après conservation

III- Résultats et discussion

30 3.1 3.1Qualité physico-chimique du lait

30 3.1.1 Mesure du pH

30 3.1.2 Acidité Dornic

31 3.2 3.2 Analyse microbiologique

31 3.2.1. Test de la réductase

31 3.2.2 Isolement de la souche de lactocoque

31 3.2.3 pré-identification et purification de la souche

31 S3 3.2.3.1 Observations macroscopiques

32 3.2.3.1.1 Description macroscopiques

32 3.2.3.1.2 Teste de catalase

33 3.2.3.2Observations microscopiques

33 3.2.3.2.1 Examen à l’état frais

33 3.2.3.2.2Examen après coloration de GRAM

34 3.2.4 Tests physicochimique et biochimique des souches isolées

38 3.2.5 purification de la souche

38 3.2.6 Mesure de la croissance durant la conservation

38 3.2.6.1 Courbe d'talonnage

39 3.3 conservation de la souche isolée

39 3.3.1 Réfrigération

40 3.3.2 congélation sans cryo-protecteur

41 3.3.3congélation avec cryo-protecteur

40 3.3.3.1 DMSO

43 3.3.3.2 Saccharose

44 3.3.3.3 Glycérol

46 Conclusion

47 Référence bibliographique

Annexe

Introduction

Introduction

1

Introduction

Le lait est un aliment indispensable pour la vie. Il constitue un produit de base dans

le modèle de consommation algérienne. Malgré cela, la production laitière algérienne ne

permet pas l’autosuffisance, car l’accroissement du cheptel arrive à peine à suivre l’évolution

de la population (YAKHLEF, 1989).Le lait représente environ 22 % des importations

alimentaires totales du pays (AMELLAL, 1995).L’Algérie représente ainsi, le deuxième

importateur de lait et dérivés, après le Mexique. Une élévation de la croissance des

importations laitières estimée à 57 % en moyenne par an, à été enregistrée entre 1996 et 2004

(SOUKI ,2009).Pour toutes ces raisons, l’Algérie a besoin de la moindre ressource en lait, en

l’occurrence celle de la chèvre, de la brebis et de la chamelle particulièrement adaptée aux

rudes conditions agro climatiques du Sahara (SIBOUKEUR, 2011).

Dans ce contexte, le lait de chamelle constitue de puis des temps très lointains, la

principale ressource alimentaire pour les peuplades nomades qui le consomment

habituellement à l'état cru ou fermenté. Il est considéré comme l’aliment de base pour une

période annuelle prolongée, dans la plupart de ces zones pastorales sahariennes

(SIBOUKEUR, 2007).

Ce lait possède un certain nombre de particularités liées à sa composition physico-

chimique, biochimique et microbiologique. Parmi ces particularités, on signale sa teneur

relativement élevée en vitamine C et en niacine (vit. B3). Sa composition en éléments

minéraux paraît plus riche que celle du lait de vache surtout en Calcium et en Potassium

(SBOUI et al., 2009). L’activité antimicrobienne du lait de chamelle est supérieure à celle du

lait de référence (EL-AGAMY et al., 1992). Cette activité est due à la présence de teneurs

assez importantes en facteurs antimicrobiens tels que la lactoferrine, le lysozyme, des

immunoglobulines, bactériocines produites par les bactéries lactiques comparables à celles de

l’être humain. Le lait camelin possède par ailleurs, certaines propriétés thérapeutiques

(SOUID ,2011).

Ces derniers composants la microflore du lait cru, participe de façon importante à

l'élaboration des caractéristiques organoleptiques des produits laitiers fermentés. De

nombreuses études montrent que les produits laitiers préparés traditionnellement à partir du

Introduction

2

lait cru ont des saveurs typiques et des qualités nutritionnelles de plus en plus recherchées par

le consommateur (BALLA, 2011).

Les bactéries lactiques ont été utilisées pour la fabrication et la conservation des

aliments. La découverte de leur action sur le lait fut probablement accidentelle mais leur

utilisation fut perpétuée sous forme de levains naturels (CHAMMAS et al., 2006).

L'existence d'un souchier de bactérie lactique au niveau d'une usine de transformation

du lait permet d'assurer une meilleure régularité des fabrications et une réalisation en routine

de l'ensemencement direct du lait. Il existe plusieurs méthodes de conservation de ces

souches. Toutefois celles-ci affectent souvent la viabilité des souches d'intérêt, en l'occurrence

les souches acidifiantes et/ou les souches aromatisants, si certaines précautions ne sont pas

prises. Parmi les nombreux facteurs qui interviennent efficacement sur la survie des souches,

l'addition de cryoprotecteurs au milieu de conservation. Ces substances permettent aux

cellules bactériennes de mieux supporter les basses températures lors des traitements de

conservation et/ou lors du stockage (BALLA, 2011).

Dans ce contexte, notre travail vise à la conservation d’une souche de lactocoques

isolée à partir du lait camelin cru, en les étapes suivantes :

Isolement de la souche sur milieu sélectif M17.

Pré-identification, par des tests physico-chimiques et biochimiques.

Conservation de la souche dans un milieu de conservation sous différentes conditions:

Réfrigération, congélation sans et avec cryo-protecteur (Glycérol 15%, DMSO 5% et

Saccharose 12%).

Partie

bibliographique

Partie bibliographique

3

I. Partie bibliographique

1.1 Le dromadaire

1.1.1 Aperçu sur le dromadaire

Le dromadaire occupe une place de choix dans les zones arides et semi arides, en

raison de son excellente adaptation aux mauvaises conditions de vie, tels que le manque d'eau

et de pâturage; mais malgré tout cela, il est apte à produire un lait de bonne qualité

(MAHBOUB et al., 2012).

1.1.2Taxonomie

La taxonomie du dromadaire selon WILSON (1984) est la suivante:

Règne : Animalia

Embranchement : Chordata

Classe : Mammalia

Ordre : Artiodactyla

Sous ordre : Tylopoda

Famille : Camelidae

Sous famille : Camelinae

Genre : Camelus

Espèce : Camelus dromedarius

1.1.3 Situation de dromadaire

Le dromadaire vit dans les régions chaudes, arides et semi-arides de la planète. Il

serait originaire de l’Amérique du Nord ou le plus ancien fossile de Camelidae a été trouvé et

d’ou il aurait rejoint l’Asie et l’Afrique, a la suite des glaciations qui sévirent dans

pratiquement la quasi totalité de l’hémisphère nord de la planète durant l’ère tertiaire (DICK

et al., 2011).


4

1.1.4 Races algériennes

Les différentes races rencontrées en Algérie se retrouvent dans les trois pays d'Afrique

du Nord; ce sont des races de selle, de bât et de trait. Il s'agit des races suivantes: Le Chaambi

L'Ouled Sidi Cheikh, le Saharaoui, l'Ait Khebbach, le Chameau de la Steppe, le Targui ou

race des Touaregs du Nord, L'Aier, le Reguibi et le Chameau de I'Aftouh (BEN AISSA,

1989).

1.1.5 Production laitière camelin

1.1.5.1 Productions mondiales

Avant d’évoquer les performances individuelles, on peut situer la production laitière

caméline dans l’ensemble de la production mondiale. On n'estime que 85 pour cent du lait

produit et commercialisé à travers le monde provenir de la vache. La femelle du dromadaire

occupe une place minime (quelques pourcentages), loin derrière la bufflonne ou même la

chèvre et la brebis. Avec un cheptel camelin 70 fois moins important que le cheptel bovin, un

tel décalage est justifié. D’après les statistiques officielles éditées par la FAO, la production

mondiale de lait de dromadaires et chameaux (la distinction n’est pas faite) se montait en

2002 à 1 283 672 tonnes de lait avec une précision surprenante concernant l’Iraq (FAYE,

2004) (tableau I).

Au-delà du fait que ces données sont incomplètes (il y manque notamment tous les

pays d’Asie centrale et quelques pays du Proche-Orient et Moyen-Orient), on constate parfois

un fort décalage entre la population estimée et la production annoncée, comme par exemple

au Soudan où l’effectif camelin représente la moitié du cheptel somalien pour une production

laitière estimée 10 fois inférieure. Une estimation différente peut être formulée à partir de

l’extrapolation de la production attendue pour une femelle allaitante. Si on retient une

population mondiale de l’ordre de 20 millions de têtes, chiffre vraisemblablement sous-

évalué, une proportion de femelles allaitantes de l’ordre de 18 pour cent (HJORT AF

ORNÄS, 1988) et une production moyenne de 1 500 litres par an, la production mondiale

peut être estimée à 5,4 millions de tonnes dont 55 pour cent environ est prélevée par les

chamelons. Il existe donc une forte incertitude sur la production réelle de lait de chamelle au

niveau mondial d’autant plus qu’une part importante de celle-ci demeure écartée des circuits

marchands (FAYE, 2004).


5

Tableau I: Production laitière cameline (en tonnes de lait) (FAYE, 2004)

1.1.5.2Production en Algérie

En Algérie, et en général, les camelins ne sont pas considérés comme producteurs de

lait. L’excédent de la traite de lait n’est utilisé que pour l’autoconsommation, et ce la après

que le chamelon ait tété sa mère. Une chamelle ne se laisse traire que si son petit est à ses

côtés. La production de lait entre, pour la majeure partie, dans l’alimentation des bergers

isolés dans les parcours et des nomades. La production laitière des chamelles varie d’une

Les payes Production laitière camelin

Afghanistan 8 100

Algérie 8 000

Arabie saoudite 89 000

Chine 14 400

Djibouti 5 900

Emirats arabes unis 33 400

Erythrée 5 100

Ethiopie 22 450

Iraq 672

Kenya 25 200

Jamahiriya arabe libyenne 2 000

Mali 54 900

Maroc 3 900

Mauritanie 21 500

Mongolie 1 000

Niger 10 800

Qatar 13 300

Somalie 850 000

Soudan 82 250

Tchad 21 800

Tunisie 1 000

Yémen 9 500

Total 1 283 672


6

région à l’autre, en fonction de la race, de l’individu, de l’alimentation….. etc. (FAYE et al.,

2003).

1.2 Lait de chamelle

1.2.1 Généralité sur le lait de chamelle

Le lait est un produit naturel sécrété par les mammifères. A la fois aliment et boisson,

il est donc d’un grand intérêt nutritionnel et se prête à de nombreuses applications culinaires,

industrielles et technologiques (FREDOT, 2009).

C'est en 1909 que le Congrès International de la Répression des Fraudes a défini ainsi

le lait: "Le lait est le produit intégral de la traite totale et ininterrompue d'une femelle laitière

bien portante, bien nourrie et non surmenée. Il doit être recueilli proprement et ne pas contenir

de colostrum"(FALL, 1997).

Le lait de chamelle, comme celui des autres mammifères, est un milieu de

composition chimique et physique complexe qui permet au jeune chamelon de couvrir ses

besoins énergétiques et nutritionnels pendant la première étape de son existence (SBOUI et

al., 2009) (tableau II).

Tableau II: Caractères physique du lait cru (LARPENT et al, 1997).

Caractère normal Caractère anormal

Couleur Blanc mat

Blanc jaunâtre :

Lait riche en crème

Gris jaunâtre :

Lait de mammite

Bleu, jaune…

Lait coloré par des

Substances chimiques ou des

pigments bactériens

Odeur Odeur faible Odeur de putréfaction, de moisi de

rance ….

Saveur Saveur agréable Saveur salée :

Lait de mammite

Gout amer:

Lait très pollué par des bactéries

Consistance Homogène Grumeleuse : mammite

Visqueuse ou coagulée:

Pollution bactérienne


7

1.2.2Caractéristiques du lait camelin

1.2.2.1 Caractéristiques physico-chimiques et organoleptiques

Le lait est un liquide blanc mat, légèrement visqueux, dont la composition et les

caractéristiques physico-chimiques varient sensiblement selon les espèces animales, et même

selon les races. Ces caractéristiques varient également au cours de la période de lactation, de

la traite ou de l'allaitement. Elles sont aussi tributaires de la nature de l'alimentation des

animaux (OUADGHIRI, 2009). Il a un gout assez doux, légèrement âpre et parfois salé. A la

traite et lors des transvasements, il forme une mousse abondante. Comparé au lait de vache, le

lait de chamelle s’acidifie très peu. Il peut être conserve longtemps sans réfrigération (3 jours

à 30°C et 2 semaines à 7°C) (SENOUSSI, 2011).

Selon une étude menée par SIBOUKEUR, (2012) le pH des de ce lait est égal à 6,65

± 0,25 ». Le pH du lait camelin frais se situe entre 6,5 et 6,7; un léger abaissement du pH à

6,4 et 6,0 est aussi enregistré. Le pH du lait camelin est similaire à celui du lait de brebis,

mais un peu acide par rapport à celui du lait bovin, ce dernier se situe entre 6,6 et 6,8 et moins

dense (d= 1,027± 0,003) que le lait de vache, alors que son acidité Dornic est égale à 14,5 ±

1,37(SOUID, 2011). Sa densité relativement plus faible par rapport au lait bovin qui est égale

à 1,023 ± 0,0047(SBOUI, 2009). Parallèlement les analyses montrent que le lait collecté

présente globalement une composition en nutriments de base (protéines, matière grasse et

lactose) très similaire à celle du lait bovin. Cependant, ce lait se singularise par une teneur

élevée en Vitamine C (teneur moyenne évaluée à 41,40 mg/l ±8,20) (SIBOUKEUR, 2012). La

viscosité du lait de chamelle est plus faible que celle du lait de vache (SENOUSSI, 2011).

1.2.3 Composition chimique

Des travaux antérieurs ont montré que le lait de chamelle est plus pauvre en matière

sèche et en matière protéique que celui de vache. Cette différence peut être due à

l’alimentation des animaux, aux conditions environnementales ainsi qu’au stade de lactation

(SBOUI, 2009).

La composition du lait camelin a été considérée comme la moins stable comparée à

celle des laits des autres espèces, bovine en l’occurrence. La variation de la composition du

lait camelin peut être attribuée à plusieurs facteurs, comme la localisation géographique, les

conditions alimentaires, la race, le stade et le rang de lactation (SOUID, 2011).


8

1.2.3.1. Fraction azotée

Selon SIBOUKEUR, (2007) la fraction azotée du lait de chamelle, comme celle du lait

de vache, est repartie en deux sous fractions : l’azote protéique et l’azote non protéique. La

première fraction azotée protéique représente 90 à 95% de l’azote total du lait de chamelle

(contre 94 à 95% pour le lait bovin). La deuxième fraction azotée non protéique, qui

représente 5 à 10%, est environ deux fois plus élevée que celle généralement retrouvée dans le

lait de vache. Cette dernière fraction est caractérisée par une haute valeur biologique qui est

due à sa richesse en acides aminés libres, en nucléotides et en certains précurseurs de

vitamines ainsi que des peptides, de l’acide urique, de l’urée, de la créatine, …etc.

1.2.3.2 Matière grasse

Le lait de chamelle est en moyenne plus faible en matière grasse que le lait de vache.

Cependant, les globules gras du lait de chamelle sont de très petites tailles (1,2 à 4,2 μ de

diamètre) et restent donc en suspension même après 24 heures de repos, contrairement au lait

de vache dans lequel ces globules constituent une couche grasse en surface au bout de

quelques heures (CHETHOUNA, 2011).

Par ailleurs, la matière grasse du lait de chamelle apparait liée aux protéines, tout ceci

explique la difficulté à baratter le lait de chamelle pour en extraire le beurre. Comparée au lait

de vache, la matière grasse du lait de chamelle contient moins d’acides gras à courtes chaines.

Cependant sa teneur en acide gras volatils et en acides gras non saturés est importante

(CHETHOUNA, 2011).

1.2.3.3Vitamines

Le lait de chamelle est riche en vitamines, affichant même des teneurs en vitamines

B3, B6, B12 supérieures à celles du lait bovin. Toutefois, les vitamines A, B1, B2, B5, B9, et E se

trouvent à des taux similaires, parfois légèrement inférieurs aux valeurs rapportées dans le lait

de référence (CHIBBAH, 2011). Le lait camelin présente la particularité d’être riche en

vitamine C (25 à 60 mg/l).Ces teneurs élevées améliorent la valeur nutritionnelle du produit

surtout que les sources en cette vitamine dans les régions arides demeurent insuffisantes

(CHIBBAH, 2011).


9

1.2.4 Propriété technologique et produits fermentés

Comparé au lait de vache : le lait de chamelle est pauvre en caséines, protéines

responsables de la consistance du lait coagulé et l'équilibre minéral de ce lait, en particulier,

amplifie son inaptitude à la coagulation. Le lait de dromadaire offre une résistance plus

marquée aux fermentations lactiques. La matière grasse du dromadaire est riche en acides gras

insaturés et plus particulièrement en acide palmitoléique ce qui fait que le point de fusion de

cette matière grasse est relativement bas. En plus de cela, la taille des globules gras est

relativement petite (KAMOUN, 1995).

Ces différences, expliquent que le lait de dromadaire ne peut pas être transformé en

yoghourt, fromage et beurre par l'application des diagrammes technologiques classiques. Les

difficultés de transformation de ce lait seraient contournables par des adaptations

technologiques couramment utilisées en industrie laitière pour corriger les laits (KAMOUN,

1995).

1.2.5 Qualité microbiologique du lait

1.2.5.1 Définition

La qualité des matières première et des aliments est définie par les contraintes des

transformateurs, les attentes des consommateurs et les exigences réglementaires. Les

composantes de la qualité sont multiples (JEANTE et al, 2006). La qualité hygiénique du lait

est étroitement liée aux conditions d’élevage et, en particulier, de niveau d’hygiène des locaux

(stabulation, traite, stockage du lait), de l’eau et de l’alimentation et de la traite (JEANTE et

al., 2006).

1.2.5.2 Microbiologie du lait

Une fois dans le lait, un microorganisme doit composer avec l’écosystème dans lequel

il se trouve, c'est-à-dire avec le milieu et les facteurs qui lui sont propres (pH, composition en

nutriments, potentiel redox, disponibilité de l’eau…) ainsi qu’avec les autres microorganismes

présents simultanément avec qui il va interagir de façon positive ou négative. Or, les

microorganismes ont des exigences nutritionnelles et physiologiques ainsi que des niches

écologiques qui leurs sont propres. Au sein de chaque groupe, il existe des spécificités liées

au genre, a l’espèce, à la sous-espèce, ou encore à la souche concernée (LAITHIER, 2011).


10

Divers microorganismes peuvent être retrouvés dans les laits crus. Les plus rencontrés sont les

bactéries lactiques, mais des levures, des moisissures, des virus et divers protozoaires peuvent

également être présents. Ils diffèrent notamment par leur taille et leur niveau de complexité

(LAITHIER, 2011).

1.3 Bactéries lactiques

1.3.1 Définition

Les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram positif, anaérobies partiellement

tolérantes à l'oxygène, ne produisant pas de spores en général, se présentant sous formes de

coques ou de bâtonnets et capables de fermenter les sucres en acide lactique. On les

caractérise aussi par le faible contenu de leur ADN en paires de bases G-C guanine cytosine

(< 50 %) sauf pour les bifidobactéries qui ont un taux supérieur à 50 % de GC. Elles ont pour

habitat de nombreux milieux naturels et accompagnent l'activité humaine en tant que bactéries

de la flore commensale des muqueuses et de la flore alimentaire. Elles sont exigeantes d'un

point de vue nutritionnel car elles sont incapables de synthétiser un certain nombre d'acides

aminés (on dit qu'elles sont auxotrophes pour ces composés). La bactérie lactique modèle,

Lactococcus lactis est auxotrophe pour 7 à 12 acides amines selon les souches. L'incapacité à

synthétiser ces acides aminés nécessaires à leur croissance, oblige les bactéries lactiques à

trouver ces molécules dans leur milieu via un processus de nutrition azoté. Ces dernières

demandent pour leur culture des milieux riches en sucres, acides aminés, acides gras, sels et

vitamine et pauvres en oxygène. Elles sont généralement cultivées dans la gélose MRS (de

Man, Rogosa, Sharpe). Elles sont aptes à survivre dans des milieux très acides (De

ROISSART et LUQUET, 1994).

1.3.2Caractéristiques générales des bactéries lactiques.

Les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram positif, immobiles, asporulées,

catalase et oxydase négatives, nitrate réductase négative, anaérobies ou aérotolérantes

(LAURENT et al, 1998).

Elles sont se trouvent sous forme de cocci ou des bâtonnet (BOURGEOIS et LARPENT,

1996).

- Elles ont des besoins complexes en facteurs de croissance: vitamine B, acide aminés,


11

peptides, bases puriques et pyrimidique.

- Certaines bactéries lactiques ont été isolées de nombreux milieux naturels végétaux

et animaux tels que le lait cru, l'environnement, les cavités buccales et vaginales

(LUQUET, 1986).

- Elles produisent des quantités abondantes d'acide lactique par fermentation de

substances hydrocarbonées.

- Elles se caractérisent par un métabolisme exclusivement fermentaire qui les conduit

à produire a partir du glucose des quantités importantes d'acide lactique,

accompagné dans certains cas d'autres métabolites (éthanol, CO2, autres acides

organiques).

- Elles ont une capacité de biosynthèse faible (LUQUET, 1986).

1.3.3Propriétés fonctionnelles et technologiques recherchées

L'utilisation des bactéries lactiques pour une application industrielle donnée est

déterminée par leurs propriétés fonctionnelles et technologiques. Celles-ci recouvrent les

propriétés suivantes :

1.3.3.1Activité acidifiante

La transformation du sucre assimilable en acide lactique conduit à L'acidification du

produit. Cette acidification accroît sa durée de vie, en limitant sa contamination par les

microorganismes d'altération ou pathogènes, et lui confère des caractéristiques

organoleptiques particulières (FRANK et al., 1998; MÄYRÄ-MÄKINEN et al., 1998).

1.3.3.2Production de métabolites d'intérêt

Selon les espèces et selon les souches, les bactéries lactiques sont capables de

produire des métabolites tels que l'acide acétique, l'éthanol, des arômes (diacétyle,

acétaldéhyde,), des bactériocines (Agents antimicrobienne), des exopolysaccharides, des

enzymes (protéases, peptidases, lipases,) et du CO2 (formation d'ouvertures dans les

fromages) (FRANK et al., 1998; MÄYRÄ-MÄKINEN et al., 1998; BEAL et al., 2008).


12

1.3.3.3Propriétés enzymatiques

Les activités protéolytiques et peptidasiques sont importantes car elles déterminent la

capacité des bactéries lactiques à utiliser la fraction azotée du milieu. L'activité lypolytique

présente, de plus, un intérêt pour les applications fromagères (BEAL et al., 2008).

1.3.3.4 Propriétés probiotiques

En plus des activités précédentes, les souches probiotiques doivent être résistantes aux

acides gastriques et aux sels biliaires rencontrés lors de leur passage dans l'estomac, le

duodénum et l'intestin (DA CRUZ et al., 2007). De plus, elles présentent des propriétés

thérapeutiques spécifiques à chaque souche, principalement en termes d'activités

immunostimulantes et anti-diarrhéiques.

1.3.3.5 Critères de performance

Indépendamment de la propriété fonctionnelle envisagée, les bactéries lactiques

doivent être résistantes aux bactériophages, aux traitements mécaniques, à la congélation ou à

la lyophilisation et au stockage. Elles doivent également être tolérantes aux inhibiteurs de la

croissance (antibiotiques, acidité, éthanol, chlorure de sodium) (BEAL et al., 2008).

1.3.4 Lactocoques

1.3.4.1 Définition et caractéristique

Les lactocoques sont des bactéries lactiques mésophiles appartenant à la famille des

Streptococaceae. Ils se trouvent principalement dans les laits et crèmes fermentés ainsi que

dans les fromages où ils sont en quantité dominante (DESMAZEAUD, 1996).

Les lactocoques se présentent sous forme de coque (habituellement de 1 μm de

diamètre) qu'on trouve isolément, en paire ou en chaînes de longueur variable

(DESMAZEAUD, 1996). Ce sont des organismes homofermentaires ne produisant que de

l'acide lactique L (+), anaérobies facultatifs à micro aérophiles (DELLAGLIO, 1994). Ils se

distinguent par la présence, dans leur enveloppe, d’antigène du groupe N, par leur caractère

faiblement α-hémolytique et non β-hémolytique, par leur température de croissance minimale

inférieur ou égale à 10°C et optimale voisine de 30°C, par leur thermo sensibilité et leur

inaptitude à croître en présence de 6,5% de NaCl et à pH 9.6 (DEROISSART, 1986).


13

1.3.4.2 Classification

Traditionnellement, les streptocoques lactiques mésophiles ont été rattachés au genre

Streptococcus. En se fondant sur des critères moléculaires, SCHLEIFIER et al., (1987) ont

montré qu'il est justifié de créer le genre Lactococcus, formé d’espèces nettement distinctes

des autres coques à Gram + et à catalase (-). Ces travaux ont d'ailleurs été confirmés par le

séquençage de l’ARNr 16 S (DEROISSART et LUQUET, 1994).

Actuellement, ce genre comporte plusieurs espèces et sous-espèces dont les plus

importantes en industrie laitière sont (GUIRAUD, 1998) :

- Lc.Lactis subsp .lacti.

- Lc. Lactis subsp.lactis biovar diacetylactis.

- Lc. Lactis subsp. Cremoris.

1.3.4.3 Habitat

Les lactocoques peuvent être isolés du lait ou des végétaux qui sont probablement leur

réservoir naturel. Ces bactéries ne se trouvent pas dans les selles ni dans le sol (NOVEL,

1993).

1.3.4.4 Rôles des lactocoques :

Les lactocoques ont une grande importance dans l'industrie agro-alimentaire et en

particulier dans l'industrie de transformation laitière. Ils sont classés en souches acidifiantes :

Lc.Lactis subsp lactis et cremoris et en souches aromatisantes : Lc. Lactis subsp.lactis biovar

diacetylactis (NOVEL, 1993).

Ces souches sont utilisées, comme ferments mésophiles, en particulier pour le

fabrication de fromages frais : Quarg, Féta, Cottage cheese ; de fromages à pâte molle :

Camembert, Brie, Pont Evêque, Coulommiers ; de fromages à pâtes pressées : Cheddar,

Gouda, Edam ou des fromages à pâte persillée : Roquefort, Gorgonzola et autres fromage

bleus (FOX et al., 1993 ; LOONES, 1994) (tableau III). Elles sont utilisées encore pour la

préparation du kéfir, du beurre et de certains laits fermentés tel que le vili finlandais

(HERMIER et al., 1992).Ces bactéries procèdes d'autres rôles utiles comme : Production

d’acide lactique, Production d’arômes, Activité protéolytique, Activité lipolytique…. etc.


14

Tableau III: Principaux produits issu de la fermentation des bactéries lactiques

Genre Substrat Exemples de produits

Bifidobacterium

Lactobacillus

Lactococcus

Leuconostoc

Pediococcus

Oenococcus

Streptococcus

Lait

Lait

viande

végétaux

céréales

lait

végétaux

lait

végétaux

viande

végétaux

lait

laits fermentés

yaourts, laits fermentés,fromages

saucissons secs, jambons secs

choucroute, olives, "yaourts"

pain au levain, bières

fromages, kéfirs

choucroute, olives, vin

fromages, kéfirs

choucroute

saucisses semi-séchées

vin

yaourts, laits fermentés,

fromages

Ces bactéries permettent de changer la saveur de l’aliment et sa texture. Ces

changements sont dus notamment à l’acide lactique produit au cours de la croissance. D’autre

part, les BL produisent des peptides et des molécules comme l’acétone, l’acétaldéhyde, le

diacétyle ou l’éthanol qui sont importants pour la flaveur des aliments. Un autre rôle des BL

est d’inhiber le développement de la flore bactérienne indésirable qu’elle soit pathogène ou

d’altération. Cette inhibition passe par deux aspects : l’acidification qui inhibe la croissance

des bactéries peu résistantes à un bas pH, et la synthèse de bactériocines talque la nisune,

molécules bactéricides dont les spectres d’action sont variables (KLAENHAMMER, 1988).

Certaines BL comme L. helveticus sont utilisées pour produire industriellement de

l’acide lactique employé comme additif en alimentation et dans les produits cosmétiques ou

pharmaceutiques. L’acide lactique est aussi transformé en acide polylactique, polymère bio

résorbable utilisé dans la fabrication d’implants pour la chirurgie osseuse ou pour la

fabrication de films plastiques biodégradables. Leuconostoc mesenteroides est utilisé pour la

production de dextran, médicament utilisé dans les cas d’hypovolémie sanguine.

1.4 Conservation et formes commerciales des ferments lactiques

La préparation en laiterie des levains de bactéries lactiques destinés à la fabrication

des produits laitiers fermentés tels que: fromages, beurre et laits fermentés, est une opération

délicate et coûteuse. Elle constitue pour les laiteries une charge importante en investissements


15

(matériel, cuves à levains) et en main-d'œuvre spécialisée, aussi bien au stade de l'entretien

des souches qu’au laboratoire de la laiterie. Lors de la préparation proprement dite du levain à

l'usine, des « accidents » peuvent se produire: contaminations diverses et attaques de

bactériophages. Ils ont pour résultat un mauvais développement des bactéries du levain et

éventuellement des fabrications défectueuses. C’est pour cela qu’il existe plusieurs

laboratoires étrangers étudiant actuellement ce problème. On trouve aux Etats- Unis des

suspensions concentrées et congelées de bactéries lactiques utilisables pour la fabrication des

produits laitiers (ACCOLAS et AUCLAIR, 1967).

1.4.1 Réfrigération

La conservation à basse température réduit la croissance et l’activité des bactéries à

l’origine de la dégradation et prolonge la durée de conservation du lait. La conservation à des

températures en dessous du minimum de croissance entraîne une prolongation continue de la

phase de latence jusqu’à ce que la multiplication cesse et la croissance du microorganisme

s’arrête (DOYLE et a.l, 1997).

D’autre part, aux températures comprises entre 0 et 10°C des changements mineurs

dans les conditions physico-chimiques ont de grands effets sur la croissance bactérienne

(KORKEALA et al., 1989). Toute fois la réfrigération ne tue pas ou n’élimine pas une

contamination microbienne. Elle permet la croissance, le développement aux seuls

microorganismes psychrophiles capables de croître sur le lait à des températures en dessous

de 7°C (RUTHERFORD et al., 2007). La réfrigération du lait dès la ferme et son stockage

pendant un temps plus ou moins long sélectionne des bactéries psychrotrophes qui peuvent

devenir alors une flore dominante. Parmi ces bactéries le genre Pseudomonas est le plus

fréquent (MIRANDA et GRIPON, 1986).

1.4.2 Congélation

La congélation est actuellement la technique de conservation des bactéries lactiques la

plus utilisée dans le domaine agro-alimentaire. Une bonne maîtrise de cette opération est

nécessaire pour éviter ou minimiser les pertes de viabilité liées à l'abaissement de la

température et à la formation de glace au cours de la congélation.

Par rapport à la lyophilisation, elle permet une reprise d'activité plus rapide des

ferments et présente un coût de fabrication inférieur à celui des ferments lyophilisés.


16

Cependant, elle induit aussi des pertes de viabilité, inégalement maîtrisées jusqu'à,

présent. De plus les ferments congelés nécessitent une attention spéciale par rapport au

maintien de la chaîne du froid. Lors de leur transport et leur stockage. Il est aussi préconisé

que les bactéries congelées, soient stockées à des températures inférieures à -45 °C afin

d'assurer la stabilité de la qualité et de l'activité des ferments (STREIT, 2008). Cependant la

congélation à une température de – 20°C permet une conservation de la plus part des

microorganismes pendant 1 à 2 ans et le métabolisme de ces derniers en dessous de -18°C est

totalement inhibé (LARPENT, 1997).

1.4.3 Cryoprotection des bactéries lactiques

Il existe des substances protectrices qui permettent aux cellules de mieux supporter

une congélation ou une décongélation lentes et un stockage à température supérieure à - 50°C

appelées cryoprotecteurs (FONSECA et al., 2001). Ces substances sont groupées en deux

classes qui ne sont pas forcement exclusives (tableau IV). On distingue ainsi les substances

qui pénètrent dans les cellules (cryoprotecteurs intracellulaires, CPI) et celles qui demeurent à

l’extérieur des cellules (cryoprotecteurs extracellulaires, CPE),(BEAL et al., 2008).

Les bactéries contiennent naturellement des cryoprotecteurs : les sucres (sucrose et le

tréhalose), chez les bactéries GRAM+ les polyols (glycérol, sorbitol, et mannitol), que l'on

retrouve chez les algues, les champignons, les levures, les plantes et certains bactéries (KETS

et al., 1996 ; HANS et al., 1995).

Tableau IV: Quelques substances utilisés comme cryo-protecteurs cellulaires (LEJARD et

al., 1994).

agents Intracellulaires (CPI) Extracellulaires (CPE)

Poids moléculaire < 400 >10.000

Activité a une

concentration de l'ordre de

mole (M) milli mole (mM)

Exemple de molécules

utilisées

Glycérol,

dyméthylsulfoxyde,

méthanol éthanol,

polyéthylène oxyde,

(PEO-400), diméthyl

acétamide 1-2 propanediol

polyvinyl pyrolidone,

Amidon hydroxyéthyle,

dextrane


17

1.4.3.1 Mécanisme d'action des cryoprotecteur

Les mécanismes de la cryo-protection sont l’objet de nombreuses études de nos jours.

Les modes d’action les plus probables sont : un accroissement du volume de la phase liquide

interstitielle, à une température donnée, par dépression du point de congélation commençante

et donc réduction des effets liés à un refroidissement lent ; une diminution de la taille des

cristaux de glace par abaissement de la température de nucléation et une réduction de leur

vitesse de croissance et une stabilisation de la configuration native des protéines (LESLIE et

al., 1995). Lorsque les premiers cristaux de glace apparaissent, les CPE se concentrent

uniquement à l’extérieur des cellules, contrairement aux autres solutés qui se concentrent à

l’intérieur et l’extérieur des cellules. La perte d’eau des cellules conduit donc à une

concentration en autre soluté, plus faible qu’en absence de CPE, minimisant ainsi les effets de

l’accroissement de concentration de la solution interstitielle. Au niveau des membranes

cellulaires séchées, des sucres comme le tréhalose et le saccharose peuvent remplacer les

molécules d'eau dans leur liaison avec les groupes polaires des phospholipides empêchant

ainsi les dommages durant la réhydratation (LESLIE et al., 1995). Le tréhalose et le

saccharose stabilisent la structure des protéines intracellulaires par ce phénomène de

remplacement de l'eau (CARPENTER et al., 1993).

D’autres études ont montré que les cryoprotecteurs étaient indispensables lors de la

congélation quelles que soient les courbes de refroidissement. Tous les cryoprotecteurs ne

pénètrent pas dans les cellules (CARPENTER et al., 1993).

Il est d'usage de les séparer en cryoprotecteurs non diffusants (la plupart des sucres

ajoutés) et diffusants (le glycérol, l'éthylène glycol, par exemple) (PEGG et al., 1988). Les

cryoprotecteurs diffusants vont se substituer à une partie de l'eau intracellulaire et permettre

ainsi une déshydratation partielle des cellules en plus de limiter la formation de cristaux de

glace intracellulaire. Ils réduisent également la vitesse de croissance de ces cristaux, abaissent

la température de solidification de l'eau intracellulaire, tel un « antigel », et modifient la forme

des cristaux de glace (HEY et al. 1998). Quand aux cryoprotecteurs pénétrants, ils protègent

aussi au cours de la congélation et de la décongélation en réduisant la taille des cristaux de

glace et en induisant des formes de cristaux moins traumatisantes. Ils permettent, via

l'augmentation de la viscosité du milieu, la diminution de la rapidité des mouvements de l'eau

et de chocs osmotiques importants. De plus, ils permettent, via l'augmentation de la pression


18

osmotique, la réduction de la quantité de cryoprotecteurs pénétrants nécessaires à une bonne

conservation (MERYMAN, 1974).

Matériel et méthodes


19

II. Matériel et méthode

2.1 Matériel d’étude

2.1.1 Lait camelin

Les échantillons de lait utilisés proviennent de troupeaux de chamelles vivant en extensif

dans la région de Ouargla. Le lait est trait à partir de chamelles saines .Les échantillons de laits ont

été mis dans des flacons propres stérilisés, et transportés au laboratoire dans une glacière. Nous

avons utilisé dans cette étude un lait de mélange.

2.1.2 Milieux utilisés

2.1.2.1 Milieu M17

Le bouillon M17 a été mis au point pour la culture et dénombrement des lactocoques dans

le lait et les produits laitiers. Il favorise la culture des mutants in capables de fermenter le

lactose. Il est bien adapté à la culture de l'espèce Lactococcus lactis qui est un microorganisme

particulièrement exigeant.

TERZAGHI et SANDINE ont montré le milieuM17, et d'augmenter le développement des

streptocoques lactiques qui sont des microorganismes produisant d'importantes quantités d'acide

par l'utilisation homofermentative du lactose.

Les peptones de, caséine, de viande et de soja, contiennent les sources de carbone et d'azote

nécessaires à la culture des lactocoques. L'extrait de levure est une source de vitamines du

groupe B. L'acide ascorbique agit comme stimulateur de croissance. Le lactose est fermenté en

acide lactique. Celui-ci est progressivement neutralisé par le glycérophosphate de sodium afin de

stabilisé le pH du milieu (TERZAGHI et SANDINE, 1975 ; ANONYME 1, 2003 ; ANONYME

2, 2004). La composition de ce milieu de culture est indiquée en annexe n°1.

2.1.2.2 Milieu de conservation

Le milieu nutritif de conservation est préparé dans 4 flacons de 250 ml la composition

du milieu témoin sans CPest la suivante:


20

Peptone 10g ; NaCl. 5g ; extrait de viande, 3g ; extrait de levure, 5g ; glucose, 1g ; Na2HPO4,

4g ; eau distillée 1l, le bouillon ne contient pas d'agar-agar.

Les 3 autres flacons sont additionnés de 150 ml d'agent protecteur (glycérol 15%,

saccharose12%, DMSO 5%).

Ces milieu sont préparés à part et stérilisés par autoclavage à 121°C pendant 15min

(LARPENT, 1997).

2.1.3Appareillage

- Microscope optique (Motic, China).

- Réfrigérateur (Acer, Kouria).

- Congélateur (Karl kolb, Allemagne).

- Compteur de colonies (Funke GERBER, Allemagne).

- Etuve (Memmert, Allemagne).

- Four pasteur (Memmert, Allemagne).

- Autoclave (Pbi-international, Milano).

- Bec benzène (Specco).

- Bain-marie (Memmert, Allemagne).

- pH mètre (Inolable, Allemagne).

- Spectrophotomètre (WPA, China).

- Balance de précision (Ohaus, Allemagne).

- Plaque chauffante (VELP, Europe).

- Vortex (VELP, Europe).

2.1.4 Petit matériel d'étude

(boites de pétri, anse de platine , erlenmeyers 250ml, béchers, fioles jaugée, pipette graduées,

tube à essais, burettes, entonnoirs, lames et lamelles, flacon de 250 ml, verre de montre,

pipettes pasteur ....).


21

2.1.5 Produits chimiques et réactifs

Eau physiologique, phénolphtaléine, bleu de méthylène 1%,violet de gentiane, liquide

de lugol, alcool, solution de Fuchsine de Ziehl, l'eau distillée stérile, l'eau oxygénée 10

volume, NaCl, HCl et NaOH, extrait de viande et de levure, glucose, lactose.

Les cryoprotecteurs utilisés dans la présente étude sont les suivants ;

- Le saccharose à 12% (DENIS et PLOY, 2007)

- Le glycérol à 15% (LARPENT, 1997)

- DMSO à 5% (DENIS et PLOY, 2007)

2.2 Méthodes analytiques

2.2.1 Tests physico-chimiques préliminaires du lait

Les échantillons de lait camelin subissent les mêmes tests physico-chimiques

consistant en la détermination du pH et de l’acidité dornic.

2.2.1.1 pH

Le pH- mètre est un appareil électronique muni d'une électrode qu'on plonge dans le

lait. L'électrode, qui renferme une solution aqueuse acide, comporte une membrane de verre

spécial perméable aux ions H+. La différence entre les ions H

+ de la solution contenue dans

l'électrode et les ions H+

du lait est convertie en une différence de potentiel électrique. Le pH-

mètre transforme cette différence de potentiel en unités pH la technique est indiquée en

annexe n°02 (VIGNOLA, 2002) (figure 01).

2.2.1.2 Acidité Dornic

L’acidité du lait, exprimée en degré Dornic, est le nombre de ml d’hydroxyde de

sodium 0.11N nécessaire pour neutraliser de 10 ml lait en présence de phénolphtaléine

comme indicateur coloré (1 °D correspond à 0,1 g d’acide lactique par litre de lait (FARAH et

al., 2004).


22

L’acidité Dornic témoigne de l’état de fraîcheur du lait et de sa richesse relative en

caséines, en phosphates, en citrate, en hydrogéno-carbonate et en lactates (SIBOUKEUR,

2007). La technique est indiquée en annexe n°03.

2.2.2Analyse microbiologiques

2.2.2.1Test de la réductase

Le test de la réductase permet d’estimer la charge microbienne des échantillons de lait

collectés. Son principe est basé sur la décoloration du bleu de méthylène. La rapidité de cette

décoloration est directement proportionnelle au nombre de germes présents (LARPENT et al.,

1997). Plus l’activité microbienne est forte, plus courte sera la durée de décoloration des

échantillons (RYFFEL, 2006). La technique est indiquée en annexe n°04.

2.2.2.2 Isolement de la souche de lactocoque

Préparation des dilutions

Les dilutions des échantillons de lait camelin sont préparés en utilisant un diluant

(peptone, sel) ce diluant est adapté aux bactéries aérobies mésophiles.

On peut également utiliser le milieu Ringer au 1/7 ou le bouillon tryptone sel. Nous

avons préparé des dilutions de 10-1

, 10-2,

10-3

, 10-4,

10-5

,10-6

,10-7

. La technique est indiquée

en annexe n°05.

2.2.2.3 Ensemencement dans un milieu sélectif

Les boites de pétri coulées par la gélose M17 sont ensemencées en surface avec 0,1 ml

de chaque dilution. Pour chaque dilution nous avons préparé trois boites de pétrie.

L'incubation a été réalisée à 30°C pendant 48/72 heures.

2.2.2.4 Pré-Identification de souches isolées

La pré-identification des souches isolée est assurée par des observations,

macroscopiques et microscopiques (après la coloration de GRAM, et à l'état frais), le test de

la catalase, et des tests physicochimique et biochimiques.


23

Figure 01: Procédure expérimentale

Lait de chamelle

(Mélange)

Analyses physico-

chimiques

(pH, acidité Dornic)

Analyses

microbiologiques

Test de la

réductase

Isolement de la souche lactocoques

Ensemencement sur le milieu M17

Incubation à 30°C pendant 48/72h

Analyses préliminaires: Etude macroscopique et microscopique,

Test de la catalase

Pré-identification par des tests physicochimique et biochimiques

Propagation de la souche

Conservation des souches dans du bouillon de conservation

Conservation avec cryoprotecteurs Conservation sans

cryoprotecteurs

Congélation Réfrigération

Détermination de la densité optique après 20 jours du stockage

Congélation


24

2.2.2.4.1Analyses préliminaires

2.2.2.4.1.1Observations macroscopiques

2.2.2.4.1.1.1Description des colonies

L'aspect macroscopique des cultures sur milieu solide, constitue encore, une part

importante de l'identification d'un microorganisme.

Sur milieu solide, après une culture en surface (isolement), on peut caractériser les bactéries

selon l'aspect des colonies formées. Plusieurs critères sont pris en ligne de compte :

- la taille : approximative;

- la forme: punctiforme, ronde régulière, dentelée irrégulière (striation radiale ou

concentrique) ;

- l'aspect : colonies rugueuses ou R (de l'anglais rough), à surface irrégulière ; colonies lisses,

ou S (de l'anglais smouth), à surface lisse, brillante et régulière : colonies muqueuses, ou M, à

aspect gras et coulant. Ces différences sont dues à la composition de la paroi et à l'éventuelle

présence d'une capsule.

Il faut préciser cependant que cet aspect n'apparaitra pas sur tous les milieux

d'isolement, la composition de ce dernier ayant une grande influence sur le développement

des colonies;

- L'éventuel envahissement du milieu;

- Le volume : colonies bombées ou plates, étalées;

- La couleur : selon l'élaboration d'un pigment (ALPHONSE et al., 2004).

2.2.2.4.1.1.2Test de la catalase

On ajoute quelque gouttes d’eau oxygénée sur les colonies bactériennes. La présence

d'effervescence indique la présence de la catalase (BOUMEDIENE, 2013).


25

2.2.2.4.1.2Observations microscopiques

L'observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules

d'une espèce bactérienne.

2.2.2.4.1.2.1Examen à l’état frais

Une méthode rapide consiste à observer entre lame et lamelle une suspension

bactérienne à l'objectif 40 sans fixation préalable par la chaleur ou l'alcool. Les

renseignements obtenus par cette observation concernant principalement la mobilité des

bactéries (DENIS et PLOY, 2007).

2.2.2.4.1.2.2Examen après coloration de GRAM

La coloration de Gram à été effectuée selon le protocole décrit par (PRESCOTT et

al.,2003).Annexe n°06.

2.2.2.4.2 Pré-Identification physico-chimique et biochimique des souches isolées

Les souches isolées subissent des tests pré-Identification physico-chimiques et

biochimiques indiqués dans le tableau V.

Tableau V : Tests d’identification physico-chimiques et biochimiques des souches, après

leur isolement.

Teste Mode opératoire Réaction positive

Type fermentaire Du bouillon M17 est ensemencé

en présence d’une cloche de

Durham, et incubé à 30°C pendant

24h.

Apparition de bulles de gaz

dans la cloche de Durham.

Croissance à

différentes température

Le lait écrémé ensemencé est

incubé à 10 °C pendant 1-7 jours,

à 40°C pendant 24 h et à 45°C

pendant 24h.

Coagulation du lait.


26

Tolérance à la salinité Du bouillon M17 à des

concentrations de 2%, 4% et 6.5%

de NaCl est ensemencés et incubé

à 30°C pendant 24 h.

Trouble du bouillon.

Tolérance au pH

Alcalin

Du bouillon M17 alcalinisé à pH

9.6 et 9.2 est ensemencés et

incubé à 30°C pendant 24h.

Trouble du bouillon.

Culture sur lait au bleu

de Sherman

9 ml du lait additionné de 1 ml de

bleu de méthylène à 1% sont

ensemencés et incubés à 30°C

pendant 24 h.

Décoloration du bleu de

méthylène qui se traduit par sa

réduction

Hydrolyse de l’arginine galeries API20. Le virage de couleur indique

l’hydrolyse de l’Arg.

Fermentation des

Glucides

galeries API20. Le virage de couleur indique la

fermentation du sucre.

2.2.2.4.3Purification par repiquages successifs

La purification des bactéries est réalisée par 4 à 5 repiquages successifs dans la gélose

M17 par des stries d'épuisement.

2.2.2.5Propagation de la souche

Avant d'être conservées, les bactéries doivent être obtenues en culture pure. Elles

doivent, durant la durée de stockage, être dans des conditions de non multiplication en milieu

de conservation en absence et présence d'agents protecteurs et doivent être prélevées sur une

culture récente (DENIS et PLOY, 2007).

2.2.2.5.1Préparation du pré culture

Une colonie de bactérie préalablement purifiée est placée dans 1 ml de bouillon M17

puis incubée à 30°C pendant 24h. On introduit ensuite la culture précédente dans un tube


27

contenant 9 ml de milieu M17, puis on l'incube à nouveau à 30°C pendant 24h

(SIBOUKEUR, 2011).

Préparer le milieu de conservation dans 5 flacons de 250 ml. Quatre flacons destinés

à la congélation sans et avec cryoprotecteurs (glycérol 15%, saccharose 12%, DMSO 5%) et

un flacon destinés à être stockés par réfrigération, sans addition de cryo-protecteur.

La culture est réalisée dans des erlenmeyers d’une capacité de 250 ml contenant du

milieu de conservation, avec la culture précédente (tube de 10 ml) à raison de 10%.

L'incubation est effectuée à 30°C pendant 24h (Annexe n°07).

On obtient ainsi 5 lots de conservation (tableau VI) la croissance bactérienne est

mesurée avant et après le traitement de conservation par mesuré de DO et l'évolution du pH.

Pour cette raison une courbe d'étalonnage est réalisée.

2.2.2.6 Mesure de la croissance

La croissance bactérienne été mesuré par évolution du pH et celle de la densité

optique

2.2.2.6.1 Mesure de la densité optique

La croissance bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique qui est effectuée à

une longueur d'onde de 600nm.

Dans le cas des dilutions, la turbidité est proportionnelle à la qualité de biomasse

lorsqu'elle ne dépasse pas la limite 0,5- 0,6 en unité d'absorbance (ONER et ERIKSON., 1986).

Lorsqu'une suspension cellulaire dans un milieu limpide est traversée par un faisceau

lumineux monochromatique, elle absorbe une quantité de lumière qui est proportionnelle à sa

concentration cellulaire selon la loi de Beer Lambert (BOURGEOIS et LEVEAU, 1991).

2.2.2.6.2 Réalisation du courbe détalonnage

Pour élaborer une courbe d'étalonnage nous avons préparé une gamme étalon à partir

d'une culture fraiche à raison 10%.Nous avons ensuite mesuré la concentration cellulaire dans


28

chaque dilution par l'utilisation de cellule de malassez.

Nous avons aussi mesuré la DO de chaque dilution a fin d'obtenir un Courbe étalon en

fonction de la concentration cellulaire.

La courbe d'étalonnage est utilisée pour estimer la concentration cellulaire avant et

après conservation.

2.2.3 Conservation des souches isolées

Après isolement, pré-identification et purification de la souche de lactocoques nous

avons procédé à sa conservation.

2.2.3.1 Préparation et inoculation des tubes de conservation

Ces solutions mères sont réparties après la mesure de la DO et du pH dans des tubes

en plastique, stériles munis d'un bouchon hermétique, de 5ml de capacité, puis elles sont

conservées pendant 20 jours par réfrigération et congélation (sans et avec cryo-protecteur).

2.2.3.2 Mesure la croissance après conservation

Les suspensions microbiennes congelées sont lentement décongelées à la température

ambiante 37°C. Les suspensions réfrigérées ont ère ressorti de réfrigération.

Après homogénéisation manuelle des tubes, nous avons mesurée l'absorbance à

600nm et le pH.


29

Tableau VI : Constitution des lots expérimentaux.

Lots Cryoprotecteurs utilisés

Type de traitement de

conservation utilisé

1 Sans cryo-protecteur

Réfrigération

2 Sans cryoprotecteur Congélation

3 DMSO à 5%

4 Saccharose à 12%

5 Glycérol à 15%

Résultats et discussion


30

3. Résultats et discussion

3.1 Qualité physico-chimique du lait

Les résultats relatifs aux caractéristiques physico-chimiques du mélange des 3

échantillons du lait camelin, ayant fait l’objet de la présente étude, sont présentés dans le

tableau VII.

Tableau VII: Caractéristiques physico-chimiques des l'échantillons de lait camelin

N° de l’échantillon Date de collecte pH Acidité Dornic

(°D)

1 03/03/2015 6,4 20

2 10/03/2015 6,6 19

3 19/04/2015 6,7 17

Moynne 6,56 ±0,15 18.66±1,52

3.1.1 Mesure du pH

Les échantillons analysés présentent un pH moyen égal à 6,56±0,15 (tableau VII). Ce

résultat est comparable aux résultats rapportés par VIGNOLA (2002) et VIERLING (2008)

pour lait de vache compris entre 6,6 et 6,8. Ces valeurs présentent un pH qui se rapprochent

également de celles rapportées par certains auteurs tels que SIBOUKEUR, 2007 (pH=

6,31±0,15) et SBOUI et al (2009) (pH=6,41), SAWAYA et al (1984) et ABU-TARBOUSH

et al (1998), en Arabie Saoudite (pH= 6.49±0.024 ; 6.48).

3.1.2 Acidité Dornic

Les échantillons de lait camelin cru analysés (tableau VII) présentent une acidité

Dornic de l'ordre de 18.66±1,52°D. Cette valeur plus élevée par rapport à celle du lait bovin

qui est de l’ordre de 15°D (SAWAYA et al, 1984).

Toutefois, de nombreux auteurs rapportent des valeurs supérieures ou égales à 15°D,

tels que ABU-LEHIA (1994) en Arabie Saoudite (15°D± 4) ; KAMOUN (1994) en Tunisie

(15.6°D ±1.4) et SBOUI et al (2009) 17,2°D.


31

Cette valeur se rapproche légèrement de celle rapportée par SIBOUKEUR (2007) soit

18,2 °D ± 2,93 et CHETHOUNA (2011) soit 18°D±0,79.

L'acidité Dornic du lait frais dépend du nombre de moles d’acides présents dans ce

produit. Elle est inversement proportionnelle à son pH (MATHIEU, 1998).

3.2 Analyse microbiologique

3.2.1. Test de la réductase

La décoloration de bleu de méthylène a commencé au delà de 5 heures. Cela signifie

que les échantillons de lait de chamelle testés présentent une bonne qualité hygiénique

(LARPENT et al., 1997). Le taux de germes dans ce lait peut être estimé entre 105

à 2.105

germes/ml (LARPENT et al., 1997). KAMOUN, (1990) et d’autres auteurs s’accordent sur le

fait que la qualité bactériologique du lait camelin peut être irréprochable si la traite est

effectuée dans les conditions hygiéniques requises.

3.2.2 Isolement de la souche de lactocoque

Nous avons tenu compte des dilutions qui nous ont permis l’obtention de colonies

isolées et dont le nombre est entre 30 et 300 (MADIGAN et al.,2007) (photo1).

3.2.3 Pré-identification et purification de la souche

Le pré identification de la souche isolée à partir lait de camelin, cultivée sur milieu

M17, est basé sur des observations macroscopiques, microscopiques, sur des tests physico-

chimiques et biochimiques.

3.2.3.1 Observations macroscopiques

Après l'incubation de lait à 30°C pendant 48 à 72 heures nous avons obtenu des

colonies qui différent uniquement par leur taille (photo 01).


32

Photo 01: Colonies isolées sur gélose M17.

3.2.3.1.1 Description macroscopique

Nous avons obtenu des colonies qui ne différent que par leur taille. La première

présente un diamètre de 1 mm environ alors que la deuxième est plus petite 2 mm. Selon

DELLAGLIO et al.,(1994).

Elles sont de couleur blanchâtre. Elle présente une consistance soit muqueuse et soit

crémeuse. Leur aspect est identique. Leur forme est soit plate, soit bombée (Tableau VIII).

Tableau VIII: Description des colonies isolées à partir du lait camelin en milieu M17

Colonie 1 Colonie2

Taille 1 mm 2mm

Forme Bombée Plate

Couleur Blanchâtre Blanchâtre

Aspect de surface Lisse Lisse

Consistance Crémeuse Muqueuse

Opacité Opaque Opaque

3.2.3.1.2 Teste de catalase

Nous avons éliminée la colonie 2 à cause de sa grande taille d’un test catalase positif.


33

Le test de catalase permet de recherche la présence de l'enzyme constitue une étape

importante de l’identification mais le test à l’eau oxygénée peut donner des résultats positifs

puisque certaines bactéries lactiques au genre Lactococcus bactéries à G+

aérotolérantes ne

posséder de système respiratoire (ni cytochrome, ni catalase) l'effervescence dans ce cas sont

due la présence d'un pseudo catalase. Par ailleurs, il faut signaler que la plupart des bactéries

lactiques possèdent leurs propres moyens de défense contre la toxicité de l’oxygène

(DESMAZEAUD et DE ROISSART ,1994).

3.2.3.2 Observations microscopiques

3.2.3.2.1 Examen à l’état frais

A prés isolement de la souche lactique à partir de lait camelin, l'examen à l'état frais

montre que cette dernière se présente sous forme de coques immobiles.

3.2.3.2.2 Examen après coloration de GRAM

Après coloration de GRAM, une observation à l'huile immersion, au grossissement

1000 nous avons montré des cocci, rassemblées en diplocoques et en chainettes, à GRAM

positif (photo02).

Les observations macroscopiques et microscopiques sont complétées par des tests

physicochimiques et biochimiques.

Photo 02: Souche isolée après coloration de GRAM (G1000).


34

3.2.4Tests physicochimiques et biochimiques des souches isolées

Les résultats de l’identification biochimique des souches isolées à partir du lait de

chamelle sur milieu M17 sont regroupés dans le tableau IX.

Les photos 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, et 12 représentent les résultats relatifs aux tests

d’identification physico-chimiques de la souche isolées.

La souche isolée dans le présent travail est de type homofermentaire (absence de

production de CO2 dans la cloche de Durham).

On observe un trouble dans le bouillon M17 après une incubation à 10°C, 40°C et

aucun trouble à 45°C. Cela indique que la souche est mésophile, un autre caractère des

lactocoques.

Un trouble est observé dans des bouillons M17, à 2%, à 4% de NaCl pour la souche

mais ne croit pas à 6.5% de NaCl. Cette inaptitude constitue une des caractéristiques des

Lactococcus lactis.

On n'observe aucun trouble dans le bouillon M17 à pH 9.6 et présence un trouble à

9.2. Ce caractère permet de distinguer l’espèce Lactococcus lactis subsp lactis des espèces

Lactococcus lactis subsp cremoris et Lactococcus lactis subsp lactis diacetylactis.

La culture de cette souche sur du lait au bleu de Sherman est positive (coagulation,

décoloration et acidification).

On observe également que cette bactérie hydrolyse de l'arginine, et ne fermentent pas

les sucres suivant : Man, Ino, Sor, Rha, Sac, Mel, Amy et Ara. Le test de croissance à pH 9.6

et l’incapacité de fermenter les sucres, sont de nature à confirmer qu’il s’agit de Lactococcus

lactis subsp lactis car selon GUIRAUD, (1998), Lactococcus lactis subsp lactis est la seule

souche de lactocoques par rapport à Lactococcus lactis subsp cremoris et diacetylactis qui ne

se développe pas à pH 9.6 (tableaux IX)


35

Tableau IX: Caractéristiques morphologiques et biochimique des souches isolées

Tests d'identification Résultats

Observation Microscopique Diplocoques et en chaînette

Examen à l'état frais (mobilité) Immobile

Examen après double

coloration de GRAM

Gram+

Test de catalase Absence d'effervescence

Type fermentaire Homofermentaire

Croissance à 10°C +

Croissance à 40°C +

Croissance à 45°C -

Croissance à 2% d'NaCl +

Croissance à 4% d'NaCl +

Croissance à 6,5% d'NaCl -

Croissance à pH 9,2 +

Croissance à pH 9,6 -

Culture sur lait au bleu de

Sherman

+

Hydrolyse de l’arginine +

Utilisation du Cit +

Fermentation de Man -

Fermentation de Ino -

Fermentation de Sor -

Fermentation de Rha -

Fermentation de Sac -

Fermentation de Mel -

Fermentation de Amy -

Fermentation de Ara -


36

Photo 03: Type fermentaire photo 04: Croissance T 10C°

Photo 05: Croissance T 40C° photo 06: Croissance T 45C°


37

Photo 07: Croissance NaCl 2% photo 08: Croissance NaCl 4%

Photo 09 : Croissance NaCl 6,5 % Photo 10 : Croissance pH=9.2


38

Photo 11 : Croissance pH =9.6 Photo 12 : Culture sur lait au bleu de

Sherman

D'après les résultats de l'observation macroscopique, microscopique et les tests

physicochimique et biochimique, on peut constater que la souche isolée appartient au genre

Lc et probablement à l'espèce Lc lactis.

3.2.5 Purification de la souche

Après quatre ou cinq repiquages successifs par des stries d'épuisement sur gélose

M17, nous avons obtenu des souches pures à partir de la colonie isolée.

3.2.6 Mesure de la croissance durant la conservation

3.2.6.1 Courbe d'étalonnage

Cette courbe est utilisée pour le suivi de l’évolution de la biomasse durant la

conservation de la souche (figure 02).


39

Figure02 : Courbe d'étalonnage de la souche isolée.

3.3 Conservation de la souche isolée

La conservation de la souche de lactocoque est effectuée pendant 20 jours à deux

méthodes réfrigération (sans cryoprotecteurs ) , congélation (sans et avec cryoprotecteur,

DMSO5 %, Saccharose 12% , glycérol 15%).

Les résultats obtenus durant, la période de stockage sont présentés dans les figures 3,

4, 5, 6,7.

3.3.1 Réfrigération

La figure 03 représente le lot n°1 des échantillons de cultures stockés à 8 °C.

L’évolution de , la biomasse pendant 20 jours.

y = 2,338x + 0,011

R² = 0,989

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

D.O

à 6

00 n

m

Concentration de la biomasse

Log.105


40

Figure 03: Evolution de la concentration bactérienne et du pH de la souche conservée à

8C°au réfrigérateur.

Nous remarquons une diminution de la biomasse (mort cellulaire). Cela peut indiquer

que le milieu ne convient pas à la croissance de la souche conservée. Nous remarquons aussi

que le pH est presque stable durant la période de stockage cela indique l'absence probable

d'une activité métabolique.

En effet le milieu utilisé est un milieu de conservation et non pas un milieu de culture.

La lyse cellulaire sous l'action des enzymes protéolytiques endogènes serait à l’origine de

cette baisse de concentration cellulaire.

3.3.2 Congélation sans cryo-protecteur

La figure 04 représente le lot n°2 des échantillons de cultures conservés dans un

congélateur de laboratoire réglé à -20°C.

0

1

2

3

4

5

6

7

j0 j2 j4 j6 j8 j10 j12 j14 j16 j18 j20

con

cen

trati

on

de

bio

mass

e

bact

érie

nn

e

durée de conservation en jour


41

Figure 04: Evolution de la concentration bactérienne et du pH de milieu de la souche

conservée à la congélation sans cryo-protecteur.

D'après la figure 04, on remarque que la concentration cellulaire est presque stable

Concernant le pH sa valeur est presque stable à 6 cela peut indiquer l'absence d'une activité

métabolique.

La conservation de ce lot utilisant cette basse température semble avoir protégé les

cellules. Le problème lié à la conservation par le froid est celui de la formation de cristaux de

glace qui peuvent être très dommageables sur les cellules n'a pas eu d'effet sur cette souches

(FULLER, 2004).

3.3.3Congélation avec cryo-protecteur

3.3.3.1 DMSO 5%

La figure 05 représente le lot n°3 des échantillons stockés à -20 °C en présence de

DMSO à 5%. Celui-ci est susceptible de protéger la membrane intra cellulaire.

0

2

4

6

8

10

12

j0 j2 j4 j6 j8 j10 j12 j14 j16 j18 j20

con

cen

tra

tio

n d

e b

iom

ass

e

bact

érie

nn

e



42

Figure 05: Evolution de la concentration bactérienne et du pH de la suspension conservée à la

congélation (-20°C) avec cryo-protecteur DMSO à 5%.

Nous remarquons une chute de la biomasse à partir de J6 4,5.105 cellule/ml jusqu'à

J10 4.105 cellule/ml puis une augmentation à 4,5.10

5 cellules /ml à J12 .une stabilisation de la

biomasse été remarquée par la suite durant toute la période de conservation. Cela peut être

expliqué la chut de la biomasse par effet de décongélation les lots que provoque la mort des

cellules.

Concernant le pH, ce dernier est presque stable. Cela indique l'absence d'activité

métabolique et donc de la croissance bactérienne.

On peut dire, que le cryoprotecteur utilisé semble protéger les cellules de lactocoques

conservées par congélation.

Le DMSO utilisé comme un cryoprotecteur possède des propriétés radioprotectrices pour

les microorganismes, ceux qui pénètrent plus lentement et ceux qui sont imperméables, La

perméabilité de certains de ces solutés dépend nettement de la température et du type cellulaire.

Quelques cryoprotecteurs intracellulaires peuvent être considérés comme étant des composés

moins perméables sous certaines conditions. Le cryoprotecteur DMSO pénétrant dans la paroi

et dans la membrane (HUBALEK, 2003).

0

1

2

3

4

5

6

7

J0 J2 J4 J6 J8 J10 J12 J14 J16 J18 J20

con

cen

trati

on

de

bio

mass

e

bact

érie

nn

e



43

3.3.3.2 Saccharose


saccharose à 12 %.


congélation avec cryo-protecteur Saccharose (12%).

Nous remarquons que la biomasse été de 10,5.105

c/ml à J0.Cette dernière augmente

l'égerment jusqu’à 11.105 c/ml à J2 .Nous remarquons ensuite une diminution de celle-ci

jusqu'à J4 puis une augmentation légère jusqu'à J6 suivie d'une stabilisation durant jusqu'a

J20.

Concernant le pH celui-ci passe de 6 à 5 puis ces valeurs sont inconstant se qui

indique la présence l'activité métabolique qui peut être possible car les cellules reste vivants.

Les cryoprotecteurs semi perméables, tel que le saccharose, induisent une déshydratation

partielle des cellules avant la congélation. Ils se concentrent entre la membrane cytoplasmique et

la paroi comme une couche de tampon qui agit contre la croissance des cristaux de glace et

protège la membrane mécaniquement (HUBALEK, 2003). Les sucres sont capables de fournir une

bonne protection pour les bactéries, Il a été démontré également que les sucres notamment le

saccharose permettent de stabiliser les membranes durant l'exposition hypertonique lors de la

croissance de cristaux de glace, par interaction avec les groupes polaires des phospholipides

(FULLER, 2004).

0

2

4

6

8

10

12

j0 j2 j4 j6 j8 j10 j12 j14 j16 j18 j20

con

cen

trat

ion

de

bio

mas

se

bac

téri

enn

e



44

Dans notre cas, il semblerait que ce cryoprotecteur n'a pas un effet très remarquable

sur la conservation de notre souche par rapport au témoin (congélation sans cryoprotecteur)

3.3.3.3Glycérol


glycérol à 15 %. Celui-ci est susceptible de protéger la membrane cellulaire.


congélation (-20°C) avec cryo-protecteur Glycérol (15%).

Nous remarquons une diminution de la biomasse en comparaison avec les lots 2 et 3

puisqu’elle passe de 11.105 c/ml à J0 à 9.10

5 c/ml à J2 puis elle se stabilise durant toute la

période de conservation.la chute de la biomasse à J2 peut êtres expliquée par un problème

rencontré durant la congélation.

En se qui concerne le pH, celui-ci reste stable à 6 ce qui indique l'absence d'une

activité métabolique.

Le Glycérol est un soluté poly-hydroxylé avec une forte solubilité dans l'eau, et une

faible toxicité lors l'exposition à court terme à des cellules vivantes (FULLER, 2004). En

général, on procède à un refroidissement lent et progressif, lors de l’utilisation de

cryoprotecteurs pénétrant les cellules tel que le glycérol.

0

2

4

6

8

10

12

J0 J2 J4 J6 J8 J10 J12 J14 J16 J18 J20


con

cen

trati

on

de

bio

mass

e

bact

érie

nn

e


45

Ce dernier, agit en évitant une trop forte déshydratation des cellules lors de la

formation primitive de glace extracellulaire puis en évitant la formation secondaire (qui suit la

déshydratation consécutive à la formation de glace extracellulaire) de trop nombreux et trop

gros cristaux de glace pure intracellulaire. Certains protocoles assurent au contraire un

refroidissement très rapide (FULLER, 2004). Il semble que ce cryo-protecteur a bien protégé

les cellules.

Conclusion

Conclusion

46

Conclusion

Le lait de chamelle, comme celui des autres mammifères, est un milieu de

composition chimique et physique complexe. Il possède un certain nombre de particularités

liées à sa composition physico-chimique, biochimique et microbiologique.

Ce lait contient plusieurs microorganismes responsables de son acidification. Permis

ces microorganismes figurent les bactéries lactiques qui forment un groupe très intéressant de

microorganismes, qui se caractérisent par leur capacité à fermenter les glucides en acide

lactique, un acide faible favorable à la conservation et à l'amélioration de la qualité

organoleptiques des aliments.

Ces souches sont conservées par plusieurs méthodes à savoir la régénération, la

congélation et la lyophilisation.

Dans ce travail, nous avons essayé de trouver une meilleure méthode pour la

conservation d'une souche de lactocoque isolée à partir du lait camelin en utilisant deux

traitement de conservation : la réfrigération et la congélation sans et avec cryo-

protécteurs.Ces substances sont utilises pour permettre aux cellules de mieux supporté les

effets liés à la décongélation.

Les résultats sont de nature à montré que :

la réfrigération semble nuire les cellules

La conservation par congélation sans cryoprotecteur semble avoir protégé les cellules.

Le cryoprotecteur DMSO utilisé semble protéger les cellules de lactocoques conservées par

congélation.

Le cryoprotecteur saccharose n'a pas un effet très remarquable sur la conservation de notre

souche par rapport au témoin (congélation sans cryoprotecteur).

Le glycérol semble avoir bien protégé les cellules pendant la période de conservation.

Références

bibliographiques

Références bibliographiques

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Annexes

Annexes

Annexe n°01 :

Le milieu M17 (LARPENTet al. ,1997)

-Tryptone........................................................2,50 g

- Peptone pepsique de viande .........................2,50 g

- Peptone papaïnique de soja ..........................5,00 g

- Extrait autolytique de levure.........................2,50 g

- Extrait de viande ...........................................5,00 g

- Lactose ..........................................................5,00 g

- Glycérophosphate de sodium ......................19,00 g

- Sulfate de magnésium ...................................0,25 g

- Acide ascorbique ...........................................0,50 g

- Agar bactériologique....................................15,00 g

Annexe n°02 :

Mesure de pH (SINA, 1992)

- L'opération débute par l'étalonnage de l'appareil à l'aide de deux solutions à pH connus (6,87

et 4,01) à 25° C.

-L'électrode du pH-mètre est ensuite rincé à l'eau distillée puis séché avec du papier buvard.

-La température du produit est mesurée avec un thermomètre. Celle-ci est utilisée pour régler

la température au niveau du pH-mètre.

-Ensuite on met le pH-mètre en marche et la valeur du pH s'affiche à l'écran de cet appareil.

-Immédiatement après usage, l'électrode est rincée puis séché.

Annexe n°03 :

Acidité Dornic

1. Réactif

- Solution d’hydroxyde de sodium(NaOH) : soude Dornic 0.11N .1 ml de cette solution

correspond à 0.01g d’acide lactique. Elle peut être préparée en diluant à 1000 ml, 111ml de

solution d’hydroxyde de sodium 1N.

-Phénolphtaléine : solution à 1g dans 100ml d’éthanol à 95-96%

2. Appareillage :

-matériel courant de laboratoire :

-Burette graduée en 0.05 ml ou0.1ml

-Erlenmeyer 100ml

Annexes

-Pipette de 10 ml

- Balance de précision

3. Mode opératoire

- Dans un erlenmeyer introduire 10 ml de lait (ou peser 10g de lait à 0.001g près)

-Ajouter 0.1ml de la solution de phénolphtaléine

- Titrer par la solution de la soude Dornic jusqu’au virage au rose. On considère que le virage

est atteint lorsque la coloration rose persiste pendant une dizaine de secondes (AFNOR ,1980

in ABIDI, 2001.)

- acidité normale : 15 à 17° D pour un lait cru (GUIRAUD, 1998) 14 à 16°D pour un

lait pasteurisé.

- acidité augmentée (fermentation lactique ou addition de (K2Cr2O7)

26°D : lait coagulant par chauffage

70°D : lait coagulant à température ordinaire

- acidité diminuée (addition de NaHCO3 ou Na2CO3)

lire le volume sur la burette

la valeur en acidité titrable exprime en dégre Dornic (D°), est donnée par l’expression

suivante :[1D°= 0,1 ml de NaOH à 0,11 N] .

Annexe n°04: Test de la réductase

1. Réactif

-Bleu de méthylène 0.5%

2. Appareillage

-Bain marie à 37°C

-10 tubes à essais munis de bouchon

-Bêcher 100ml

-Pipette de 10 ml

3. Mode opératoire

-Dans un tube, mettre 1 ml de la solution de bleu de méthylène 0.5% dans 10 ml de lait cru.

-Agiter le tube manuellement

-Placer le tube dans un bain marie à 37°C

-Noter avec précision le temps de cette immersion. Le niveau du bain marie doit être

supérieur à celui du lait dans le tube.

-Suivre la réaction toutes les demi-heures. Les tubes décolorés sont retirés et le temps

Annexes

d’apparition de la décoloration doit être noté. Ceux dont le contenu reste bleu sont retournés

une seule fois chaque demi- heure et soumis à une incubation plus prolongée jusqu’à

disparition de teinte bleutée. Il persiste souvent une zone colorée au contact du lait avec l’air,

ne pas en tenir compte pour l’interprétation (LARPENT et al., 1997).

Selon (LARPENT et al., 1997) on peut approximativement estimer les résultats du test de

bleu des méthylènes de la façon suivante :

Durée de décoloration en

Heures

Nombre de germes/

ml

Qualité du lait

5 heures et plus 100.000à 200.000 Bonne

2 à 4 heures 200.000 à 20000.000 Bonne à passable

Moins de 2 heures 2 à 10 millions Insuffisante

La réfrigération du lait à la ferme, son transport en citernes isothermes obligent à modifier la

technique recommandée ci-dessus. Le maintien du lait des températures voisines de + 4°C

pendant 1à 2 jours prolonge considérablement la durée de réduction des colorants. Il valorize

l’interprétation de la qualité bactériologique du produit qui, en fait, n’est pas toujours

meilleur. Il est donc conseillé de soumettre les laits réfrigérés à une pré incubation à +13°C

durant 18 heures avant de pratiquer la recherche du temps de réduction du bleu de méthylène.

Le tableau ci- dessous représente les résultats obtenus qui se rapproche davantage de ceux

obtenus avec les laits crus non refroidis (LARPENT et al., 1997).

Durée de décoloration en heures Nombre de germes / ml

5 heures 12 à 20.000

4 heures 30 à 50.000

2 heures 1 à 2 millions

1 heure 6 à 10 millions

Annexe n°05

Préparation des dilutions

La dilution est réalisée afin de diminuer le nombre de colonies. Le meilleur résultat (colonies

isolées) est statistiquement obtenu pour des boites comportant entre 30 et 300 colonies

(MADIGAN et al. 2007).

1ml de lait camelin ou bovin collecté est prélevée aseptiquement à l’aide d’une pipette

préalablement stérilisée. On aspire et on refoule le lait au moins une fois dans la pipette, avant

d’effectuer le prélèvement. La pipette ne doit pas être plongée de plus de 1 à 2 cm dans le lait.

Annexes

La prise d’échantillon est introduite aseptiquement dans un tube contenant 9 ml de diluant. La

pipette ne doit pas entrer en contact avec le diluant.

Le tube est agité doucement mais suffisamment pour rendre la dilution homogène. Il faut

éviter le barattage survenant au cours d’une agitation trop violente.

A d’une nouvelle pipette stérile, aspirer et refouler le mélange à plusieurs reprises et prélever

1 ml de la première dilution (1/10), la pipette plongeant de 1 à 2 cm dans le liquide. Le

millilitre de dilution est introduit dans un deuxième tube contenant 9 ml de diluant, on obtient

ainsi la dilution au 1/100.

Une troisième opération est effectuée de la même manière afin d’obtenir une dilution au

1/1000. Une quatrième opération est réalisée afin d’obtenir une dilution de 1/10000.Une

nouvelle pipette stérile est employée pour chaque temps de ces dilutions (TERROINE ,1966).

Annexe n°06

Coloration de Gram (SUID, 2011)

1- Déposer une goutte d'eau physiologique stérile sur une lame bien propre

2- 2- Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d'eau, strier et sécher par

passage rapide sur la flamme d'un bec benzène

3- Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes

4- Laver l'excès du colorant avec de l'eau distillée

5- Couvrir de lugol pendant 30 secondes

6- Laver à l'eau distillée pendant 5 secondes

7- Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool - acétone en inclinant la lame et par

goutte à goutte jusqu'à disparition complète de la coloration violette


9- Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes


11- Déposer une goutte d'huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à un fort

grossissement.

Les cellules Gram+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes en

apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distincte

Annexes

Annexe n°07

Etapes de conservation de la souche isolée à partir du lait camelin

10%

Mesure de la concentration cellulaire avant conservation

1 colonie pure

Le tube contient 1ml de bouillon M17

Incuber les 03 tubes à température 30°C pendant

24heures

Verser le tube précédent dans 9 ml

Erlenemeyer de

250ml contient de

90ml milieu de

conservation

Etape 01

Etape 02

Incuber les 03 tubes à température 30°C pendant

24heures

Etape 03

Etape 05

Annexes

Conservation de la souche

Etape 06

Sans cryoprotecteur Avec cryoprotecteur (DMSO 5%,

Glycérol 15%, Saccharose 12%)

Congélation Réfrigération Congélation

Mesure de la concentration cellulaire après conservation.

Etape 07

Effets de quelques cryoprotecteurs sur la conservation d’une souche de lactocoques isolée à partir du

lait camelin.

Résumé

L'objectif de ce travail vise à la conservation d'une souche de lactocoques isolée à partir du lait camelin après

sa pré-identification. Deux techniques de conservation ont été utilisées : la réfrigération à 8°C, la congélation

à-20°C sans et avec cryoprotecteurs (glycérol à 15%, saccharose à12%, DMSO à5%) pour une période de vint

jours. La survie de la survie des cellules été mesuré par turbidimétrie et l'évolution du pH. Ces méthodes de

conservation sont utilisées afin d'utiliser cette souche pour la conservation des aliments dans l’industrie

alimentaire.

Le résultat obtenu montre que le glycérol à 15% est le meilleur cryoprotecteur, (concentration cellulaire de

l'ordre de 10.105 c/ml par rapport au témoin 11.10

5 c/ml) qui protège ces cellules .pendant le stockage.

Mots clé : lait ; camelin ; conservation ; cryoprotecteur ; survie, glycérol.

اثار بعض cryoprotecteur على المحافظة ساللة lactocoque تم عزلها من حليب النوق

الملخص

نهزا انغشض فمذ اسخخذينا . انخعشف عهٍها بعذ اننىق حهٍب ين يعضونتlactocoques سالنت عهى انحفاظ انعًم هزا ين انهذف

%انسكشوص , %15انجهٍسٍشول) ,ورنك باسخخذاو حافظ°20C- ححج دسجت و انخجًٍذ°8C ححج دسجت انخبشٌذ:حمنٍخٍن نهحفظ

12٪ .(5%DMSO, طشٌك لٍاط عن نسبت بماء انخالٌا عهى بماء انحٍاة لٍاط ٌىو كًا حى20ولذ حى انخخضٌن نًذةturbidimétrie و

pH. ولذ اظهشث اننخائج .األغزٌت صناعت فً انغزائٍت انًىاد عهى نهحفاظ انسالنت هزه اسخخذاو أجم ين انحفظ هزه اسانٍب ٌخى اسخخذاو

10.10 حشكٍض انخهٍت )حافظ أفضم هى %15انجهٍسٍشول 5c/ml 11.10باننسبت انى انشاهذ

5c/ml) ًًأثناء انخالٌا انزي ٌح

.انخخضٌن

. انجهٍسٍشول , انبماء عهى لٍذ انحٍاة , انحافظ ,اننىق , انحهٍب : المفتاحية كلمات

Effects of some cryoprotectants on the conservation of strain lactococci isolated from camel milk.

Abstract

The objective of this work is aimed at the conservation of a lactococci strain isolated from the camel milk after

it's pre-identification. Two conservation techniques were used: the refrigeration at 8 ° C, freezing at -20 ° C

without and with cryo-protective (glycerol 15%, sucrose 12% DMSO5%) for a period of twenties days. The

survival of cells was measured by turbidimetry and the change in pH. These conservation methods are used in

order to use this strain for the conservation of food in the food industry.

The result shows that glycerol 15% is the best cryo-protective, (cells concentration is 10.105 c/ml to the

witness 11.105 c/ml) which protects the cells during storage.

Key words: milk, camel; conservation; cryo-protective; survival, glycerol.

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cryoprotecteurs sur la conservation d’une souche · Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie ... 2.2.2.4.1.2.1Examen à l’état frais 25 ... 3.2.3.2.2Examen après coloration