page de garde - univ-ouargla.dz · dans l’échantillon bioaugmenté et biostimulé par le biosurfactant, 98, 22% en 35 jours dans l’échantillon bioaugmenté et biostimulé par

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET

SCIENCES DE LA TERRE ET DE L’UNIVERS

Département des Sciences de la Nature et de la Vie

Mémoire

Présenté en vue de l’obtention du Diplôme de

MAGISTER Spécialité : Biologie. Option : Microbiologie Appliquée.

Par : BOUDERHEM Amel.

THEME :

Soutenu publiquement le : / /2011

Devant le jury:

Président Mr HAMDI AISSA B. Professeur (U.K.M.O)

Examinateur Mr HACINI M. Maitre de conférences A (U.K.M.O)

Examinateur Mme SIBOUKEUR O. Maitre de conférences A (U.K.M.O)

Encadreur Mme OULD EL HADJ-KHELIL A. Mait re de conférences A (U.K.M.O)

Invité Mr ARROUSSI A. Chef département Analyses CRD (HMD)

UTILISATION DES SOUCHES BACTERIENNES TELLURIQUS AUTOCHTONES DANS LA

BIODETECTION ET LA BIOREMEDIATION DES SOLS POLLUES PAR LES HYDROCARBURES.

Année universitaire : 2010 / 2011

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET

SCIENCES DE LA TERRE ET DE L’UNIVERS

Département des Sciences de la Nature et de la Vie

Mémoire

Présenté en vue de l’obtention du Diplôme de

MAGISTER Spécialité : Biologie. Option : Microbiologie Appliquée.

Par : BOUDERHEM Amel.

THEME :

Soutenu publiquement le : / /2011

Devant le jury:

Président Mr HAMDI AISSA B. Professeur (U.K.M.O)

Examinateur Mr HACINI M. Maitre de conférences A (U.K.M.O)

Examinateur Mme SIBOUKEUR O. Maitre de conférences A (U.K.M.O)

Encadreur Mme OULD EL HADJ-KHELIL A. Mait re de conférences A (U.K.M.O)

Invité Mr ARROUSSI A. Chef département Analyses CRD (HMD)

UTILISATION DES SOUCHES BACTERIENNES TELLURIQUS AUTOCHTONES DANS LA

BIODETECTION ET LA BIOREMEDIATION DES SOLS POLLUES PAR LES HYDROCARBURES.

Année universitaire : 2010 / 2011

TABLEAU DES MATIERES

Remerciements Résumé Abstarat Liste des figures Liste des photos Liste des tableaux

Introduction

PARIE 1: Synthèse bibliographique

I. Hydrocarbures pétroliers………………………………………………………………….. I.1. Définition………………………………………………………………………………... I.2. Classification……………………………………………………………………………. I.2.1. Hydrocarbures saturés…………………………………………………………………

a. Alcanes linéaires……………………………………………………………………. b. Alcanes ramifiés…………………………………………………………………….. c. Cycloalcanes………………………………………………………………………...

I.2.2. Hydrocarbures aromatiques…………………………………………………………... I.2.3. Composés polaires……………………………………………………………………. I.2. 4.Asphaltènes…………………………………………………………………………… I.3. Devenir des hydrocarbures dans l'environnement…………………………………….. I.3.1.Evaporation……………………………………………………………………………. I.3.2.Solubilisation………………………………………………………………………….. I.3.3.Emulsification…………………………………………………………………………. I.3.4.Sédimentation…………………………………………………………………………. I.3.5.Photo-oxydation……………………………………………………………………….. I.3.6.Biodégradation………………………………………………………………………… I.4. Pollution par les hydrocarbures et leurs impacts………………………………………. I.5. Biodétection de la pollution du sol par les hydrocarbures……………………………… I.6.Traitement des sols pollués par les hydrocarbures…………………………………….. I.6.1. Traitements physiques………………………………………………………………... I.6.2. Traitements thermiques……………………………………………………………….. I.6.3. Traitements chimiques………………………………………………………………... I.6.4.Traitements biologiques……………………………………………………………….. a. Traitement in situ…………………………………………………………………………… b. Traitement en réacteur……………………………………………………………… c. Biotertre et Landfarming…………………………………………………………… d. Phytoremédiation…………………………………………………………………... II. Biodégradation des hydrocarbures………………………………………………………. II.1. Définition de la biodégradabilité………………………………………………………. II.2. Types de biodégradation……………………………………………………………….. II.2.1. Biodégradation aérobie………………………………………………………………. II.2.2. Biodégradation anaérobie……………………………………………………………. II.3. Microorganismes dépolluants le sol…………………………………………………… II.4. Facteurs influençant la biodégradation des hydrocarbures…………………………….

1 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 7 9 10 10 10 10 10 11 11 12 12 12 13 13 13 13

II.4.1.Structure et nature du sol……………………………………………………………... II.4.2.Composition chimique des hydrocarbures…………………………………………… II.4.3.Humidité……………………………………………………………………………… II.4.4.Température…………………………………………………………………………... II.4.5.Salinité………………………………………………………………………………... II.4.6. Potentiel d’hydrogène (pH)………………………………………………………….. II.4.7.Taux d'oxygène……………………………………………………………………….. II.4.8. Contenu en nutriments……………………………………………………………….. II.5. Mécanisme d’accession aux hydrocarbures………………………………………….... II.5.1. Utilisation de la phase dissoute……………………………………………………… II.5.2. Transfert interfacial direct (TID)…………………………………………………….. II.5.3. Transfert interfacial assisté par les biosurfactants (TIA)……………………………. II.5.4. Transfert micellaire (Pseudosolubilisation)…………………………………………. II.6. Biodégradation par type d'hydrocarbures……………………………………………… II.6.1. Biodégradation des hydrocarbures saturés…………………………………………... II.6.2. Biodégradation des hydrocarbures aromatiques……………………………………...

PARTIE 2: Matériel et méthodes

I. Biodétection……………………………………………………………………................. I.1. Matériel biologique……………………………………………………………………... I.2. Méthodes………………………………………………………………………………... I.2.1. Echantillonnage………………………………………………………………………. I.2.2. Caractérisation des sols……………………………………………………………….. a. Analyse physiques…………………………………………………………………. a1. Analyse granulométrique……………………………………………………….. a2. Hygrométrie …………………………………………………………………….. b. Analyses physico-chimiques ……………………………………………………… b1. Potentiel d’hydrogène (pH)……………………………………………………. b2. Conductivité électrique (CE)…………………………………………………... c. Analyses chimiques ……………………………………………………………….. c1. Dosage du phosphore ………………………………………………………….. c2. Dosage des nitrates …………………………………………………………….. c3. Dosage des nitrites …………………………………………………………….. c4. Dosage des hydrocarbures totaux ……………………………………………... d. Evaluation du taux de biodégradabilité des hydrocarbures………………………... d1. Détermination de la demande chimique en oxygène (DCO)…………………... d2. Détermination de la demande biologique en oxygène (DBO5)………………... e. Analyses microbiologiques ………………………………………………………... e1. Dénombrement de la microflore bactérienne…………………………………… e2. Isolement des bactéries susceptibles de dégrader les hydrocarbures……………

e3. Purification et conservation des bactéries……………………………………… α. Purification……………………………………………………………………. β. Conservation des souches purifiées…………………………………………...

e4. Préidentification des souches purifiées…………………………………………. α. Etude morphologique…………………………………………………………. α1. Aspect macroscopique……………………………………………………...

α2. Aspect microscopique……………………………………………………... β. Analyses biochimiques……………………………………………………….

15 15 15 15 15 16 16 16 16 16 17 17 17 18 19 19 20 22 22 22 22 23 23 23 23 23 23 23 24 24 24 24 25 25 25 26 26 26 27 27 27 28 28 28 28 28

β1. Études des enzymes respiratoires…………………………………………. β2. Métabolisme des glucides…………………………………………………. β3. Étude du métabolisme protéique…………………………………………… γ. Sélection des bactéries par utilisation de milieux de culture spécifiques……..

γ1.Croissance sur Cétrimid agar………………………………………………. γ2.Croissance sur milieu King (King A et King B)…………………………...

II. Bioremédiation…………………………………………………………………………... II.1. Matériel ……………………………………………………………………………….. II.1.1. Sol……………………………………………………………………………………. II.1.2. Inoculum bactérien…………………………………………………………………... II.1.3. Biosurfactant…………………………………………………………………………. II.1.4. Solution nutritive…………………………………………………………………….. II.1.5.Solution d'urée………………………………………………………………………... II.2. Méthodologie : bioprocédé «Landferming»………………………………………….. II.2.1. Biostimulation…………………………………………………………………. II.2.2. Bioaugmentation…………………………………………………………………….

a. Sélection d'isolats………………………………………………………………… b. Préparation de l'inoculum………………………………………………………….

PARTIE 3 : Résultats et discussions

I. Caractéristiques des sols………………………………………………………………….. I.1. Analyses physiques……………………………………………………………………... I.2. Analyses physico-chimiques…………………………………………………………… I.3. Analyses chimiques…………………………………………………………………….. I.4. Evaluation de la biodégradabilité des hydrocarbures…………………………………... I.5. Etude microbiologique………………………………………………………………….. I.5.1. Dénombrement de la microflore bactérienne…………………………………………. I.5.2. Isolement de souches bactériennes susceptibles de dégrader les hydrocarbures……... a. Etude macroscopique………………………………………………………………. b. Etude microscopique……………………………………………………………….

c. Tests biochimique…………………………………………………………………... d. Préidentification des souches bactériennes isolées………………………………… I.5.3.Répartition de souches bactériennes préidentifiées dans les sols étudiés……………. I.5.4. Etude statistique………………………………………………………………………. II. Bioremédiation…………………………………………………………………………... II.1. Cinétique de croissance des souches isolées…………………………………………... II.2. Evolution des concentrations en biomasses bactériennes…………………………….. II.3. Evolution des hydrocarbures résiduels………………………………………………… II.4. Rendements d'élimination des hydrocarbures…………………………………………. II.5. Evolution du pH……………………………………………………………………….. Conclusion et perspectives Références bibliografiques Annexes

29 29 30 31 33 33 33 34 34 34 34 34 34 34 35 35 35 36 36 38 38 39 40 41 42 42 43 43 44 44 46 51 53 55 55 56 57 58 60 62 64

Résumé

L’impact de la pollution des sols par les hydrocarbures sur la distribution des bactéries

telluriques (Biodétection) et l’évaluation de leur pouvoir dégradant de ces polluants (Bioremédiation)

ont fait l’objet de notre travail.

Le diagnostic bactériologique des sols étudiés révèle la présence de 9 souches bactériennes

correspondant à une biomasse de 6,4.108 UFC/g de sol dans l’échantillon le moins pollué. Cette

biodiversité est inversement proportionnelle à l’augmentation de la teneur en hydrocarbures. En effet,

dans l’échantillon le plus contaminé, une seule souche à été isolée avec une biomasse de 1,1 .104UFC/kg

de sol. Cette souche est d’ailleurs présente dans tous les échantillons de sols étudiés.

L’application du bioprocédé « Landferming » dans la bioremédiation de l’échantillon E1

contaminé par 123,7g d’hydrocarbures/kg de sol, en présence de la souche autochtone Bacillus

megaterium a aboutit à une forte dégradation des polluants expliquée, par une diminution de leur

concentration. Cette souche choisie pour son temps de génération court est aussi performante vu les

meilleurs rendements d’élimination d’hydrocarbures évalués à 98.43% en 28 jours d’expérimentation

dans l’échantillon bioaugmenté et biostimulé par le biosurfactant, 98, 22% en 35 jours dans

l’échantillon bioaugmenté et biostimulé par l'urée, et 86,1% en 35 jours dans l’échantillon bioaugmenté

et biostimulé par la solution nutritive.

L’utilisation des souches bactériennes telluriques autochtones dans des conditions favorables

(aération, humidité ….) pourrait contribuer à la bioremédiation des sols contaminés par les

hydrocarbures dans les zones d’exploitations pétrolières.

Mots clés: Sol, Hydrocarbures, Pollution, Biodétection, Bioremédiation, Microccocus luteus,

Bacillus megateruim, Biosurfactant, Urée.

Utilisation des souches bactériennes telluriques autochtones dans la biodétection

et la bioremédiation des sols pollués par les hydrocarbures

ملخص

وتقدير ) ا+كتشاف الحيوي(على توزع البكتيريا الترابية بالنفطاثر تلوث التربة عنيتمحور حول البحث ھذا موضوع عملنا).معالجة بيولوجية(استطاعتھا ا+ستھ1كية لھذه الملوث

س1+ت 9 كشف التشخيص البيولوجي للتربة عن وجود /وم م 108 6.4بكتيرية ممثلة بكتلة حيوية في العينة ) غ من التر بةفي التربة الملوثة حيث تم عزل س1لة واحدة فقط في العينة النفطاHقل تلوث وھذا التنوع البيولوجي يتناسب عكسيا مع زيادة نسبة

(ممثلة بكتلة حيوية قدرھا Micrococcus luteus اHكثر تلوث 1.1.104/ .المدروسةوھي متواجدة في جميع عينات التربة ) غ/ م وم

(تطبيق الطريقة البيولوجية Landfarmimg من التربة لعينةفي المعالجة البيولوجية ) E1 الملوثة بـ النفطمن كغ /غ123.4باستعمال الس1لة الترابية اHصلية أدى إلى استھ1ك كبير للملوثات توضح بانخفاض تركيزھم اختيرت ھذه الس1لة الترابية اHصلية

Bacillus megaterium ثرھا باWضافة أدى إلى استھ1ك كبير للملوثات توضح بانخفاض تركيزھم اختبرت ھذه الس1لة لقصر مدة تكا 98.43 النفط إلى كفاءتھا العالية نظرا لنسب إزالة جزيئاتيوم من التجريب في العينة المزودة بيولوجيا و المحرضة بـ 28خ1ل %

98.22 السطح , يوم في العينة المزودة بيولوجيا 35خ1ل % 86.1يوم في العينة المزودة بيولوجيا و المحرضة باليوري ، 35خ1ل % .حرضة بمحلول مغذيو الم

يساھم في المعالجة البيولوجية ...) الرطوبة –التھوية (استعمال الس1+ت البكتيرية اHرضية اHصلية في ظل ظروف مواتية .في مناطق التنقيب عن النفط بالنفطللتربة الملوثة

معالجة بيولوجية - الحيوي ا+كتشاف -تلوث –محروقات –تربة : الكلمات الدالة Micrococcus luteus– Bacillus megaterium . اليوري -جزيئات السطح

استعمال س'!ت بكتيرية ترابية اصلية في ا!كتشاف الحيوي و المعالجة البيولوجية للتربة الملوثة بالنفط

Abstract

The impact of soil pollution by oil on the distribution of soil bacteria (Biodetection) and

evaluation of their power degrading these pollutants (bioremediation) have been the subject of our work.

Bacteriological diagnosis of soils studied revealed the presence of 9 bacterial strains

corresponding to a biomass 6, 4. 108 CFU / g of soil in the least polluted soil sample. This biodiversity is

inversely proportional to the increase in oil content. Indeed, in the most contaminated sample, only one

strain was isolated Micrococcus luteus with a biomass of 1.1 .104 CFU / kg of soil. This strain is also

present in all soil samples studied.

The application of bioprocess "Landfarming" in the bio remediation of sample E1 contaminated

by 123.4 g oil / kg of soil in the presence of native strain Bacillus megaterium has led to severe

degradation of pollutants explained by a decrease in their concentration. This strain chosen for its short

generation time is so powerful best removal of oil valuated at 98,43% in 28 days of experimentation in

the bioaugumented and biostimulated sample by biosurfactant, 98,22 % in 35 days in the bioaugumented

and biostimulated sample by urea and 86,1 % in 35 days in the bioaugumented and biostimulated

sample by nutrient solution.

The use of terrestrial indigenous bacterial strains under favorable conditions (ventilation,

humidity ....) Could contribute to the bioremediation of contaminated soils by hydrocarbons in the areas

of oil exploration.

Keywords: Soil, oil, Pollution, Biodétection, Bioremédiation, Micrococcus luteus, Bacillus

megaterium, Biosurfactant, Urea.

The use of terrestrial indigenous bacterial strains in the biodetection and the bioremediation of oil contaminated soils.

Liste des figures

Figure 1 : Dégradation aérobie de la matière organique………………………………

Figure 2 : Dégradation anaérobie de la matière organique…………………………...

Figure 3: Schéma général des voies métaboliques de dégradation des n-alcanes et des

isoalcanes…………………………………………………………………………...

Figure 4 : Différents produits issus de l’oxydation du toluène………………………..

Figure 5 : Voie de l’oxydation du toluène…………………………………………….

Figure 6: Localisation des sites d’étude……………………………………………….

Figure 7 : Principe de détermination des teneurs en HCT dans le sol par distillation

dans un four……………………………………………………………… …………….

Figure 8 : Schéma d’isolement et dénombrement des bactéries telluriques…………..

Figure 9 : Stratégie de bioremédiation ……………............................................

Figure 10 : Préparation d'inoculum bactérienne………………………………………...

Figure 11 : Résultats d’analyse granulométrique des six sols étudiés………………….

Figure 12: Triangle textural……………………………………………………………..

Figure 13: Taux d'humidité des six sols étudié…………………………………………

Figure 14 : Potentiel d’hydrogène et conductivité électrique des six sols étudies……...

Figure 15: Teneurs de nitrate, nitrite et phosphore dans échantillons de sols

étudiés.………………......................................................................................................

Figure 16: Concentrations en hydrocarbures dans les six échantillons de sols………..

Figure 17: Taux de biodégradabilité (B%) dans les échantillons pollués……………....

Figure 18 : Densité de la microflore bactérienne des six échantillons de sols………

13

13

20

21

21

22

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35

38

38

39

39

40

41

41

Figure 19: Concentrations de la biomasse bactérienne et des hydrocarbures dans les

échantillons du sol étudiés………………………………………………..

Figure 20 : Courbe de tendance entre la concentration des hydrocarbures et la

biomasse dans les échantillons pollués…………………………………………………

Figure 21 : Courbe de tendance entre la biomasse bactérienne et le nombre d'espèces

dans les échantillons pollués……………………………………………………………

Figure 22 : Cinétiques de croissance des souches bactérienne isolées de l’échantillon

E1………………………………………………………………………………………..

Figure 23 : Evolution des biomasses bactériennes dans les échantillons traités en

fonction de temps……………………………………………………………………….

Figure 24: Evaluation de la concentration des hydrocarbures résiduels dans les

échantillons traités en fonction de temps……………………………………………….

Figure 25: Taux de biodégradation des hydrocarbures dans les huit bacs en fonction

de temps………………………………………………………………………………...

Figure 26 : Evolution du pH des huit échantillons en fonction de temps………………

Figure 27: Etapes d'étude de la cinétique de croissance des souches bactériennes

(Annexe 04)

42

42

53

53

55

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57

Liste des photos

Photos 1 : Aspects macroscopiques (a) et microscopiques (b) (G x 100) des souches SA, SB et SC………………………………………………………………………………

Photos 2: Aspects macroscopiques (a) et microscopiques (b) (Gx100) des souches SD, SE et SF…………………………………………………………………………………..

Photos 3: Aspects macroscopiques (a) et microscopiques (b) (Gx100) des souches SG et SH……………………………………………………………………………………….

Photos 4: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (G x 100) des souches SI, SJ et SK……………………………………………………………………………………

Photos 5 : Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (G x 100) de la souche SL……………………………………………………………………………...

Photos 6: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (Gx100) de la souche SM.

Photos 7: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (Gx100) de la souche

SN………………………………………………………………………………………

Photos 8 : Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (G x100) de la souche

SO………………………………………………………………………………………….

Photos 9 : Aspects macroscopiques (a) et microscopiques (b) (Gx100) des souches SP et SQ…………………………………………………………………………………...

Photos 10: Variation de la couleur du sol après traitement……………………………...

Photo 11 : Galerie API 20E……………………………………………….(Annexe 0 3)

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46

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49

49

Liste des tableaux

Tableau I : Effet des hydrocarbures dans l’organisme ……………………………………

Tableau II : Synthèse des principaux traitements de dépollution ………………………….

Tableau III : Exemples de microorganismes dépollueurs…………………………………..

Tableau IV : Présentation des différents sites de prélèvements…………………………….

Tableau V : Aspect macroscopique des colonies isolées…………………………………..

Tableau VI : Aspects microscopiques des souches isolées………………………………….

Tableau VII: Résultats des tests biochimiques des souches bactériennes isolées…………...

Tableau VIII : Distribution des souches bactériennes préidentifiées dans les différents sols

étudiés………………………………………………………………………………………..

06

12

14

22

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45

52

Liste des abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique.

ARN : Acide ribonucléique

AFNOR : Association Française de Normalisation.

B (%): Biodégradabilité.

BTEX : Benzène, Toluène, Ethyl-benzène et Xylène.

DBO5 : Demande biochimique en oxygène durant 5 jours.

DCO : Demande Chimique en Oxygène.

GN : Gélose Nutritive.

HAP: Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques.

HCP : Hydrocarbures pétroliers.

HCT : Hydrocarbures Totaux.

ISO: Organisation international standard.

NAD: Nicotinamide- adénine dinucléotide.

NADP: Nicotinamide- adénine dinucléotide phosphore.

NF ISO : les internationales éditées par l'AFNOR.

R2 : Coefficient de corrélation.

UFC: Unités Formants Colonies.

VP : Voges Proskauer.

Introduction

[Tapez le titre du document]

14

Le phénomène de pollution par les hydrocarbures a une importance de plus en plus grande

sur les plans environnemental, sanitaire et économique. Cette pollution peut avoir un impact

soit direct ou indirect, sur la santé humaine et l’équilibre des écosystèmes aussi bien marins

que continentaux. La qualité des sols peut également en être altérée (MBONIGABA et al .,

2009).

Les effets dévastateurs de l'industrialisation pétrolière et leur impact ont été évalués

sur l’environnement. En effet, de nombreux dégâts réels ont été constatés lors d’accidents

(fuite de pétrole …etc.), de rejets ou de déversements volontaires, pouvant entraîner des

catastrophes écologiques irréversibles (SOLTANI, 2004).

Il est donc nécessaire de trouver des outils capables d’aborder de manière aussi

globale et intégrée que possible ces problèmes, dans le souci d’améliorer les connaissances et

le contrôle des phénomènes mis en cause.

L’évaluation de la pollution par les hydrocarbures moyennant les analyses

quantitatives et qualitatives s’avère très onéreuses bien qu’elle soit indispensable en

fournissant des données physicochimiques quantifiées. De plus, ces analyses ne permettent

pas de connaitre l’impact de ces polluants sur le milieu vivant. Néanmoins, ces mesures

permettent de connaitre la pollution et de mesurer les concentrations des polluants présents et

aussi en mesurer les effets (GREENE et al, 2000).

Compte tenu des limites présentées par les analyses physico-chimiques, il est

nécessaire de faire appel à des moyens biologiques pour surveiller les effets de ces polluants

émis par les décharges dans le sol. Le recours aux microorganismes présente l’intérêt

d’observer la vie sous ses différentes formes et permet de servir, dans les conditions de

perturbation, de signal d’alarme. Le développement de la bio-indication ouvre ainsi la voie à

une surveillance écologique plus large intégrant les effets sur l’environnement grâce à des

organismes sentinelles (GARREC et VAN HALUWYN, 2002).

Par ailleurs, le problème majeur rencontré dans les sols pollués par les produits

pétroliers est l’atteinte de la nappe phréatique affectant ainsi la qualité des eaux. Leur

décontamination peut nécessiter soit l’intervention de procédés physicochimiques ou alors

biologiques (SCOW, 2003).

En dépit des utilisations multiples des procédés physicochimiques dans la restauration

des sols pollués par les produits pétroliers, la bioremédiation reste la solution la plus efficace,


15

la plus demandée car la mieux maîtrisée et la moins coûteuse (VOGEL, 2001). Il s’agit là

d’une technique douce dont le principe repose sur la minéralisation complète des produits

pétroliers qui ne génèrent aucun sous produit toxique ; contrairement aux procédés

physicochimiques qui consistent souvent en un transfert de la pollution d’un milieu à un autre

ou encore à son confinement (VANDERCASTEEL, 2005).

C’est dans ce contexte que s’insère notre travail qui consiste en une contribution à la

restauration des sols pollués par les hydrocarbures en utilisant des bactéries telluriques

autochtones des zones sahariennes.

Deux approches sont adoptées. Par la première, les relations pouvant exister entre le

degré de pollution des sols par les hydrocarbures et la distribution des bactéries telluriques

autochtones susceptibles de les dégrader sont recherchées (Biodétection). La seconde

approche concerne l’évaluation de la capacité des bactéries détectées à dégrader les

hydrocarbures lorsqu’elles sont intégrées dans l’un des procédés de traitement d’un sol pollué

(Bioremédiation).

La réalisation de cette étude se base sur des procédés biologiques impliquant des

méthodologies appropriées.


16

Partie : 1

Synthèse bibliographique

PARTIE : 1 Synthèse bibliographique

1

I. Hydrocarbures pétroliers

I.1. Définition

Les hydrocarbures sont des composés organiques contenant exclusivement des atomes

de carbones (C) et d'hydrogène (H) (FRNENNEC et al ., 1988).

D'après STANDARDS et PANCANADIENS (2008), le terme « hydrocarbure

pétrolier » (HCP) est un terme générique qui désigne les mélanges de composés organiques

présents dans des matières géologiques comme l’huile, le bitume et le charbon ou dérivés de

ces matières.

I.2. Classification

Les hydrocarbures constituent la fraction la plus importante d'un brut pétrolier, ils

représentent entre 65 et 95 % de la plupart des pétroles bruts. Ces hydrocarbures peuvent être

classés en quatre familles principales qui sont présentes en proportions variables selon leur

origine: les hydrocarbures saturés (30 à 70 %), les hydrocarbures aromatiques et

polyaromatiques (20 à 40 %), les composés polaires (5 à 25 %) et les asphaltènes (0 à 10 %)

(NEFF, 1979).

Selon SOLTANI (2004), les hydrocarbures pétroliers sont classés comme suit:

I.2.1. Hydrocarbures saturés

Parmi les hydrocarbures saturés on distingue:

d. Alcanes linéaires

Les alcanes linéaires (n-alcanes, CnH2n+2), dont la longueur de leur chaîne varie de 7

à 40 atomes de carbone constituent une des classes les plus abondantes (10 à 40 % des

hydrocarbures totaux d'un brut pétrolier).

e. Alcanes ramifiés

Les alcanes ramifiés les plus abondants sont les iso-alcanes (groupement méthyle en

position 2). Les autres composés ramifiés antéiso (groupement méthyle en position 3) ou

polyramifiés tels que les isoprénoïdes (exemple: pristane, phytane) sont beaucoup moins

nombreux. Ces composés se trouvent dans le pétrole brut à des proportions sensiblement

égales à celles des n-alcanes.


2

f. Cycloalcanes

Les cycloalcanes renferment des composés cycliques (à 5 ou 6 atomes de carbone)

saturés et le plus souvent substitués. Quelques dérivés polycycliques sont aussi présents et

certains d’entre eux tels que les stéranes et les triterpanes sont caractéristiques d’un pétrole

brut. Cette famille peut représenter entre 30 et 50 % des hydrocarbures totaux d’un pétrole

brut.

I. 2.2. Hydrocarbures aromatiques

Plusieurs familles d'hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques dont le nombre de

noyaux varie de 2 à 6 sont présentes dans les pétroles bruts. Ces composés sont dominés par

des composés mono-, di- et tri-aromatiques. En général, les hydrocarbures aromatiques sont

moins abondants que les alcanes, et ne représentent que 10 à 30 % des hydrocarbures totaux

d'un brut pétrolier.

I.2.3. Composés polaires

Les composés polaires correspondent à des molécules hétérocycliques, telles que:

- des composés oxygénés: phénols, acides carboxyliques, alcools, aldéhydes,…

- des composés soufrés: mercaptans, sulfures, disulfures,…

- des composés azotés: pyridines, quinoléines,…

Les dérivés soufrés sont dans la plupart des cas plus abondants que les composés

oxygénés ou azotés.

I.2.4. Asphaltènes

Les asphaltènes correspondent à une classe de composés de hauts poids moléculaires,

insolubles dans le pentane ou l’hexane. La structure de ces composés est mal connue du fait,

d’une part de leur composition chimique complexe (à base de cycles aromatiques condensés,

de naphtéo-aromatiques, de ramifications et d’hétéroatomes (O, N, S), et d’autre part de

méthodes analytiques difficilement utilisables.

I.3. Devenir des hydrocarbures dans l'environnement

C'est par des processus physiques, chimiques et biologiques qu'un hydrocarbure va

pouvoir être déplacer, transformer ou éliminé, après avoir été répondu dans l'environnement.

Parmi les différentes altérations que peut subir un hydrocarbure, on citera les facteurs

environnementaux qui sont :


3

I.3.1 Evaporation

L'évaporation est un phénomène qui touche les fractions de faible poids moléculaire et

dépend des conditions atmosphériques (vent, vagues, température,…). Les hydrocarbures les

plus légers, ayant de 4 à 12 atomes de carbone (T° eb < 270 °C), qui représentent

généralement prés de 50 % des hydrocarbures totaux d’un brut moyen, sont éliminés

rapidement dès les premiers jours, pouvant conduire à une pollution de l’atmosphère

(SOLTANI, 2004).

I.3.2 Solubilisation

La solubilité des hydrocarbures dans l’eau est très faible. Un hydrocarbure est

d’autant plus soluble que sa masse moléculaire est faible et que sa polarité est élevée. Il est

important de noter que ces hydrocarbures solubles sont parmi les plus dangereux pour

l’environnement. Ils sont difficiles à éliminer et sont adsorbés par la faune et la flore

(GOSWAMI et SINGH, 1991;BOUCHEZ et al ,1995).

I.3.3. Emulsification

Deux types d’émulsions peuvent se former : eau dans l'huile appelée "mousse

Chocolat" et huile dans l'eau. Les émulsions eau dans l'huile sont constituées par des

hydrocarbures de haut poids moléculaires. Ces émulsions difficilement dégradables sont les

précurseurs des résidus goudronneux retrouvés sur les plages, alors que les émulsions « huile

dans l'eau » facilitent l’élimination des hydrocarbures (SOLTANI, 2004).

I.3.4. Sédimentation

La sédimentation est le passage du pétrole de la surface vers le fond. Ce phénomène

concerne les résidus goudronneux constitués de la fraction pétrolière la plus lourde et dont la

densité est supérieure à celle de l’eau de mer.

La sédimentation conduit à la constitution d’agrégats de haute densité difficilement

dégradable par voie naturelle (VANDERSTEEL, 2005).

I.3.5. Photo-oxydation

La photooxydation est observée au niveau de la surface de l’eau où l’air (oxygène)

et la lumière (radiations solaires) sont présents pour la transformation des hydrocarbures

(PAYNE et PHILLIPS, 1985). L’efficacité de ce phénomène dépend de la nature des

hydrocarbures et de la présence de composés non hydrocarbonés (BERTRAND et MILLE,


4

1989). Ainsi, la photooxydation touche plus particulièrement les composés aromatiques qui

sont plus photosensibles que les composés aliphatiques. Parmi ces derniers, les composés

ramifiés sont plus facilement photo-oxydés que les n-alcanes (RONTANI et GIUSTI, 1987).

I.3.6. Biodégradation

La biodégradation est le processus naturel le plus important dans la dépollution de

l’environnement. Les microorganismes en sont responsables, en particulier les bactéries

(VOGEL, 2001). L’importance de la biodégradation dans l’élimination du pétrole, les voies

métaboliques d’oxydation des hydrocarbures par les bactéries et les paramètres qui peuvent

influencer la biodégradation seront traitées plus loin.

I.4. Pollution par les hydrocarbures et leurs impacts

La pollution est une modification défavorable du milieu naturel (dégradation,

altération) qui apparaît en totalité ou en partie comme le sous-produit de l'action humaine

(RODRIGO et al, 2005).

Les impacts de la pollution par les hydrocarbures sont multiples. Les aspects les plus

évidents sont les grandes catastrophes très médiatisés (SOLTANI, 2004).

Les hydrocarbures sont des contaminants environnementaux omniprésents. Ils

constituent une classe des produits chimiques organiques dangereux dont certains de leurs

effets toxiques sont reconnus comme fortement cancérogènes, génotoxiques,

immunotoxique, mutagénique ou tératogénique. Ils représentent une menace pour la santé

publique (WANG et al., 2000; REHMANN et al.,2001; CHEUNG et KINKLE, 2001;

ALEXANDER et al., 2002 ; KANALY et al., 2002; ERIKSSON et al., 2003).

Le tableau I montre parfaitement les effets des hydrocarbures dans l'organisme

(LOWYER, 2000).

Les sols contaminés par les hydrocarbures présentent un danger lors d'un contact direct

avec l'Homme ou l'animal ou lors de leur transfert dans les chaines alimentaires. C'est le

phénomène de bioaccumulation avec le piégeage par les végétaux et les animaux des

polluants ou de leurs produits de dégradation jusqu'à des teneurs atteignant les seuils de

toxicité (SCRIBAN, 1999).


5

Tableau I : Effet des hydrocarbures sur l’organisme (LAWYER, 2000)


5

I.5. Biodétection de la pollution du sol par les hydrocarbures

Il paraît nécessaire de donner quelques définitions concernant la notion de bio-

indication qui, avec l’avancement des travaux de recherche, se diversifie et recouvre en réalité

plusieurs concepts.

GARREC et VAN HALUWYN (2002) considèrent le terme de bio-indicateur comme

« un simple relais ne faisant référence qu’à des effets observables au niveau de l’individu se

traduisant par des altérations morphologiques, tissulaires ou physiologiques (croissance et

reproduction) ». Les auteurs prennent ainsi la réaction au niveau individuel.

Lorsque la réaction se situe au niveau populationnel et/ou communautaire (disparition

ou apparition d’espèces, variation densitaire), on utilisera le terme de bio-intégrateur.

Un troisième concept relève également des processus biologiques mais se situe au

niveau infra-individuel : altérations moléculaires, biochimiques, cellulaires ou physiologiques

non visibles à l’œil. Il s’agit de la notion de bio-marqueur dont on peut donner la définition de

LAGADIC et al (1997): « Un bio-marqueur est un changement observable et/ou mesurable au

niveau moléculaire, biochimique, cellulaire, physiologique, qui révèle l’exposition présente

ou passée d’un individu à au moins une substance chimique à caractère polluant».

Plusieurs auteurs ont étudié la répartitions des dégradeurs des HAP dans

l'environnement (KAISTNER et al.1994 ; MAHMOOD et RAMA RAO, 1994 ; MULLER et

al., 1997) . La plupart de ces études ont trait aux bactéries des sols.

La diversité microbienne contribue au fonctionnement des sols et peut être utilisée

comme un indicateur biologique de la qualité des sols et de leur fertilité. Les bactéries

hétérotrophes participent directement ou indirectement à l’altération des matières organiques

dans e sol (BELLAND, 2009).

La capacité de dégrader les hydrocarbures est distribuée parmi de nombreux genres

bactériens appartenant aux protéobacteries et aux bactéries Gram positives. Les souches

isolées sont généralement mésophiles et sont le plus souvent isolées à partir du sol. La gamme

de substrats utilisée par une souche peut être restreinte à un ou deux hydrocarbures ou

s'étendre à cinq et plus. Elle peut être liée à la présence chez la même souche d'une ou de

plusieurs voies cataboliques mais ne peut pas être clairement assignée à des genres bactériens

particuliers (VANDCASTEELE, 2005).

Les études de la microflore des sols pollués par les hydrocarbures ont mis en évidence

plusieurs points relatifs à l'activité des bactéries aérobie. Ces études ont notamment souligné

l'intérêt physiologique et écologique de la croissance microbienne, la grande diversité de la


6

microflore et leur adaptation aux conditions du milieu. La prédominance des souches à

croissance rapide du genre telles Pseudomonas, Micrococus, Bacillus a fréquemment été

observée (NELSON et al., 2002).

DUTTA et HARAYAMA (2001) ont étudié la distribution des microorganismes

dégradeurs d'hydrocarbures dans différents habitats. Des microorganismes ont été isolés dans

des sédiment marins, des océans, des eaux côtières, des étangs arctiques, des lacs et des

estuaires. Cependant, ces microorganismes se retrouvent en proportions variables dans la

communauté microbienne totale. .

SHI et al. (1999) ont montré que la composition de la microflore des sols est modifiée

par la venue d'une pollution par des carburants, avec un enrichissement en ß-protéobactéries

et/ou y- protéobactéries. GREENE et al. (2000) ont mis en évidence 55 génotypes différents

dans la communauté d'un site contaminé par BTX, styrène et naphtalène. Ces génotypes

correspondent à des bactéries possédant des capacités de dégradation des hydrocarbures

différentes et plus ou moins larges selon les souches bactériennes.

Les résultats de KIYOHARA et al. (1992) montrent que la plupart des bactéries

utilisant les HAP ont été trouvées dans des environnements ou une activité humaine non

négligeable a amené des contaminations par HAP. Les auteurs, notent également la rareté des

souches dégradant l'anthracène et le kérosène ainsi que l'ubiquite remarquable des souches

dégradant le phénanthrène. Il n'est pas exclu que cette études complaise aussi certains cas de

dégradation des HAP par cométabolisme.

Si les bactéries capables de dégrader le naphtalène sont observées dans tous les sols

en quantité non négligeables, c'est –à- dire supérieures à 104 UFC/g, les bactéries dégradant

les HAP à trois ou quatre cycles ne sont au contraire présentes en quantités importantes (de

103à 106UFC g-1 de sol) que dans les sols contaminés par les HAP. Des observations

analogues ont été rapportées, dans le cas des bordures d'autoroute, par (TUHACKOVA et al.,

2001 ; KASTNER et al., 1994).

MULLER et al. (1997) ont effectué une comparaison incluant les caractères

physiologiques (analyses des acides gras des phospholipides et détermination de l'éventail de

substrats de croissance) et les caractères phylogéniques (séquence d'ARN r16S) d'une série de

bactéries. Les souches étaient isolées des sols géographiquement divers contaminés par la

créosole et étaient sélectionnés pour leur croissance sur phénanthrène ou fluoranthène. Les

auteurs ont observé une prédominance de bactéries Gram négatives, sans doute favorisées par

leur vitesse de croissance plus élevée que celle des bactéries Gram positives.


7

KAISTNER et al. (1994) ont par ailleurs précisé qu'aucune bactérie utilisant le

pérylène, le chrysène ou le benzopyrène comme seule source de carbone et d'énergie n'avait

pu être détectée, quel que soit le type de sol.

I.6. Traitement des sols pollués par les hydrocarbures

Les hydrocarbures sont connus pour représenter un risque certain pour la santé

humaine et les écosystèmes, si leur concentration et leur mobilité sont trop importantes. Afin

d’éviter la diffusion des HCP des sites contaminés vers les profondeurs des sols, des mesures

doivent être prises en considération. Le choix d’une méthode particulière de dépollution va

dépendre, au préalable, de certains paramètres comme le type de polluant et de la variabilité

de son comportement (volatilité, adsorbabilité, polarité…), de la diversité des conditions

locales (nature du sol, de la nappe, accessibilité, disponibilité de surfaces utilisables à

proximité, zone urbaine ou non), de voir s’il s’agit d’une pollution récente ou ancienne, de

son étendue ou non. En plus, les exigences économiques et administratives sont à prendre en

compte. Tout ceci nécessite donc, au préalable, un diagnostic (VOGEL, 2001).

En fonction de ces différents aspects, trois catégories d'actions peuvent être menées :

- Les méthodes ex situ qui consistent en l'excavation des sols contaminés. On parlera de

méthode "hors site" si le sol est évacué vers un centre de traitement spécialisé, ou de

méthode "sur site" si le sol excavé est redéposé sur le site pour être traité,

- Les méthodes in situ pour lesquelles l'opération de dépollution s'effectue sans excavation du

sol. Cette option est souvent choisie pour traiter des sites en activité ou lorsque la zone

polluée est trop étendue pour avoir recours à l'excavation (BALLERINI et

VANDECASTEELE, 1999).

La dépollution peut être mise en œuvre en utilisant les procédés suivants :

I. 6.1.Traitements physiques

Actuellement, les traitements physiques constituent la majorité des techniques mises

en œuvre. Elles consistent à séparer et concentrer les polluants, sans les modifier ou les

détruire. Les procédés d’extraction, de lavage et de confinement sont les plus souvent utilisés

(SCRIBAN, 1999).

I.6.2. Traitements thermiques

Deux techniques ex situ sont utilisées, l'incinération et la désorption thermique. Elles

sont employées pour la décontamination des sols pollués par les produits organiques. Ces


8

technologies consistent à utiliser les hautes températures pour réduire les polluants en CO2 et

H2O (LECOMTE, 1995).

I.6.3. Traitements chimiques

Les traitements chimiques ont pour but de détruire les polluants ou de les transformer

en une forme moins nocive pour l'environnement ; et ceci par l’intermédiaire de réactions

chimiques se produisant entre le polluant et le réactif ajouté. Ils peuvent être applicables in

situ ou après excavation des sols. La majorité des procédés exigent que les sols soient sous

forme de boues ou que les contaminants soient mobilisés dans un milieu liquide (MASTEN et

DAVIES, 1997).

I.6.4.Traitements biologiques

Les procédés biologiques permettent de dégrader les polluants par l'action des

organismes (bactéries, champignons, levures, plantes). Ils peuvent être utilisés seuls ou en

complément d'une autre technique. La décontamination par voie biologique consiste donc à

stimuler un phénomène naturel pour en augmenter le rendement afin de détruire le polluant

organique qui sera utilisé comme source de carbone (COLIN, 2000).

Pour la dégradation des hydrocarbures, différents micro-organismes sont utilisés tels

que Arthrobacter, Novocardia ou Pseudomonas. Si la flore locale est inadaptée à la

dégradation des polluants ou est peu abondante, des souches bactériennes performantes

allochtones peuvent être ajoutées au sol (SCOW, 2003).

a. Traitement in situ

La biodégradation par traitement in situ Cette technique fait appel au pompage et

injection de l'oxygène sous forme gazeuse (O2, O3) ou liquide (H2O2) avec injection de

nutriments nécessaires à l'activité microbienne. La source d'oxygène est le principal

inconvénient de ce système, car l'injection d'eau saturée en air n'est pas suffisante. L'apport

d'oxygène s'effectue de plus en plus en phase liquide surtout à partir de peroxyde d'hydrogène.

Cependant, cette source d'oxygène présente trois inconvénients majeurs : son coût, le

caractère corrosif de H2O2, qui attaque les puits d'injection et le pouvoir désinfectant de H2O2

si celui-ci est utilisé à de fortes concentrations. (KOSARIC, 2001).

b. Traitement en réacteur

Le principe du traitement en réacteur consiste à réaliser et faciliter la biodégradation

dans un contenant installé sur le site, en ajoutant au sol les nutriments nécessaires aux micro-

organismes (VOGEL, 2001).


9

Le sol excavé va subir diverses opérations de broyage, de tamisage et

d'homogénéisation. Il sera ensuite mélangé à de l'eau, généralement en proportions de 30 %

en poids/volume et introduit dans le réacteur par pompage. Différents modes de

fonctionnement sont possibles, soit en continu ou en discontinu (VANDECASTEELE, 2005).

La plupart des dispositifs sont constitués de plusieurs réacteurs en chaîne, ce qui

permet de transférer la boue d'un réacteur à l'autre. Les quantités de nutriments, calculées en

fonction de la quantité initiale de polluant, sont ajoutées régulièrement afin de maintenir un

rapport optimum entre les taux de carbone, d’azote et de phosphore. Des micro-organismes

peuvent également être ajoutés pour maintenir la concentration en biomasse. Dans chaque

réacteur, un brassage assure un contact et un transfert de masse maximum entre le polluant et

les bactéries (MORGAN et al., 1994 ; DUBOURGUIER, 2000).

c. Biotertre et Landfarming

Le biotertre et le landfarming regroupent toutes les applications mettant en œuvre des

lots de terres contaminées de différentes hauteurs, y compris ceux auxquels ont été

additionnés des matières végétales (composts) (LECOMTE, 1995).

Pour se faire, le sol est étalé après excavation sur une grande surface imperméable, sur

une épaisseur de quelques dizaines de centimètres. Ensuite la terre est retournée avec

d'éventuels ajouts favorisant la biodégradation (LECOMTE, 1995).

Lorsque le taux d’élimination n'est pas suffisamment élevé, la biostimulation peut être

effectuée par ajout de nutriments spécifiques et/ou bioaugmenté par ajout de bactéries

adaptées à la pollution. STRAUBE et al. (2003) ont constaté une réelle amélioration des taux

de dégradation des hydrocarbures après avoir ajouté de l'azote (augmentation de 10 % du taux

de biodégradation). De même, JUHASZ et NAIDU (2000) suggèrent que la bioaugmentation

est une méthode pour favoriser la dégradation des HAP lourds (benzo [a] pyrène) ou le

traitement des sols fortement contaminés.

a. Phytoremédiation

Certaines plantes permettent de transformer (phytoremédiation) ou de stabiliser

(phytostabilisation) les polluants dans les sols. En effet, les racines de celles-ci sont

étroitement associées à une microflore bactérienne et fongique qui va aider ou faciliter la

dégradation des hydrocarbures (LISTE et ALEXANDER, 2000). Longtemps, la

phytoremédiation était restée essentiellement appliquée aux métaux lourds, mais de récentes

études ont montré que cette technique est utilisable pour les HAP (BALLERINI, 1999).

Cependant, les mécanismes mis en jeu sont encore mal connus (BINET et al., 2000).


10

Les différentes techniques de traitement de la pollution par les hydrocarbures

aromatiques polycycliques sus citées sont résumées dans le tableau II.


5

Tableau II: Synthèse des principaux traitements de dépollution

(BALLRINI, 1999 ; COLIN, 2000)


5

Figure 1 : Dégradation aérobie de la matière organique (ZHANPENG et al, 2002).

Figure 2: Dégradation anaérobie de la matière organique (HONGWEI et al, 2003).


11

II. Biodégradation des hydrocarbures

II.1. Définition de la biodégradabilité

La biodégradabilité est l'aptitude d'une matière organique à subir la biodégradation,

c'est-à-dire la dégradation moléculaire en milieu généralement aqueux résultant des actions

complexes des microorganismes. Sous l'activité enzymatique des ces microorganismes, une

substance pourra subir la biodégradation en se transformant en métabolites et finalement, en

dioxyde de carbone et en eau (SCOW, 2003).

Les processus de biodégradation sont :

• Biodégradation primaire; qui est l'évaluation de la disparition de substance, dans des

conditions définies par la mesure de la quantité résiduelle ou la perte de propriétés (SCOW,

2003).

• Biodégradation ultime; qui exprime le stade au quel la ou les molécules sont totalement

transférées en CO2 (conditions aérobie) ou en CH4 (conditions anaérobie), soit en constituant

de la biomasse, soit en éléments minéraux (ex: minéralisation de l'azote organique en nitrate,

ammonium…) (BOUILLON, 2003).

• Biodégradation acceptable; qui est la dégradation biologique d'un composé organique au

point d'atténuer sa toxicité (SCOW, 2003).

II.2. Types de biodégradation

II.2.1. Biodégradation aérobie

Selon ZHENPENG et al.,(2002), La biodégradation aérobie d'une substance

organique est le degré de modification physique et chimique que subit cette matière

organique par les microorganismes. La figure 1 illustre les processus de biodégradation d'une

substance organique en condition aérobie. Celle-ci peut être affectée par la modification de

l'un des facteurs suivants :

• Vitesse de dégradation des composés organiques.

• Quantité de l'oxygène consommée.

• Produits résultant de la dégradation.

• Activité microbienne.


12

II.2.2. Biodégradation anaérobie

La biodégradation anaérobie d'une substance organique est le degré de modification

physique et chimique que subit cette matière organique par les microorganismes en

conditions d’anaérobiose. La figure 2 illustre les processus de biodégradation que subit la

matière organique en condition anaérobie (HONGWIE et al., 2003).

II.3. Microorganismes dépolluants le sol

Le sol est composé de matière minérale provenant de l'érosion des roches et de matière

organiques (l’humus) provenant de la décomposition partielle des végétaux (DOVET, 1996).

Les microorganismes sont des êtres vivants microscopiques généralement

unicellulaires qui prolifèrent naturellement dans tous les milieux et dans des conditions très

variables (BOUSSSEBOUA, 2002). Le sol comprend des bactéries, des champignons, des

protozoaires, des algues et des virus (SOLTANI, 2004).

La capacité de se développer sur les hydrocarbures ne se limite pas uniquement sur les

bactéries, certains sites contaminés contiennent également de nombreux champignons et

levure capables de les dégrader (VANDECASTEELE, 2005).

Une grande diversité de bactéries et champignons peut dégrader les polluants

organiques dans le sol (biodégradation), tels que les hydrocarbures et leurs produits de

dégradation. Ces derniers deviennent de nouvelles sources de carbone dans le sol. Les

microorganismes s’en nourrissent et les transforment en eau et en CO2. Cependant, tous les

composés organiques ne seront pas dégradés de la même façon (CHAINEAU et al, 1995).

Quelques exemples de genres microbiens incluant des microorganismes agissant dans la

biodégradation des hydrocarbures sont présentés dans le tableau III.

Tableau III: Exemples de microorganismes dépollueurs.

Bactéries Champignons

Gram - Gram + Aspergillus Penicillium Acremonium

Fusarium Trichoderma Pseudomonas Xanthomonas Acinetobacter

Flavobacterium Agrobacterium

Micrococcus Arthrobacter Rhodococcus

Parmi les microorganismes aptes à se développer sur les hydrocarbures, les bactéries

restent qualitativement et quantitativement prépondérantes pour métaboliser ces substrats


13

(BERTRAND et MILLE, 1989). On peut y retrouver tous les types de bactéries, des

autochtones, des hétérotrophes, des aérobies ; des anaérobies ; des mésophiles ; des

psychrophiles et des thermophiles (ZHENPENG et al., 2002).

Plusieurs hypothèses sur l'origine des bactéries dans le sou sol sont émises:

- Migration depuis la surface soit par un processus naturel géologique soit par les

opérations de forage.

- Migration latérale ou verticale avec l'eau de surface via les infiltrations, les flux

hydrodynamiques et les mouvements d'eau profonde.

- Capture dans les sédiment lors de leur formation (LENAITRE et al., 1998).

D'après CHAINEAU et al. (1995), un sol qui contient des hydrocarbures modifie

l’activité des microorganismes. Ceux-ci doivent donc adapter leur activité enzymatique afin

de pouvoir s’y attaquer. Les bactéries et les champignons vont ensuite subir une période de

forte croissance au cours de laquelle ils seront capables d'assimiler les produits de la

dégradation des hydrocarbures. Cette biodégradation peut prendre plusieurs mois. Une fois

qu’ils ont consommé les composés les plus facilement dégradables, leur nombre diminue

jusqu'à atteindre de nouveau la taille d’une population normale. Parfois, seule une partie des

polluants est dégradés car les hydrocarbures se lient partiellement à la matière organique du

sol et deviennent alors moins accessibles aux microorganismes.

II.4. Facteurs influençant la biodégradation des hydrocarbures

De nombreux paramètres influent sur l'efficacité du traitement biologique, il s'agit de :

II.4.1. Structure et nature du sol

Les bioprocédé s’appliquent à une grande variété de sol. Pour cela, il est important

connaitre la structure et la nature de sol (LECOMTE, 1995).

NAM et al. (2003) ont observé que les agrégats de sols réduisaient la biodégradation.

II.4.2.Composition chimique des hydrocarbures

Les hydrocarbures pétroliers différents par leur susceptibilité aux attaques

microbiennes. Ainsi, la vitesse de biodégradation est plus élevée pour les hydrocarbures

saturés, viennent ensuite les aromatiques légères, les aromatiques à haut poids moléculaire et

les composés polaires ayant la vitesse de dégradation la plus faible (SOLTANI, 2004).

II.4.3.Humidité


14

L'humidité est un paramètre important dans les processus de dégradation des

composés organiques simples ou complexes. Il est connu que les faibles humidités

inferieures à 2% limitent la vitesse de biodégradation (DAVIS et MADSEN, 1996).

Inversement, des teneurs trop élevées vont influer sur la perméabilité des sols aux gaz et

générer des conditions de limitations de transfert d'oxygène et donc de limitation de

métabolisme microbien aérobie (BALLERINI, 1999).

II.4.4.Température

La température influe profondément la multiplication microbienne et sur leurs

métabolismes. Les températures optimales de la croissance et de l'activité des réactions

chimiques des microorganismes du sol varient selon l'espèce. L’intervalle de température

favorable à la bonne activité microbienne se situe entre 20 et 37°C (SCRIBAN et al, 1999;

GIBBS et al ,2001).

II.4.5.Salinité

La salinité diminue le nombre de micro-organismes dans le sol. Elle ralentit les

processus de l'humification et de la minéralisation des matières organiques. En effet, de tous

les processus biologiques, la nitrification est la plus touchée, ainsi que le dégagement de CO2

(MALLOUHI, 1989),. Les fortes salinités constituent donc une barrière naturelle pour la

biodégradation (BERTRAND et al., 1993).

II.4.6. Potentiel d’hydrogène (pH)

L'activité microbienne est largement influencée par le pH. Il doit être situé entre 5 et 9

avec un optimum aux alentours de 7 (GABET, 2004). Si le pH est acide, il peut favoriser la

solubilisation des métaux lourds qui sont très toxiques pour les bactéries (ABUL-KASSIM et

SIMONIETE, 2001).

II.4.7.Taux d'oxygène

Le processus biologique aérobie est souhaitable pour la bioremédiation de sol pollué

par le diesel (BRINKMANN et al., 1998). Ainsi, la respiration aérobie semble être le

mécanisme primaire pour la biodégradation des hydrocarbures (GREER et al, 2003).

Plusieurs auteurs montrent que la biodégradation anaérobie est plus lente que la

biodégradation aérobie (HUANG et al., 2000).

II.4.8. Contenu en nutriments

Les nutriments sont indispensables à l'activité et au développement des micro-

organismes. Ce sont des corps simples qui peuvent être assimilés, sans transformation


15

digestive par les organismes et favoriser la croissance des populations de bactéries. Les plus

importants sont l'azote et le phosphore (N, P) (BAROAAH et BORTHAKOR, 1999).

II.5. Mécanisme d’accession aux hydrocarbures

Selon SCOTT et FINNERTY (1976), le mécanisme d’accession impliqué dans le

transport des hydrocarbures à travers la paroi des microorganismes est mal élucidé bien que

des gouttelettes d’hydrocarbures soient fréquemment observées dans la cellule.

Depuis longtemps, la faible dégradation de plusieurs contaminants a été attribuée à

leur récalcitrance (résistance à l’attaque enzymatique). Mais, depuis le début des années 90, il

a été avancé que c’est plutôt leur très basse hydro-solubilité qui expliquerait leur catabolisme

difficile et limité (COMEAU, 1999).

Ainsi, du fait de la faible solubilité de la plupart des hydrocarbures, le mécanisme

d’accession par les microorganismes peut se faire d’après de nombreux auteurs selon quatre

modes que l’on peut décrire comme suit :

II.5.1. Utilisation de la phase dissoute

Ce modèle est celui généralement accepté pour la plupart des substrats. Une fois le

substrat dissout assimilé, la bactérie ne peut utiliser que les molécules se solubilisant dans

l’eau. Par exemple, il a été démontré que la solubilité et la vitesse de dissolution du

naphtalène limitent la croissance d’une souche Alcaligenes NP-ALK. Au début de la

croissance, la faible densité cellulaire de la culture initiale permet une croissance

exponentielle puisque la concentration de naphtalène dissous suffit aux besoins métaboliques.

Si la densité cellulaire augmente à un niveau où les exigences nutritionnelles surpassent la

vitesse de dissolution, la biodisponibilité deviendra alors limitante et la croissance linéaire.

Cette dernière va dépendre alors de la vitesse de dissolution du naphtalène (COMEAU, 1999).

II.5.2. Transfert interfacial direct (TID)

Dans ce cas, le microorganisme ne produit pas de biosurfactant mais va adhérer du fait

de sa forte hydrophobicité à l’interface phase hydrophobe/phase aqueuse (BALLERINI et


Ainsi, d’après FINNERTY et SINGER (1985) beaucoup de microorganismes

dégradant les hydrocarbures ont des surfaces hydrophobes et peuvent donc s’associer aux

gouttelettes d’hydrocarbure ou même entrer dans la phase organique pendant la culture.

SINGER et FINNERTY (1984) ainsi que RATELDGE (1978) ont largement démontré que

les changements étendus dans la composition des lipides de la membrane cellulaire peuvent se


16

produire pendant la croissance sur des alcanes ; et peuvent dans certains cas, représenter le

moyen d’augmenter l’association cellulaire avec la phase d’hydrocarbure. Un système actif de

transport employé par Acinetobacter HO1-N cultivé sur n-hexadécane a été décrit par

KAPPELI et FINNERTY (1979), où des gouttelettes d’hydrocarbure ont été encapsulées dans

les microvésicules de la membrane finissant alors par pénétrer dans la cellule.

II.5.3. Transfert interfacial assisté par les biosurfactants (TIA)

Des biosurfactants sont produits par les bactéries. Ils ne sont pas indispensables au

transfert qui s’effectue comme dans le cas précédent mais ils vont l’accélérer de façon

importante en augmentant l’aire interfaciale entre les phases hydrophobe et hydrophile

(émulsification) (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).

La formation d’une émulsion est souvent observée lors de la croissance de

microorganismes sur des hydrocarbures aliphatiques (huiles). Dans ce cas, la production de

bioémulsifiant permet un accroissement du ratio surface/volume, ce qui va augmenter la

surface disponible pour l'adhésion direct des microorganismes au substrat (COMEAU, 1999).

L’emulsane est le bioémulsifiant le plus connu, sécrété par la souche Acinetobacter

calcoaceticus RAG-1(FOGHT et al., 1989 ; HOMMEL, 1994). Il existe aussi l’alasane

sécrété par Acinetobacter radioresistens KA53. BARKAY et al. (1999) et TOREN et

al.(2002) ont démontré que le complexe alasane augmente considérablement la solubilité des

hydrocarbures polyaromatiques dans la phase aqueuse.

II.5.4. Transfert micellaire (Pseudosolubilisation)

Certains microorganismes peuvent produire des biosurfactants qui solubiliseraient le

substrat dans des micelles qui à leur tour seraient directement assimilés (COMEAU, 1999).

Un mutant Tn5 d’une souche de P.aeruginosa dégradant des hydrocarbures et qui est

incapable de se développer sur n-hexadécane a été isolé par KOCH et al. (1991). Ces auteurs

ont constaté que la mutation avait eu comme conséquence une perte de production de

biosurfactant. Ce qui a entraîné la cessation complète de la prise des hydrocarbures.

GOSWAMI et SINGH (1991) ont remarqué qu’un processus de pseudo solubilisation

(formation de microémulsion) a été impliqué dans la prise du n-hexadécane. Ces auteurs ont

étudié deux souches de Pseudomonas capables de croître sur cet hydrocarbure. Ils ont observé

qu’une souche s’est développée beaucoup plus rapidement que l’autre, avec un taux de

croissance très élevée. Ce résultat est dû à la production simultanément d’un émulsifiant «une

lipoprotéine» et d’un facteur de pseudo solubilisation «une glycoprotéine» qui ont fonctionné

en synergie.


17

Les espèces les plus importantes sont celles appartenant au genre Pseudomonas

produisant les rhamnolipides et les espèces du genre Torulopsis produisant les sophorolipides.

Les biosurfactants de ces différentes espèces sont extrêmement efficaces et créent les niveaux

de tension superficielle les plus bas et ceci pour des concentrations inférieures à celles

requises pour les agents tensioactifs synthétiques (VANDECASTEEL, 2005).

Il convient de noter que les rhamnolipides sont activement synthétisés au cours de la

phase stationnaire de Pseudomonas aeruginosa. Par conséquent, ils sont également produits

pendant la première étape du processus de la bioremédiation et contribuent à la mobilisation

et solubilisation des contaminants pendant les étapes de minéralisation (CHAYABUTRA et

JU, 2000).

II.6. Biodégradation par type d'hydrocarbures

II.6.1. Biodégradation des hydrocarbures saturés

La biodégradation des hydrocarbures saturés est essentiellement un processus aérobie

réalisé par des bactéries. La dégradation des n-alcanes a été étudiée en détail. Une

spécialisation nette des microorganismes selon les longueurs de chaîne des alcanes est une

première caractéristique importante. En effet, les bactéries méthylotrophes strictes sont seules

capables (hormis quelques levures) de dégrader le méthane. Elles sont très répandues dans la

nature, ce qui reflète la large distribution du méthane dans l’environnement. Ces bactéries

appartiennent à cinq genres de bactéries Gram-négatives (Methylobacter, Methylococcus,

Methylomonas, Methylocystis, Methylosinus) (PARALES et al., 2000).

Les alcanes à chaîne moyenne (C5-C10) sont utilisés notamment par des espèces de

bactéries du genre Pseudomonas comme P.aeruginosa, P. putida et P. oleovorans qui ont

été particulièrement étudiées (KAISTNER et al.1994 ; VANDECASTEELE, 2005).

Les alcanes à chaîne longue (C10-C20) sont très bien utilisés par lesmicroorganismes,

plus rapidement que les alcanes moyens. Les bactéries remplissant ce rôle appartiennent en

particulier aux groupes des Corynebacterium, Mycobacteruim et Nocardia (CMN);

notamment au genre Rhodococcus, c’est le cas de la souche Rhodococcus Q15 capable

d’utiliser une large gamme des alcanes (C10 à C21) et à des températures allant de 0 °Cà

30°C, (WHYTE et al., 1998).

De plus, les alcanes à très longue chaîne (>C20) sont également dégradés par les

microorganismes, mais l’utilisation de ces substrats solides à température ambiante a été

moins étudiée (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).


18

Le catabolisme des n-alcanes commence par l’hydroxylation du carbone situé à une

extrémité de la chaîne (oxydation terminale) correspondant au bilan réactionnel d’une

monooxygénase (TRUFFAUT et al., 2001; MORGAN et al., 1994), selon la réaction

suivante:

RCH3 + O2 + NAD (P) H + H+ RCH2OH + NADP+ + H2O

Le système enzymatique impliqué est bien connu chez la souche Pseudomonas

oleovorans, modèle de référence pour la dégradation des alcanes. Ce système comprend trois

composantes :

Une hydroxylase membranaire (gène alkB) qui catalyse l’oxydation de la molécule,

ainsi qu’une rubridoxine-Fe2+ couplée à une rubrédoxine réductase qui assurent le transport

d’électrons (VANDECASTEELE, 2005). La voie métabolique impliquée dans la dégradation

des alcanes linéaires et branchés est donnée dans la figure 3.

En ce qui concerne les alcènes, le cas des doubles liaisons terminales a été étudié. Ces

alcènes sont biodégradables et leur métabolisme est proche de celui des alcanes. Plusieurs

modes d’attaques ont été mis en évidence, mais l’oxydation du groupement méthyle terminal

est considérée comme le mécanisme majeur (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).

II.6.2. Biodégradation des hydrocarbures aromatiques

En aérobiose, la plupart des voies cataboliques des hydrocarbures aromatiques

convergent vers des intermédiaires hydroxylés tels que les catéchols ou leurs dérivés

(protocatéchuate, gentisate). Les enzymes qui catalysent ces transformations sont des

monooxygénases et des dioxygénases. D’autres dioxygénases vont agir ensuite pour réaliser

l’ouverture du cycle aromatique de ces intermédiaires selon un clivage en position ortho ou

méta. Ainsi, les dioxygénase impliquées dans le catabolisme des hydrocarbures aromatiques

par des microorganismes du sol illustrent bien leur nature et leur capacité à s’adapter à

différentes sources de carbone (MESARCH et al., 2000; TRUFFAUT et al., 2001;

SAKAMOTO et al., 2001).

La dégradation des hydrocarbures monoaromatiques est essentiellement le fait de

bactéries Gram-négatives, telles que les espèces de Pseudomonas (P.putida 01G3, P.putida

PaW1, P.pseudoalcaligens KF707, P.putida F1, P.mendocina KR1, Burkholderia cepacia

G4,Ralstonia pickettii PKO1), mais également Gram positives du groupe des

Corynebacterium, Mycobacteruim et Nocardia (CMN) (HANSON et al., 1999 ; BALLERINI

et VANDECASTEELE, 1999 ; PARALES et al., 2000 ; CHABLAIN et al., 2001 ;

SUENAGA et al., 2001).


19

Le mode d’attaque dépend des groupements alkyles substituant mais pour un même composé va dépendre également de la souche bactérienne. Cinq voies distinctes ont été


11

Figure 3 : Schéma général des voies métaboliques de dégradation des n-alcanes et des

isoalcanes (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).


11

Figure 4:Différents produits issus de l’oxydation du toluène

(PARALES et al., 2000).

Figure 5 : La voie de l’oxydation du toluène

(SAKAMOTO et al., 2001).

Toluène


décrites pour la dégradation aérobie du toluène. Toutes les voies démarrent avec

l’oxydation du toluène, mais cinq produits différents d’oxydation sont formés (figure 4). Le

mode d’attaque très utilisé par une dioxygénase sur le noyau aromatique est la voie de

dihydrodiol, avec la molécule du toluène (figure 5).

Quelques HAP sont classés comme polluants prioritaires par la plupart des agences de

protection de l’environnement et en particulier, celle des Etats-Unis et ceci en raison de leur

persistance dans l’environnement (KANALY et al., 2000 ; KANALY ET HARAYAMA,

2000 ; WANG et al., 2000 ; KANALY et al., 2002 ; ERIKSSON et al., 2003).

Bien que les HAP puissent subir l'oxydation chimique, la photodécomposition et la

volatilisation, la dégradation microbienne reste le processus principal affectant la persistance

des HAP dans l’environnement (POTIN et al., 2004b).

Il a été observé que la dégradation des HAP dans le sol est dominée par des souches

bactériennes appartenant à un nombre très limité de groupes taxonomiques, tels que

Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas et Mycobactérie ; y compris d’autres genres

comme Acidovorax, Bordetella, Bacillus et Variovorax (JOHNSEN et al., 2005 ; YU et al.,

2005). Parmi ces groupes taxonomiques, des isolats appartenant aux Sphingomonadaceae

représentent la proportion la plus élevée. Ces isolats ont été classés dans différents genres :

Sphingomonas, Sphingobium, Novosphingobium et Sphingopyxis. Les membres de ces genres

apparaissent êtres spécialisés dans la dégradation des produits chimiques aromatiques, et dont

certains sont même considérés comme des oligotrophes strictes (JOHNSEN et al., 2005).

En revanche, la majorité des travaux ont porté sur l’étude des espèces de

mycobactéries. La raison principale est leur capacités à dégrader les HAP ; soit par

cométabolisme, ou alors par minéralisation. Dans ce cadre, la plupart des voies biochimiques

des mycobactéries et de leurs métabolites ont été identifiés (KANALY et HARAYAMA,

2000; CHEUNG et KINKLE, 2001; KHAN et al., 2001; MOODY et al., 2001 ; REHMANN

et al., 2001; VILA et al., 2001; BOGAN et SULLIVAN, 2003).

Les voies de dégradation des HAP ont été caractérisées sur la base des structures des produits intermédiaires de dégradation identifiés. Le schéma général est comparable à celui des hydrocarbures monoaromatiques. Après la double hydroxylation du premier noyau, une étape d’oxygénation supplémentaire est nécessaire pour chaque ouverture de cycle (MENN et al., 1993 ; SANSEVERINO et al., 1993 ; WANG et al., 2000 ; MOODY et al., 2001 ;FERRERO et al., 2002).

Partie : 2

Matériel et méthodes

Figure 6: Localisation des sites d’étude (google maps 2011).

بركاويBerkaoui

Partie 2 Matériel et méthodes

22

I. Biodétection

La microbiodétection est réalisée grâce à la microflore bactérienne prélevée de

l’horizon superficiel des sols pollués ou non par les hydrocarbures afin de caractériser les

éventuels impacts toxiques de ce polluant sur la qualité et la quantité de la microflore

bactérienne.

I.1. Matériel biologique

Pour la réalisation de nos expériences, nous avons utilisé des échantillons de sols

prélevés de trois bourbiers pollués par des rejets de forage au niveau des champs de Hassi

Messaoud, Haoud Berkaoui et un échantillon accidentellement pollué au niveau de Bamendil.

D'autres échantillons sont prélevés de deux sols n'ayant pas subit de rejets pétroliers, il s'agit

de Bamendil et l''exploitation agricole de l'université de Ouargla (figure 6).

Afin de déterminer la répartition des bactéries telluriques en fonction du degré de

pollution du sol par les hydrocarbures, des prélèvements d’échantillons de sol sont effectués

dans les différents sites (tableauIV).

Tableau IV: Présentation des différents sites de prélèvements.

Echantillons Origines Localisation ■ Age de la contamination Date de prélèvement

E1 Haoud Elhamra 80km 1an (2010) 23 - 03 – 2011

E2 HBK 35km 1 mois (4/2011) 08 - 04 – 2011

E3 C.I.S 80km 4 ans 02 - 03 – 2011

E4 Bamendil 1 7km 6 ans 14- 04 – 2011

E5 Explio-univer 2km - 03 - 04 - 2011

E6 Bamendil 2 7km - 14 - 04 – 2011

HBK: Haoud Berkaoui. C.I.S: Centre Industriel Sud.

■ Localisation des sites par rapport le centre de ville de Ouargla.

I.2. Méthodes

I.2.1. Echantillonnage

L'échantillonnage est effectué à l’entrée, au centre et à la sortie de chaque site. Les

prélèvements ont été réalisés à l'aide d'une spatule stérile à une profondeur de 20 cm. Pour

chaque échantillon, 1Kg de sol prélevé est mis dans des flacons en verre stériles.

Les échantillons de sols obtenus sont ensuite tamisés à 5 mm puis à 2 mm pour

éliminer les éléments grossiers et les débris organiques. En attendant les analyses, les


23

échantillons de sols sont conservés au frais (environ 4°C) car un stress hydrique peut

perturber les mesures biologiques (CHAUSSOD et al, 1992 ; FARDOUX et al, 2000).

I.2.2. Caractérisation des sols

a. Analyse physiques

a1. Analyse granulométrique

La texture d’un sol est révélée par son analyse granulométrique dont le principe est

basé sur la vitesse de sédimentation des particules séparées et dispersées par destruction de la

matière organique par une attaque à l’eau oxygénée. Le fractionnement de ces particules se

fait par l’intermédiaire de la pipette de Robinson qui permet la détermination des fractions

argileuses et limoneuses fines. Ensuite, les sables fins et grossiers sont mesurés par tamisage

(BAIZE, 2000).

a2. Teneur en eau ou humidité

Nous avons procédé à la détermination de la teneur pondérale en eau du sol par la

méthode gravimétrique selon la norme NF ISO 1146. Elle s'exprime en % c'est-à-dire en

gramme d'eau pour 100 g de sol déshydraté à 105°C. Le taux d’humidité s’exprime en %

selon la formule suivante : H% = P 1 - P 0 / P 0

- P 0 : poids de la prise d'essai du sol (g).

- P 1 : poids de la prise d'essai de sol après séchage à 105°C (g).

b. Analyses physico-chimiques

b1. Potentiel d’hydrogène (pH)

Le pH est déterminé selon la norme AFNOR X 31-103 (AFNOR, 1994) par la mesure

du pH d'une suspension de sol dans l'eau à 2/5 (rapport masse/volume) après 1 heure

d'agitation puis décantation à l'aide d’un pH mètre de type Inolab MLM .

b2. Conductivité électrique (CE)

La conductivité électrique est mesurée sur l’extrait de sol dilué au 1/5. Elle doit être

exprimée en dicisiemens par mètre (ds/m) (BAIZE, 2000). Elle a été déterminée par un

conductimètre de type Inolab cond 720.

c. Analyses chimiques

c1. Dosage du phosphore


24

Le phosphore en solution se trouve sous forme de phosphates. La seule forme de

phosphate pouvant être détectée est l'orthophosphate. Toutes les autres formes doivent subir

un prétraitement afin d’être transformées en orthophosphate avant d'être analysées.

Le dosage de ce dernier nécessite une mise en œuvre d'une réaction colorée spécifique

de l'élément recherché selon le schéma suivant (Norme NFT 90-032):

Molybdate Acide ascorbique

Orthophosphate Complexe phosphomolybdate Complexe

Coloré (bleu de molybdène)

Le dosage s'effectue à l'aide d'un spectrophotomètre (DR2000) à une longueur d'onde

de 890 nm. L’intensité de la coloration sera proportionnelle à la concentration en phosphore.

c2. Dosage des nitrates

Le dosage des nitrates nécessite une mise en œuvre préliminaire d'une réaction colorée

spécifique de l'élément recherché selon la réaction suivante (Normes NFX 31 160):

Ce dosage par spectrophotomètre est effectué à une longueur d'onde de 400nm pour

les faibles concentrations et de 500nm pour les fortes concentrations.


de 500 nm. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en nitrate.

c3. Dosage des nitrites

Le dosage des nitrites nécessite une mise en œuvre préliminaire d'une réaction colorée

spécifique de l'élément recherché. Dans ce cas, la réaction dépend de la teneur en nitrites.

Pour les faibles concentrations, la réaction est la suivante (Norme NFT 90-013):

Pour les fortes concentrations, la réaction est:

Nitrite Sel de déazomium

Acide chromotropique Acide sulfanilique

Complexe rose

Nitrates

Cadmium métallique

Sel de déazonium Nitrites Complexe colorée

Acide sonalique Acide genticique

"Réduction"


25

L'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en nitrites.


de 580 nm. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en nitrite.

c4. Dosage des hydrocarbures totaux (HCT)

Les teneurs des sols en hydrocarbures sont mesurées par Retord qui est un four

conçu pour déterminer la saturation en huile et en eau des échantillons solides (roches, déblais

de forage) par un procédé thermique dans lequel l'huile et l'eau contenue dans un échantillon

frais de matériau broyé sont vaporisés, condensés et recueillis dans un tube en verre gradué.

Les échantillons sont progressivement chauffés pour éliminer l'eau et ensuite l’huile à une

température allant jusqu’à jusqu'à 650°C (1200°F)(ANONYME, 2001) (figure 07).

La détermination de la concentration des HCT est effectuée selon la formule suivante :

d. Evaluation du taux de biodégradabilité des hydrocarbures

Evaluation du taux de biodégradabilité des hydrocarbures est un test normalisé

(Norme ISO 9 408, 1991) qui consiste à évaluer ou estimer la biodégradation ultime des

composés organiques par voie biologique en aérobiose.

Selon la norme ISO 9 408, le taux de biodégradabilité est calculé selon la formule

suivante:

B (%) =DBO / DCO

B%: taux de biodégradabilité.

Concentration des hydrocarbures (g /kg de sol) = Vhuil (ml) x 0,8 x 10

Nitrite Sulfate ferreux

Complexe brun Oxyde nitreux

L'ion ferreux

Figure 7 : Principe de détermination des teneurs en HCdans un four

Principe de détermination des teneurs en HCT dans le sol dans un four(ANONYME, 2001)

dans le sol par distillation


26

d1. Détermination de la demande chimique en oxygène (DCO)

Le test de la DCO selon la norme NFT 90-101 consiste en la mesure de l'oxygène

équivalent à la quantité des matières organiques oxydables par le dichromate de potassium

(K2Cr2O7). Dans une solution d'acide sulfurique à 50%, un composé à base d'argent est ajouté

comme catalyseur et un autre mercurique est ajouté pour réduire les interférences dues à

l'oxydation des ions chlorures par le dichromate, d’après la réaction:

Matière organique + yK2Cr2O7 + zH2SO4 CO2 + VH2O + nCr2 (SO4)3 + mK2SO4

L'oxydation effectuée à une température de 150°C pendant deux heures, la lecteur se

fait à l'aide du spectromètre DR2000 à une longueur d'onde de 600nm.

d2. Détermination de la demande biologique en oxygène (DBO5)

Selon la norme NFT 90-103, la mesure de la DBO repose sur la quantification de l'O2

consommé après 5 jours d’incubation de l'échantillon.

Au cours de l'incubation de l'échantillon à l'obscurité et à 20°C, se produisent des

réactions physico-chimiques et biologiques qui se traduisent par un métabolisme de la matière

organique et une consommation d'O2. Si l'eau contient des concentrations importantes en

substances réductrices celle-ci absorbent rapidement l'O2 d'eau. Deux réactions d'oxydation se

produisent.

� Une oxydation lente par voie chimique des composés organiques et minéraux.

� Une métabolisation des matières organiques assimilables.

e. Analyses microbiologiques

e1. Dénombrement de la microflore bactérienne

Afin de dénombrer la microflore bactérienne existant dans les différents échantillons,

nous avons procédé à une culture sur milieu de gélose nutritive. Pour se faire, une série de

dilution variant de 10-1 à 10-9 a été préparée (figure 8). Le dénombrement après culture

concerne, évidement les cellules viables de l'échantillon autrement dit, les cellules capables

de croitre. Il est basé sur l'aptitude de chaque bactérie, fixée par la solidification du milieu

gélosé, à former une colonie visibles à l'œil nu (AUSTIN, 1988).

Suspension mère

10-2

Figure 8 : Schéma d’isolement et dénombrement des bactéries telluriques.

1g d'échantillon de sol

Incubation à 30 C°/ 24-48 h

10-3

10-4

10-n

ml1

Dénombrement des colonies


27

Après 24h d'incubation à 30°C, les colonies développées sont dénombrées à l'aide

d'un compteur de colonies de type Funke Gebber Colony Star.

Selon MARCHAL et BOURDON (1982), le nombre de germes par gramme de sol est

déterminé en calculant la moyenne arithmétique des résultats obtenus et en tenant compte des

facteurs de dilution, selon la formule:

N : nombre des microorganismes en UFC/ml.

n: nombre des colonies dénombrées.

v: volume prélevé (0.1ml).

d: dilution.

e2. Isolement des bactéries susceptibles de dégrader les hydrocarbures

Cette étape nous permet de mettre en évidence la microflore bactérienne dégradante

les hydrocarbures dans les échantillons des sols pollués par les hydrocarbures pétroliers.

À partir d'un échantillon de sol, 1 g est prélevé puis mélangé à 9 ml de milieu minéral

(BH) (Annexe 01). Le milieu est additionné de pétrole brut de 2% considéré comme seule

source de carbone à raison de 2 %. Le mélange est ensuite incubé à 30°C sous agitation à

raison de 150 tours/min.

Après l’étape de pré enrichissement, nous avons procédé à la préparation des dilutions

variant de 10-1 à 10-9, et à l’ensemencement sur un milieu de gélose nutritive "GN".

L'incubation se fait à 30°C pour une durée de 24 heures (JOHNSEN, 2005).

e3. Purification et conservation des bactéries

α. Purification

Après 24 h d’incubation, nous passons à l’étape de purification des cultures. Celle-ci

nous permet d’obtenir des cultures pures à partir des différentes colonies isolées.

La sélection des colonies est basée sur l'aspect macroscopique des colonies à savoir

la couleur, la forme, le diamètre, l’opacité. Un échantillon de chaque type de colonie est

prélevé et ensuite purifié par repiquages successifs selon la méthode de stries (DELARRAS,

2008)

β. Conservation des souches purifiées

N = n / d. v


28

Les souches isolées sont conservées dans des tubes à essai contenant de la gélose

nutritive (GN) inclinée. Les souches sont ensemencées sur la pente des tubes par la méthode

des stries, puis incubées à 30°C pendant 24 heures. Les tubes dans lesquels il y a eu une

croissance seront bouchés et conservés à 4°C pour une durée de 4 à 6 semaines. Afin de

pouvoir toujours disposer de souches viables, la réactivation doit se faire tous les mois

(MARCHAL et BOURDON, 1982).

e4. Préidentification des souches purifiées

L'identification des souches isolées est réalisée en se basant sur les études

morphologique et biochimique.

α. Etude morphologique

α1. Aspect macroscopique

L’observation de l'aspect macroscopique des colonies permet d'effectuer une première

caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de l'identification.

D’après JOFFIN et LEYRAL (2006), les éléments d’identifications macroscopiques

sont:

• La forme des colonies : rondes, irrégulières,…etc.

• La taille des colonies par la mesure du diamètre: ponctiformes ou

non ponctiformes.

• La chromogénèse: couleur de la colonie.

• L'élévation: convexe, concave, plate.

• L'opacité: opaque, translucide ou transparente.

• La surface: lisse, rugueuse, sèche, dentelée,…etc.

α2. Aspect microscopique

� Mobilité à l’état frais

Il s’agit de déterminer si la bactérie est mobile ou non. Ce test permet également de

déterminer la forme, l'arrangement et la mobilité des bactéries. Il consiste en l'observation

d'une goutte de suspension bactérienne, préparée avec de l'eau physiologique et placée entre

lame et lamelle. L’observation se fait au microscope optique de type Bently laboscop 200au

grossissement x100 (DELARRAS, 2008).


29

� Coloration de Gram

C'est une double coloration qui nous permet de connaître la forme, l'arrangement, la

pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées. Cette coloration est

réalisé systématiquement sur les différentes colonies purifiés pour préciser le caractère Gram+

ou Gram-. Avec cette coloration double, les bactéries Gram positive apparaissent en violet

foncé tandis que les bactéries Gram négatives sont colorées en rose ou en rouge

(DELARRAS, 2008).

� Recherche de spores

La coloration au bleu de méthylène permet l’observation de la morphologie cellulaire

et la présence ou l’absence de spore (DELARRAS, 2008).

β. Analyses biochimiques

Les épreuves biochimiques permettent en général de distinguer les espèces, même

étroitement apparentées entre elles (TORTORA et al, 2003).

Cette approche nous oriente sur le métabolisme suivit par les bactéries et les enzymes

qu'elles possèdent. Certains tests ont été réalisés en utilisant la galerie API 20E (Annexe03).

β1. Études des enzymes respiratoires

� Recherche de la catalase

La catalase est une enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène

(H2O2) avec dégagement d'oxygène selon la réaction suivante:

Catalase

H2O2 H2 O + ½ O2

Sur une lame et à l’aide d’une pipette Pasteur, on dépose une colonie bactérienne à

laquelle on ajoute de l'eau oxygénée (à 10 volumes). La présence d'une catalase est révélée

immédiatement par des bulles de gaz qui correspondent à l'oxygène dégagé (MARCHAL et

BOURDON, 1982).

� Recherche de l'oxydase

Ce test détecte un type de chaine respiratoire, qui comporte en fin des chaine un

cytochrome C et une oxydase associée. Les bactéries qui possèdent une telle chaine peuvent

oxyder les composés chimiques comme le réactive oxydase. Les électrons sont transférés de

ce réactif au cytochrome C et de là, via l'oxydase, à l'oxygène. Ainsi oxydé, le réactif


30

Citrate perméase

développe une coloration violette sur le disque d'oxydase imbibé par la suspension

bactérienne, cela indique que le test est positif (SINGLETON, 1999).

β2. Métabolisme des glucides

� Utilisation des sucres (D.Glc, D.Sac, D.Ara)

L'utilisation d'un glucide (ose, diholoside, polyoside) se traduit par une acidification

du milieu par le CO2 ou par les acides organiques produits. En règle générale, c'est un

indicateur de pH qui permettra la visualisation de l'acidification par l'apparition de

chromogène jaune (JOFFIN et LEYRAL, 2006).

� Recherche de la β-galactosidase ou ONPG - hydrolase

Pour dégrader activement le lactose, les microorganismes doivent posséder deux

enzymes ; la perméase et la β-galactosidase. L’ONPG soit β- galactoside possède une

structure analogue au lactose. Le lactose est formé de molécules de glucose et de galactose,

tandis que l’ONPG est composée d’une molécule d’orthonitrophényl liée à un galactose.

L’hydrolyse de l’ONPG (composé incolore) libère l’orthonitrophényl qui est responsable de

la coloration jaunâtre du milieu. La réaction se déroule comme suite:

Figure 09: Réaction d’hydrolyse de l’ONPG (MARCHAL et BOURDON, 1982).

� Recherche de Citrate perméase

Le milieu utilisé est le citrate de Simmons (de couleur verte), qui ne contient que le

citrate (C6H5O7) comme seule source de carbone qui est le citrate de sodium. Seules les

bactéries possédant une enzyme citrate perméase seront donc capables de se développer sur ce

milieu. L'utilisation de citrate provoque l'alcalinisation du milieu selon la réaction suivante

(MARCHAL et BOURDON, 1982):

Citrate + 3H2O acide citrique + 3OH

galactosidase - ß


31

� Réaction de Voges- Proskauerb (VP)

Certaines bactéries sont capables de produire de l’acétyl-méthyl carbinol, soit à partir

de deux molécules d’acide pyruvique, soit, le plus souvent au cours de la fermentation de 2-3

butyléneglycolique. En présence d’une base forte, l’acétoine donne une coloration rouge au

milieu oxygéné (oxydation en diacétyle). Le diacétyle formé réagit avec le groupement

guanidine de α- naphtol pour donner un composé rouge (JOFFIN et LEYRAL, 2006).

� Test Mannitol mobilité

Le Mannitol est un produit de réduction de D-Mannose. Sa dégradation conduit à la

formation du fructose dont l'attaque aboutit à la formation des acides à chaînes très courtes

(acide acétique, Acide formique). Le milieu Mannitol mobilité permet la recherche

simultanément de la fermentation du Mannitol et la mobilité des bactéries (MARCHAL et

BOURDON, 1982).

• La fermentation du Mannitol entraîne le virage du milieu au jaune.

• Les souches mobiles diffusent à partir de la ligne d'ensemencement.

β3. Étude du métabolisme protéique

� Recherche des décarboxylases (ODC, LDC, ADH)

Les décarboxylases scindent les acides aminés entraînant la formation de l'amine

correspondant avec la libération de CO2 selon la réaction suivante:

Décarboxylase

R-CH-COOH RCH2-NH2 + CO2

NH2 amine

Acide aminé

Il s'agit d'enzymes induites dont la synthèse est favorisée par un pH acide (pH entre

3.5 et 5.5) et des conditions d'anaérobiose (MARCHAL et BOURDON. ,1982).

Les décarboxylases sont:

- Lysine décarboxylase (LDC): Lysine Cadavérine + CO2.

- Ornithine décarboxylase (ODC): Ornithine Putricine + CO2.

- Argenine dihydrolase (ADH ): Argénine Agmatine + CO2.

LDC

ODC

ADH


32

� Recherche de l'uréase

Toutes les bactéries hydrolysent l'urée grâce à la réaction suivante:

NH2 Uréase

C=O + H2O H –COO- NH2 + NH3

NH2

Seule, une uréase très active aboutit finalement à la réaction :

NH2 Uréase

C =O + H2O CO2 + NH3

NH2

.

Le CO2 et le NH3 en présence d'eau se combinent en donnant le carbonate

d'ammonium selon la réaction:

CO2 + 2NH3 +H2O CO3 (NH4)2 Carbonate d'ammonium

� Production de H2S

La production d'H2S est révélé par les ions F3+ qui forme avec le sulfure d'hydrogène

un précipité noire de sulfure de fer. Le précipité peut être redisous en milieu acide (JOFFIN

et LYERAL, 2006).

� Production d'indole

Ce test s'effectue en utilisant un milieu riche en tryptophane exempt d'indole (ou

milieu urée-indole). L'indole produit par la bactérie est mis en évidence par le réactif de

Kovacs (MARCHAL et BOURDON, 1982)

� Recherche de la tryptophane-désaminase (TDA)

La désaminase agit sur le L- tryptophane en donnant l'acide indol-pyruvique. Ce

dernier donne avec le perchlorure de fer une coloration brune (MARCHAL et BOURDON,

1982) selon la réaction:

TDA

Tryptophane + H2O acide indol-pyruvique + NH3+ 2H++ 2é


33

� Recherche de gélatinase (Collagénase)

La gélatine peut être incorporé dans un milieu de culture afin mettre en évidence sa

dégradation par certaines bactéries possédants une gélatinase: c'est le test gélatinase. Cette

enzyme hydrolyse le collagène en acides aminés ou en peptides (JOFFIN et LYERAL, 2006).

γ. Sélection des bactéries par utilisation de milieux de culture spécifiques

γ1.Croissance sur Cétrimid agar

Le milieu de gélose au Cétrimid agar est un milieu sélectif pour P.aerogénosa .

Lorsqu' il est incubé à 42°C, les colonies apparaissent muqueuses et vertes (JOFFIN et

LYERAL, 2006).

γ2.Croissance sur milieu King (King A et King B)

Les milieux King A et King B (Annexe 01) permettent la différenciation entre les

espèces de Pseudomonas par la mise en évidence de leurs pigments spécifiques. La

production de pigments est favorisée par la composition du milieu (MARCHAL et

BOURDON, 1982).

� Le milieu King A favorise la production de pyocyanine, pigment permettant l'identification

de Pseudomonas aerugenosa. Les cultures typiques sont colorées en bleu-vert.

� Le milieu King B favorise la synthèse de la pyoverdine, pigment vert fluorescent produit

par Pseudomonas aerugenosa et d’autres Pseudomonas(P.fluorescens, P.putida). La

pyoverdine se manifeste par une coloration vert fluorescent du milieu de culture.

II. Bioremédiation

Le traitement biologique des sols consiste à utiliser des organismes pour transformer

des substances chimiques toxiques en substances non toxiques (ABDELLY, 2006).

II.1. Matériel

II.1.1. Sol

Pour effectuer la bioremédiation de l’échantillon E1, nous avons utilisé 16 kg de sol.

II.1.2. Inoculum bactérien

L'inoculum bactérien est constitué par une biomasse bactérienne préparée à partir de

la souche ayant le temps de génération le plus court. Il est utilisé pour bioaugmenter la

microflore indigène du sol.


34

II.1.3. Biosurfactant

Le biosurfactant est utilisé pour biostimuler la microflore du sol. Ce biosurfactant

provenant d'une boite de commercialisation qui comporte les caractérisations suivantes :

volume (5litres), biosurfactant (2%), alcolhydroxylate (0.43%), 2-méthylopentan (0.2%), 2-

3diol, de (0.22%), sodium (0.2%), tetrasoduim (2%) (www.hcbbv.com).

II.1.4. Solution nutritive

Selon GLASER (1991), il faut approximativement 150 mg d'azote et 30 mg de

phosphore pour convertir 1 g d'hydrocarbures par les bactéries.

Compte tenu de la teneur de E1 en hydrocarbures, le support nutritif est préparé de

NH4NO3 et K2HPO4 à des concertations de 18.51g /l et 3.7g/l d'eau physiologique stérile

respectivement.

II.1.5. Solution d'urée

Sur la base de la concentration en urée dans le milieu de production de biosurfactant

cité par BENINCASA et al., (2008) et afin d'améliorer les conditions de dégradation des

hydrocarbures par des bactéries (biostimulation), nous nous sommes proposé de préparer une

solution d'urée à 6g/l.

II.2. Méthodologie : bioprocédé « Landferming »

Le sol (échantillon E1) est étalé sur huit bacs dans plastique de dimensions:

30 x15x15cm3. Chaque bac contenant 2 kg de sol pollué (figure 10).

B1:bac témoin, contenant un échantillon du sol pollué.

B2:bac stimulé par apport de solution nutritive.

B3:bac stimulé par apport de biosurfactant.

B4:bac stimulé par l'ajout d’urée (6g /l.).

B5:Bac bioaugmenté par l'ajout d'un inoculum d'une souche bactérienne sélectionnée.

B6:Bac bioaugmenté par une souche bactérienne sélectionnée et stimulé par solution

nutritive ;

B7:Bac bioaugmenté par une souche bactérienne sélectionnée et stimulé par biosurfactant.

B8:Bac bioaugmenté par une souche bactérienne sélectionnée et stimulé par urée (6g/l).


35

II.2.1. Biostimulation

La biostimulation consiste à stimuler, au moyen d’adjuvants chimiques ou

biochimiques, la dégradation des polluants par les micro-organismes indigènes (VOGEL,

2001).

La stimulation de la microflore de notre sol est réalisée par le moyen soit de 200ml de

solutions contenant soit 2% de la solution de biosurfactant, soit 18.51g/l de NH4NO3 et

3.7g/l de K2HPO4 ou 6 g/l solution d’urée.

L'aération et l'humidification des échantillons se fait de manière régulière pendant

toute la période d'essai.

Témoin B.1

2kg de sol

Biostimulation

Inoculum

bactérienne

B.2

B.3

B.4

Figure 9: Stratégie de bioremédiation.

B.5

Stimulant

Bioaugmentation

biosurfactant

Solution nutritive

Solution en urée

Bioaugmentation

Inoculum

bactérienne

B.8

27

Bioaugmentation+ Biostimulation

B.6

B.7


36

II.2.2. Bioaugmentation

La bioaugmentation consiste à ajouter des micro-organismes dans la zone polluée afin

d’augmenter le taux de biodégradation des contaminants. Les micro-organismes ajoutés

peuvent être étrangers au sol ou indigènes (VOGEL, 2001).

a. Sélection d'isolats

La cinétique de croissance des souches isolées de l'échantillon de sol (E1) sur milieu

BH additionné de 2% de pétrole comme seule source de carbone, a été suivie pendant 8

heures en mesurant chaque deux heures la concentration bactérienne (RODRIGO et al, 2005).

La sélection se fait selon les paramètres de croissance, à savoir, le temps de

génération (G) et le taux de croissance (µ).

Le temps de génération G correspond au temps nécessaire à une souche pour passer

du nombre initial n0 = x0 à t = 0 au nombre n= 2x0 au temps t n.

Le taux de croissance est le nombre de division N par unité de temps (heures).

Où : µ = N / t G = t / N

N = (log UFC1 – log UFC0) / log2 (PREVOT, 1961).

Les étapes de l'expérience sont décrites dans l’Annexe 04.

La souche ayant montré le temps de génération le plus court à été choisie pour

augmenter l’échantillon destiné à la bioremédiation.

b. Préparation de l'inoculum

La préparation de l'inoculum consiste en la réalisation d'une culture à partir de la

souche sélectionnée. Elle est préparée en prélevant une colonie à partir d'une culture jeune

(24 heures) et en l’ensemençant dans un Erlen meyer contenant 250 ml de milieu BH (2%) à

30°C dans un incubateur à agitateur (150 tr/min) pendant 24 heures (LEUNG, 2005).

Après la centrifugation de la culture à 3000 tr/min pendant 10 minutes, le culot est

récupéré et dilué dans 100 ml d'eau physiologique stérile (LEUNG, 2005).

L'inoculum est constituée par une biomasse bactérienne de 3.41 1011 UFC/ml.

250 ml de milieu BH(2% de pétrole)

24 h d à 30 °C. 150 tours /min

Figure 10 :

Centrifugation à 3000 tr/mn

Dilution dans 100 ml d'eau physiologiques stérile

Culot

ml de milieu BH(2% de pétrole)

1Colonnie

Incubation pendant

24 h d à 30 °C. 150 tours /min

Figure 10 : Préparation d'inoculum bactérienne.

Centrifugation à 3000 tr/mn

Pendant 10 mn

Dilution dans 100 ml d'eau physiologiques stérile

Culot

Culture jeune de souche sélectionnée


37

Afin d'estimer la vitesse de dégradation des hydrocarbures par les bactéries telluriques

à partir des prélèvements effectués de témoin et des bacs bioaugmentés et/ou biostimulés

hebdomadairement pendant 5 semaines, un suivi des différents paramètres en relation avec la

concentration bactérienne évaluée par simple dénombrement sur le milieu GN et celle des d’

hydrocarbures résiduels, les taux d'élimination des ces polluants et le pH a été effectué.

Le taux de dégradation des hydrocarbures exprimé en % est calculé à partir de la

formule suivante :

Taux de dégradation(%)=(Concentration initiale en HCT - Concentration finale en HCT)x100

Concentration initiale en HCT

PARTIE : 3

Résultats et discussion

Figure 11 : Résultats d’analyse granulométrique

Figure

15%

15%

12%16%

42%

E4

9%11%

16%

23%

41%

E1

E4 E6

: Résultats d’analyse granulométrique des six sols

Figure 12: Triangle textural (BAIZE, 1990)

20

%

39

%

E67%

13%

14%

24%

42%

E5

15

12

%

26

%

37

%

E3

6% 12

%

14

%

25

%

43

%

E2

16

37

six sols étudiés.

13

% 17

%

11

%

7% 14

%

16

%

Partie 3 : Résultats et discusion

38

I. Caractéristiques des sols étudiés

I.1. Analyses physiques

Les résultats de l’analyse granulométrique et d'humidité des six échantillons de sols

étudiés sont consignés dans les figures 11et 13.

D'après la figure11, l’analyse granulométrique montre que la fraction prépondérante est celle

des sables (plus de 50%).

D’après la figure12, les horizons étudiés sont donc classés comme des horizons

sableux limoneux pour E1, E2, E3 et E5 et sableux argilo- limoneux- pour E4 et E6 selon le

triangle textural du Groupement d'Études des Problèmes de Pédologie Appliquée : GEPPA

La structure sableuse des sols étudiés suggère une circulation facile des fluides

contenant les nutriments et l'oxygène qui sont d'autant accessibles aux microorganismes que

le milieu est perméable (LEGOMTE, 1995).

ERIKSON et al. (2001) ont montré l'influence de la structure du sol sur le transport de

l'oxygène dans ce dernier. Ces auteurs indiquent que plus un sol est dense, moins les

nutriments et l'O2 sont transportés vers la flore indigène du milieu, responsable de la

biodégradation. De même, NAM et al. (2003) ont observé que les agrégats de sols réduisaient

la biodégradation. Cependant, dans les zones arides où le sable est la fraction dominante, les

micro-organismes et leurs produits de synthèse sont faiblement reliés aux particules du sol

(DOMMERGUES ET MANGENOT, 1970).

La qualité structurale du sol est fortement influencée par la valeur du pouvoir

d’oxydoréduction de ce sol. Cette valeur oriente la nature et l’intensité de la population

microbienne (DOMMERGUES et MANGENOT, 1970).

Plusieurs études ont été effectuées dans le but de comprendre le mode d'action de

l'argile en présence de composés organiques et de bactéries. WARR et al,.(2008) ont souligné

que l'action bactérienne sur les hydrocarbures est nettement améliorée en présence des

smectites de Ca2+ échangeables. Les cations divalents Ca2+ et Mg 2+ agissent comme des ponts

entre l'argile chargée négativement et les biofilms se trouvant aux surfaces des bactéries.

Une autre propriété de l'argile est sa capacité à augmenter la croissance bactérienne et

par conséquence augmenter la dégradation des hydrocarbures (VANLOOSDRECHT et al.,

1990; STOTEZKY et REM,1996; CHAERUN et TAZAKI, 2005).

Partie 3 :

Figure13

Figure14 : Potentiel d’hydrogène et conductivité électrique des six sols étudies

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

E1

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

18%

20%

1

H(%

)

Figure13: Taux d'humidité des six sols étudiés.

Potentiel d’hydrogène et conductivité électrique des six sols étudies

E2 E3 E4 E5

Echantillons

E1 E2 E3 E4 E5

Echantillons

Résultats et discusion

Potentiel d’hydrogène et conductivité électrique des six sols étudies.

E6

pH

CE (dS/m) à 25°C

E6


39

Les échantillons de sols étudiés sont aussi caractérisés par une humidité relative

variant de 6 à 17%. Les valeurs les plus élevées sont celles de l'échantillon de HBK E2 (17%)

et de Bamendil E4 (14%), l’échantillon E1 et E3 présentent la valeur d'humidité la plus faible

soit 6% (figure13).

Les faibles teneurs en eau des échantillons peuvent d'une part être expliquées par les

faibles humidités relatives des sols sahariens (MONOD, 1999) et d'autre part par les

déversements des fluides de forage dans le cas de l’échantillon de HBK et la richesse du sol

en argile (14.8%) dans le cas de l'échantillon de Bamendil (E4). Toutefois, il est à noter qu'un

faible taux d’humidité peut avoir un effet négatif sur l’activité microbienne en limitant le

contact microorganisme / polluant et en inhibant le processus de dégradation enzymatique

(LECOMTE, 1995).

Dans un sol sableux suffisamment humide, La continuité d’un film liquide autour des

particules assure une propagation rapide de l’activité microbienne (MOREL, 1989).

I.2. Analyses physico-chimiques

Les valeurs du pH et de conductivité électrique des six échantillons sont mentionnés

dans la figure14. Les échantillons de sols étudiés présentent des pH alcalins peu variables,

allant de 7,51 à 7,9 (figure14).

Par ailleurs, les valeurs de la conductivité électrique de l échantillon E5 est de l’ordre

de 6,4 dS/m, les cinq autres échantillons présentent des valeurs de conductivité électrique

similaires variables de 0,53 à 0.83dS/m (figure14).

Dans les régions arides, les sols sont généralement alcalins (7,5< pH <8,5) (KOULL,

2007).

Le pH alcalin des échantillons prélevés de bourbiers (E1, E2, E3) est influencé par

celui des boues rejetées qui présentent des pH alcalins nécessaires afin d’éviter la corrosion

du matériel de production.

Selon GABET (2004), l'activité microbienne est plus affectée par le pH. Il doit être

compris entre 5 et 9 et avoir un alentour de 7.

Selon l'échelle de salinité (RICHARD et al., 1954) démontre que la majorité des sols

sont moyennement salés, le sol prélevé de l'exploitation de l'université (E5) qui est hyper salé.

L’absence totale de la végétation, la température élevée, la rareté des pluies et la forte

évaporation pourraient expliquer les quantités de sels solubles dans les échantillons de sol

(HALILAT, 1998).


40

Selon MALLOUHI (1989), la salinité diminue le nombre de micro-organismes dans le

sol. Elle ralentit les processus de l'humification et de la minéralisation des matières

organiques. En effet, de tous les processus biologiques, la nitrification est la plus touchée,

ainsi que le dégagement de CO2. Les fortes salinités constituent donc une barrière naturelle

pour la biodégradation (BERTRAND et al., 1993).

Partie 3 :

Figure15: Teneurs de nitrate, nitrite et phosphore

0

5

10

15

20

25

30

E1

Teneurs de nitrate, nitrite et phosphore des échantillons de sols

E2 E3 E4 E5

Echantillons

Nitrite (mg/l(

Nitrate (mg/l(

Phosphate (mg/l(


des échantillons de sols étudiés.

E6

Nitrite (mg/l

Nitrate (mg/l

Phosphate (mg/l


41

I.3. Analyses chimiques

Les résultats des certains paramètres chimiques étudiés sont donnés dans la

figure15.

Les concentrations des deux formes d’azote mesurées (nitrate et nitrite) sont très

variables dans les six échantillons de sols. Les nitrites sont très concentrés dans l’échantillon

E3 (11.67mg/l) et E4 (26.3mg/l), moyennement concentrés dans E2 (14.3mg/l) et E3

(11.67mg/l) et plus faibles dans les autres échantillons (figure15).

Par ailleurs, le nitrate est généralement présent à des valeurs faibles et presque

semblables dans tous les échantillons à l'exception de E3 et E4 qui contiennent les plus forts

teneures 1.03mg /l et 1.5mg/l respectivement (figure15).

Le phosphate se trouve en concentration la plus élevée dans l’échantillon E6

(2.12mg/l) par rapport aux autres échantillons E1, E2, E3, E4 et E5 dont les valeurs sont

respectivement de 0.13mg /l; 1.2mg /l; 1.1mg /l; 0.84mg /l; 0.91mg/l (figure15).

Selon ECKFORD et al. (2002), la pollution des sols par les hydrocarbures a pour

conséquence un déficit en azote et en phosphore, ce qui peut limiter la biodégradation des

hydrocarbures. Pour tout traitement biologique, un enrichissement du sol avec ces éléments

sera donc nécessaire. L’azote et le phosphore sont des facteurs limitant la biodégradation des

hydrocarbures dans les sols (MOHN et STEWART, 2000).

Par ailleurs, il est connu que la flore microbienne a besoin d’éléments minéraux pour

sa croissance, en particulier d’azote et de phosphore, dont les proportions optimales,

généralement admises, sont de 10g d’azote et 1g de phosphore pour 100g de carbone

(BALLERINI, 1999). Ces éléments rentrent dans l’édification des constituants cellulaires lors

de la multiplication des microorganismes (synthèse d’ADN, protéines…etc.).

SCOW et al. (2003) rapportent que dans les environnements aérobies les éléments

limitant les plus susceptibles sont l’azote et le phosphore. Ainsi, dans de telles conditions, il

est probable quel a biodégradation soit limitée


Figure16: Concentrations en hydrocarbures dans les six échantillons de sols

.

Figure 17: Valeurs de taux de biodégradabilité (B%) dans les échantillons pollués.

0

50

100

150

200

250

300

E1 E2 E3 E4 E5 E6

ten

eu

rs e

n H

CT

(g

/kg

de

so

l)

Echantillons

0

2

4

6

8

10

12

E1 E2 E3 E4

B(%

)

Echantillons


42

� Teneurs des hydrocarbures dans les sols étudiés

Les résultats de dosage des hydrocarbures totaux obtenus sont représentés par la figure

16.

D'après la figure 16, nous constatons que l’échantillon E2 (HBK) est le plus chargé en

hydrocarbures totaux (247.12g/kg de sol) comparé aux échantillons E1 (HH), E3 (C.I.S) et

E4 (B1) qui ont des concentrations en hydrocarbures de 123.43g/kg de sol, 156.02g/kg de sol

et 134.4g/kg de sol respectivement. Les échantillons E5 et E6 n'ont révélé que des traces

d'hydrocarbures totaux.

Les teneurs en hydrocarbures totaux des échantillons (E1, E2, E3 et E4) sont

largement supérieures à la valeur fixée par la norme hollandaise (0.1 g/kg de sol) (GABET,

2004). Ces résultats confirment bien la pollution de ces sols par les hydrocarbures, sachant

que la variation du taux de pollution des échantillons par les hydrocarbures peut être attribuée

à l'historique de contamination.

Par railleur, les faibles teneures en hydrocarbures inferieures à 0,1g/kg de sol indique

que les échantillons E5 et E6 ne sont pas pollués.

I.4. Evaluation de la biodégradabilité des hydrocarbures

La mesure de taux de biodégradabilité des hydrocarbures dans les échantillons pollués

a donné les résultats regroupés dans la figure 17.

Nous pouvons constater que les taux de biodégradabilité (B%) des hydrocarbures

dans les échantillons pollués varient de 2.26 à 9.6% (figure 17).

La détermination de la biodégradabilité aérobie des hydrocarbures dans les conditions

naturelles nous a permis de constater que les hydrocarbures sont faiblement biodégradables

dans tous les échantillons. En effet, dans le même type de sol, OUDOT (2000) rapporte un

taux de biodégradabilité de 65% pour le pétrole d’arabain light et 11% pour le fuel.

La complexité des rejets de production pétrolière (bourbier), de pétrole brut (E4), et

les conditions du milieu expliqueraient les difficultés rencontrées par les microorganismes

pour dégrader le polluant.

I.5. Etude microbiologique

I.5.1. Dénombrement de la microflore bactérienne

Les résultats du dénombrement sur gélose nutritive obtenus pour les différents échantillons des sols étudiés testés, sont représentés par la figure 18.

Partie 3 :

Figure18 : Densité de la microflore bactérienne des six échantillons de sols.

Figure 19: Concentrations de

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

E1

Co

nce

ntr

ati

on

ba

cté

rie

nn

e(l

og

UF

C /

g d

e s

ol)

0

50

100

150

200

250

300

E1

Co

nce

ntr

ati

on

de

s H

CT

(g/k

g d

e s

ol)

Densité de la microflore bactérienne des six échantillons de sols.

Concentrations de la biomasse bactérienne et des hydrocarbures dans les

échantillons du sol étudiés.

E2 E3 E4 E5

Echantillons

E2 E3 E4 E5 E6

Echantillons

HCT

Biomasse bacterienne


Densité de la microflore bactérienne des six échantillons de sols.

bactérienne et des hydrocarbures dans les

E6

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Bio

ma

sse

(lo

g U

FC/g

)


43

Il en ressort de cette figure qu’il y a présence d’une microflore dans les six

échantillons, mais la comparaison des concentrations en microflore bactérienne totale des

sols nous permet d’avancer que l'échantillon E2 étant le plus récemment pollué présente la

plus faible microflore avec une valeur de 1,1 .104UFC/g de sol par rapport aux échantillons

E1, E3 et E4 présentant des concentrations bactériennes de 6,41.108 UFC/g de sol, de 2,29 107

UFC/g de sol et de 3,1 .108 UFC/g de sol respectivement. Les échantillons E5 et E6 (sols non

pollués) ont des valeurs de 3,09.106UFC/g de sol et 3, 38.107 UFC/g de sol respectivement

(figure18).

On registre une variation nette de la densité bactérienne dans les deux échantillons

E4 (HCT: 137.4g /kg de sol) et E6 (non pollué) sachant que ces derniers sont prélevés de

même zone (Bamendil) (figure19)

Selon DOMMERGUES et MANGENOT (1970), les densités bactériennes dans les

sols soumis à des conditions écologiques dures (régions arides et régions polaires), sont

faibles mais elles ne tombent rarement en dessous de 104 - 105 germes /g de sol sec dans les

horizons superficiels, ce qui est confirmé par nos résultats.

Les bactéries capables de dégrader les hydrocarbures sont observées dans le sol en

quantité non négligeables, c'est –à- dire supérieures à 104UFC/g de sol (TUHACKOVA et

al.2001).

La différence de biomasses bactérienne de deux échantillons E4 et E6 peut être

expliquée par la présence de source de carbone supplémentaire dans l’échantillon E4.

Le rejet des produits pétroliers dans les milieux marins ou terrestres entraîne une

prolifération des microorganismes aptes à se développer sur les hydrocarbures et leurs

produits de dégradation. Leur nombre est beaucoup plus important dans les zones polluées de

façon chronique et s’accroît après un apport d’hydrocarbures dans les sites dépourvus de

contamination (ATLAS, 1993).

La différence de la biomasse bactérienne entre les deux échantillons E5 et E6 (non

pollués) est due à l'effet de salinité de l'échantillon E5 qui sembles avoir affecter la

prolifération bactérienne.


Tableau 05 : Aspect macroscopique des colonies isolées

Consistance Surface Opacité Contour Elévation Forme Chromogénèse Diamètre (mm)

Critère

souche

visqueuse lisse Translucide irrégulière Convexe Ronde Beige 2 SA crémeuse Rigoureuse Opaque Régulière Convexe Ronde Beige 2 SB crémeuse lisse Opaque Régulière Convexe Régulière Blanche 2 SC crémeuse lisse Translucide Régulière Convexe Ronde Jaune 1 SD crémeuse lisse Translucide Régulière Convexe Régulière Blanche 1 SE visqueuse lisse Translucide Régulière Convexe Régulière Blanche 1 SF visqueuse lisse Translucide Régulière Convexe Régulière Jaune 3 SG visqueuse lisse Translucide Régulière Convexe Régulière Blanche 2 SH visqueuse lisse Opaque Régulière Convexe Régulière Jaune 1 SI crémeuse lisse Translucide Régulière Convexe Ronde Beige 2 SJ visqueuse Rigoureuse Translucide Régulière Convexe Ronde Jaune 2 SK crémeuse lisse Opaque Régulière Convexe Régulière Jaune ≥2 SL visqueuse lisse Translucide Régulière Convexe Régulière Beige 2 SM visqueuse lisse Translucide Régulière Convexe Régulière Blanche 2 SN visqueuse lisse Opaque Régulière Convexe Ronde Jaune 2 SO crémeuse Rigoureuse Translucide Régulière Convexe Blanche 1 SP visqueuse lisse Opaque Régulière Convexe Blanche ≥1 SQ


44

I.5.2. Isolement de souches bactériennes susceptibles de dégrader les hydrocarbures

a. Etude macroscopique

L'ensemencement sur milieu BH additionné de 2% de pétrole brute comme source de

carbone nous a permis d'isoler 17 colonies distinctes par leur aspect, leur taille et leur

couleur. Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau V.

Les clonies des bactéries sont généralement lisses et ont un diamètre de plus de 1mm

(tableau V).

D’après ROGER et GARCIA (2001), de tous les microorganismes du sol, les bactéries

sont les plus nombreuses et les plus petites : la taille de leurs colonies ne dépasse pas en

général, 0.5 à 2 mm de diamètre.


Tableau 06 : Aspects microscopiques des souches isolées.

+:positive/présence/mobile. I:isolée. A: en amas.

-: négative/ absence/ immobile. P:en paire. C: en chênette.

Etat frai Coloration de Gram Coloration au

bleu de méthylène

Colonies Mobilité Arrangement forme des

cellules

Gram présence de

spores

SA + P /A Bacilles + +

SB - p /A Bacilles + +

SC + p/ A Bacilles + +

SD - P/A Coques + -

SE - I Coques + -

SF - A Coques + -

SG + I/P/C Colibacilles - -

SH + P/A Colibacilles - -

SI + P/A Colibacilles - -

SG + P Colibacilles - -

SK + P/A Colibacilles - -

SL + A Coques - -

SM - A Coques - -

SN + A Coques + -

SO + A Bacilles - -

SP + A Bacilles - +

SQ - I/C Bacilles - +


45

b. Etude microscopique

L'observation microscopique a été réalisée suivant deux étapes : après une observation

à l'état frais et après coloration de Gram et au bleu de méthylène. Les résultats obtenus sont

donnés dans le tableau VI.

Les résultats consignés dans le tableau VI, montrent une variété de types bactériens.

Les bactéries isolées sont généralement mobiles (11/17). Elles présentent différentes formes :

bacille, coccobacille ou cocci. Elles sont assemblées en différents arrangements soit en paire,

en amas, en chainettes ou même isolées. Elles présentent aussi une paroi de Gram positive ou

négative. La coloration au bleu de méthylène a révélé la présence de spore uniquement chez

les bacilles, les coques et les colibacilles en sont dépourvus.

Les bactéries du sol ont une grande variété de formes. Elles peuvent être mobiles ou

immobiles, et posséder ou non des formes de résistance (spores, kystes) (DOMMERGUES,

1977).

A cause de la structure solide du sol et de l'absence d'eau en quantité suffisante, les

bactéries de sol sont peu mobiles et se fixent plutôt sur toutes sortes de supports où elles se

développent en microcolonies de manière à rester en contact avec leurs ressources en eau et

en nutriments (BOUSSBOUA, 2002).

Le caractère mobile des bactéries isolées peut être expliqué par le phénomène de

chimiotactisme, il est important dans la dégradation de nombreuses classes d’hydrocarbures.

Il donne en effet aux bactéries mobiles l'avantage de pouvoir localiser des composés comme

le toluène (VANDECASTEEL, 2005).

Les souches les plus fréquemment décrites dans la biodégradation des hydrocarbures

appartiennent aux genres de Gram positif. D’autres souches Gram négatives ont la capacité de

dégradation des hydrocarbures assez large (VANDERCASTEELE, 2005).


46

c. Tests biochimiques

Les résultats des tests biochimiques sont représentés dans le tableau VII

Tableau VII: Résultats des tests biochimiques des souches bactériennes isolées.

+ : résultat positif. -: résultat négatif. Sac: saccharose. -: Glc: glucose.

D'après les résultats présentés dans le tableau VII, la totalité des souches sont

catalase positive alors que le caractère oxydase négative n'est pas un critère général, il ya des

souches qui sont oxydase positive

SA SB SC SD SE SF SG SH SI SJ SK SL Sm SN SO SP SQ Souches/Tests

+ + + + + + + + + + + + + + + + + Catalase

Enz

ymes

re

spira

toire

s

- - - - - - - - + + + - - - + - - Oxydase

+ + + - - - + + - - - - + + + + + Glu

Mét

abol

ism

es g

luci

diqu

e

+ + + - - - + - - + - - + + + + - Sac

- + + - - - + + - - - - - + + - - Ara

+ + - + + + - - + - - + + + - - + Mannitol

- - - - - - - + - - - - - + - - - H2S

- - + + + - + + - - - - + + + - - (ONPG)

+ + + - - - + + + + + + - - - + + Citrate

perméase

+ + - + - - + - - - - - - - - + + VP

- - - - - - - - - - - - - + + - - LDC

Mét

abol

ism

e pr

otéi

que

- - - - - - + - + + + + - + - - - ADH

- - - - - - + - - + - - + - - - + ODC

- + + + + + - - + - - - - + - + - Uréase

- - - + - + - - - - - - - - - - - TDA

- - - - - - + - + + - - + - - + - IND

+ + - - - + - - - + - - - - + + GEL

- - - - - - - - + - - - - - - - - King A

- - - - - - - + + + - - - - - - - King B

Partie 3 :

Photos 01 : Aspects macroscopiques (a) et microscopiques (b) des souches SA, SB et SC.

(a)

(b)

SA

Photo 02: Aspects macroscopiqu

(a)

(b)

SD

BOUDERHEM A., 2011

BOUDERHEM A., 2011

BOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEM A ., 2011

: Aspects macroscopiques (a) et microscopiques (b) (Gxdes souches SA, SB et SC.

SB

: Aspects macroscopiques (a) et microscopiques (b) (G

des souches SD, SE et SF.

SE SF

BOUDERHEMBOUDERHEM A., 2011

BOUDERHEMBOUDERHEM A., 2011

BOUDERHEMBOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEM ABOUDERHEM A ., 2011


45

(Gx100)

SC

es (a) et microscopiques (b) (Gx100)

SF

BOUDERHEM A., 2011

BOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEM A ., 2011


47

d. Préidentification des souches bactériennes isolées

La préidentification a pu être réalisée à l’échelle du genre ou de la famille. En effet,

selon la clé de BERGEY’S, parmi les 17 bactéries isolées, nous avons pu affilier les souches

comme appartenant aux familles suivantes :

� Bacillaceae

En raison de la morphologie de leurs cellules en forme de bacilles (photos 1, b), Gram

positif, sporulés (tableau VI) catalase positive, oxydase négative et un citrate perméase positif

(tableau VII). Les souches SA, SB et SC ont été affiliées au genre Bacillus.

La souche SA a une gélatinase positive, ONPG, ADH, LDC et ODC négatives, elle

oxyde le glucose et le saccharose, ne produit pas H2S (tableau VII), les spores sont sous

forme cylindrique centrées. D'après ces caractéristiques, cette souche pourrait être B. firmus

(BERGEY, 1984 ; LEYRAL et JOFFIN, 1998).

Le caractère immobile de la souche SB est le seul déterminant de B.mycoides

(BERGEY, 1994LEYRAL et JOFFIN, 1998,).

D'après les résultats biochimiques de la souche SC à ONPG positive, elle oxyde les

sucres, citrate perméase, uréase positive, elle peut être B.megateruim. (BERGEY, 1984 ;

LEYRAL et JOFFIN, 1998).

La capacité du genre Bacillus à dégradé les hydrocarbures est attribuée à un système

enzymatique approprié (ANTAI ,1990; IJAH et UKPE, 1992).D'autre part, certaines espèces

du genre Bacillus sont capables d'excréter les biosurfactants tels que GradisidineS, surfactine,

polymyxine et lipopeptides (ROSENBERG et RON, 1999; RON et ROSENBERG, 2001)

� Micrococcaceae

Les souches SD, SE et SF sont apparentées au genre Micrococcus en raison de leur

forme sphérique et de leurs cellules qui se présentent soit en amas ou isolées (photos2, b). Les

colonies paraissent jaunes ou blanches, opaques et lisses (photos2, a). Ces souches n’oxydent

pas le glucose, à mobilité et oxydase négative.

D'après les résultats des tests biochimiques et par comparaison avec ceux établis par

BERGEY (1984), il est probable que la souche SD correspondrait à l’espèce M.varians.

La souche SE ne dégrade pas les protéines et les sucres et présente une uréase

positive. Selon BERGEY'S (1994) cette souche pouvait être Miccrococcus lylae .

Partie 3 :

\

Photos 03: Aspects macroscopique

(a)

(b)

SG

BOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEM A ., 2011

: Aspects macroscopiques (a) et microscopiques (b) (G

des souches SG et SH.

SG SH

BOUDERHEM A ., 2011., 2011

BOUDERHEM A ., 2011., 2011


s (a) et microscopiques (b) (Gx100)

., 2011

., 2011


48

La souche SF a une uréase, ODC, ADH et gélatinase positives,VP négative, Ces

caractéristiques correspondent à celles de Miccrococus luteus (BERGEY, 1984; LEYRAL et

JOFFIN, 1998.).

L'étude initiale de la dégradation du butane a fait l'objet d'études enzymologiques qui

ont mis en évidence la diversité des butane mono-oxygénase (HAMAMURA et al., 1999).

Celle de Micrococcus CF8, une souche utilisant une gamme étendue d'alcanes, a des

propriétés, notamment son inactivation par la lumière, qui suggèrent nettement une mono-

oxygénase à cuivre, comme celle des méthanotrophes et autotrophes oxydant l'ammoniac

(HAMAMURA et ARP, 2000).

Enterobacteriaceae

Les souches SG et SH ont été rattachées à la famille des Enterobacteriaceae et

présentent les caractéristiques suivantes : une forme bacillaire (photos 3, a), à Gram négatif,

catalase positive et oxydase négative. L'étude des caractères biochimiques, nous a permis de

rattacher la souche SG au genre Enterobacter. Quant à la souche SH, elle pourrait appartenir

au genre Citrobacter.

En se basant sur les tests biochimiques de cette souche, LDC et uréase négatives,

citrate positif, oxyde les sucres, ne produit pas l'H2S, indole et VP positifs (tableauVII), nous

pouvons supposer que la souche SG appartienne à l’espèce E. cloacae (LEYRAL et JOFFIN,

1998).

La souche bactérienne SH est mobile, capable d'utiliser le citrate de sodium comme

unique source de carbone, elle est ONPG positive, LDC, ADH, ODC, indole et VP négatives

(tableauVII). Compte tenu de ces résultats, l’espèce serait probablement Citrobacter freundi

(BERGEY, 1984, LEYRAL et JOFFIN, 1998).

La présence de pompes d'export multidrogues peut conférer à des souches

appartiennant aux entérobactéries dégradant les hydrocarbures, une résistance à des

hydrocarbures toxiques (VANDECASTEELE, 2005).

La souche Enterobacter PK01 convertit le toluène en 3-méthylcatécol par

l'intermédiaire d'une seul enzyme, le toluène ortho-mono- oxygénase (TOM), qui hydrolyse

succulemment le toluène en o-crésol, puis se dernier en 3- méthylcatéchol. Cette enzyme est

également capable de co-oxyder le trichloréthylène. Les gènes de la voie de dégradation, dont

les gène tomA de TOM, sont localisés sur le plasmide TOM (SHIELDS et al., 1995)

Partie 3 :

Photo 04: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (G x 100) des

(a)

(b)

SI

BOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEM A ., 2011

: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (G x 100) des

souches SI, SJ et SK.

SJ

BOUDERHEM ABOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEMBOUDERHEM A ., 2011


: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (G x 100) des

SK

BOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEM A ., 2011


49

� Pseudomonaceae

D’après leurs morphologies macroscopiques, les souches SI, SJ et SK ont été

rattachées au genre Pseudomonas. Celles -ci forment de petites colonies circulaires, lisses et

brillantes avec une pigmentation jaune sur le milieu GN (photo 4, a). Les souches ont une

forme bacillaire (Photo 4, b) avec les caractéristiques suivantes : Gram négatif, oxydase,

catalase, ADH et citrate positives (BERGEY, 1984; SINGLETON, 1999).

L’incapacité de la souche SI à dégrader le mannitol avec ONPG positive (tableauVII)

nous permet de supposer qu’il s’agit de Pseudomonas putida. (LEYRAL et JOFFIN, 1998).

La souche SJ a une citrate perméase et une ODC positives (tableau VII) et

produit du pyocyanine et du pyoverdine. Ces caractères nous suggèrent qu'il s'agit de

P.aerogenosa (LEYRAL et JOFFIN, 1998).

Les colonies de la souche SK sont incolores dans le milieu King A et elles sont de

couleur jaune dans le milieu King B. A coté de ce paramètre, les caractères biochimiques

permettent de déduire que cette souche correspondrait à P.fleoresens. (LEYRAL et JOFFIN,

1998).

Les alcanes de chaines moyennes (C5-C10) sont utilisés notamment par des bactéries

de genre Pseudomonas (VANDECASTEELE, 2005).

Les études des systèmes alcane hydrolases de P.oleovorance et P.aerogenosa

indiquent que la spécificité de l'enzyme est large. En effet, pour le dernier microorganisme, le

système enzymatique oxyde les n–alcanes, des akylobenzen et des cycloalcanes (cyclohexane,

méthylocyclohexane)(VAN RAVENSWAAY CLAASEN et VAN DER LINDEN, 1971;


L'espèce Pseudomonas putida possède une large capacité de dégradation des

composés aromatiques (WHITE et al, 1996), elle dégrade le toluène par une voie spécifique

codé par le plasmide TOL, ce derniers lui permet la croissance sur cinq hydrocarbures

aromatiques (ASSINDER et WILLIAMS, 1990).

Les caractéristiques génomiques de P.putida KT2440 mettent en évidence une

efficacité métabolique en harmonie avec sa qualité saprophyte omnivore. Elle possède un

équipement génétique lui permet l'assimilation de composés aromatiques très variés et

assurant sa compétitivité dans le sol (JIMINEZ et al., 2002; NELSON et al., 2002 ; WEINEl

et al., 2002).

Partie 3 :

Photos 05 : Aspects macroscopi

(a)

Photos 06: Aspects macroscopique (a) et

(a)

BOUDERHEM A

BOUDERHEM

: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (Gxla souche SL.

(b)

: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (Gx100) de la

souche SM.

(b)

BOUDERHEM A

BOUDERHEM A

A ., 2011

A ., 2011


que (a) et microscopique (b) (Gx100) de

x100) de la

BOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEM A ., 2011


� Rhodococaceae

La souche SL présente une morphologie de bacille pleomorphique donnant des

filaments avec des branchements et des formes coccoides, Elle est Gram positive (Photos 5,

b), mobile, catalase, citrate perméase et ADH positives, oxydase négative, dégrade le

mannitol et n'oxyde pas les sucres (tableau VII). L'espèce proposée à cette souche selon ces

critères est Rhodoccocus sp.

Selon GURTLER et al. (2004), plusieurs espèces du genre Rhodococcus sont isolées

des sols pollués. Ceci est dû à leur versatilité métabolique. Les mono- et dioxygénases sont

caractérisées biochimiquement et génétiquement chez beaucoup d’espèces de ce genre.

De nombreuses espèces du genre Rhodococcus dégradent un large spectre de

composés récalcitrant. R.opacus SAO101 est capable de croître sur le phénol, le benzène, le

4-nitrophénol, le biphényle, le naphtalène (KIMURA et URUSHIGAWA, 2001). R.opacus

M213 dégrade le naphtalène, le toluène, le phénol et l’hydroxybenzoate (UZ et al., 2000).

Les hydrocarbures aromatiques et aliphatiques halogénés sont des produits toxiques et

résistants à la dégradation biologique. Bien que beaucoup de microorganismes sont capables

de dégrader le benzène monochloré, seulement quelques espèces du genre Rhodococcus

peuvent utiliser ce substrat (ZAITSEV et al., 1993).

La dégradation versatile du genre Rhodococcus est due à la présence de larges

plasmides linéaires portants des gènes codant pour la dégradation de différents composés

(VAN DER GEIZE et DIJKHUIZEN, 2004 ; KONIG et al., 2004).

� Neisseriaceae

La souche SM est apparentée à la famille des Neisseriaceae présentant une forme

coccobacillaire (photos 6, b), Gram négatif, catalase positive et oxydase négative. L'étude des

caractères biochimiques, nous ont permis de rattacher cette souche au genre Acinetobacter.

Etant donné que cette souche est LDC, uréase et citrate négatives, oxyde le glucose et le

saccharose et ne produit pas d'H2S (tableauVII), nous l'avons supposé être

A. baumanii (LEYRAL et JOFFIN, 1998).

Les souches du genre Acinetobacter produisent des biosurfactants de nature et de

masse molaire différentes (RON et ROBSENBERG, 2001). En effet, L'alasan, émulsifiant

polymérique produit par Acinetobacter radioresistens se fixe à la surface d'autres bactéries

dont il modifie les propriétés. L'émulsan, excrété par Acinetobacer caloaceticus est un

héteropolysaccharides de masse molaire moyenne de 106 g/mol (VANDECASTEEL, 2005).

Partie 3 :

Photo 8 : Aspects macroscopi

Photo 07: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (Gx100)

(a)

(a)

BOUDERHEM

BOUDERHEM

: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (Gx100) de la

: Aspects macroscopique (a) et microscopique (b) (Gx100)

de la souche SN.

(b)

(b)

BOUDERHEM A

BOUDERHEM A

BOUDERHEM A ., 2011

BOUDERHEM A ., 2011


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