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AGENDA
• CHAPITRE II : METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE
• I / ETUDE MORPHOLOGIQUE:
• A ) Techniques de contraste en observation microscopique & préparation d’échantillon ,
B ) colorations,
, l’échantillon : fixation, inclusion, coupe, étalement, coloration.
• II / TECHNIQUES IMMUNOHISTOCHIMIQUE
Histo Cytochimie, immuno-histochimie, histo-enzymologie, autoradiographie,
Revue
Rappel :
La microscopie est un ensemble de techniques d’imagerie qui permet d’obtenir une image agrandie
de bonne qualité d’objets de petites dimensions.
On distingue principalement deux types de microscopies :
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Les microscopes dits à transmission nécessitent d’avoir des échantillons de très faible épaisseur.
Le matériel biologique devra donc être traité pour pouvoir être analysé.
Les techniques histologiques et cytologiques décrites plus loin dans le cour répondent à ce besoin
la microscopie optique (ou photonique)
et la microscopie électronique.
Introduction :
• De nombreux objets microscopiques d'intérêt biologique sont intrinsèquement transparents ou de
réflectivité similaire à leur entourage et donnent donc en observation simple au travers d'un
microscope une image quasi-uniforme inexploitable.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Champs clair (échantillons non colorés)Faisant passé la lumière directement à traversl’échantillon, sauf si la cellule est naturellement pigmenté ,l’image obtenue et très peu contrastée,
De plus, les cellules vivantes non pigmentées ne sont pas clairement
visibles au microscope à fond claire à cause de la faible différence de
contraste entre les cellules et l’eau.
D’où la nécessité d’utiliser des colorants spécifiques pour une
observation correcte
Introduction :
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Des techniques de coloration ou de révélation “chimiques” peuvent éventuellement être
utilisées mais leur emploi est restreint par des difficultés de mise en œuvre ou par les
modifications de l'objet étudié qu'elles entraînent inéluctablement (altération du
métabolisme des cellules vivantes, attaque irréversible des surfaces...)
Cependant ces “imperceptibles” objets bruts, s'ils modifient peu l'intensité de la lumière
d'éclairage qu'ils transmettent ou réfléchissent, changent usuellement de manière
tangible d'autres propriétés de celle-ci, comme la phase ou la polarisation.
L’optique/ principe
Structure du microscope optique
Laser
Lampe UV
…
Absorbants
Diffusants
Dépolarisants
Fluorescents
…
Objectifs
Lentilles
…
Caméras
Photodiodes
…
Cours de Cytologie
Agents de contraste
• Les techniques de contraste sont couramment utilisées pour de nombreux types d'observation.
• Elles sont même indispensables dans de nombreux domaines scientifiques, techniques allant de
l'analyse médicale de routine au contrôle de matériaux de pointe.
Il est donc important de connaître ces techniques et de comprendre les méthodes optiques sous-
jacentes très diverses et intéressantes qu'elles mettent en œuvre.
Cette partie « Techniques de contraste en observation microscopique » du chapitre « Microscopie » a pour
objet de présenter les principaux éléments de ce domaine. Il fait suite au partie « Principes et notions de
base du microscope » du même chapitre, sur lequel il s'appuie pour les définitions et concepts de base de
microscopie qui ne seront pas repris ici.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Techniques de préparation des échantillons
L'examen vital (l'examen de cellules ou tissus vivantes):
Le nombre de tissus de Vertébrés qui se prête à l'examen vital est assez réduit.
Le matériel idéal pour ce type d'étude:
- cellules habituellement isolées dans un milieu liquide. Ex: cellules sanguines et protistes
- des petits métazoaires transparents. Ex: Rotifères, petits Vers, larves d'Arthropodes, de
Mollusques ou d'Echinodermes.
- des fragments de métazoaires facilement isolables. Ex: gonades d'Invertébrés, fragments
d'épithélium
- des organes entiers. Ex: poumon de Grenouille, pancréas de Rongeur
L'identification certaine d'une structure dans des cellules vivantes ne peut découler que de
colorations et réactions cytochimiques
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
L'examen vital (l'examen de cellules ou tissus vivantes):
Etalement des cellules sur des lames de verre :
l'étalement est fait par le préleveur lors des cytoponctions d'organes, des frottis,
écouvillonage, brossages ou appositions ; ce geste simple doit être bien maîtrisé pour
éviter un écrasement des cellules ou des amas en plusieurs couches peu interprétables.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Colorations vitales
Il s'agit de coloration sur des tissus qui resteront vivants durant l'étude.
Cette méthode représente souvent une meilleure mise en évidence des structures puisqu'elle
ne comporte que peu de traitements sur les tissus.
note: Cela implique de prendre en compte la compléxité de la matière vivante et chaque coloration vitale
devient, en fait, une expérience de physiologie cellulaire, impliquant une critique du résultat brut. En effet, les
colorations vitales mettent en jeu des composés chimiques dont l'innocuité, loin d'être évidente, doit être
démontrée dans chaque cas
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Technique cytologique/ histologiques
Pour une observation au microscope photonique, l’échantillon doit être de faible épaisseur
(2 à 10 m) afin de permettre le passage de la lumière.
Ainsi, lorsque le matériel biologique est massif (tissus animaux ou végétaux : foie, cerveau,
muscle, etc. ou tige, feuille, etc.), il faut préalablement le débiter en tranches fines et
régulières, que l’on appelle coupes histologiques
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Techniques de contraste en
observation microscopique
Le microscope permet d'observer les cellules d'un tissu, mais dans des conditions très
strictes :
il faut que l'objet à examiner soit transparent à la lumière. Les objets biologiques ne le sont que
rarement, à l’exception des objets naturellement très minces :
suspensions (sang, ..) ou cultures cellulaires.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Différents type de microscope optique: Une comparaison
Type de microscope Type de microscope
Contraste de phase : augmente lecontraste dans les cellule non coloréesen amplifiant des variation dans l’indexde réfraction dans l’échantillons ellemême; spécialement utile pour l‘examen de cellule vivante nonpigmentées,
Contraste d’interférence différentielle:Utilise une procédure optiquepermettant « d’exagérer » ladifférance d’indexe de réfraction
Confocal: utilise laser et optique spécialpour focaliser un fiscaux sur un seul plan(optique) à l intérieur de l’échantillon,seulement une région dans un champsétroit est visualisée, les régions endessous et en dessus du plan choisie ,apparaissent obscure ou floutées
Champs clair (échantillons non colorés)Faisant passé la lumière directement àtravers l’échantillon, sauf si la cellule estnaturellement pigmenté , l’image obtenueet très peu contrastée,
Champs clair (avec coloration):La coloration de l’échantillon par différentscolorant permet augmente le contrastenéanmoins la plus part des procédures decoloration requirent une fixation descellules
Fluorescence: montrant une localisation demolécules spécifiques dans la cellule Showsthe locations. Les substance fluorescentes(fluorochrome) absorbe les UV pouremmètre ensuite une lumière visible.
Les colorants pour préparation microscopique
La plupart des objets biologiques ne sont pas colorés ou sont faiblement colorés. D'où la
nécessité de colorer la plupart des échantillons. Voici les principaux colorants, il en
existe d’autres.
Coloration des structures cellulaires
Bleu de méthylène Ce colorant est utilisé essentiellement pour colorer les noyaux et autres structures
oxydantes
Bleu de méthylène phéniqué Ce colorant est utilisé en bactériologie (coloration simple pour bactéries).
Liquide de Lugol Ce colorant s'utilise comme colorant des noyaux des cellules végétales et des
membranes.
Il permet la mise en évidence des grains d’amidon (amyloplastes) contenus dans les
cellules végétales : par exemple dans le tubercule de pomme de terre, dans les
grains de blé…
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Techniques d’observation des formes et des surfaces
La technique histologique en microscopie électronique
1. Fixation
Les fixateurs classiques ne suffisent pas car ils tendent à coaguler les protéines et à détruire les structures
fines. Il faut utiliser ici des agents chimiques qui réalisent des pontages entre les molécules voisines, plus
qu’ils ne les dénaturent ; cette fixation « en douceur » stabilise les structures auxquelles elles
appartiennent :
– le permanganate de potassium assure une excellente conservation des membranes lipoprotéiques,
mais les structures cellulaires contenant des acides nucléiques sont très mal fixées ;
– le tétroxyde d’osmium se comporte comme le précédent, mais il pénètre mal dans les cellules ;
– le glutaraldéhyde pénètre bien dans les cellules, fixe efficacement de nombreuses structures, sauf les
membranes.
De fait, on combine les avantages des différents fixateurs en réalisant une double fixation : un
traitement au glutaraldéhyde suivi d’un traitement au tétroxyde d’osmium.
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
Techniques d’observation des formes et des surfaces
La technique histologique en microscopie électronique
2. Inclusion en résine
Le principe est le même que pour l’histologie classique, à la différence près que la déshydratation
préalable doit se terminer dans un solvant de la résine utilisée pour l’inclusion. Les milieux d’inclusion
utilisés sont souvent des résines de la famille des araldites, qui polymérisent à chaud en présence d’un
catalyseur. On obtient des petits blocs solides et très durs, incluant et imprégnant l’échantillon à analyser
; la dureté de ce matériel permet d’obtenir des coupes extrêmement fines et régulières.
On utilise aussi des résines hydrosolubles pouvant être éliminées des coupes, ce qui autorise des
expériences d’immunocytochimie en microscopie électronique.
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
Techniques d’observation des formes et des surfaces
3. Coupe : ultramicrotomie
Les coupes ultrafines sont réalisées grâce à des couteaux de verre ou de diamant très affutés. Le
problème technique de l’avance régulière et surtout très progressive du porte-objet devant le couteau
est résolu par la mise au point de systèmes basés, par exemple, sur la dilatation d’un axe métallique
(avance thermique).
Les coupes, de très faible taille (moins de 0,5 mm de côté) et très fines, sont invisibles à l’oeil nu et
difficilement manipulables sans l’aide d’une loupe.
Le couteau est en fait muni d’une petite cuvette contenant de l’eau à la surface de laquelle les coupes
flottent.
Celles-ci sont récupérées sur des grilles de 3 à 4 mm de diamètre, à mailles très fines, qui servent en fait
de porte-objet et seront introduites dans la colonne du microscope.
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
Techniques d’observation des formes et des surfaces
4. « Coloration »
Cette étape consiste en un simple renforcement des contrastes : on parle de «coloration positive».
Certains atomes de métaux lourds se fixent sélectivement sur diverses structures cellulaires, fixation qui
arrête efficacement les électrons à leur niveau.
Le résultat est un meilleur contraste des images.
On utilise pour cela des solutions d’acétate d’uranyle ou de citrate de plomb et on fait flotter quelque
temps les grilles portant les coupes sur des gouttes de ces substances.
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
Préparations pour
microscopie électronique
Comment avoir une coupe ultrafine de 60-100 nm d'épaisseur ?
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
On peut observer les organites qui doivent être fixé très rapidement, sinon ils seront détruit.
➢ Fixation au Glutaraldéhyde, qui fixe les protéines très rapidement
➢ Post fixation à l'Acide Osmique qui fixe les lipides.
➢Déshydratation en passant par un solvant
➢ Le bloc doit être très rigide pour pouvoir être coupé finement, il y a donc une inclusion en
résine: Epon ou Araldite semi-liquide à froid.
➢ La résine est chauffé à 60°C environ où elle polymérise
➢ L'échantillon enrobé sera de l'ordre du millimètre cube
➢On découpe l'échantillon avec un Ultra-microtome plus sensible (avec un pas de 50nm).
Le couteau est fait de diamant et dont le fil fait 3mm.
➢ La coupe est maintenant ultra-fine avec une épaisseur de 100nm.
➢ Les coupes sont regroupées sur des grilles à maillage adapté.
La coupe flotte à la surface d'une cuve d'eau où elle sera récuperée
A mouse macrophage eating Staphylococcus aureus (12000 x) Courtesy of FIDEL MADRAZO
Comment augmenter la visibilité ?
a. Coloration négative
La fixation et les réactions ultérieures peuvent modifier notablement la structure de l'objet biologique.
Le contraste négatif permet d'assombrir le fond sans colorer l'objet lui-même et donc de le rendre visible sans le
modifier, par simple contraste.
Principe général : au lieu de colorer l'objet (coloration positive), celui-ci est enrobé d'un colorant qui mettra en évidence son contour.
Au début de la microscopie et en particulier de la microscopie électronique à transmission,
un objet ne pouvait être visible que si, après fixation, il était imprégné de substances, plus ou
moins spécifiques, contenant des atomes de métaux lourds opaques aux électrons.
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
Comment augmenter la visibilité ?
a. Coloration négative
Coloration de petits objets isolés et déposés sur une grille recouverte d'un filtre.
Le produit de contraste vient se mouler autour des objets, le MeT affichera alors une image en négatif (en marquant les
contours).
mise en évidence des feuillets d’un liposomes
Adénovirus
Virus de la mosaïque du tabac (VMT)
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
Comment augmenter la visibilité ?
b. Ombrage métalliqueIl met en évidence de petits éléments dans une cellule (ex: molécules protéique de la membrane
cellulaire). Le métal chauffé se dépose sur un coté de la structure.
Une fois déposé, il faudra solidariser la structure en appliquant un filtre
transparent. L'échantillon pourra ensuite être détruit, et on ne gardera
que la réplique qu'on passera au MET. On aura alors une image en
contraste avec impression de relief.
L'ombrage métallique est souvent associé aux techniques suivante:
1. La cryofracture
2. Le cryodécapage
Charpente cellulosique de la paroi végétale
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
Définition:
• Transformation d'un élément transparent en un élément opaque pour l'observation au microscope
But:
• Faire ressortir tous les détails superficiels de la cellule
Méthode:
• 1ère vaporisation verticale d’une mince couche de carbone, c’est la réplique carbonée ; cette dernière est ombrée par 2ème vaporisation oblique de platine
b. Ombrage métallique
Comment augmenter la visibilité ?
b. Ombrage métallique
1. La cryofracture 2. Le cryodécapage
Ces techniques, cryofracture et cryodécapage, permettent une visualisation tridimensionnelle d'organites
intracellulaires ou de réseaux dans des gels hydratés.
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
1. La cryofracture
La technique de cryofracture permet d'obtenir une empreinte, appelée
réplique, de la surface fracturée sous vide d'un échantillon cryofixé.
technique de congélation qui permet d'observer la structure
d'échantillons fluides à l'échelle du nanomètre.
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
2. Le cryodécapage : « technique des répliques »
Technique moderne de cytologie
Etude des membranes cellulaires
l'observation avec un(MET)
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
2. Le cryodécapage : « technique des répliques »
• congélation ou utilisation de froidCryo
• élimination de la partie superficielle d’un objetDécapage
Enlever la partie superficielle d’un objet par congélation
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
2. Le cryodécapage : « technique des répliques »
Appareil de Golgie observer au MET après cryodécapage
Cellule végétale (Euglena gracilis ) observer au MET après cryodécapage
MÉTHODES D’ÉTUDE DE LA CELLULE
MICROSCOPIE ELECTRONIQUECours de CytologieMICROSCOPIE
La coupe
Le microscope photonique en transmission ne peut fournir d'images que si la préparation à examiner
est suffisamment fine pour se laisser traverser partiellement par la lumière.
Dans le cas d'objets épais comme par exemple des tissus animaux ou végétaux, il est nécessaire de
pratiquer des coupes en leur sein pour les rendre suffisamment transparents. L'épaisseur de ces
coupes se situe aux alentours de 4 µ .
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
La coupe
A cette épaisseur, la résistance des tissus à la pression de l'arête de l'instrument coupant
n'est pas suffisante et entraîne des détériorations qui rendent inexploitables les
observations qui en résultent.
C'est pourquoi on a l'habitude de pratiquer une inclusion du tissus préalablement à la
coupe.
Le médium utilisé va se substituer à l'eau tissulaire pour augmenter la tenue du bloc à
couper.
Ruban de coupes sur le Microtome
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Coupe
Microtome
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Fixation
Fixer, c'est immobiliser les structures organiques dans un état aussi proche que possible de l'état vivant.
La fixation provoque l'insolubilisation des constituants intracellulaires et l'augmentation de l'indice de
réfraction.
Il existe des fixateurs simples et des mélanges fixateurs.
La fixation d'une coupe dans un tissu permet de mieux le colorer en favorisant la pénétration du
colorant.
En outre, elle facilite l'observation des pigments.
La fixation des cellules étalées sur lames est fait :
- par séchage à l'air (comme en technique hématologique),
- par vaporisation d'un spray,
- par immersion dans un fixateur liquide (alcool + éther).
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Fixation
• Le formaldéhyde: gaz en solution aqueuse à 40%, vendue dans le commerce sous la dénomination
de « formol. » La solution à utiliser doit être encore diluée à 10% : on obtient un formol à 5%. Ce
produit est très toxique.
• Bouin : formol + acide picrique
FIXATEURS CHIMIQUES SIMPLES
. Ethanol ou alcool éthylique : fixe bien les glucides, mais il a l'inconvénient de durcir les tissus et est un
solvant des graisses. Il est utilisé à la concentration de 70 à 100 %. Il entre également dans la
composition de nombreux mélanges fixateurs.
N.B.
: il existe un polymère du formol (ParaFormAldéhyde P.F.A.) qui permet une fixation plus fine des structures et ne contient pas de méthanol
MAIS a l’inconvénient de déshydrater les tissus et la morphologie est moins bien préservée.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Étalement
Etalement des cellules sur des lames de verre :
l'étalement est fait par le préleveur lors des cytoponctions d'organes, des frottis, écouvillonage, brossages ou
appositions ; ce geste simple doit être bien maîtrisé pour éviter un écrasement des cellules ou des amas en plusieurs
couches peu interprétables.
La fixation des étalements se fait soit par simple séchage à l'air pour la coloration de May-Grunwald-Giemsa soit
par immersion dans l'alcool-ether ou par application d'un aérosol de laque fixante pour les colorations de Harris-
Schorr ou de Papanicolaou (frottis cervico-utérins notamment).
À gauche : projection du produit de ponction à l’aiguille sur une lame. Au centre : la goutte est étalée,
tirée à l’aide d’une autre lame. À droite : lame d’un étalement cytologique après coloration.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Étalement
Liquides frais : LCR, épanchement pleural ou péritonéal, ponction de collection liquidienne
Il est recommandé un acheminement rapide à 4°. Au laboratoire, ces prélèvements sont pris en charge par technique
de cytocentrifugation. Les préparations sont colorées par MGG.
Ces examens sont souvent complétés par un examen du culot de centrifugation traité par inclusion en paraffine.
Etalement des cellules en monocouche sur cellules fixées
Cette technique s’applique essentiellement à la cytologie urinaire et à la cytologie cervico utérine (en alternative au
frottis dit conventionnel). Les cellules sont recueillies dans un liquide conservateur, fixateur spécifique ou alcool à 50°.
Les cellules présentes dans le flacon de fixateur sont traitées par un processus de concentration (par filtration et/ou
cyto centrifugation). Enfin, les cellules sont transférées en couche mince sur une lame.
Les lames sont colorées par Papanicolaou.
Ces milieux sont également utilisé pour la conservation des cellules en vu d’un examen en biologie moléculaire
comme le typage viral HPV dans les FCU.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
La coloration au May Grümwald Giemsa (MGG)
Habituelle en hématopathologie, elle est exclusive (en dehors des
frottis) dans certains laboratoires. Les lames sont séchées à température
ambiante.
Produit de cytoponction d’un ganglion lymphatique de lymphome de Hodgkin ;
étalement coloré au May-Grünwald-Giemsa
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Test de Papanicolaou
méthode standard de diagnostic du cancer et des cycles hormonaux.
La cytologie s'est imposée comme méthode de diagnostic de malignité
concernant différents organes, notamment le tractus respiratoire, urinaire ou
gynécologique.
Elle impose une fixation préalable (Alcool éther, SEDFIX, laque).
Frottis cervico-utérin : étalement coloré au Papanicolaou
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Coloration
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Des colorants sont utilisés en microscopie à chaque fois que des cellules et des tissus animaux dans les
composants et le matériel végétal doivent être visualisés.
Souvent, ces techniques de visualisation optiques sont les seules
méthodes d'identification et de différenciation des tissus.
Utilisation en microscope optique
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Les colorants en microscopie sont employés principalement en histologie, cytologie et
microbiologie mais également pour l'analyse des fibres de textile, le papier et d'autres produits
techniques.
Définitions:
Colorant: produit susceptible de teindre une ou plusieurs strucutres de façon durable.
Colorations structurales: elles mettent en évidence les composants de certaines structures tissulaires
indépendamment du tissu lui-même:
fibres élastiques,
phloème lignifié, (végétaux)
structures kératinisées, chitinisées, etc…
Colorations vitales: Coloration s'opérant sur des tissus qui resteront vivants durant l'étude.
(opposées aux colorations non-vitales).
Coloration létale (non-vitale) : la plupart des colorants agissent sur des cellules mortes, tout
simplement parce qu’ils nécessitent une fixation préalable.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Définitions:
Colorations histologiques: ce sont celles qui différencient finement tous les éléments d'un
tissu.
Cette coloration devient histochimique si elle est spécifique de tel ou tel composé défini.
Colorations cytologiques: ce sont celles qui permettent d'analyser les détails internes des
cellules.
De telles colorations peuvent être cytochimiques si elles mettent en évidence des fonctions
chimiques déterminées.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Classification des colorants en fonction de leurs propriétés chimiques
Colorants acides: il s'agit de colorants anioniques (C'est un anion qui est colorant).
Ex: Eosinate de K+
Colorants basiques: c'est un cation qui est colorant.
Ex: sel de Cl-, bleu de méthylène = Chlorohydrate de tétramethylthionine (où la fonction
methyl modifie la couleur violette en bleu)
Colorants neutres: cations et anions sont colorants.
Les groupements acides ou basiques se fixent:
Ou
aux structures basophiles (colorants cationiques, riches en groupements acides)
aux structures acidophiles (colorants anioniques, riches en groupements basiques).
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Colorants selon l’origine
• Naturels
– Vert de Malachite
– Noir Soudan
– Safran
– Orcéine
– Éosine
– Aniline
– Hematoxyline
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
• Synthétique
– Giemsa
– …/...
Type de coloration
1. On parlera de COLORATION INDIRECTE lorsque celle-ci ne peut se produire sans l’intervention d’un
agent mordant ; avant la coloration, il est impératif de « mordancer », c'est-à-dire pratiquer le
mordançage (faire agir une autre substance qui va « préparer le terrain » au colorant et lui permettre
de se fixer sur les éléments à colorer.
2. On parlera de COLORATION DIRECTE lorsque celle-ci se produit par simple
immersion dans un bain de colorant, qui agit directement sur les composants
cellulaires.
Sans l’agent de mordançage, la coloration est impossible, ou difficile à réaliser.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Coloration : les AUTOMATES
Automate d'inclusion - Leica TP 1040 Automate de coloration - Leica AUTOSTAINER XL
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Une coloration est une expérience de physiologie cellulaire
l'opérateur travaille dans l'infinie complexité de la matière vivante et doit particulièrement surveiller ses
conditions opératoires pour pouvoir tirer de bons enseignements de ses résultats.
Les colorations sont utilisées pour mettre en évidence des structures morphologiques intra-cellulaires, mais aussi
pour étudier la perméabilité de certaines interfaces, la réaction cellulaire à l'introduction d'un colorant, etc.
Notons cependant que les colorants que nous utilisons, opèrent tous, à concentration normale, une action létale sur
les éléments étudiés, même sans fixation préalable ; les colorants vitaux (qui laissent les cellules en vie) sont rares ;
le moins nocif est le rouge neutre, utilisé à 1/1.000 ; citons également le bleu de méthylène, le bleu de crésyl, le vert
Janus, employés à des dilutions de l’ordre de 1/10.000 à 1/30.000, voire 1/100.000.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Congo red
Coloration de rouge Congo d’une amylose
glomérulaire (lumière non polarisée).
Coloration de rouge Congo d’une amylose
glomérulaire : aspect dichroïque vert-jaune des dépôts
amyloïdes en lumière polarisée.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
Inclusion
Inclusion en paraffine des prélèvements effectués sur la lésion.
La paraffine, liquide est chauffée, et refroidie sur une plaque réfrigérée.
en paraffine nécessite une étape d'enrobage préalable par passage de chaque prélèvement dans une série de
solvants organiques qui le déshydratent (et dissolvent les graisses figurées intra-tissulaires) et permettent
l'imprégnation de la paraffine dans le tissu.
Elle consiste à confectionner un bloc de paraffine pour chaque prélèvement en orientant convenablement le
fragment dans le sens de la coupe.
tissu inclus en paraffine dans le
bloc correspondant.
Cours de CytologieTRAITEMENT D’ÉCHANTILLON POUR LA MICROSCOPIE
• Paraffine
• Celloïdine
Techniques particulièresExamen histologique extemporané
Cours de Cytologie
BASES DE LA MICROSCOPIE
Il s’agit d’un examen anatomopathologique pratiqué dès que le prélèvement est effectué, non fixé, pendant une
intervention chirurgicale, afin de fournir rapidement au chirurgien un diagnostic susceptible de modifier le déroulement
de l’acte chirurgical.
Les motifs les plus fréquents de demandes d’examens histologiques extemporanés sont :
• déterminer la nature inflammatoire ou tumorale d’une lésion et, en cas de tumeur, sa nature bénigne ou cancéreuse
pour déterminer l’importance du geste d’exérèse chirurgical ;
• s’assurer qu’une biopsie chirurgicale a bien intéressé un territoire lésionnel représentatif de la maladie ;
• s’assurer que des limites de résection sont saines.
Étude macroscopique du prélèvement frais.
Un fragment est prélevé et fixé sur un portoir.
3 Le fragment congelé est coupé dans un cryostat.
4. Coupe de tissu congelé colorée au bleu de toluidine.
Examen histologique
extemporané
L’observation de cellules vivantes est possible si on utilise des colorants vitaux ou des
dispositifs physiques appropriés ajoutés au microscope photonique.
De façon générale, le matériel biologique doit être traité pour pouvoir être débité en
coupes fines et transparentes, qui sont ensuite colorées.
Des protocoles spécifiques existent pour l’histologie classique ou électronique.
L’observation des formes et des surfaces à l’échelle des ultrastructures ou des
molécules est possible grâce à la réalisation de répliques (cryofracture) ou à la
microscopie à balayage.