A G E ‐ R E L A T E D  MA C U L A R  D E G E N E R A T I O N :  

H I S T O P A T H O L O G I C A L   A N D   S E R UM  

A U T O A N T I B O D Y   S T U D I E S  

 

 

 

 

 

Svetlana Cherepanoff 

 

Submitted to the Faculty of Medicine 

in fulfillment of the requirements of for the degree  

Doctor of Philosophy (Medicine)  

 

 

 

 

Department of Clinical Ophthalmology & Eye Health 

University of Sydney 

 

 

AUGUST 2007 

 

 

 

 

 

 

For Rinjani and Ambika 

i

A C K N O W L E D G E M E N T S  

 

First and foremost, I would like to thank Soren Soengkoeng, my husband, for his 

endless patience, unwavering support, and willingness to do far more than his fair 

share of child rearing and housekeeping during the course of my candidature. 

Without him this thesis would not have been possible. 

 

To my parents, Mei Lan, Irina and Leonid, who have always encouraged me to 

pursue my interests, and who arrive each week to look after the girls and perform 

endless chores without question – I thank each of you for your kindness, 

generosity and tireless support. 

 

I thank Mark Gillies, my supervisor, for his enthusiastic support of all ideas and 

potential projects, for introducing me to ophthalmology research and for 

graciously putting up with a “firebrand” student. 

 

Thanks must go especially to Shirley Sarks, who has been an extraordinary teacher 

and mentor, and who has utterly changed the way I understand this disease. I 

thank both Shirley and John Sarks for their generosity in sharing their tissue 

resources, their unique insights and their unrivalled expertise. 

 

Finally, a big thank you to all the people who enable the smooth running of both 

Save Sight Institute and the Prince of Wales Medical Research Institute – without 

you the experimental and written work could not have been produced. 

 

 

 

The National Health and Medical Research Council (Canberra, ACT Australia) 

provided financial support in the form of a PhD scholarship. 

ii

D E C L A R A T I O N  

 

I hereby declare that this thesis is my own work, except where due 

acknowledgement is specified below. To the best of my knowledge, the thesis 

contains no material previously published or written by another person, nor 

material which to a substantial extent has been accepted for the award of any 

other degree or diploma of a university or other institute of higher learning. All 

experiments described in this thesis were performed at the Save Sight Institute 

laboratories (University of Sydney, Sydney Eye Hospital Campus, Sydney NSW 

Australia) and at the Prince of Wales Medical Research Institute laboratories 

(Randwick, NSW Australia), between 2001 and 2006. 

 

The histopathological observations in Chapter 3 were made by Dr Shirley Sarks 

(Prince of Wales Medical Research Institute, Randwick NSW Australia), and the 

electron micrographs in the same chapter were produced by A/Prof Murray 

Killingsworth (South Western Area Pathology Services, Liverpool NSW 

Australia). Dr Shirley Sarks produced the line drawings in Figure 2.2‐1 and Figure 

3.1‐5. Ms Emma Kettle (Children’s Medical Research Institute, Westmead, NSW 

Australia) provided assistance with the immunohistochemical studies. Dr Karen 

Byth Wilson (NHMRC Clinical Trials Centre, University of Sydney, NSW 

Australia) performed the linear mixed effects modelling in Chapter 4. 

 

 

 

              Svetlana Cherepanoff 

              August, 2007 

 

iii

 

A B S T R A C T  

 

BACKGROUND :  The accumulation of abnormal extracellular deposits beneath 

the retinal pigment epithelium characterises the pathology of early age‐related 

macular degeneration. However, the histopathological threshold at which age‐

related changes become early AMD is not defined, and the effect of each of the 

deposits (basal laminar deposit and membranous debris) on disease progression is 

poorly understood. Evidence suggests that macrophages play a key role in the 

development of AMD lesions, but the influence of basal laminar deposit (BLamD) 

and membranous debris on the recruitment and programming of local 

macrophages has not been explored. Although evidence also suggests that 

inflammation and innate immunity are involved in AMD, the significance of anti‐

retinal autoantibodies to disesase pathogenesis is not known. 

 

A IMS :  (i) To determine the histopathological threshold that distinguishes normal 

ageing from early AMD; (ii) to determine the influence of BLamD and 

membranous debris on disease progression; (iii) to examine whether distinct early 

AMD phenotypes exist based on clinicopathological evidence; (iv) to determine 

the histopathological context in which Bruch’s membrane macrophages first 

found; (v) to examine the relationship between Bruch’s membrane macrophages 

and subclinical neovascularisation; (vi) to determine if the progressive 

accumulation of BLamD and membranous debris alters the immunophenotype of 

Bruch’s membrane macrophages and/or resident choroidal macrophages; (vii) to 

determine if the anti‐retinal autoantibody profile differs significantly between 

normal individuals and those with early AMD, neovascular AMD or geographic 

atrophy; (viii) to examine whether baseline anti‐retinal autoantibodies can predict 

progression to advanced AMD in individuals with early AMD; and (ix) to examine 

iv

whether baseline anti‐retinal autoantibodies can predict vision loss in individuals 

with neovascular AMD. 

 

METHODS :Clinicopathological studies were performed to correlate progressive 

accumulation of BLamD and membranous debris to fundus characteristics and 

visual acuity, as well as to sub‐macular Bruch’s membrane macrophage count. 

Immunohistochemical studies were perfomed to determine whether the presence 

of BLamD and membranous debris altered the programming of Bruch’s 

membrane or resident choroidal macrophages. The presence of serum anti‐retinal 

autoantibodies was determined by western blotting, and the association with 

disease progression examined in early and neovascular AMD. 

 

RE SU L T S :  The presence of both basal linear deposit (BLinD) and a continuous 

layer of BLamD represents threshold early AMD histopathologically, which was 

seen clinically as a normal fundus in the majority of cases. Membranous debris 

accumulation appeared to influence the pathway of progression from early AMD 

to advanced AMD. Bruch’s membrane macrophages were first noted when a 

continuous layer of BLamD and clinical evidence of early AMD were present, and 

increased with the amount of membranous debris in eyes with thin BLamD. Eyes 

with subclinical CNV had high macrophage counts and there was some evidence 

of altered resident choroidal macrophage programming in the presence of BLamD 

and membranous debris. Serum anti‐retinal autoantibodies were found in a higher 

proportion of early AMD participants compared with both controls and 

participants with neovascular AMD, and in a higher proportion of individuals 

with atrophic AMD compared to those with neovascular AMD. The presence of 

baseline anti‐retinal autoantibodies in participants with early AMD was not 

associated with progression to advanced AMD. Participants with neovascular 

AMD lost more vision over 24 months if they had IgG autoantibodies at baseline 

compared to autoantibody negative participants.  

v

 

CONC LU S I ON S :  The finding that eyes with threshold early AMD appear 

clinically normal underscores the need to utilise more sophisticated tests to enable 

earlier disease detection. Clinicopathological evidence suggests two distinct early 

AMD phenotypes, which follow two pathways of AMD progression. Macrophage 

recruitment and programming may be altered by the presence of BLamD and 

membranous debris, highlighting the need to further characterise the biology of 

human resident choroidal macropahges. Anti‐retinal autoantibodies can be found 

in both control and AMD sera, and future approaches that allow the examination 

of subtle changes in complex repertoires will determine whether they are involved 

in AMD disease pathogenesis. 

vi

P U B L I C A T I O N S  

 

Original Articles 

Cherepanoff S, Mitchell P, Wang JJ, and Gillies MC. Retinal autoantibody profile 

in early age‐related macular degeneration: Preliminary findings from the Blue 

Mountains Eye Study. Clin Exp Ophthalmol, 2006. 34(6): p. 590‐5. 

 Cherepanoff, S and Gillies, MC, Circulating antiretinal autoantibodies and age‐

related macular degeneration: What is the link? Exp Rev Ophthalmol, 2007. 2(1): p. 

27‐31. 

 Sarks S, Cherepanoff S, Killingsworth M, and Sarks J. Relationship of basal 

laminar deposit and membranous debris to the clinical presentation of early age‐

related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2007. 48(3): p. 968‐77. 

 Published Abstracts 

Cherepanoff S, Sarks J, Killingsworth M, and Sarks S. The Life Cycle of Soft 

Drusen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007 48: E‐Abstract 3026. 

 Cherepanoff S, Gillies M, Luo W, Chua W, Penfold PL.  Anti‐Retinal Auto‐

Antibodies in Neovascular Age Related Macular Degeneration ‐ A Useful 

Prognostic Marker? Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42(4): S801. Abstract 4294 

 Gillies MC, Luo W, Chua W, Cherepanoff S, Billson FA, Mitchell P, Simpson J. 

The Efficacy of a Single Injection of Triamcinolone for Neovascular Age Related 

Macular Degeneration. One Year Results of a Randomised Clinical Trial: IVTAS. 

Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001; 42(4): S522. Abstract 2808 

 Jordan B, Cvejic S, Trapaidze N, Cherepanoff S, Unterwald E, Devi LA. Agonist 

mediated internalization of the μ, κ and δ opioid receptor types. Society of 

Neuroscience Abstracts 1997; 2: 691.6. 

vii

 

T A B L E   O F   C O N T E N T S  

ACKNOWLEDGEMENTS............................................................................................................................ i 

DECLARATION............................................................................................................................................ii 

ABSTRACT................................................................................................................................................... iii 

PUBLICATIONS...........................................................................................................................................vi 

TABLE OF CONTENTS .............................................................................................................................vii 

LIST OF FIGURES ......................................................................................................................................xii 

LIST OF TABLES....................................................................................................................................... xiii 

LIST OF TABLES....................................................................................................................................... xiii 

ABBREVIATIONS .....................................................................................................................................xiv 

ABBREVIATIONS .....................................................................................................................................xiv 

1  INTRODUCTION..................................................................................................................................... 1 

2  BACKGROUND........................................................................................................................................ 2 

2.1  AGE‐RELATED MACULAR DEGENERATION: CLINICAL DEFINITIONS AND EPIDEMIOLOGY........... 3 

2.1.1  Clinical definition...................................................................................................................... 3 

2.1.2  Disease classification ................................................................................................................. 5 

2.1.3  Prevalence and incidence........................................................................................................... 6 

2.1.4  Natural history.......................................................................................................................... 8 

2.1.5  Risk factors .............................................................................................................................. 10 2.1.5.1  Smoking....................................................................................................................................... 10 2.1.5.2  Cardiovascular disease and cardiovascular risk factors ....................................................... 11 2.1.5.3  Inflammatory markers............................................................................................................... 12 2.1.5.4  Dietary factors............................................................................................................................. 13 2.1.5.5  Genetic factors ............................................................................................................................ 13 

2.1.6  Estimated costs and disease burden......................................................................................... 16 

2.1.7  Therapeutics ............................................................................................................................ 17 2.1.7.1  Preventative interventions ........................................................................................................ 17 2.1.7.2  Palliative interventions.............................................................................................................. 18 

 

 

viii

2.2  THE “ANATOMY” OF AMD......................................................................................................... 19 

2.2.1  The macula in health and ageing ............................................................................................. 19 2.2.1.1  Anatomy & embryology of the human eye ............................................................................ 19 2.2.1.2  The retinal pigment epithelium................................................................................................ 21 2.2.1.3  Age‐related changes in the RPE ............................................................................................... 22 2.2.1.4  The choroid and Bruch’s membrane........................................................................................ 23 2.2.1.5  Age‐related changes in the choroid ......................................................................................... 25 2.2.1.6  Age‐related changes in Bruch’s membrane ............................................................................ 25 2.2.1.7  Immunological specialisations of the retina and choroid ..................................................... 28 

2.2.2  The pathology of endstage AMD............................................................................................. 29 2.2.2.1  Geographic atrophy of the RPE: the natural endstage of AMD........................................... 29 2.2.2.2  Choroidal neovascularisation and disciform scarring........................................................... 30 

2.2.3  The basal deposits and early AMD.......................................................................................... 31 2.2.3.1  Basal laminar deposit is a marker of RPE degeneration ....................................................... 31 2.2.3.2  Basal linear deposit  and soft drusen are the specific lesions of early AMD...................... 32 2.2.3.3  Drusen classification .................................................................................................................. 35 2.2.3.4  Drusen biogensis ........................................................................................................................ 36 2.2.3.5  Histopathological classification schemes ................................................................................ 38 

2.3  AMD DISEASE PATHOGENESIS: SUMMARY OF CURRENT CONCEPTS .......................................... 41 

2.3.1  Oxidative stress ....................................................................................................................... 41 

2.3.2  Ischaemia ................................................................................................................................. 43 

2.3.3  Inflammation ........................................................................................................................... 43 

2.4  MACROPHAGES AND IMMUNE COMPETENT CELLS IN AMD...................................................... 44 

2.4.1  Morphological evidence ........................................................................................................... 44 2.4.1.1  Macrophages, Bruch’s membrane breaks and early AMD................................................... 44 2.4.1.2  Macrophages in advanced AMD lesions................................................................................. 44 

2.4.2  Macrophages and choroidal neovascularisation ...................................................................... 45 

2.4.3  Choroidal macrophage recruitment and turnover and AMD.................................................. 47 2.4.3.1  Ccl‐2, Ccr‐2 and Cx3Cr1 knockout mice and AMD‐like lesions .......................................... 47 2.4.3.2  IL‐10 knockout mice and laser‐induced CNV ........................................................................ 49 2.4.3.3  Polymorphisms in leukocyte recruitment and turnover genes............................................ 49 2.4.3.4  Serum myeoloid cells and AMD .............................................................................................. 50 2.4.3.5  Macrophages in an immune‐privileged compartment.......................................................... 50 

2.4.4  Dendritic cells and drusen biogenesis ..................................................................................... 52 

2.5  INFLAMMATION AND AMD........................................................................................................ 54 

2.5.1  Tissue evidence of inflammatory proteins ............................................................................... 54 2.5.1.1  Evidence of inflammation‐associated proteins in drusen..................................................... 54 

ix

2.5.1.1.1  Immunoglobulins and complement in drusen and Bruch’s membrane ........................ 55 2.5.1.1.2  Amyloid, fibrinogen and other inflammatory proteins found in drusen...................... 57 

2.5.2  Genetic associations................................................................................................................. 59 2.5.2.1  Single nucleotide polymorphisms in complement cascade and complement regulatory 

genes  59 2.5.3  Serum inflammatory markers in AMD................................................................................... 61 

2.6  SERUM ANTI‐RETINAL AUTOANTIBODIES IN AMD..................................................................... 63 

2.6.1  Autoantibodies and autoimmunity.......................................................................................... 63 

2.6.2  Autoantibodies and ocular disease........................................................................................... 64 2.6.2.1  Anti‐recoverin autoantibodies, CAR and autoimmune retinopathy................................... 64 2.6.2.2  Retinal degenerations, autoimmune retinopathy and glaucoma......................................... 66 

2.6.3  Autoantibodies in AMD.......................................................................................................... 66 

2.7  THESIS AIMS ................................................................................................................................. 74 

3  HISTOPATHOLOGICAL STUDIES ................................................................................................... 76 

3.1  RELATIONSHIP OF BASAL LAMINAR DEPOSIT AND MEMBRANOUS DEBRIS TO THE CLINICAL 

PRESENTATION OF EARLY AGE‐RELATED MACULAR DEGENERATION....................................................... 77 

3.1.1  Introduction............................................................................................................................. 77 

3.1.2  Methods ................................................................................................................................... 78 3.1.2.1  Patients and Eyes........................................................................................................................ 78 3.1.2.2  Histopathological Methods and Definitions........................................................................... 78 3.1.2.3  Clinical Parameters .................................................................................................................... 81 3.1.2.4  Statistical Methods ..................................................................................................................... 81 

3.1.3  Results ..................................................................................................................................... 82 3.1.3.1  Basal laminar deposit and RPE changes.................................................................................. 82 3.1.3.2  BLamD – clinical correlations ................................................................................................... 91 3.1.3.3  Membranous debris‐ localization and correlation with BLamD.......................................... 91 3.1.3.4  Membranous debris – clinical correlations ............................................................................. 92 

3.1.4  Discussion ............................................................................................................................... 98 

3.2  CHOROIDAL AND BRUCH’S MEMBRANE MACROPHAGES IN EARLY AND ADVANCED AMD... 105 

3.2.1  Introduction........................................................................................................................... 105 

3.2.2  Methods ................................................................................................................................. 108 3.2.2.1  Eyes ............................................................................................................................................ 108 3.2.2.2  Clinical definitions ................................................................................................................... 108 3.2.2.3  Histopathological definitions and grading: BLamD............................................................ 109 3.2.2.4  Histopathological definitions and grading: membranous debris ...................................... 109 3.2.2.5  BrM macrophage counts ......................................................................................................... 109 3.2.2.6  Immunohistochemistry ........................................................................................................... 110 

x

3.2.2.7  Statistics ..................................................................................................................................... 111 3.2.3  Results ................................................................................................................................... 112 

3.2.3.1  Groups I & II‐ normal and normal aged eyes....................................................................... 112 3.2.3.2  Groups III & IV– early AMD .................................................................................................. 112 3.2.3.3  Groups III & IV: BrM macrophages and subclinical CNV.................................................. 120 3.2.3.4  Group V – Geographic atrophy.............................................................................................. 125 3.2.3.5  Group VI – Disciform scarring ............................................................................................... 125 

3.2.4  Discussion ............................................................................................................................. 128 

4  SERUM AUTOANTIBODY STUDIES.............................................................................................. 131 

4.1  COMPARISON OF THE ANTI‐RETINAL AUTOANTIBODY PROFILE IN EARLY, NEOVASCULAR & 

ATROPHIC AMD ...................................................................................................................................... 132 

4.1.1  Introduction........................................................................................................................... 132 

4.1.2  Methods ................................................................................................................................. 133 4.1.2.1  Study serum.............................................................................................................................. 133 

4.1.2.1.1  Blue Mountains Eye Study................................................................................................. 133 4.1.2.1.2  Intravitreal Triamcinolone Study...................................................................................... 134 4.1.2.1.3  Serum used in autoantibody assays ................................................................................. 135 

4.1.2.2  Autoantibody assay ................................................................................................................. 135 4.1.2.2.1  Preparation of human retinal proteins for electrophoresis ........................................... 135 4.1.2.2.2  Electrophoresis and western blotting............................................................................... 136 4.1.2.2.3  Detection of serum anti‐retinal autoantibodies............................................................... 136 4.1.2.2.4  Antibodies used to detect serum autoantibodies............................................................ 137 

4.1.2.3  Statistics ..................................................................................................................................... 138 4.1.3  Results ................................................................................................................................... 139 

4.1.4  Discussion ............................................................................................................................. 149 

4.2  ANTI‐RETINAL AUTOANTIBODIES AND DISEASE PROGRESSION IN EARLY AMD ..................... 152 

4.2.1  Introduction........................................................................................................................... 152 

4.2.2  Methods ................................................................................................................................. 152 4.2.2.1  Participants ............................................................................................................................... 152 4.2.2.2  Autoantibody assay ................................................................................................................. 152 4.2.2.3  Statistics ..................................................................................................................................... 153 

4.2.3  Results ................................................................................................................................... 154 

4.2.4  Discussion ............................................................................................................................. 156 

 

 

 

xi

4.3  ANTI‐RETINAL AUTOANTIBODIES AND VISION LOSS IN NEOVASCULAR AMD........................ 157 

4.3.1  Introduction........................................................................................................................... 157 

4.3.2  Methods ................................................................................................................................. 158 4.3.2.1  Participants ............................................................................................................................... 158 4.3.2.2  Autoantibody assay ................................................................................................................. 158 4.3.2.3  Statistics ..................................................................................................................................... 158 

4.3.3  Results ................................................................................................................................... 160 

4.3.4  Discussion ............................................................................................................................. 164 

5  SUMMARY & CONCLUSIONS......................................................................................................... 165 

REFERENCES............................................................................................................................................. 168 

APPENDICES............................................................................................................................................A‐H 

 

xii

L I S T   O F   F I G U R E S  

 

Figure 2.2‐1  Schematic diagram of BLamD and membranous debris ...................33 

Figure 2.5‐1  The complement cascade........................................................................56 

Figure 3.1‐1  Basal Laminar Deposit ............................................................................84 

Figure 3.1‐2  Continuous Late Basal Laminar Deposit..............................................86 

Figure 3.1‐3  High magnification membranous debris .............................................88 

Figure 3.1‐4   Basal mounds ..........................................................................................89 

Figure 3.1‐5  Membranous debris: basal mounds and soft drusen .........................94 

Figure 3.1‐6   Influence of basal deposits on the progression of AMD.................102 

Figure 3.2‐1  Morphological and immunohistochemical features of normal (group 

I) and normal aged (group II) eyes ................................................................116 

Figure 3.2‐2  Morphological and immunohistochemical features of eyes with early 

AMD (groups III and IV) .................................................................................118 

Figure 3.2‐3  Morphological features of eyes with subclinical CNV.....................121 

Figure 3.2‐4   CD68 and iNOS Immunohistochemistry in eyes with geographic 

atrophy (group V) or disciform scarring (group VI) ...................................126 

Figure 4.1‐1  Western blot‐detected anti‐retinal autoantibodies in normal controls 

and participants with geographic atrophy ...................................................141 

Figure 4.1‐2 Western blot‐detected anti‐retinal autoantibodies in participants with 

early AMD .........................................................................................................143 

Figure 4.1‐3 Western blot‐detected anti‐retinal autoantibodies in participants with 

neovascular AMD.............................................................................................145 

Figure 4.3‐1  Vision loss over 24 months in anti‐retinal autoantibody positive 

participants vs. anti‐retinal autoantibody negative participants (anti‐

IgGAM detected autoantibodies) ...................................................................162 

Figure 4.3‐2  Vision loss over 24 months in anti‐retinal autoantibody positive 

participants vs. anti‐retinal autoantibody negative participants (anti‐IgG 

detected autoantibodies) .................................................................................163 

xiii

L I S T   O F   T A B L E S  

 

 

Table 2.2‐1  Histopathological grading scheme suggested by Sarks (1976)...........40 

Table 2.2‐2  Histopathological grading scheme suggested by Curcio et al (1998) 40 

Table 2.6‐1 Autoantibodies in AMD: summary of studies .......................................70 

Table 3.1‐1 Clinical and histopathological characteristics of study eyes................83 

Table 3.1‐2   Basal laminar deposit – clinical and histopathological correlations .96 

Table 3.1‐3  Membranous debris – clinical and histopathological correlations.....97 

Table 3.1‐4   Basal laminar deposit ‐ a summary......................................................103 

Table 3.1‐5  Membranous debris – a summary ........................................................104 

Table 3.2‐1  Clinical and histopathological features of study eyes........................114 

Table 3.2‐2  BLamD, membranous debris and macrophages in early AMD .......115 

Table 3.2‐3  BrM macrophages, membranous debris and subclinical CNV.........123 

Table 3.2‐4  BrM macrophages and subclinical CNV in the fellow eye................124 

Table 4.1‐1  Serum anti‐retinal autoantibodies in controls and in early, neovascular 

and atrophic AMD: summary of findings ....................................................140 

Table 4.1‐2  Comparison of Anti‐IgGAM and anti‐IgG detected autoantibodies in 

control, early AMD, neovascular AMD and atrophic AMD participants 148 

Table 4.2‐1   Baseline serum anti‐retinal autoantibodies and progression to 

advanced AMD at 5 and 10 years...................................................................155 

Table 4.3‐1   Participant characteristics and baseline anti‐retinal autoantibody 

status...................................................................................................................161 

xiv

A B B R E V I A T I O N S  

 AMD    age‐related macular degeneration 

APC    antigen presenting cell 

ApoE    apolipoprotein E 

BF    factor B 

BLamD   basal laminar deposit 

BLinD    basal linear deposit 

CAR    cancer‐associated retinopathy 

CC    choriocapillaris 

CFH    complement factor H 

CNV    choroidal neovascularisation 

CRP    C‐reactive protein 

FasL    fas ligand 

GA    geographic atrophy 

GFAP    glial acidic fibrillary protein 

HLA    human leukocyte antigen 

IL‐1    interleukin‐1 

IL‐10    interleukin‐10 

iNOS    inducible nitric oxide synthase 

MAC    membrane attack complex 

MCP‐1    macrophage chemoattractant protein‐1 

MHC    major histocompatibility complex 

MMP    membrane metalloproteinases 

PDT    photodynamic therapy 

PEDF    pigment epithelium‐derived factor 

ROI    reactive oxygen intermediate 

RPE    retinal pigment epithelium 

TGFβ transforming growth factor beta 

TIMP    tissue inhibitors of metalloproteinases 

TLR‐4    toll like receptor‐4 

VEGF    vascular endothelial growth factor 

1

 

 

I N T R O D U C T I O N  

 

 

The macula is a part of the retina found at the posterior pole of the eye. It has the 

highest concentration of cone photoreceptors, and is responsible for high acuity 

colour vision. In age‐related macular degeneration (AMD), loss of the retinal 

pigment epithelium and the photoreceptors they support lead to loss of central 

vision, with devastating consequences for the affected individual. AMD is the 

leading cause of irreversible vision loss in industrialised populations, with the 

numbers of cases expected to grow due to population ageing.  

 

 

  

 

1

2

 

 

B A C K G R O U N D  

 

2

3

2 . 1 A G E - R E L A T E D M A C U L A R D E G E N E R A T I O N : C L I N I C A L

D E F I N I T I O N S A N D E P I D E M I O L O G Y

2.1.1 Clinical  definition  

Drusen, atrophy of the retinal pigment epithelium (RPE) and disciform lesions 

were recognised clinical entities by the late 19th century. Donders described the 

clinical appearance of drusen in 1855 (reviewed in 1), while “symmetrical central 

chorio‐retinal disease occurring in senile persons” was described by Hutchinson 

and Tay in 1874 (reviewed in 2). In 1885, Haab described pigmentary and atrophic 

changes in the macular of patients over the age of 50, which was associated with 

central vision loss (reviewed in 3). However, Gass was first to suggest that drusen, 

senile macular degeneration and senile disciform degeneration were 

manifestations of a single disease entity 4. This entity has been variously named 

“senile macular degeneration”, “disciform degeneration” and “maculopathy”, but 

is currently known as “age‐related macular degeneration” (AMD). 

 

Clinically, AMD can be classified as early or advanced. The advanced disease is 

further categorised as neovascular (“wet” or “exudative”) or atrophic 

(“geographic atrophy”). The term “dry” AMD has been used by some 

investigators to describe both early AMD and geographic atrophy, i.e. the non‐

exudative forms of AMD.  

 

Geographic atrophy (GA) of the RPE is considered the natural endstage of the 

disease when choriodal neovascularisation (CNV) does not intervene 5. GA 

appears as discreet areas of pallor, due to loss of RPE and reduced retinal 

thickness. It commonly begins in the parafoveal region, and the foveal centre is 

often spared until late in the disease process 6‐8. Visual acuity may thus be 

preserved, although scotomas surrounding the point of fixation can be significant 

9. GA may follow pigmentary change and attenuation or may occur subsequent to 

drusen regression. GA may also follow involution of CNV, and CNV can develop 

4

in an eye with GA 10. Sunness et al. found that the 4‐year cumulative incidence of 

CNV was 11% for eyes with GA, and 34% for eyes with GA if the fellow eye had 

CNV 11. 

 

Neovascular AMD results from the growth of new vessels from the choroid into 

the sub‐RPE or sub‐retinal space. These vessels are abnormally permeable, leading 

to the leakage of fluid or blood into the sub‐RPE (“occult” CNV) or sub‐retinal 

(“classic” CNV) space (reviewed in 12. Clinically, neovascular AMD can present as 

sub‐retinal fluid or haemorrhage, lipid exudates, pigment epithelial detachment 

or, in the later stages, as a fibrovascular “disciform” scar. Neovascular AMD is 

responsible for an estimated 75‐90% of the severe vision loss attributable to AMD 

13. 

 

Early AMD is defined as the presence of soft (or large) macular drusen with or 

without pigmentary changes. Soft drusen appear as ill‐defined yellow deposits 

while pigmentary abnormalities can include hypo‐ or hyperpigmentation. There is 

less agreement on whether pigmentary changes without drusen should be 

considered early AMD (see Section 2.1.4). Patients with early AMD often have 

good vision. There may be subtle deficits, such as reduced dark adaptation, which 

are revealed by psychophysical or electrophysiological testing.  

 

There is, thus, a wide range of clinical presentations of AMD, even within families 

14. Various definitions (of early AMD in particular) can lead to different prevalence 

estimates in population‐based studies. This “phenotypic heterogeneity” has lead 

to the development of a number of systems of disease classification. 

 

5

2.1.2 Disease  classification  

The Wisconsin Age‐Related Maculopathy Grading Scheme was developed to 

quantify retinal changes in the Beaver Dam Study, one of the largest and earliest 

population‐based studies of age‐related eye disease 15. This system uses grids with 

a radius of 3000μm, centred on the fovea, to define subfields in the macula of 

fundus photographs. Templates are then used to estimate drusen size and the area 

involved by drusen or RPE abnormalities. Drusen are graded on each of three 

criteria: size, type and area of macula involved. RPE changes are graded according 

to type of abnormality and area of macula involved. Early AMD was defined as: (i) 

the presence of hard or soft drusen with pigmentary changes; or (ii) the presence 

of soft, indistinct drusen only, in the absence of GA or exudative lesions. Despite 

achieving high agreement between trained graders, the Wisconsin system was not 

universally adopted. 

 

In the hope of creating common disease definitions that would allow comparisons 

between studies, the International Age‐Related Maculopathy Study Group 

brought together a number of leading investigators to develop the International 

Classification System 16. This system incorporated the Wisconsin Grading Scheme 

with other commonly used grading schemes. Early disease was termed “age‐

related maculopathy” (ARM), while advanced disease was termed “age‐related 

macular degeneration” (AMD). ARM was defined as: (i) the presence of drusen, 

“discrete whitish‐yellow spots” external to the neuroretina or RPE; or (ii) areas of 

hyperpigmentation associated with drusen; or (iii) areas of hypopigmentation 

associated with drusen. “Dry” AMD, or geographic atrophy, was defined as 

sharply demarcated areas of hypopigmentation, at least 175μm in diameter, in 

which the choroidal vessels are more visible than surrounding areas. “Wet” AMD, 

or “neovascular”, “disciform” or “exudative” AMD, was defined as: (i) RPE 

detachments, which may be associated with neurosensory retinal detachment; or 

(ii) subretinal or sub‐RPE neovascular membranes; or (iii) epiretinal, intraretinal, 

6

subretinal or sub‐RPE scar/glial tissue/fibrin‐like deposits; or (iv) subretinal 

haemorrhages not related to other retinal vascular disease; or (v) hard (lipid) 

exudates related to other ARM findings, and unrelated to other vascular diseases. 

 

Of the longer‐running, large population‐based studies so far conducted, the 

Wisconsin Grading Scheme is used by the Beaver Dam Study (US) 17, the Blue 

Mountains Eye Study (Australia) 18 and the Melbourne Visual Impairment Project 

(Australia) 19. The Vitamin E, Cataract and Age‐related Maculopathy (VACT) 

Study (Australia) 20 and the Rotterdam Study (Netherlands) 21 utilise the 

International Classification System. The Age‐Related Eye Diseases Study (US) uses 

its own classification system 22, in which fundus features are classified into four 

categories based on drusen type and number and, unlike the other studies, 

incorporates a visual acuity score.  

 

A unified classification system has yet to be formulated. This is partly because 

new insights continue to be generated by ongoing epidemiological and 

clinicopathological studies. The findings from recent genetic studies are also likely 

to influence classification of disease subgroups. 

 

2.1.3 Prevalence  and  incidence  

AMD is the commonest cause of blindness in industrialised populations 23. In 2005, 

Taylor and colleagues 24 reviewed the findings of the Melbourne Visual 

Impairment Project (VIP) and the Blue Mountains Eye Study (BMES), involving a 

total of 8909 participants, and estimated that 24 200 Australians are blind due to 

AMD, making it by far the commonest cause of blindness in people aged 40 and 

over. AMD was also found to be the most common cause of untreatable low 

vision, affecting an estimated 48 300 individuals. When findings from the Beaver 

Dam Study, the BMES and the Rotterdam study were pooled, AMD (early and 

7

advanced) was present in 0.2% of 55‐64 year olds, rising to 13% of those aged 85 or 

older 25. Geographic atrophy increased from 0.04% to 4.2% for these age groups, 

while neovascular AMD increased from 0.17% to 5.8%. In general, population‐

based studies have shown that AMD is rare before age 55 and becomes more 

common after age 75 26. The Age‐Related Eye Diseases Study estimated that AMD 

affected over 8 million people in the US, with the advanced form affecting 1.75 

million 27. This number is projected to increase 50% by 2020. 

 

Racial differences in both AMD prevalence and incidence exist. The frequency of 

neovascular AMD was higher in the Rotterdam population than the Beaver Dam 

or the BMES populations 25. However, in all three studies, the incidence and 

prevalence of neovascular CNV was higher in whites when compared to blacks 26. 

Although the frequency of early AMD in blacks appears to be similar to whites, 

the risk of progression to neovascular AMD is higher in whites.  

 

The early form is more commonly found than the late form, with both types 

increasing in frequency with age (17. The 5‐year overall incidence of advanced 

AMD (geographic atrophy and neovascular AMD) was 0.4% in the Beaver Dam 

Study, 0.7% in the BMES, and 1.1% in the Rotterdam study 28. In the longest 

running population‐based study (Beaver Dam), the 15‐year cumulative incidence 

for early AMD was 14.3% for early AMD and 3.1% for advanced AMD 29. 

 

AMD frequently affects both eyes. In the BMES cohort, 80% of participants with 

AMD (early and advanced) had bilateral disease 30.  Once neovascular AMD is 

present in one eye, involvement of the second eye occurs in 82% of cases within 

four years in an Icelandic population 31. 

 

8

2.1.4 Natural  history  

Gass noted that drusen size, area and detectability altered over time, and that 

increased drusen area increased the risk of progression to advanced AMD 6. These 

observations were verified by later, large population‐based studies. Using the 

Wisconsin Grading System to grade retinal features, the Beaver Dam Study found 

that 14% of eyes with large (>125μm) drusen developed advanced AMD over 10 

years 32. The Blue Mountains Eye Study, also using the Wisconsin Grading System, 

found that eyes with large drusen were six times as likely as eyes without large 

drusen to develop advanced AMD 33. The BMES also found that eyes with large, 

soft drusen were more likely to progress to neovascular AMD than atrophic AMD 

33.  The Rotterdam Study, using the International Classification System 16, found 

that ten or more large drusen at baseline best predicted development of advanced 

AMD six and a half years later 34. Using these findings and their own, the Age‐

Related Eye Diseases Study (AREDS) investigators developed a severity scale for 

assessing AMD risk 35, which could produce a simplified score based on the 

presence of large drusen or pigmentary changes in each eye 36.  

 

The presence of large drusen is thus an established risk factor for progression to 

advanced AMD. However, it is not known whether there is an orderly progression 

from small, to intermediate and later, large drusen in the natural history of AMD. 

Klein et al. found that approximately 25% of large drusen found at baseline faded, 

or regressed over the same period, without progression to more advanced lesions 

in the Beaver Dam Study 32. The smaller, Chesapeake Bay Waterman study found 

that large drusen disappeared in 34% of eyes over a 5‐year period 37.  

 

While AREDS recognised intermediate drusen as a feature of early AMD 22, 

intermediate drusen were not significantly associated with progression from early 

to advanced AMD in the Cardiovascular Health and Age‐related Maculopathy 

(CHARM) Study 38. It should also be noted that while drusen size appears to be 

9

the most consistently found predictor of progression, drusen appearance may also 

influence risk of progression. Tikellis et al. 38 found that eyes with soft indistinct 

drusen were more likely to progress to advanced AMD compared to eyes with 

soft, distinct drusen in the CHARM study. 

 

Small drusen (<65μm) are present in 90% of the population, are not considered 

AMD and do not increase the risk of developing AMD 32. However, the 

Chesapeake Bay study found that large numbers of small, hard drusen increased 

the risk of developing larger drusen over a 5‐year period 37. Over a 15‐year period, 

the Beaver Dam Study found that eyes with more than 8 small, hard drusen were 

more likely to develop large, indistinct drusen and/or pigmentary abnormalities 

compared to eyes with fewer than 8 small hard drusen (16.3% vs. 4.7%) 29. Thus it 

appears that large drusen do not irreversibly progress to advanced AMD, and that 

while a few small, hard drusen are not considered AMD, the presence of 

numerous small hard drusen increases the risk of developing larger drusen or 

pigmentary changes. The effect fading or regressing drusen has on the long‐term 

risk of AMD progression is unknown. It is also unclear whether numerous small 

hard drusen coalesce to form larger drusen, or whether the larger drusen arise 

separately in these eyes. 

 

The presence of pigmentary abnormalitites (hyperpigmentation or 

hypopigmentation) alone, without drusen, is not included as a definition of early 

AMD by all investigators, notably the International Classification System 16. 

However, in the three largest and longest running population‐based surveys eyes 

with pigmentary changes alone were included in the early AMD or age‐related 

maculopathy diagnostic group. Both the BMES 33 and AREDS 35 found that the risk 

of progression to advanced AMD is lower in eyes with hyperpigmentation alone 

group compared to eyes with large drusen. The BMES also found that eyes with 

hyperpigmentation alone did not show a strong predisposition for progession to 

10

one or the other form of advanced AMD 33. However, in Beaver Dam Study, the 5‐ 

and 10‐ year incidence of advanced AMD is almost the same for large indistinct 

drusen and pigment changes 32, 39. The Rotterdam Study 34 also found that the most 

important predictors of progression to late AMD were either the presence of 

drusen involving more than 10% of macula area or the presence of retinal pigment 

changes 34. However, the BMES, Beaver Dam Study, Rotterdam Study and AREDS 

have all found that the risk of progression to advanced AMD is highest when 

abnormalities of the pigment epithelium are present in addition to large, soft 

drusen 29, 33‐35.  

 

Eyes with neovascular AMD are at highest risk of rapid vision loss, with 80‐90% of 

eyes losing at least 2 lines of vision within 2 years (reviewed in 12). Once 

neovascular AMD is present in one eye, the Macular Photocoagulation Study 

Group found that 42% of individuals with neovascular AMD will have second eye 

involvement within 5 years 40. Even after disciform scar formation, patients can 

continue to lose vision due to the development of expanding areas of GA around 

the scars 41. 

 

In eyes with GA, vision loss can also continue due to enlargement of the area of 

involvement. Sunness et al found that the median expansion rate for GA was 

2.1mm2 per annum 42. 

 

2.1.5 Risk  factors  

2 . 1 . 5 . 1 Smo k i n g  

Smoking is the most consistently found modifiable risk factor and is associated 

with the prevalence of both early and advanced AMD (and to a lesser extent, 

incidence) 43‐49. Pooled data from the Beaver Dam Study, the BMES and the 

Rotterdam Study suggest that smokers were approximately 3‐4 times more likely 

11

to have any form of AMD compared to non‐smokers 25. Current smokers were also 

2‐3 times more likely to develop AMD over a 5‐6 year period compared to non‐

smokers 50. The association between smoking and early AMD appears to be less 

strong. The Beaver Dam Study found that smoking was associated with the 

development of soft drusen, but not pigment abnormalities, over a 5‐year period 

51. 

 

It has been postulated that smoking creates additional metabolic or biological 

stressors that contribute to the development of AMD. These include reductions in 

macular carotenoids, choroidal blood flow, serum antioxidant levels, and RPE 

anti‐oxidant defence systems 26. It appears however, that smoking cessation does 

not reverse the damage. In the Beaver Dam Study, participants who quit between 

baseline and the 5‐year follow up were no less likely to develop AMD than those 

who continued smoking 32. 

 

2 . 1 . 5 . 2 Ca r d i o v a s c u l a r   d i s e a s e   a n d   c a r d i o v a s c u l a r   r i s k  f a c t o r s  

The Rotterdam Study reported a 4.5‐fold increase in the risk of advanced AMD in 

participants with carotid bifurcation plaques (determined by ultrasound) 52. A 2.0‐

2.5 fold increased risk was also found for plaques in common carotid and lower 

extremities.  However, when other studies have examined the association with 

stroke or myocardial infarction and AMD, the results have been less conclusive 53.  

 

The Beaver Dam Study found that higher pulse pressure and systolic blood 

pressure were associated with pigmentary abnormalities and neovascular AMD 

over a 10‐year period, although no association was found at the 5‐year follow up 

54. The Framingham, National Health and Nutrition Examination Survey and 

Rotterdam studies also found positive associations between hypertension and 

AMD (reviewed in 53). However, other studies have found no association between 

12

blood pressure and AMD (reviewed in 26). Significantly, there is no current 

evidence suggesting that antihypertensive medications reduce the risk of AMD. 

 

The relationship between serum lipids and AMD risk is appears to be complex. 

While some studies have been unable to find an association (reviewed in 26), the 

Beaver Dam & Rotterdam studies both found that increased serum HDL‐

cholesterol or low LDL‐cholesterol was associated with prevalent and incident 

AMD. Additionally, the Beaver Dam Study also found an increased risk of early 

AMD with low total serum cholesterol and lower cholesterol/HDL‐cholesterol 

ratios 54. Surprisingly, these observations are  the inverse of the relationship 

between lipids and cardiovascular risk. The use of lipid‐lowering agents does not 

appear to have a significant effect on AMD risk 26. 

 

Genetic studies have found associations between allelic variations in the 

apolipoprotein E (ApoE) gene and AMD. Apolipoproteins are involved in the 

transport and metabolism of lipids, and ApoE is particularly important in the 

central nervous system. Individuals with the epsilon 2 variant appear to have an 

increased risk of developing AMD while those with the epsilon 4 variant are 

protected 55‐60. While these observations have not been consistently found by all 

studies 61, 62, they are again the opposite of the relationship between ApoE genetic 

variants and cardiovascular disease. 

 

2 . 1 . 5 . 3 I n f l amma t o r y  ma r k e r s  

The relationship between systemic markers of inflammation, such as C‐reactive 

protein (CRP), fibrinogen, cytokines and white cell count have been examined by a 

number of studies 63‐70. The results have been somewhat mixed, and are discussed 

in more detail in Section 2.5.3. 

 

13

2 . 1 . 5 . 4 D i e t a r y   f a c t o r s  

There does not appear to be a strong association between dietary fat and the risk 

of AMD (reviewed in 53), although the BMES found that high omega‐3 fatty acid 

intake may protect against early and advanced AMD 71. The BMES also found that 

the use of lipid lowering drugs (statins) was associated with a decreased 10‐year 

risk of soft drusen 72.  

 

Oral supplementation with antioxidants (vitamins A, C and E) and zinc reduced 

the risk of AMD progression and vision loss in the AREDS cohort 73. Diets high in 

antioxidant‐rich fruits and vegetables also appear to be associated with a lower 

risk of exudative AMD (reviewed in 53). The Nurse’s Health Study found that a 

higher intake of high glycaemic index carbohydrates was associated with 

increased risk of pigmentary changes over a 10‐year period 74.  

 

2 . 1 . 5 . 5 Gen e t i c   f a c t o r s  

AMD is not a single gene disease. Its late onset (not typically seen until the 

seventh decade) and phenotypic heterogeneity suggest that complex interactions 

between multiple genes and environmental exposures are likely to be involved. 

Twin studies have shown that the concordance rate for monozygotes is about 

twice that for heterozygotes, supporting a genetic component for the large drusen 

or multiple small drusen phenotypes in particular 75, 76. Familial aggregation 

studies suggest that a first degree relative of an individual with AMD is up to five 

times more likely to develop AMD than a family member of a control 77, 78, 

although there appears to be a large degree of variability in the genetic risk among 

families 79. Multiple sequence variations in many genes, either singly or more 

likely, in combination, are likely to exert subtle effects on the development of the 

disease.   

 

14

Recently, candidate gene screening and genetic association (or linkage) studies 

have found several single‐nucleotide polymorphisms that are moderately or 

strongly associated with various AMD phenotypes. It is important to note that 

polymorphisms are present in the normal population, and only confer 

susceptibility. This is in contrast to gene mutations which, when inherited, always 

lead to disease. 

 

Technological advances have allowed the entire genomes of individuals to be 

rapidly scanned. Linkage studies compare the genomes of normal individuals 

with diseased individuals to identify regions which are sufficiently different and 

thus potentially implicated in disease pathogenesis. In AMD, the majority of 

studies support a linkage to the 1q31 region (reviewed in 80). A number of genes 

potentially important to AMD reside in this region. These include the genes for 

hemicentin, laminin C1 and C2, regulator of G‐protein signalling 16, oculomedin, 

glutaredoxin 2, proline arginine‐rich end leucine‐rich repeat protein and 

complement factor H (CFH). The next region of interest linkage studies identified 

was 10q26 (reviewed in 80). Within this region resides HTRA1, the gene for a serine 

protease involved in the degradation of extracellular matrix proteoglycans, and 

loc387715, whose function and gene product are unknown.  

 

Candidate gene screening studies select genes based on: (i) their functional 

importance in the pathobiology of a disease; (ii) their presence in susceptibility loci 

found in linkage studies; or (iii) their association with hereditary diseases that 

share similarities with the disease of interest.  The sequences of the selected genes 

in normal individuals are compared with those with AMD to identify differences. 

 

Screening of genes involved in rare, hereditary degenerative maculopathies have 

yielded mixed results. The ABCA4 gene encodes a transporter protein involved in 

the visual cycle. While ABCA4 mutations give rise to Stargardt disease, the gene 

15

does not appear to play a role in the majority of AMD cases (reviewed in 81). 

Deletions in the ELOVL4 gene, which is involved in fatty acid biosynthesis, result 

in Stargardt‐like macular dystrophy. A single nucleotide polymorphism in the 

ELOVL4 gene was associated with AMD in one population 80 but not another 82. A 

missense mutation in the fibulin‐5 gene is responsible for all cases of Malattia 

Leventinese, another rare hereditary maculopathy. The same mutation however, 

was present in only 1.7% of patients with AMD 83, and no associations with 

fibulin‐5 polymorphisms have been found.  

 

Candidate screening of genes based on their role in other diseases has identified 

associations between AMD and the ApoE gene, as previously discussed (Section 

2.1.5.2). This approach has also identified: (i) two at‐risk polymorphisms in the 

fraktalkine (CX3CR1) gene 84; (ii) one at‐risk polymorphism in the toll‐like receptor 

4 (TLR‐4) gene 85; (iii) and one at‐risk polymorphism and two protective 

polymorphisms in genes encoding human leukocyte antigens (HLA) 86. These 

genes encode proteins involved in inflammatory cell recruitment (CX3CR1) and 

phagocytosis (TLR‐4 and HLA). The possible functional implications of these 

allelic variants for AMD pathogenesis are discussed in Section 2.4.3.3. 

 

Screening of genes in the AMD susceptibility loci have found the strongest disease 

associations to date. Of these, a single nucleotide polymorphism at position 402 in 

the CFH gene has been robustly associated with both early and advanced AMD in 

a number of studies 82, 87‐94. CFH is a regulatory protein of the complement 

pathway, which prevents uncontrolled activation of complement cascades. These 

observations have lead to candidate gene screening of other members of the 

complement cascade. Both at‐risk and protective single nucleotide polymorphisms 

have been identified for complement factor B (BF), and complement component 2 

(C2) 95. The pathobiological implications of complement pathway gene variants are 

discussed in Section 2.5. 

16

 

Candidate studies of genes in the 10q26 region have found strong associations 

between a single nucleotide polymorphism in the promoter region of HTRA1 and 

AMD risk 96‐98. The potential functional implications of HTRA1 polymorphisms at 

the tissue level are discussed in Sections 2.2.3.1. Candidate gene studies of 

loc387715, the other gene located at 10q26, have also identified a single nucleotide 

polymorphism that is strongly associated with both early and advanced AMD 82, 99‐

103. Although loc387715 mRNA is weakly expressed in retina, the gene product is 

yet to be identified. Because the loc387715 and HTRA1 genes are only 6bp apart, it 

is possible that the associations are due to one gene and not the other. 

 

While associations between a gene single nucleotide polymorphism and a disease 

do not necessarily infer causality, genetic studies have provided valuable insights, 

which will continue to inform research into pathogenesis. There is already some 

evidence that both the CFH and loc387715 polymorphisms are associated with 

AMD progression 94, 103, and it has been estimated that individuals homozygous for 

the at risk variants of CFH, loc 287715 and BF have a 250‐fold higher risk of 

developing AMD 104. It is thus likely that genetic testing in some form will be used 

in the near future, both to identify individuals most at risk of developing AMD 

and those most at risk of progression.  

 

In summary, the strongest risk factors thus identified for AMD are age, smoking 

and polymorphisms in the complement factor H gene.  

 

2.1.6 Estimated  costs  and  disease  burden  

AMD has a significant impact on quality of life. Patients with mild AMD are 

estimated to lose an average 17% in quality of life, similar to the reduction 

experienced by patients with moderate cardiac angina or those with symptomatic 

17

HIV. Those with moderate AMD have a 40% reduction in quality of life, akin to 

patients with severe angina or on renal dialysis. Severe AMD causes a 63% 

reduction in quality of life, similar to patients with end‐stage prostate cancer or 

those who have suffered a catastrophic stroke (reviewed in 105).   

 

The prevalence of AMD is expected to rise. In the US, for example, the population 

over 85 years is set to increase 107% by 2020 53. In Australia, AMD is estimated to 

cost $2.6 billion annually, projected to grow to $6.5 billion by 2025 (reviewed in 

106). The direct financial costs of blindness due to AMD was estimated at up to $22 

507 per individual per year in 2000 107. Estimates of the economic burden of AMD 

using a value‐based medicine approach suggest it may have a $30 billion negative 

impact annually in the US 108 and $2.6 billion in Canada 109. The Australian study 

predicted a saving of $5.7 billion over 20 years if AMD progression could be 

reduced by as little as 10%. The search for therapeutic interventions is thus an 

urgent priority in industrialised countries. 

 

 

2.1.7 Therapeutics  

2 . 1 . 7 . 1 P r e v e n t a t i v e   i n t e r v e n t i o n s  

The only modifiable risk factor for AMD is smoking. However, cessation of 

smoking has not been consistently shown to reverse risk 46, 47. The use of high dose 

antioxidant and zinc supplementation is not yet a part of standard clinical 

practice, since AREDS is the only prospective study that has found a reduction in 

the risk of AMD progression 110, 111. Ongoing population‐based studies and 

intervention trials will better define which nutrients confer the greatest protection 

and the best formulations or routes of administration for their use as supplements. 

 

18

2 . 1 . 7 . 2 P a l l i a t i v e   i n t e r v e n t i o n s  

For patients with neovascular AMD, a number of recent innovations have offered 

hope of slowing progression and stabilising, or even improving, vision. 

Photodynamic therapy (PDT) uses verteporfin, an intravenously administered 

photosensitising dye to target subfoveal CNV, and can be used concomitantly 

with intravitreal injection of triamcinolone, a corticosteroid. However, PDT 

treatment (with or without triamcinolone) only leads to modest reductions in 

vision loss and does not generally result in vision gain in the long term (reviewed 

in 112).  

 

The most promising therapeutic strategy to emerge in recent years is the use of 

engineered antibodies that target vascular endothelial growth factor (VEGF) and 

inhibit CNV. The dosing schedule and long term effects of a number of anti‐VEGF 

therapies are currently being evaluated, although several have been shown to slow 

disease progression and stabilise vision 112. To date, ranibizumab, a recombinant 

monoclonal antibody which recognises all isoforms of VEGF, is the only anti‐

VEGF therapy shown to reverse vision loss.  The rate of vision loss was slowed in 

over 90% of participants over two years in a randomised trial, with up to a third of 

participants experiencing vision gain which was maintained over two years 113.   

 

There is currently no palliative therapy for GA and preventative interventions for 

all forms of AMD are limited. Advances in gene therapy and stem cell therapy 

have the potential to alleviate vision loss and the development of AMD lesions in 

the near future. However, AMD is a complex disease and a thorough appreciation 

of pathogenic mechanisms will necessarily underpin new therapies. The following 

sections overview normal macular anatomy and AMD histopathology, and 

summarise the current understanding of disease pathogenesis as well as its 

limitations. 

 

19

2 . 2 T H E “ A N A T O M Y ” O F A M D

2.2.1 The  macula  in  health  and  ageing  

2 . 2 . 1 . 1 An a t om y  &   em b r y o l o g y   o f   t h e   h um a n   e y e  

The eyeball lies in the bony orbit, and consists of three layers of tissue: (i) the 

outermost fibrous tunic, composed of the sclera and cornea; (ii) the uveal tract, 

which forms the middle layer; and (iii) the retina, the innermost layer. The eye is 

divided into the anterior and posterior chambers by the iris and lens. The sclera 

and cornea together form an elastic envelope that gives the eye its shape. The 

uveal tract is composed of the iris, ciliary body and choroid. It carries the principle 

nerves and blood vessels of the eye, upon which the intraocular structures depend 

for their nourishment.  

 

The retina is an extension of the central nervous system, and extends from the 

optic nerve to the ora serrata. The retina and optic nerve are forebrain derivatives, 

with the optic nerve connecting the retina to the brain via the optic chiasm and 

optic tracts. In life, the retina is completely transparent, and in contact with 

Bruch’s membrane externally and the vitreous body internally. The macula, or 

macula lutea (“yellow spot”), is a shallow depression that lies in the central retina, 

3.5mm lateral to the edge of the optic disc. High concentrations of the carotenoids 

lutein and zeaxanthin, known as macular pigment, give rise to the yellow colour 

of the macula. Although the macula area measures 5‐6 mm in diameter, it accounts 

for almost 10% of the visual field due to the concentration of photoreceptors. 

 

Microscopically, the retina has ten well‐defined layers. From the outermost to 

innermost, these are: (i) retinal pigment epithelium (RPE); (ii) photoreceptor outer 

segments; (iii) outer limiting membrane; (iv) outer nuclear layer, comprised of 

photoreceptor cell bodies; (v) outer plexiform layer; (vi) inner nuclear layer; (vii) 

inner plexiform layer; (viii) ganglion cell layer; (ix) nerve fibre layer; and (x) outer 

20

limiting membrane. The rod and cone cells contain photopigments essential for 

the transduction of light into chemical and then electrical energy. 

 

Within the macula lies the fovea (1.5mm in diameter) and foveola or  fovea centralis 

(0.35mm in diameter). The photoreceptor layer in the foveal region contains only 

cones ‐ approximately 100 000 cones within the total foveal area of 1.75mm2 114. The 

nerve fiber layer, ganglion cell layer, inner plexiform layer and inner nuclear layer 

are all absent in the fovea.  

 

Embryologically, the eyeball begins to form with the invagination of the optic 

vesicle into the optic cup at week four. Two neuroectodermal layers, in contact 

with each other at their apices, will have differentiated into the neurosensory 

retina internally and the RPE externally by week four. A thin capillary network 

appears and covers the entire optic cup after its formation. Primitive rod and cone 

inner, and later outer, segments appear in the seventh week, with the neuroblastic 

layers of the macula differentiating first. Pigmentation of the cells of the outer cup 

increases during the eighth week. The anterior margin of the cup grows forward 

during the tenth week to form the future ciliary body and iris. The inner plexiform 

layer forms in the 12th week, the end of embryonic life. During the fourth month, 

the outer plexiform layer is discernable and bipolar, amacrine, Muller and 

horizontal cells differentiate. The first retinal vessels also appear in the fourth 

month, and develop their adult pattern by the fifth month after birth. The RPE 

cells enlarge from the fourth to the eight month. The final arrangement of retinal 

cells and their processes is complete by the sixth month, with some further retinal 

differentiation after birth, particularly in the macular region. RPE cells, however, 

continue to increase in density between birth and two years of age 114. 

 

21

2 . 2 . 1 . 2 Th e   r e t i n a l   p i gm e n t   e p i t h e l i um  

Approximately 4.2 ‐ 6.1 million RPE cells are present in the adult eye. 

Pigmentation varies depending on the region of retina, with the highest density of 

pigmentation at the macular region. RPE cells at the macula measure 14μm wide 

by 10‐14μm high, compared to flatter cells at the ora serrata that measure up to 

60μm wide. RPE cells of the ora serrata are often multinucleate. It is generally 

accepted that in situ, RPE cells are post mitotic, and that adjacent cells slide in to 

replace cells that have died 114. 

 

The primary function of the RPE is to support the photoreceptors. They secrete 

and maintain both the inter‐photoreceptor matrix and Bruch’s membrane, 

regenerate bleached visual pigments, provide metabolic support by facilitating the 

movement of fluid and ions between the choroid and the photoreceptors, and 

phagocytose spent photoreceptor outer segments. The phagocytic load is great: in 

the rhesus monkey, for example, each RPE cell supports around 30 

photoreceptors, which shed a combined 3000 membrane disks every day 115. In 

humans, each RPE cell supports approximately 45 photoreceptors, and a rod outer 

segment is fully phagocytosed and replenished every 10 days (reviewed in 116). To 

accomplish this, RPE cells have a highly developed lysosomal system. Outer 

segments are engulfed by phagosomes, which fuse with lysosomes to allow 

degradative enzymes to break down their contents. Undigested material becomes 

residual bodies, which become the substrate for lipofuscin in iron‐catalysed 

reactions in lysosomes. This autofluorescent lipid‐protein aggregate accumulates 

in the post‐mitotic RPE cells from the age of 16 months (reviewed in 2). In addition, 

the RPE releases cytoplasmic contents into Bruch’s membrane, to meet the 

demands of the high phagocytic load (reviewed in 117. 

 

The RPE secretes and maintains its own basement membrane and intercellular 

membrane, as well as the intercellular matrix of the photoreceptors and 

22

choriocapillaris. These processes depend on a balance of RPE‐derived membrane 

metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) 118, 

and possibly other proteolytic enzymes 119. As well as providing the local cellular 

scaffolding, RPE cells regulate their own survival, together with that of the 

choriocapillaris, by the production of VEGF and pigment epithelial derived 

growth factor (PEDF), such that loss of RPE results in loss of not only the 

overlying photoreceptors, but the choriocapillaris as well 120.  

 

The RPE also regulates the choroidal vasculature, most likely by producing a 

balance of pro‐ angiogenic factors such as VEGF121, 122, and anti‐angiogenic factors, 

such as PEDF 123 and Fas ligand  (FasL) 124. Additionally, RPE cells secrete a 

number of immunomodulatory factors that maintain outer retinal immune 

privilege and the immunological specialisations of the choroid (see Section 2.2.1.7).   

 

2 . 2 . 1 . 3 Ag e ‐ r e l a t e d   c h a n g e s   i n   t h e  RPE  

A degree of polymorphism with regard to RPE cell shape, size, nuclei and degree 

of pigmentation occurs with advancing age. Cell nuclei become smaller and more 

basophilic 114. In the macular region, RPE cells become taller and narrower with 

normal ageing, and accumulate lipid and granular material, which is deposited in 

the inner collagenous zone of Bruch’s membrane. Lipofuscin, consisting of 

partially degraded cell membranes in lysosomes, accumulates and increases from 

around 1% of the cytoplasm during the first decade of life, to 19% during the ninth 

decade 125. Lipofuscin accumulates in cells that do not have a mechanism to deal 

with oxidised lipoproteins. These cells can be professional lipoprotein scavengers 

like macrophages, or non‐professional phagocytes such as central nervous system 

neurons and RPE. In RPE, it is most concentrated in the central retina, where 

photoreceptor cell density, and hence metabolic demand, is highest. Increasing 

lipofuscin content not only significantly reduces the volume of functional RPE 

cytoplasm, its generation also produces damaging reactive oxygen species 

23

(reviewed in 116). Death of any critically damaged RPE cells results in increased 

demands on the remaining cells.  

 

Lipofuscin can slowly disappear once the overlying photoreceptors are lost. The 

residual bodies that give rise to lipofuscin retain degradative enzyme activity, 

implying that once the phagocytic demands on RPE are reduced, lipofuscin is 

eventually degraded, recycled or shed into Bruch’s membrane (reviewed in 117). 

Several histopathological studies have shown that an abnormal, thickened RPE 

basement membrane, together with loss of RPE basal infoldings, occurs in eyes 

after the seventh decade 10, 126, 127. Not only are these features indicative of cellular 

stress and loss of function, they were also found to be commonly associated with 

choroidal neovascularisation (see Section 2.2.2). Not surprisingly, RPE failure is 

considered a central event in the pathogenesis of AMD. 

 

2 . 2 . 1 . 4 Th e   c h o r o i d   a n d  B r u c h ’ s  memb r a n e  

The retina has one of the highest metabolic demands of any tissue. While the inner 

retina derives its nutrition from the retinal vessels, the choroid functions 

principally to nourish the outer retina. It also acts as a conduit for vessels that 

supply the anterior eye. The choroidal stroma contains a significant number of 

pigmented cells – choroidal melanocytes – which are concentrated in the 

outermost layers 128.  

 

Microscopically, the choroid consists of: (i) Bruch’s membrane; (ii) choriocapillaris; 

(iii) stroma; and (iv) suprachoroidea. In ultrastructure, Bruch’s membrane is 

comprised of the basement membrane of the RPE, an inner collagenous layer, an 

elastic layer, an outer collagenous layer, and incorporates the basement membrane 

of choriocapillaris endothelial cells. It thus comprises the outer limit of the retina, 

and acts not only as a stabilising and anchoring structure, but also as a barrier and 

a filter 128. 

24

 

Bruch’s membrane separates the photoreceptors and RPE from their primary 

source of nourishment, the choriocapillaris, and forms a permeable filter through 

which metabolic exchange can take place. Glycosaminoglycans, laminin, 

fibronectin and collagens I, III, IV, V, and VI are found in various combinations 

within the five layers of Bruch’s membrane 129. The composition and turnover of 

these extracellular matrix components can alter the structural integrity and 

permeability of Bruch’s membrane. Age‐related Bruch’s membrane thickening is 

attributed to compositional changes (Section 2.2.1.6), and abnormal extracellular 

Bruch’s membrane deposits are a feature of early AMD (see Section 2.2.3). 

 

Some of the material shed from RPE into Bruch’s membrane is probably cleared by 

the choriocapillaris by passive diffusion. Guymer et al suggest that choroidal 

endothelial cells or pericytes may also actively phagocytose RPE‐derived debris 117. 

Recent evidence points to a significant role for choroidal macrophages, a 

population of dedicated phagocytes, in keeping Bruch’s membrane debris‐free 

(discussed in Section 2.3). 

 

Embryologically, endothelial cells in the mesoderm adjacent to the RPE of the 

optic cup begin to differentiate during the fourth week. By the fifth week, the 

vascular net extends along the entire optic cup, coinciding with heavier 

pigmentation of the RPE. The RPE basement membrane and inner collagenous 

layer of Bruch’s membrane develop by the sixth week. Also at this time, 

rudimentary vortex veins appear and the choroidal capillary network becomes 

more developed. The elastic layer of Bruch’s membrane appears in the twelfth 

week. The elastic layer is one third (or less) as thick at the fovea than the periphery 

in the adult 130. Most of the choroidal vessel systems develop during the third and 

fourth months. Pigment in the choriodal melanocytes first appears in the fifth 

month. The choroidal melanocytes, unlike the RPE, derive from the neural crest.  

25

 

The unique capillary system of the choroid resides in a single plane and is highly 

fenestrated on the Bruch’s membrane side. The blood flow rate through the 

choroid is relatively fast, resulting in lower oxygen exchange per millilitre of 

blood, and a relatively oxygen‐rich outer retina. In the macaque monkey, 90% of 

outer‐retinal oxygen is consumed by the photoreceptors 131. A rich nerve supply 

exists in the choroid, probably to control ocular blood flow, which also depends 

on intraocular as well as systemic blood pressure. Loss of the choroid, either 

experimental or disease‐related, results in atrophy of the overlying retina 128. A 

capillary‐free zone of 0.4mm exists within the macula, making it particularly 

vulnerable to age‐related reductions in choroidal blood flow 132. 

 

2 . 2 . 1 . 5 Ag e ‐ r e l a t e d   c h a n g e s   i n   t h e   c h o r o i d    

There is a decrease in choroidal thickness from 200μm at birth to 80μm by age 90, 

due to a decrease in both choriocapillaris density and lumen diameter 5, 133 as well 

as increase in intercapillary pillar width 134. This is accompanied by an increase in 

Bruch’s membrane thickness 5, 133. The normal lobular arrangement, where a 

central arteriole feeds lobules of capillaries surrounded by venules 135, becomes 

tubular (reviewed in 117, thus reducing the surface area available for exchange. 

There is also a reduction of choriocapillary fenestrations as the overlying RPE 

becomes damaged or lost with age 5, 120. Correspondingly, there is a drop in 

macular choroidal blood flow (as measured by laser Doppler flowmetry), with 

delayed indocyanine green choriodal filling in normal individuals over 50 years 

136.  

 

2 . 2 . 1 . 6 Ag e ‐ r e l a t e d   c h a n g e s   i n  B r u c h ’ s  memb r a n e  

Bruch’s membrane measures 2μm in thickness at birth and increases to 4 to 6μm 

by the tenth decade 133, 137, 138. Between 10 and 90 years, Bruch’s membrane 

26

thickness doubles. These changes have been attributed to increased or altered 

protein content, increased lipid content and increased glycosaminoglycan size. On 

light and electron microscopy, there is accumulation of vesicular, granular, 

membranous and filamentous material, most prominently between the RPE 

basement membrane and the inner collagenous layer 129, 137, 139.  

 

There is increased collagen cross‐linking and possibly, glycosylation, which result 

in resistance to breakdown by RPE collagenases. Correspondingly, there is 

impaired collagen turnover and increased Bruch’s membrane collagen content 

(reviewed in 116). Two types of collagen accumulate: the normally present 64nm‐

periodicity collagen, and a 100‐140nm‐periodicity collagen described as “long‐

spacing collagen” 137, 140. Although long‐spacing collagen is also found in young, 

normal eyes in the outer collagenous zone, outer‐collagenous zone deposits 

steadily increase with age 140. Laminin, an important basement membrane 

structural component that facilitates RPE anchoring and choriocapillaris 

remodelling, is also increasingly found deposited in the inner collagenous zone, 

and between the outer collagenous zone and choriocapillaris basement membrane 

(reviewed by 117). Guo et al found reduced active forms of matrix 

metalloproteinases (MMPs) and increased inactive forms in the Bruch’s membrane 

of aged eyes, suggesting impaired extracellular matrix turnover 118.   

 

Bruch’s membrane hydroxyproline content decreases proportionate to tyrosine, 

methionine and phenylalanine in the macular region 141. Material resembling RPE 

phagosomal contents can be found in the inner collagenous layer, and later the 

elastic layer 142. There is also evidence of an age‐related increase in advanced 

glycation end products (products of non‐enzymatic glycosylation of long‐lived 

protein) in Bruch’s membrane 143.  

 

27

Bruch’s membrane lipid content is negligible before the age of 30 by rises to 

220mg/m2 by age 100, and consists primarily of phospholipids, triglycerides, fatty 

acids and free cholesterol, which suggest a cellular source 134, 144‐146. Peroxidised 

lipid content also increases with age 147, particularly at the macula, and appear to 

derive from the long‐chain polyunsaturated fatty acids found in outer segments.  

 

These age‐related changes in Bruch’s membrane composition and thickness alter 

its permeability. Fluid movement is significantly impeded by the fifth decade 148, 

particularly at the macula. Maximal resistance was found in the inner collagenous 

layer, and thought to be due to the entrapment of both lipid and visculo‐granular 

material 149. Diffusion of macromolecules 150 and amino acids 151 across Bruch’s 

membrane also follow a significant age‐dependent decline.  The expression of 

vascular endothelial growth factor (VEGF) is increased in RPE, photoreceptor 

outer segments and the outer plexiform layer with increased Bruch’s membrane 

lipid content 152. VEGF is a potent promoter of angiogenesis, and its production is 

stimulated by hypoxia and ischaemia 153. 

 

Taken together, age‐related changes in the RPE, choriocapillaris and Bruch’s 

membrane result in reduced blood flow, impaired oxygen, fluid, amino acid and 

macromolecular exchange, dysregulated extracellular matrix turnover and 

alterations in RPE‐derived trophic factors. These are normal age‐related changes 

and do not by themselves constitute AMD. However, in susceptible individuals, it 

is within this compromised context that AMD develops.  

 

Inflammation is increasingly recognised as a significant factor in the pathogenesis 

of AMD (Sections 2.4 & 2.5). Before describing the pathological changes in early 

and advanced AMD (Sections 2.2.2 & 2.2.3), it is important to consider the 

specialised local immunological environment in which inflammation occurs.  

 

28

2 . 2 . 1 . 7 Immun o l o g i c a l   s p e c i a l i s a t i o n s   o f   t h e   r e t i n a   a n d  c h o r o i d  

Immune reactions within ocular tissues, while sharing many features with 

immune responses in other tissues, are atypical. This was first demonstrated when 

allografts transplanted into the anterior chamber of the eye survived better than 

those transplanted in skin 154. It is now understood that “ocular immune privilege” 

is the result of a complex network of interactions which allow the control of sight‐

threatening inflammation while affording immunity. This is made possible, in 

part, by the relative lack of lymphatics draining intraocular tissues,and the 

existence of the blood‐retina barrier (maintained by tight junctions between retinal 

vascular epithelium internally and the RPE externally). However, it is clear that 

immune privilege results from active as well as passive processes.  

 

Intraocular tissues express and secrete a number of molecules that suppress 

inflammation. Expression of major histocompatibility (MHC) molecules is limited 

to low levels of class I and virtually no class II in the anterior chamber, vitreous 

cavity and subretinal space 155, 156. Parenchymal ocular tissues express FasL, 

inducing apoptosis in invading activated T cells 157. Despite the presence of the 

blood‐retina barrier, ocular antigens can leave the eye compartment inside ocular‐

derived antigen presenting cells via the circulation 158. While the APCs travel to the 

spleen, they do not activate helper T‐cells. Rather, ocular‐derived APCs are 

programmed by a local microenvironment rich in immunosuppressive cytokines, 

such as TGFβ, vasoactive intestinal peptide and somatostatin (reviewed in 159). The 

end result is the production of CD8 suppressor cells and the suppression of both 

delayed type hypersensitivity and complement‐fixing antibody producton 160.  

 

While the location of the uveal tract is external to the blood‐retina barrier, several 

lines of evidence suggest that local immune reactions are also “atypical”. In the 

choroid, the local immune microenvironment appears to depend to a large degree 

29

on RPE‐derived immunosuppressive factors. The RPE separates the retina from 

the highly fenestrated capillary network of the choriocapillaris. Due to the large 

amount of photoreceptor outer segments phagocytosed by RPE daily, and the 

constant release of cytoplasmic contents into Bruch’s membrane (Section 2.2.1.2), 

retinal antigens are readily available for antigen presentation in the choroid. It is 

thus important that inappropriate retinal antigen presentation resulting in 

sensitisation of the RPE or retina to autoimmune attack is prevented.  

 

RPE cells do not express MHC II molecules in the quiescent eye 161. While RPE can 

express pro‐inflammatory cytokines when stimulated, they constitutively express 

the anti‐inflammatory molecules transforming growth factor‐β1 (TGFβ1) 162, 

interleukine‐1 (IL‐1) receptor antagonist 163, somatostation, interleukin‐10 (IL‐10) 

and PEDF 164.  These molecules are thought to modulate the immune 

microenvironment of Bruch’s membrane and the choriocapillaris, such that 

resident dendritic cells and APCs become tolerogenic. RPE compromise may thus 

have significant immunomodulatory consequences for the choroid and Bruch’s 

membrane (discussed further in Sections 2.4 and 2.5). 

  

2.2.2 The  pathology  of  endstage  AMD  

2 . 2 . 2 . 1 Ge o g r a p h i c   a t r o p h y   o f   t h e  RPE :   t h e  n a t u r a l   e n d s t a g e  o f  AMD  

Gass used “geographic atrophy” to describe the slowly enlarging or coalescing 

areas of RPE atrophy, resulting in lesions with irregular boundaries 6. Within an 

area of atrophy, there is an absence of RPE cells, and loss of the overlying 

photoreceptors. The underlying choriocapillaris is atrophic or absent, highlighting 

its dependence on RPE‐derived maintenance factors 120. RPE cells at the edge of the 

atrophic area form a heaped‐up, hyperpigmented edge, which consists of large 

cells filled with lipofuscin and membrane‐bound bodies 165, with distortion of the 

30

few remaining microvilli. Photoreceptors overlying the edge of atrophy are 

grossly abnormal, if present at all 8.  

 

2 . 2 . 2 . 2 Ch o r o i d a l  n e o v a s c u l a r i s a t i o n   a n d   d i s c i f o rm   s c a r r i n g  

In the early stages of choroidal neovascularisation (CNV), capillary‐like vessels 

extend from the choroid into the inner Bruch’s membrane and the sub‐RPE space 7, 

166. Initially, the new vessels grow within the space normally occupied by basal 

linear deposit and drusen, i.e. along the inner layers of Bruchʹs membrane 167.

Endothelial sprouts continuous with pre‐existing choroidal vessels are surrounded 

by enlarged, activated pericytes, eventually forming lumina 167. The points of 

origin can vary from one to 12, with an average of 2.2 per eye 168. These vessels 

later become larger veins and arteries 126.  

 

Early CNV is rarely clinically discernable.  Sarks found sub‐clinical CNV in a 

surprisingly high proportion (41.7%) of eyes with GA 10, suggesting that although 

a common occurrence, early CNV does not readily progress to neovascular AMD. 

Ultrastructural evidence supports two different phases of new vessel growth 167. A 

“low‐turnover” phase characterises the initial intra‐choroidal neovascularisation, 

while substantial sub‐RPE neovascularisation is accompanied by extensive 

endothelial cell proliferation and migration in a “high‐turnover” phase. In rare 

instances, CNV may encroach into the sub‐retinal space and join with retinal 

vessels 126. 

 

As discussed earlier (Section 2.1.1), once CNV is established in the sub‐RPE or sub‐

retinal space, vessels can leak or bleed, causing serous or haemorrhagic 

detachments of the RPE. Resolution of these events results in the proliferation of 

fibrous tissue and the formation of a sub‐RPE fibrovascular scar. Sarks noted that 

the choroid underlying disciform scars was thicker than that underlying areas of 

GA 10, although both are thin compared to normal 169. 

31

 

The histopathological features of GA, CNV and disciform scars are thus well 

defined. However, there is less agreement regarding the histopathological 

definition of early AMD. This is partly because the earliest histopathological 

changes are not clinically evident. It was Gass who first proposed that 

neovascularisation originating from the choroid may occur secondary to 

accumulation of abnormal deposits beneath the RPE 6. 

2.2.3 The  basal  deposits  and  early  AMD  

2 . 2 . 3 . 1 B a s a l   l am i n a r   d e p o s i t   i s   a  ma r k e r   o f  RPE  d e g e n e r a t i o n  

 

In 1976, Sarks described a deposit found between the RPE plasma membrane and 

its basement membrane (Figure 2.2‐1), with a blue, striated appearance on picro‐

Mallory staining, which eventually came to be known as basal laminar deposit 

(BLamD) 10 (Figure 3.1‐2). The first systematic clinicopathological review of its 

kind, the study found that in 378 eyes, submacular BLamD correlated well with 

age, Bruch’s membrane hyalinisation and importantly, with the degree of RPE 

degeneration 10. When eyes in this series were organised by the appearance of 

BLamD, a histopathological grading system, comprised of five groups, emerged 

(detailed in Section 2.2.3.5).  

 

In 1986 Loffler et al confirmed that the BLamD consisted of long‐spacing collagen 

in a granular matrix, and was composed, in part, of normal RPE basement 

membrane molecules, such as collagen IV, laminin and heparin‐sulphate 

proteoglycan 170. On EM, the earliest evidence of BLamD had a remarkably similar 

appearance to normal RPE basement membrane 170. A late form of BLamD, found 

internal to the early form was noted subsequently, and found to correspond to 

severe RPE degeneration 8 (Figure 3.1‐2). Ultrastructurally, the late BLamD is 

32

amorphous, with the appearance of having been laid down in waves (Figure 3.1‐

2). 

 

The similarity of BLamD to RPE basement membrane suggests it is perhaps an 

aberrant type of basement membrane material, secreted by distressed RPE. Hirata 

et al examined RPE secretion of radiolabelled proline in vitro and proposed that 

BLamD accumulation may be the result of aberrant degradation, rather than 

enhanced synthesis 171. There is some evidence of age‐related reduction in active 

MMP‐2 and increase in inactive degradative enzymes, suggesting reduced Bruch’s 

membrane extracellular matrix turnover 118. As discussed earlier, a single gene 

polymorphism in the promoter region of the HTRA1 gene has been associated 

with AMD risk (Section 2.1.5.5). The HTRA1 gene product is a member of the 

serine protease family, which includes proteins which facilitate the activity of 

matrix‐degrading enzymes (including MMPs) 172. The functional impact of the 

polymorphism appears to be HTRA1 over‐expression 97, although it is not yet clear 

how this impacts extracellular matrix turnover within Bruch’s membrane and 

BLamD deposition. 

 

Because material similar to BLamD can be found in the peripheral retina 173, and in 

the trabecular meshwork and cornea 140, it is not considered specific for AMD. 

However, it is the commonest histopathological finding in eyes with AMD 126, 169, 

174, and remains the most reliable marker of RPE degeneration 8, 175, 176. 

 

 

2 . 2 . 3 . 2 B a s a l   l i n e a r   d e p o s i t     a n d   s o f t   d r u s e n   a r e   t h e   s p e c i f i c  l e s i o n s   o f   e a r l y  AMD  

Membranous material accumulates in the inner collagenous layer of Bruch’s 

membrane from the second decade onwards 177. Ultrastructurally, this material 

resembles coiled phospholipid membranes, and can be found in the RPE basement 

33

membrane and between strands of early BLamD 3. Early investigators postulated 

that it derived from RPE, either as partially digested phagosomes 177 or selectively 

sequestered aliquots of cytoplasm shed into Bruch’s membrane 139, 177. Thin layer 

chromatography studies have shown that lipids of cellular origin, such as 

phospholipids, triglycerides, fatty acids and free cholesterol preferentially 

accumulated in macular Bruch’s membrane 144. 

 

 

Figure 2.2‐1  Schematic diagram of BLamD and membranous debris 

 

 

 

 

When membranous material collects in a continuous layer external to the RPE 

basement membrane, it is known as basal linear deposit (BLinD) (Figure 2.2‐1). 

This deposit is only visible on electron microscopy (EM).  In contrast to BLamD, 

BLinD disappears when RPE is atrophied and overlying photoreceptors absent 178, 

suggesting that it is a product of the RPE‐photoreceptor complex. Curcio and 

Millican found that not only is BLinD specific for early AMD, but soft drusen, the 

hallmark lesions of early AMD, are composed of the same membranous material 

34

176 or “membranous debris”179, 180. Thus, soft drusen can be understood as focal 

accumulations of BLinD external to the RPE basement membrane 175, 176, 179 (Figure 

2.2‐1). Smaller focal collections of membranous debris can also accumulate internal 

to the RPE basement membrane, and are known as basal mounds (Figure 2.2‐1). 

 

The biochemical constituents of membranous debris are not fully characterised. 

Earlier histochemical and ultrastructural studies identified neutral lipids and 

cerebrosides/gangliosides 142 in drusen. Pauleikhoff and colleagues later showed 

that drusen also contained phospholipids 181. Ruberti et al used quick freeze/deep 

etch electron microscopy to find that lipids, including cholesterol, preferentially 

accumulated with age in a thin layer external to the RPE basement membrane. The 

authors proposed that lipid deposition in this layer may be the pre‐cursor event to 

BLinD formation (and later, soft membranous drusen) 146. Recently, Curcio and 

colleagues have shown that Bruch’s membrane and drusen contain solid lipid 

particles 182, esterified and unesterified cholesterol 145, 183 and lipoproteins 184, 185. 

Because they were also able to demonstrate the presence of microsomal 

triglyceride transport protein 186 and apolipoproteins C‐I, C‐II, E, and J 185 in RPE, 

these investigators have proposed that dysregulated lipid metabolism by RPE may 

be responsible for the accumulation of membranous debris in AMD. 

 

 Although RPE apolipoprotein biochemistry is not well understood, genetic 

studies support a role for ApoE in AMD pathogenesis. In the central nervous 

system, ApoE modulates phospholipid and cholesterol transport as part of normal 

neuronal metabolism, as well as during neuronal remodelling. Certain ApoE gene 

polymorphisms, particularly the E4 allele, are linked to Alzheimer’s disease and 

atherosclerosis. Interestingly, the E4 allele of ApoE appears to be associated with a 

decreased risk of neovascular AMD 55, 58‐60, 187 (discussed in Sections 2.1.5.2 & 2.1.5.1).  

 

35

Another mechanism by which membranous debris may form is by the non‐

apoptotic blebbing of damaged RPE cells, discussed further in Section 2.2.3.4.  

   

2 . 2 . 3 . 3 Dru s e n   c l a s s i f i c a t i o n    

Drusen are seen as discrete spots in the fundus clinically (see Section 2.1.2). 

Histopathologically, they consist of focal, discrete aggregates of abnormal 

extracellular material external to the RPE basement membrane. However, drusen 

can vary widely in their appearance in terms of size, shape, elevation, distribution 

and contents, and drusen nomenclature remains confusing. To a large degree, this 

is the result of the lack of availability of post mortem eyes which have been 

photographed during life, thus limiting clinicopathological correlations.  

 

Clinically, drusen have been described as: hard or soft; distinct or indistinct; large, 

intermediate or small; as well as by their fluorescein staining characteristics. 

Histopathologically, drusen have been described as: small hard (or hyalinised); 

soft extensive (or membranous); as well as by their ultrastructural and histological 

staining characteristics (with terms such as papillary drusen and basal laminar 

drusen). Hard drusen have a discrete, hyalinisted light‐microscopic appearance, 

while soft drusen are usually larger, have sloping margins, and membranous or 

granular contents. 

 

Large, population‐based studies have contributed a great deal to the 

understanding of the natural history of drusen. It is clear that the natural histories 

of small hard drusen and large soft drusen are distinct, and the associated AMD 

risk is also significantly different. Small, hard drusen are present in 94% of the 

population 29 and 80% of post mortem eyes 188. Over a 5 to 15 year period, eyes 

with fewer than 8 small hard drusen are no more at risk of developing AMD than 

normal eyes 29, 32‐34, 37, 39. Eyes with soft, indistinct drusen (>125μm), on the other 

36

hand, are almost 18 times more likely to develop late AMD over 5 and 15 years 29, 

37.  

 

Unfortunately, studies investigating drusen contents often do not discriminate 

between small hard drusen and large soft drusen, while the results are generalised 

to explain AMD pathogenesis. This may be partly due to the vulnerability of soft 

drusen contents to loss during tissue processing, and partly because small hard 

drusen are much more commonly found in donor eyes. However, given the 

differences in clinical behaviour, there has been a surprising lack of large‐scale 

studies comparing the contents of hard and soft drusen. Hageman and Mullins 

found that the extracellular matrix protein vitronectin, and carbohydrate moieties 

stained by wheat germ agglutinin and limax flavus agglutinin were present in 

several drusen phenotypes 189, 190. This, and their reports of the presence of 

immunoglobulin G and complement components in both hard and soft drusen 191, 

192 lead them to propose that phenotypic descriptions of drusen as “hard” or 

“soft”, “small” or “large” were meaningless. While this approach simplifies 

drusen nomenclature, it fails to address the clinical reality that a few small hard 

drusen are considered normal while large soft drusen are the hallmarks of early 

AMD, and carry a significant risk of progressing to advanced AMD. However, 

Hageman and Mullins point out that different drusen phenotypes may result not 

from differences in protein or carbohydrate composition, but from the amount and 

type of lipids present 189. 

 

2 . 2 . 3 . 4 Dru s e n   b i o g e n s i s  

Evidence to date suggests the RPE plays a significant role in the biogenesis of both 

hard and soft drusen. Observations that RPE overlying drusen are cytologically 

abnormal in shape, size and pigment characteristics were made at least as early as 

1905 193. Ultrastructural studies later showed that pigmentation, intercellular 

junctions, and organelle content and organelle distribution are altered in RPE 

37

adjacent to drusen 142, 194, 195. As RPE becomes increasingly degenerate 

histopathologically, soft drusen regress and collapse, and hard drusen may 

disappear 196. Farkas and colleagues demonstrated the presence of degenerate 

organelles and possibly lysosomes in drusen 197, implicating the RPE as a source of 

drusen components. Although lysosomal activity was not demonstrated in a study 

by Burns and Feeney‐Burns 195, cytoplasmic debris was found in small drusen.   In 

a later ultrastructural study, Ishibashi et al found that RPE cells in aged human 

eyes with drusen shed portions of their basal cytoplasm into Bruch’s membrane 

198. These “buds” of RPE cytoplasm contained many organelles, including 

secondary lysosymes, mitochondria, vesicles and vacuoles. In conditions of stress, 

mammalian cells may sequester non‐functional or toxic cytoplasmic components 

in discrete packets of their cytoplasm to be shed as membrane blebs 199, 200. There is 

in vitro evidence that oxidative damage causes increased RPE membrane blebbing 

201.  Interestingly, RPE MMP‐2 activity is correspondingly reduced under the same 

conditions, suggesting a possible mechanism for increased membranous debris 

production and decreased degradation.  

 

A recent proteomic analysis of primarily hard drusen found increased 

carboxyethylpyrrole adducts (CEP protein adducts), products of 

docosahexaenoate lipid oxidation 202. Since docosahexanoate is the most abundant 

fatty acid in photoreceptor outer segments 203, the finding of CEP adducts in 

drusen suggests that drusen may contain indigestible, RPE‐derived photoreceptor 

elements. However, it is evident that apart from RPE derived components, hard 

drusen also contain molecules involved in extracellular matrix turnover, as well as 

acute phase reactants and other molecules of the innate immune system 202 

(discussed further in Section 2.5.1.2).  The possible involvement of choroidal 

dendritic cells in drusen biogenesis is discussed in Section 2.4.4. 

 

 

38

2 . 2 . 3 . 5 H i s t o p a t h o l o g i c a l   c l a s s i f i c a t i o n   s c h em e s  

As with clinical classifications, there is no universally accepted classification 

system for AMD histopathology. In particular, histopathological definitions of 

early AMD have varied. These include: (i) the type or number of drusen; (ii) the 

presence of basal deposits; (iii) RPE changes; and (iv) degree of photoreceptor 

degeneration 126, 133, 169, 175, 204.  

 

Histopathological grading is only meaningful when pathological features can be 

correlated to clinical (particularly fundus) features. Two large‐scale studies have 

attempted to do this. Sarks surveyed 378 eyes, all with clinical data, including 

fundus appearance, and in some cases, fluorescein angiography 10. Eyes with no 

BLamD were considered normal (group I). A normal fundus was seen in all eyes 

in this group. Eyes with patchy BLamD represented normal ageing (group II). The 

majority of eyes in this group had a normal fundus. Since approximately half of 

the eyes with a thin continuous layer of BLamD (group III), and all eyes with thick 

continuous BLamD (group IV) had clinical fundus changes (soft drusen and/or 

pigmentary disturbance), they were considered to have early AMD. Eyes with 

geographic atrophy (Group V) and disciform scarring (Group VI) were classified 

irrespective of BLamD appearance, although BLamD was incorporated into scar 

tissue in disciform lesions and persisted in areas of GA even in the absence of RPE.  

 

The Alabama Age‐Related Macular Degeneration Grading System for donor eyes 

was devised by Curcio and colleagues, and surveyed 34 eyes, 30 of which had 

accompanying clinical data 205. Clinicopathological correlations were made using 5 

eyes. The grading in this study was based on the extent of the “basal deposits, a 

combination of BLamD and BLinD” (since BLinD can only be distinguished on 

EM). In both studies, normal and early AMD eyes were defined 

histopathologically. Tables 2.2‐1 and 2.2‐2 compare the two grading schemes. 

Although similar in many respects, Sarks’ grading scheme was used for the 

39

histopathological studies in Chapter 3 due to its larger sample size and more 

extensive clinico‐pathological correlations. 

 

Despite the availability of clinical and histopathological classification systems, 

there is no universal definition of early AMD. Chapter 3.1 presents findings of a 

clinicopathological study that examined the influence of BLamD and membranous 

debris on the progression of AMD. The histopathological threshold at which 

ageing becomes early AMD is discussed. 

 

 

 

 

40

Table 2‐1  Histopathological grading scheme suggested by Sarks (1976) 10 

 

 

Group I II III IV V VI

BLamD Absent Patchy Thin continuousThick 

continuousPersists after 

loss of pigmentIncorporated into scar

RPE Normal3.6% with fine 

pigment disturbance

46.7% fine pigment        

11.7% coarse pigment

16.7% fine pigment        

78.6% coarse pigment

GAIncorporated into scar

CNV Nil Nil Nil 14.3%* 41.7%* 100%

* subclinical CNV  

 

 

 

Table 2‐2  Histopathological grading scheme suggested by Curcio et al (1998) 205 

 

 

Grade 0 1 2 3 4

Basal deposits

None PatchyThin 

continuousThick 

continuousN/A

RPE Uniform Non‐uniformHeaped or sloughed

Anterior migration

GA

CNV None Present N/A N/A N/A

  

41

2 . 3 A M D D I S E A S E P A T H O G E N E S I S : S U M M A R Y O F C U R R E N T

C O N C E P T S

Although the pathogenesis of AMD is incompletely understood, histopathological 

& epidemiological studies, together with newer molecular and genetic insights, 

show that AMD results from age‐related changes plus additional pathological 

events. Models of AMD pathogenesis fall into one of three main categories. The 

mechanisms described in each are not mutually exclusive, and all centre on 

interactions between photoreceptors, RPE, Bruch’s membrane, and choroid. 

 

2.3.1 Oxidative  stress  

Reactive oxygen intermediates (ROIs), are released under physiological conditions 

by mitochondrial oxidative phosphorylation and liver cytochrome p450‐related 

reactions. ROIs can be quenched or removed by antioxidant defence systems, 

which depend on the enzymes glutathione, superoxide dismutase and catalase, 

and on vitamins A, C and E, the carotenoids, bioflavinoids, selenium and zinc.  

Oxidative damage results if antioxidant defences are exceeded by the production 

of ROIs.  

 

Advancing age is accompanied by increased oxidative damage, due to an age‐

related reduction in antioxidant defences. For example, total plasma glutathione, 

oxidised glutathione and peroxidised lipid increase with age, while total serum 

vitamin C and E decrease (reviewed in 116). The retina is susceptible to oxidative 

damage due to the amount of light irradiation it receives, the relatively high 

concentration of local oxygen, the presence of peroxidation‐prone polyunsaturated 

fatty acids (in photoreceptor outer segments), the presence of photosensitising 

pigments and the high RPE phagocytic load. There is an age‐related decline in 

macular pigment (lutein and zeaxanthin) 206, RPE cell density, and RPE cell 

vitamin E 116.  Conversely, there is a corresponding increase in RPE lipofuscin. In a 

42

study of AMD donor eyes graded by post‐mortem fundus features, Decanini et al 

found that RPE expression of catalase, copper‐zinc superoxide dismutase and 

manganese superoxide dismutase increased with increasing AMD pathology 207, 

along with proteins associated with secondary defence against oxidative damage. 

These findings suggest oxidative defence is upregulated in response to increasing 

oxidative stress.  However, even though protein levels are increased, there is 

evidence that at the activity of least one antioxidant enzyme, catalase, diminishes 

with age 208. Other ROI‐quenching enzymes, such as metallothionein 209 and heme 

oxygenase 210 appear to decrease in RPE with age.  

 

Data from epidemiologic studies tend to support a role for oxidative stress in 

AMD. Lower plasma glutathione reductase 211, and higher glutathione peroxidise 

212 are associated with AMD. A number of population‐based studies have shown 

increased risk of AMD with low dietary intake of carotenoids (reviewed in 206), and 

AREDS (see Section 2.1.5) has reported a reduction in risk of progression to 

advanced AMD with dietary antioxidant supplementation 73. In addition, cigarette 

smoking, known to increase ROIs and reduce antioxidant defence systems, is a 

well‐established risk factor for AMD (see Section 2.1.3). 

 

Oxidative damage can result in destruction of cytoplasmic and nuclear structures, 

leading eventually to cell death. Apoptotic cells themselves release cytochrome c 

from their disintegrating mitochondria, leading to higher local levels of ROIs 

(reviewed in 213). Non‐lethal oxidative damage to RPE cells may result in cellular 

blebbing, which may contribute to the deposition of sub‐RPE membranous debris 

214. Oxidative damage may also result in the production of an abnormal 

extracellular matrix and thickened Bruch’s membrane, due to modifications in 

matrix proteins or their degradative enzymes.   

 

43

2.3.2 Ischaemia    

The age‐related increase in lipid and protein content reduces Bruch’s membrane 

permeability to water soluble plasma molecules and amino acids, resulting in 

reduced metabolic exchange (Section 2.2.1). Increased Bruch’s membrane 

thickness results in a greater distance between the fenestrated choriocapillaris and 

the RPE, thus also impairing oxygen exchange. Age‐related reductions in 

choroidal blood flow, due to loss of choriocapillaris density and choroidal 

thinning, further exacerbate these changes. Even small reductions in the 

diffusional capacity of Bruch’s membrane or choriocapillaris blood flow can 

significantly affect photoreceptors and RPE, since the photoreceptors consume 90‐

100% of the oxygen delivered by the choriocapillaris 131. Reductions in gas 

exchange and in the bidirectional flow of molecules and fluid between the choroid 

and RPE, further promote the production of ROIs. 

 

2.3.3 Inflammation  

Inflammation is a tightly controlled response to injury or infection, essential in 

restoring the balance between health and disease. It is becoming increasingly 

apparent that a breakdown in the regulation of the inflammatory response 

contributes to a number of chronic, degenerative diseases. The following sections 

review the growing evidence implicating inflammatory and immune‐mediated 

processes in AMD disease pathogenesis.

44

2 . 4 M A C R O P H A G E S A N D I M M U N E C O M P E T E N T C E L L S I N A M D

2.4.1 Morphological  evidence  

2 . 4 . 1 . 1 Ma c r o p h a g e s ,  B r u c h ’ s  memb r a n e   b r e a k s   a n d   e a r l y  AMD  

Sarks noted that in eyes with early AMD, macrophages were found adjacent to 

breaks in Bruch’s membrane and in association with subclinical CNV, the earliest 

evidence of neovascularisation 10, 179. These observations were reinforced by similar 

follow‐up findings 127, 215. Stromal and choroidal leukocytes, including 

macrophages, were found in increased numbers by Penfold et al 216 once eyes 

developed a continuous layer of BLD. Mean macrophage counts were significantly 

higher in eyes with continuous BLD compared to normal aged eyes  217. Later 

reports found that macrophages appeared to be attracted to membranous debris 

deposition within Bruch’s membrane in early AMD 218. Macrophages were also 

found accompanying both “active” and “inactive” sublinical CNV 219. These 

morphological observations suggested a link between macrophage infiltration and 

the earliest stages of the neovascular process, possibly by causing breaks in 

Bruch’s membrane which allow the in‐growth of newly formed vessels. This 

hypothesis was strengthened by the known angiogenic influence of macrophages 

in other chronic inflammatory and fibroproliferative states, including rheumatoid 

arthritis and solid tumour growth 220, 221. 

 

2 . 4 . 1 . 2 Ma c r o p h a g e s   i n   a d v a n c e d  AMD   l e s i o n s  

An ultrastructural study of membranes from eyes with neovascular AMD  found 

leukocytes and macrophages within neovascular structures, at breaks in Bruch’s 

membrane, and in contact with activated pericytes 222, further reinforcing the view 

that  macrophages induced new vessel growth. Macrophage association with the 

neovascular process appeared to persist in burnt‐out disciform lesions 7. The most 

recent large histopathological survey of surgically excised subfoveal CNV lesions 

45

confirmed that macrophages were the most frequently found cell type after RPE in 

both neovascular membranes and disciform scars 174. 

 

Interestingly, giant cells appear to the be commonest type of leukocyte found in 

eyes with GA 217, 223, whereas the breaks in Bruch’s membrane commonly found in 

eyes with disciform scars are absent. This observation further emphasises the 

association of Bruch’s membrane breaks with the in‐growth of neovascular tissue. 

Sarks proposed that macrophages and giant cells are attracted to Bruch’s 

membrane when the phagocytic capacity of RPE is exceeded 3. This idea has been 

supported by a number of recent observations on choroidal macrophage 

recruitment and turnover (see Section 2.4.3). 

 

2.4.2 Macrophages  and  choroidal  neovascularisation  

With compelling morphological data that macrophages were intimately involved 

with AMD lesions, and particularly the suggestion that they may facilitate 

neovascularisation, investigators sought evidence of macrophage expression of 

angiogenic mediators. Oh et al found that macrophages in surgically excised 

neovascular membranes, identified by CD68 labelling, expressed the pro‐

inflammatory cytokines interleukin‐1β (IL‐1β) and tumour necrosis factor alpha 

(TNFα), while RPE cells admixed in the same lesion expressed vascular 

endothelial growth factor (VEGF) 224. The authors suggested that the presence of 

activated, pro‐inflammatory macrophages may induce VEGF production by RPE, 

promoting choroidal neovascularisation. Grossniklaus et al also examined 

surgically excised CNV membranes, and observed that CD68‐positive 

macrophages expressed VEGF and tissue factor, while RPE cells expressed 

monocyte chemoattractant protein (MCP) 121. These authors concluded that RPE 

might be important for macrophage recruitment, and that recruited macrophages 

expressed two growth factors essential for neovascularisation. 

46

 

Further evidence of the ability of macrophages to induce neovascularisation was 

provided by animal model studies. The animal model most commonly used to 

approximate the CNV found in AMD uses laser photocoagulation to cause breaks 

in Bruch’s membrane. Neovascular lesions typically form within one week of 

photocoagulation 225. Choroidal vascular endothelial cells migrated to into the 

subretinal space via the laser‐induced defects in Bruch’s membrane in monkey 

eyes three days after photocoagulation, and macrophage infiltration was observed 

three to seven days after photocoagulation 226. In the same study, VEGF expression 

was first found in macrophages and later in RPE and Muller cells. Similarly, in a 

rat model of laser‐induced CNV, macrophages in both the subretinal space and the 

choroid adjacent to the site of laser injury expressed VEGF three to seven days 

after photocoagulation 227.  

 

Tsutsumi and colleagues explored this relationship further when they compared 

macrophage infiltration and extent of CNV after laser photocoagulation in a Ccr‐2 

knockout mouse model 228. Ccr‐2 is the receptor for macrophage chemoattractant 

protein‐1 (MCP‐1), is normally expressed by macrophages and is essential for 

macrophage trafficking. Both the number of infiltrating macrophages and the 

extent of CNV was significantly less in the knockout mice compared to wild type 

mice. These observations suggested that the neovascularisation process depended 

much more on recruited, and not resident, macrophages. Further strengthening 

this observation, Sakurai et al found that depletion of circulating monocytes using 

intravenous clodronate reduced both CNV lesion volume and leakage (as 

measured by fluorescein angiography) 229. 

 

To demonstrate that the recruited macrophages were derived from circulating 

monocytes, Caicedo et al used fluorescently‐labelled monocytes transplanted into 

the bone marrow of irradiated mice 230. Care was taken to reduce the laser intensity 

47

and duration to limit its effect to Bruch’s membrane and minimise retinal injury. 

Blood‐derived monocytes in this study infiltrated the retina overlying CNV three 

days after laser photocoagulation. Activation of the overlying Muller cells 

(evidenced by their expression of c‐fos and phosphorylated extracellular signal‐

regulated kinase) occurred secondary to macrophage infiltration. Muller cell 

activation was abolished after depletion of circulating monocytes using 

clodronate.  

 

 

In summary, the laser‐induced model of CNV has produced a number of 

important observations.  Firstly, it is likely that circulating monocytes, and not 

resident immune cells, are responsible for the inflammatory damage immediately 

after Bruch’s membrane disruption. Indeed, infiltrating macrophages may activate 

local cells 230. Secondly, recruited macrophages express VEGF and the extent of 

neovascularisation and leakage depends on the extent of macrophage trafficking 

and infiltration. However, laser photocoagulation tends to destroy the outer 

retina, along within Bruch’s membrane and choroid. In any case it is a significant, 

acute traumatic event very unlike the chronic, but sub‐lethal cellular changes that 

take place in AMD. Not surprisingly, the first cells to infiltrate laser‐induced CNV 

lesions are neutrophils, which are conspicuously absent in AMD lesions. As 

discussed below, the Ccr‐2 knockout mice used to illustrate the dependence of 

CNV on macrophage recruitment turn out to behave very differently when left to 

age without intervention. 

2.4.3 Choroidal  macrophage  recruitment  and  turnover  and  AMD  

2 . 4 . 3 . 1 C c l ‐ 2 ,  C c r ‐ 2   a n d  Cx 3C r 1   k n o c k o u t  m i c e   a n d  AMD ‐

l i k e   l e s i o n s    

In 2003, Ambati et al reported that knockout mice deficient in either MCP‐1 (Ccl‐2) 

or its receptor Ccr‐2, developed AMD‐like lesions when left to age beyond 9 

48

months 231. These included RPE lipofuscin accumulation, RPE degeneration, 

photoreceptor fall out and the development of drusen and choroidal 

neovscularisation; features not seen in wild type mice even beyond 24 months of 

age. Evidence of IgG and C3c in choroidal vessel walls of the knockout mice 

suggested immune complex deposition. C5, serum amyloid P protein and 

advanced glycation endproducts were also immunolocalised on RPE or the 

choroids of knockout mice. In wild‐type mice, an age‐dependent increase in Ccl‐2 

expression by RPE cells, together with an age‐dependent increase in choroidal 

macrophages, suggested that Ccl‐2 – Ccr‐2 interaction was critical to normal 

choroidal macrophage recruitment. This study also found that choroidal 

macrophages from wild type mice were able to degrade C5 and IgG deposited on 

the choroids or RPE of knockout mice. Together, data from this report suggests 

that resident choroidal macrophages play a critical role in the elimination 

opsonised debris in Bruch’s membrane. Macrophages expressing scavenger 

receptors for oxidised lipoproteins are seen found in human AMD eyes 232. 

Disruption of the normal recruitment or turnover of choroidal macrophages may 

lead to persistence of both the debris and the opsonising molecules C5 and IgG, 

resulting in lesions similar to those found in AMD. AMD‐like lesions were also 

found in mice deficient in Ccl‐2 and CXC3R1 (fractalkine, a chemokine receptor 

involved in leukocyte trafficking) 233, further reinforcing this view. 

 

These reports highlight the differences between age‐related pathological changes 

and those that result from laser disruption of Bruch’s membrane in mouse models. 

While CNV is reduced in Ccl‐2 (MCP‐1) knockout mice after laser 

photocoagulation, it develops spontaneously when the same mice are left to age 

beyond 9 months.  

 

49

2 . 4 . 3 . 2 I L ‐ 1 0   k n o c k o u t  m i c e   a n d   l a s e r ‐ i n d u c e d  CNV  

An interesting, but counterintuitive finding in interleukin‐10 (IL‐10) knockout 

mice was recently reported by Apte et al 234. IL‐10 is a major immunosuppressive 

cytokine that programs macrophages along the non‐inflammatory, “repair” 

pathway (discussed in Section 2.4.3.4).  These authors reported that the knockout 

mice developed less extensive laser‐induced CNV compared to wild type mice. 

Lack of IL‐10 would be expected to permit macrophage programming along the 

pro‐inflammatory pathway, resulting in more CNV. The authors explain their 

unexpected observations by proposing that it is the inhibition of normal 

macrophage recruitment (e.g. by local IL‐10) that promotes CNV. That is, a lack of 

macrophage recruitment results in increased debris deposition in Bruch’s 

membrane. This in turn results in the increased deposition of acute phase reactants 

and other opsonising components of the innate immune system, leading to further 

activation of damaging inflammatory cascades. 

 

2 . 4 . 3 . 3 P o l ym o r p h i sm s   i n   l e u k o c y t e   r e c r u i tm e n t   a n d   t u r n o v e r  g e n e s  

 A number of genetic studies have supported the observation that normal 

macrophage recruitment and function is important in the maintenance of a healthy 

and debris‐free Bruch’s membrane. Goverdhan et al examined polymorphisms in 

the human leukocyte antigen gene and AMD risk. The authors found one at‐risk 

allele and two protective alleles, as well as differential expression of HLA antigens 

in the choroid 86. HLAs are important molecules for macrophage recognition of 

antigen.  The HLA genes are the most polymorphic in the human genome, and the 

mechanism by which the confer susceptibility to AMD is not yet clear. These 

findings, however, provide further evidence for the involvement of immune or 

inflammatory processes in AMD pathogenesis.  

 

50

A single gene polymorphism in the CX3CR1 gene was also found to be associated 

with AMD 84. Donor eyes with the “at risk” allele had reduced fractalkine 

transcripts in the macula region. Since fraktalkine is an important chemokine in 

monocyte transendothelial migration 235, the authors concluded that aberrant 

macrophage recruitment may be implicated in AMD pathogenesis. Finally, a 

single gene polymorphism of the toll‐like receptor 4 (TLR‐4) gene was also 

associated with AMD 85. TLR‐4 plays an essential role in innate immunity, and 

mediates macrophage recognition and phagocytosis of microbial invaders 236. 

Interestingly, TLR‐4 appears to also involved in RPE photoreceptor phagocytosis 

and in cholesterol transport 237, 238. 

 

 

2 . 4 . 3 . 4 S e r um  my e o l o i d   c e l l s   a n d  AMD  

There is some epidemiological evidence implicating circulating myeloid cells in 

AMD, suggesting a higher systemic inflammatory “set point”  A higher white cell 

count was found in patients with neovascular AMD and disciform scars compared 

to controls in a small case‐control study in 1986 239. High white cell count was also 

associated with neovascular AMD 240, and with the 10‐year incidence of large 

(>125μm) drusen in the Beaver Dam Study 241. Finally, monocytes isolated from 

patients with neovascular AMD expressed more TNFα when stimulated with RPE 

blebs in vitro compared to controls 242. 

 

2 . 4 . 3 . 5 Ma c r o p h a g e s   i n   a n   i mmun e ‐ p r i v i l e g e d   c om p a r tm e n t  

Cells of the macrophage/monocyte lineage can vary widely in function, 

morphology and immuno‐phenotype depending on the tissue microenvironment 

in which they are found. In broad terms, macrophages can be activated along a 

“classical” or “alternate” pathway (reviewed in 243). Classical activation follows 

stimulation with bacterial lipopolysaccharide and IFNγ or with TNFα. These 

macrophages express the enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS), which 

51

allows them to convert arginine to nitric oxide, producing nitrite, peroxynitrites 

and superoxides. These powerful oxidants cause lipid peroxidation of affected cell 

membranes, leading to cell death. Alternate activation of macrophages switches on 

a different metabolic program, which is TGFβ1‐dependent. Macrophages thus 

programmed express the enzyme arginase, which converts arginine to ornithine, 

promoting cell division and repair.  

 

A rich network of macrophages and dendritic cells has been found in the choroid 

of mice 244. The dendritic cells appear to be in the “immature” phase of their life 

cycle, similar to the Langerhans cells of skin, suggesting that their function in the 

normal choroid is antigen capture and not antigen presentation. Although 

definitive data is not available for human eyes, it is likely that similar networks 

also exist. Resident choroidal dendritic cells and macrophages appear to be pre‐

programmed to resist classical activation, thus limiting inflammation and 

promoting repair. In culture, dendritic cells and macrophages isolated from rat 

and mouse choroid failed to present antigen 245. And, although the immunological 

specialisations of the choroid are less well characterised than the retina and other 

ocular compartments, there is evidence that local inflammation‐suppressing 

immune modulation exists, primarily via RPE cells (see Section 2.2.1.7).  

 

In culture, RPE produce of thrombospondin‐1 and TGFβ, and can directly 

suppress T‐cell activation 246. Mouse eye cup RPE cells produced PEDF and IL‐10, 

potent immunosuppressive cytokines. The supernatants from these RPE cells 

inhibited activated macrophages by reducing their production of IL‐12 (a pro‐

inflammatory cytokine) and increasing their production of IL‐10 (an 

immunosuppressive cytokine) 164. This effect was neutralised by anti‐PEDF 

antibodies. Ingestion of oxidised photoreceptor outer segments by the human RPE 

cell line ARPE‐19 in culture resulted in increased expression of MCP‐1, but not 

TNFα 122, suggesting that RPE can recruit macrophages without activating them. 

52

In pathological circumstances, it appears that choroidal macrophages can be 

classically activated. Hattenbach et al found that macrophages in the eye of a 70 

year old woman with neovascular AMD expressed iNOS 247. Endothelial cells 

within the neovascular membranes of the other 6 CNV specimens in this study 

also expressed iNOS. Although the macrophages in this study were identified by 

morphology alone, the results suggest that CNV‐associated macrophages in 

human eyes are phenotypically different to resident choroidal macrophages. Their 

ability to produce nitric oxide can not only damage local cells, but may also 

stimulate angiogenesis. Ando et al found that VEGF‐mediated retinal and 

choroidal neovascularisation in mice depended on local nitric oxide production 248. 

And finally, in the experimental autoimmune uveitis mouse model, choroidal 

macrophages (identified by ED1 labelling) expressing iNOS were seen 11 days 

after sensitisation with retinal S antigen, coinciding with the peak of inflammation 

249. Thus, iNOS‐expressing choroidal macrophages may be associated with both 

inflammation and neovascularisation.  

 

In the context of AMD, the influence of the progressive accumulation of 

extracellular deposits on local populations of macrophages, both recruited and 

resident, is not well defined. Section 3.2 examines the influence of BLamD and 

membranous debris on macrophages found within Bruch’s membrane and in the 

choroid. 

 

2.4.4 Dendritic  cells  and  drusen  biogenesis  

Although dendritic cell networks are likely to be present in the normal human 

choroid, the functional role of choroidal dendritic cells is at present poorly 

characterised. Hageman and associates have proposed that sub‐RPE debris can 

attract the processes of cells on the choroid side of Bruch’s membrane and that 

these cells share immunophenotypic features with dendritic cells 250. Unfortunately 

53

they reported CD68 and HLA‐DR immunoreactivity in drusen, an 

immunophenotype more typical of macrophages. These authors propose that 

dendritic cell processes are attracted to injured RPE or diffuse sub‐RPE debris, 

becoming a focus for deposition of inflammatory proteins which eventually results 

in the formation of drusen. While an interesting pathogenic mechanism, there has 

so far been insufficient evidence to support it. 

54

2 . 5 I N F L A M M A T I O N A N D A M D

2.5.1 Tissue  evidence  of  inflammatory  proteins  

2 . 5 . 1 . 1 Ev i d e n c e   o f   i n f l amma t i o n ‐ a s s o c i a t e d   p r o t e i n s   i n  d r u s e n  

As discussed in Sections 2.2.3.2 and 2.2.3.4, drusen contain lipids and protein. 

The protein constituents of drusen so far identified can be roughly divided, 

with some overlap, into three groups: (i) cytoskeletal and basement 

membrane proteins, such as crystallins, collagens I‐V, laminin, fibronectin, 

vitronectin and proteoglycans 251, 252; (ii) proteins associated with lipid 

metabolism (apolipoproteins) 184, 253; and (iii) inflammation‐associated 

proteins, such as immunoglobulins, HLA‐DR, C‐reactive protein (CRP), 

vitronectin, complement cascade components, clusterin, crystallins, amyloid, 

serum amyloid P, albumin, factor X, thrombin and fibrinogen (see below). 

Cytoskeletal proteins and those associated with lipid turnover may result 

from extrusion by damaged RPE cells unable to meet the metabolic demands 

of constant photoreceptor outer segment turnover (see Section 2.2.3.4). 

Similarly, the production of excess basement membrane can be expected 

from epithelial cells under stress. However, it is the inflammation‐associated 

proteins that have the most obvious potential to influence the course of 

disease, due to their capacity to activate damaging inflammatory cascades.  

 

The following sections review the inflammation‐associated proteins found in 

drusen and Bruch’s membrane to date. It should be emphasised that 

interpretation and comparison of such studies is complicated by differences 

in drusen phenotype (see Section 2.2.3.3). Where defined, the majority of 

studies involve hard drusen, and often those found in the peripheral retina. 

Nonetheless, the findings have contributed to a growing understanding of 

the inflammatory pathways elicited by the presence of extracellular debris 

within the Bruch’s membrane‐choroid complex. 

55

 

2.5.1.1.1 Immunoglobulins and complement in drusen and Bruch’s membrane 

Immunoreactivity to IgM was found to be strong in macular hard drusen by 

Newsome et al 251, while IgG immunoreactivity was prominent in Bruch’s 

membrane but less strong in drusen. Johnson et al 191 also demonstrated IgG 

immunoreactivity in small, hard drusen in normal aged eyes, as well as in 

the RPE that overly or flank these drusen. Interestingly, both the complement 

component C5 and the terminal complement complex (membrane attack 

complex) C5b9 were found in drusen and adjacent RPE, leading the authors 

to propose that antibody‐mediated complement attack of RPE may result in 

drusen formation.  

 

The complement system consists of at least 20 proteins, found in serum in 

inactive form (Figure 2‐2). The system is involved in both innate and 

adaptive immunity, and in the removal of both microbial invaders and 

extracellular debris. Formation of the final product, the membrane attack 

complex (C5‐9) is triggered by activation of the critical element, C3, which 

can occur in three main ways: (i) the classical pathway, by C1q binding to the 

Fc region of IgM or IgG; (ii) the alternate pathway, by microbial elements, 

aggregated immunoglobulins, polysaccharides and others; and (iii) the lectin 

pathway, by collectin binding to viral or bacterial carbohydrate‐containing 

proteins. The membrane attack complex (MAC) forms transmembrane 

channels when it binds to target cells, leading to cell lysis. Proteolytic 

fragments of the complement cascade, particularly those of C3 and C5, are 

potent inflammatory mediators, and can be activated by proteolytic enzymes 

within inflammatory exudates, independently of the complement cascade. 

C3a and C5a cause vasodilation and increased vascular permeability via 

mast cell degranulation. C3b and C3bi are opsonins, facilitating phagocytosis 

of their targets by macrophages and neurtrophils, which possess cell surface 

56

C3b receptors. Additionally, C5a is a powerful promoter of leukocyte 

adhesion, chemotaxis and activation. To prevent self‐perpetuating 

inflammatory damage, the complement system is closely regulated by 

inhibitory proteins. These act primarily as inhibitors of C3 and C5 

convertases, although regulatory proteins that prevent C1 binding to 

immune complexes or MAC formation also exist 254. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figure 2.5‐1  The complement cascade 

Adapted from Cellular and Molecular Immunology 254 

 

 

The presence of terminal complement components and IgG in drusen 

provided tissue evidence that the complement system may trigger 

inflammatory sequelae important in AMD pathogenesis via the classical 

C1

C4 + C2 C4b2a C4b2a3b

C5-9Membrane Attack Complex (MAC)

C3 C3b C3bBb C3bBb3b

C3 C3b C5 C5b

Activated C1

IgG or IGM immune complex Acute phase proteins

+C6 +C7 +C8 +C9

Classical Pathway

Alternative PathwayMicrobial surfaces

Lipopolysaccharides

Factor BFactor B

Factor HFactor H

Accelerates decay of C3bBb

57

pathway (i.e. immune complexes). This hypothesis was further supported 

when two complement inhibitory proteins were found in aged normal eyes 

and eyes with GA: clusterin (in hard drusen) and vitronectin (in RPE 

surrounding hard drusen and sub‐RPE deposits resembling basal mounds) 

192. In a separate study, the same author group co‐localised IgG and C5b‐9 

immunoreactivity within hard drusen (and on the internal aspect of 

choroidal capillary walls) 255.C5b‐9 immunoreactivity was also found on the 

basal RPE membrane, suggesting that RPE cells were targets of MAC‐

mediated attack. Interestingly, only C5 immunoreactivity was demonstrated 

in the one soft druse presented in this study.  

 

2.5.1.1.2 Amyloid, fibrinogen and other inflammatory proteins found in drusen 

Immunofluorescence studies identified the coagulation proteins, thrombin, 

fibrinogen and factor X in drusen in 253. RNA transcripts for fibrinogen and 

factor X were amplified in the in RPE/choroid of AMD eyes in this study, 

suggesting local production. Factor X, thrombin and fibrinogen are proteases 

involved in the final common pathway of the clotting cascade. Since there is 

a well‐recognised association between vascular injury, inflammation and 

coagulation/fibrinolysis, these findings support a role for choroidal vascular 

dysfunction (in addition to inflammation) in AMD pathogenesis.  

 

C‐reactive protein, amyloid P component, α1‐antitrypsin and vitronectin are 

acute phase proteins, and have all, to various degrees, been localised in 

drusen by immunofluorescence techniques 190, 253. Acute phase proteins are 

inflammatory mediators released in response to both microbial invasion and 

tissue injury. One of their functions is to recognise molecules released by 

apoptotic or necrotic cells, such as nucleic acids, mitochondrial elements, 

membrane proteins, modified lipids, cholesterol, cytoskeletal proteins and 

proteins associated with cellular stress 256. Acute phase protein binding to 

58

microbial or cellular elements activates the complement cascade by the 

classical pathway 257, 258. This process is called “opsonisation”, and allows the 

rapid removal of potentially immunogenic debris from the extracellular 

compartment by phagocytic cells. The presence of HLA‐DR, an MHC class II 

molecule required in the capture of opsonised antigen by macrophages, has 

also been demonstrated in drusen and sub‐RPE debris 253. 

 

The abnormal extracellular deposits in found in early AMD (BLamD and 

membranous debris), together with damaged RPE, are obvious candidates 

for binding by acute phase proteins, immunoglobulins and complement. 

That these deposits persist in AMD eyes despite the presence of opsonisation 

molecules, HLA‐DR and macrophages suggests dysfunction somewhere 

along the opsonisation‐phagocytosis axis. This may be in: (i) the control of 

the acute phase response or complement cascade; (ii) the strength of the 

acute phase response proportionate to the amount of debris present; (iii) 

failure of phagocytosis; or (iv) failure of local recruitment or turnover of 

phagocytes. As described in the previously (Section 2.4.2), human genetic 

evidence and evidence from transgenic mice implicate dysfunctional 

macrophage recruitment and turnover in AMD and the development of 

AMD‐like lesions. Human genetic evidence has also strongly implicated the 

complement cascade in AMD pathogenesis (Section 2.1.5.5). Interestingly, the 

genetic evidence implicates defective regulation of complement activation 

via the alternate pathway, and not the classical pathway. The next section 

discusses the functional consequences of polymorphisms in complement 

proteins.  

59

2.5.2 Genetic  associations    

2 . 5 . 2 . 1 S i n g l e  nu c l e o t i d e   p o l ym o r p h i sm s   i n   c om p l em e n t  c a s c a d e   a n d   c om p l em e n t   r e g u l a t o r y   g e n e s  

In 2005, four author groups independently published data reporting an 

association between AMD risk and a single nucleotide polymorphism in 

complement factor H (CFH) gene 87‐90. These observations are particularly 

strong, considering the participants were derived from four separate 

(American Caucasian) populations, and distinct methods of gene screening 

were used. The studies included participants with early, neovascular or 

atrophic AMD.  

 

CFH is the major soluble inhibitor of the alternate complement pathway, 

preventing C3 activation by proteolytic cleavage of C3b. Single nucleotide 

polymorphisms are variations in a single nucleotide within the genome, and 

are commonly found (approximately 1 in 1250 base pairs). The Tyr402His 

variant of CFH, in which histidine takes the place of tyrosine at amino acid 

402, was found to increase an individual’s risk of AMD 2‐4 fold in 

heterozygotes and 5‐7 fold in homozygotes. The tyrosine‐histidine 

substitution is purported to affect the heparin and CRP binding site of CFH, 

diminishing its ability to keep the complement cascade in check. Association 

of the Tyr402His variant was found to be strongest for individuals with early 

and neovascular AMD. 

 

Studies in other ethnic groups have not corroborated closely the findings 

from the Caucasian populations. No association was found between the CFH 

Tyr402His polymorphism and Japanese patients with atrophic AMD 259, 

neovascular AMD or disciform scars 260. Additionally, the Tyr402His allele 

was associated with bilateral, but not unilateral early AMD in a US‐based 

Latino/Hispanic population 261. Even within Caucasian populations, disease 

60

risk for the allelic variants has not yet been adequately tested in large 

prospective studies. 

 

More recently, analysis of polymorphisms in the Factor B (FB) and C2 genes 

found two “protective” and one “risk” haplotype 95. BF binds C3b, and its 

cleavage ultimately results in the formation of C3 convertase (C3Bb), while 

C2 is an activator of the classical pathway. The BF and C2 genes are situated 

only 500bp apart within the major histocomaptibility (MHC) class III locus, 

and the gene products have almost identical molecular structures, both 

regulating the production of C3 (the critical complement cascade 

component). Thus it is as yet unclear whether the association with AMD is 

due to the BF or C2 polymorphisms. The authors suggest however, that the 

BF polymorphism may be causal, since one of the protective alleles produces 

a gene product with reduced haemolytic activity, and BF immunoreactivity 

within retina was similar to that of CFH, C3 and the MAC 95. 

 

The genetic evidence appears to implicate the alternative complement 

pathway while earlier immunohistochemical and immunofluorescence 

studies implicated the classical pathway (which is activated by acute phase 

proteins such as β‐amyloid, IgG, CRP, serum amyloid P). As discussed 

earlier, CFH also binds CRP 262 and a recent study provides some clues on the 

way CFH‐CRP interactions may influence the development of AMD. When 

the distribution of CFH protein in the RPE, Bruch’s membrane and choroid 

was assessed in donor eyes with the “at risk” CFH Tyr402His variant, no 

differences were found compared to normal donor eyes 263. However, the 

Tyr402His homozygotes did have significantly more CRP protein deposition 

in the choroidal stroma than normals. Since the Tyr402His variant affects a 

CRP binding site, these findings suggest the associated increased AMD risk 

may be due to failure of CFH to bind and inactivate or remove CRP. 

61

Excessive extracellular CRP deposition would act as a persistent 

inflammatory stimulus, and an activator of the classical complement 

pathway. 

 

Some have suggested that genetic evidence implicating the alternative 

pathway points to the possible involvement of pathogens, such as Chlamydia 

pneumoniae, in disease pathogenesis. There is some evidence that previous 

infection with c.pneumomiae is associated with AMD 264 and AMD 

progression 265, and c.pneumonia is more frequently found in neovascular 

lesions compared to normal eyes 266. Current evidence therefore, suggests 

both the classical and alternative pathways of complement activation may be 

implicated in AMD pathogenesis. 

 

2.5.3 Serum  inflammatory  markers  in  AMD  

A number of population‐based studies and case‐control studies have 

examined the association between serum markers of inflammation and 

AMD. These studies were undertaken partly because of the strong evidence 

implicating serum markers of inflammation, such as CRP and homocysteine, 

in cardiovascular disease (reviewed in 267), and partly because of the evidence 

for acute phase protein deposition in Bruch’s membrane and drusen. 

 

While Smith et al found that serum fibrinogen levels greater than 4.5g/L were 

associated with both neovascular and atrophic late AMD in an Australian 

population‐based study 268, Dasch et al failed to find any association between 

early or late AMD and serum fibrinogen in a German population‐based 

study, once cardiovascular risk factors were adjusted for 65. A small study 

suggests reduced serum leptin, a protein involved in control of inflammation 

and lipid metabolism, was associated with early and advanced AMD 269.  

62

 

Seddon and colleagues found a significant association between CRP and both 

“intermediate” and advanced AMD 67 in the AREDS study, and progression 

to advanced AMD in a cohort of participants with non‐exudative AMD 68. 

Apart from a small case‐control study in which participants with drusen, 

neovascular or atrophic AMD were found to have higher CRP and 

homocysteine levels than controls 270, others have not been able to replicate 

these findings. In the Cardiovascular Health Study, no association between 

CRP and either early 64, or advanced AMD 270 could be found. Dasch and 

colleagues also failed to find an association between CRP and either early or 

advanced AMD in the Muenster Ageing and Retina Study 65. A case‐control 

study of participants from the Beaver Dam population could not find an 

association between prevalent or incident early AMD and several 

inflammatory markers, including CRP, IL‐6, TNFα or amyloid A and 63. Wu 

et al found a small association between serum intercellular adhesion 

molecule‐1 levels and late AMD, but found no association between early or 

advanced AMD and CRP, and interleukin‐6, white cell count (WCC), 

fibrinogen, homocysteine, plasminogen activator inhibitor‐1 or von 

Willebrand factor in the Blue Mountains Eye Study population 70. It may be 

that factors associated with cardiovascular disease have an inverse, or at least 

more complex, association with AMD. Certainly polymorphisms in the ApoE 

(a lipoprotein), ABCA1 (a cholesterol transporter) and TLR4 (a receptor 

important in innate immunity and cholesterol efflux) genes which are 

associated with increased risk of atherosclerosis are protective for AMD 85.  

 

Autoantibodies, found in serum and directed against retinal and other 

proteins, have also been associated with AMD. However, their putative role 

in AMD pathogenesis remains controversial.  

 

63

2 . 6 S E R U M A N T I - R E T I N A L A U T O A N T I B O D I E S I N A M D

2.6.1 Autoantibodies  and  autoimmunity  

Autoimmunity is classically described as the failure of self‐tolerance. The 

ability of the immune system to distinguish “self” from “non‐self” is 

essential to its normal function. Antibodies are produced by B cells as part of 

the acquired (or specific) immune response, after exposure to antigen. 

Antibody binding to the antigen (immune complex formation) activates the 

complement cascade, leading to complement‐mediated lysis of affected cells, 

and recruitment and activation of inflammatory cells (neutrophils and 

monocytes) 271. Autoimmune diseases arise when cells or antibodies of the 

immune system recognise and bind self‐antigens. 

 

Immunoglobulins that recognise self antigens are known as “autoantibodies” 

and are typically considered pathological. They can cause tissue damage in 

two recognised ways.  Autoantibodies may form complexes with circulating 

antigens, which eventually deposit in vessel walls and/or tissues. An 

example of this occurs in systemic lupus erythematosus, whereby 

autoantibodies bound to DNA, nucleoproteins and other proteins deposit to 

cause nephritis, disseminated vasculitis and arthritis.  Autoantibodies can 

also directly bind antigens in tissues to cause damage, such as when anti‐

type IV collagen antibodies cause pnuemonitis and glomerulonephritis in 

Goodpasture’s syndrome. Both mechanisms lead to the same downstream 

consequences, i.e. cell lysis, inflammatory cell recruitment and opsonisation 

and phagocytosis of affected cells.  

 

Direct binding to a tissue antigen can also alter the functional properties of a 

target protein. In myasthenia gravis, autoantibodies cause paralysis by 

binding acetylcholine receptors, preventing neurotransmission at muscle 

64

endplates. In Grave’s disease, autoantibodies bind and activate receptors for 

thyroid stimulating hormone, leading to thyrotoxicosis. 

 

More recently however, autoantibodies have been found in association with 

a number of degenerative diseases, such as Alzheimer’s disease 272 and 

atherosclerosis 273. In the strictest definition of an autoimmune disease, the 

following criteria, postulated by Witebsky 274 should be satisfied: (i) presence 

of circulating autoantibodies; (ii) identification of the corresponding 

antigen(s); (iii) induction of autoreactivity against these antigens in an 

experimental model, leading to (iv) tissue pathology similar to the human 

disease; and (v) initiation of disease following adoptive transfer of the self‐

reactive antibodies or lymphocytes. Autoantibodies found in association 

with degenerative diseases do not of course, fulfill these criteria. 

Degenerative diseases cannot thus be considered primary autoimmune 

diseases. However, the findings do raise questions about definitions of 

autoimmunity, and about the involvement of the immune system in the 

setting of chronic degenerative disease.  

 

Autoantibodies have also been found in association with AMD. Before 

reviewing this evidence, autoantibody associations with several other ocular 

diseases will be discussed.  

 

2.6.2 Autoantibodies  and  ocular  disease  

2 . 6 . 2 . 1 An t i ‐ r e c o v e r i n   a u t o a n t i b o d i e s ,  CAR   a n d  a u t o immun e   r e t i n o p a t h y  

Probably the best known autoantibody in ocular disease is the anti‐recoverin 

autoantibody, which is well described in cancer‐associated retinopathy 

(CAR). This is a paraneoplastic syndrome in which autoantibodies against 

the 23kD protein recoverin cause unexplained vision loss in patients with 

65

diagnosed or occult tumours 275, 276, primarily small cell lung cancers. 

Recoverin is a photoreceptor protein involved in the visual cycle. Tumour 

expression of recoverin was thought to elicit the production of anti‐recoverin 

antibodies which cross‐reacted with those found in photoreceptors, causing 

cell death 277‐279. Typically, CAR patients have profoundly abnormal 

electroretinograms. 

 

Anti‐recoverin autoantibodies were thus thought to be specific for CAR. 

However, later studies showed that anti‐recoverin autoantibodies could be 

found in other ocular diseases, and that autoantibodies against other proteins 

were found in CAR. Whitcup et al found anti‐recoverin autoantibodies in 

patients without cancers but with symptoms clinically similar to CAR 280. 

This entity became recognised as “recoverin‐associated retinopathy” or 

“autoimmune retinopathy” 281. Anti‐recoverin autoantibodies were also 

found in patients with retinitis pigmentosa, a hereditary retinal degenerative 

disorder 282. CAR patients were later found to have autoantibodies against 

enolase 283, 284 and heat shock protein 70 (hsp70) 285 (anti‐hsp 70 autoantibodies 

induced CAR‐like electroretinogram changes when were injected into the 

vitreous of rats 286). Up to 15 or more autoantigens have now been described 

in CAR 287. 

 

Melanoma‐associated retinopathy (MAR) is another paraneoplastic 

syndrome whereby tumour expression of aberrant proteins leads to the 

development of autoantibodies against retinal antigens 287. ERG changes 

differ to that of CAR, although multiple autoantigens have been reported, 

including a 35kD Muller cell antigen and a 22kD neuronal antigen 287, as well 

as putative antigens retinal transducin, rhodopsin, visual mitofilin and titin 

288. 

 

66

2 . 6 . 2 . 2 R e t i n a l   d e g e n e r a t i o n s ,   a u t o immun e   r e t i n o p a t h y  a n d   g l a u c om a  

Immunohistochemical studies have shown increased serum reactivity 

against normal human retinae for a number of retinal diseases, including 

retinitis pigmentosa, diabetic retinopathy 289, 290 and cystoid macular oedema 

291. Autoantibodies against enolase were found to be associated with 

glaucoma 292‐294 and autoimmune retinopathy 295. More recent studies of 

serum from glaucoma patients have also revealed complex patterns of 

reactivity against retinal and optic nerve antigens 296, 297. These studies were 

the first to show that the same complex reactivities were present in up to 

100% of normal controls.  

 

It is thus increasingly recognised that the presence of serum autoantibodies is 

not necessarily a sign of pathological autoimmunity. However, the 

significance of autoantibody associations in ocular diseases is still being 

clarified. 

 

2.6.3 Autoantibodies  in  AMD  

Using direct immunofluorescence, Chant and colleagues noted in 1987 298, 

that IgM autoantibodies from two patients with “macular degeneration” 

bound to human retinal tissue. A larger study by Penfold et al 299 showed that 

autoantibody binding to human tissue was present in 20% of normal 

controls, 29% of patients with geographic atrophy, 52% of patients with 

disciform lesions, 62% of patients with drusen and 78% of patients with 

pigmentary disturbance. The autoantibody staining pattern on retinal tissue 

in this study resembled that of glial acidic fibrillary protein (GFAP), a 

cytoskeletal protein found in neurons, astrocytes and Muller cells. By 

contrast, a later study 300 found that 47% of patients with macular 

degeneration (including patients with neovascular AMD, atrophic AMD and 

67

bilateral drusen) had autoantibodies directed mainly to photoreceptor outer 

segments. Western blot experiments by the same group showed that the 

autoantibodies reacted with a protein between 58‐62kD, and cross‐reacted 

with a bovine neurofilament protein. In 1993, Chen and co‐workers reported 

that serum anti‐retinal autoantibodies detected by western blotting were 

found in 66% of patients with “AMD”, compared with 18% of controls. The 

autoantibodies reacted with peptides and proteins occurring in five different 

molecular weight bands (Table 2.6‐1).  

 

Gu and colleagues used ELISA to test autoantibody binding to 

carboxyethylpyrrole protein (CEP) adducts 301, a product of lipid 

peroxidation which, although not specific to retina, was identified as a 

drusen component by earlier proteomic studies 202. They found that 53% of 

“AMD” patients (compared to 21% of controls) had high titres of anti‐CEP 

autoantibodies. Patel et al correlated immunohistochemical staining patterns 

of serum autoantibodies with AMD disease classification 302. Autoantibodies 

reacted with multiple retinal elements, including the inner and outer nuclear 

layers, the inner and outer plexiform layers and the ganglion cell layer (with 

some autoantibodies targeting membranes, others nucleoli and still others 

nuclear membranes or photoreceptor inner segments). Autoantibodies also 

reacted with RPE, Bruch’s membrane and choroid. The highest proportion of 

autoantibody reactivity was seen in patients with large drusen and 

pigmentary abnormalities. 

 

Joachim et al recently found complex anti‐retinal autoantibody binding 

patterns on western blots in both control and neovascular AMD sera 303. 

Using statistical software to discriminate western blot densitometry 

differences, AMD sera was found to have densitometry peaks at 46 and 

52kD, and troughs at 18 and 36kD. Tandem liquid choromatography/mass 

68

spectrometry was used by this author group to identify the 18kD antigen as 

α‐crystallin, the 46kD antigen as α‐enolase and the 52kD antigen as GFAP.  

 

Interpretation of these studies is complicated by several factors: (i) the 

different detection methods used (immunofluorescence, western blotting and 

ELISA); (ii) the different serum dilutions assayed (1:20 – 1:1000); and (iii) the 

various clinical AMD phenotypes (some poorly defined) involved in 

different studies (summarised in Table 2.6‐1). Most frustratingly, there 

appears to be not one or two, but many, retinal antigens implicated. Only a 

few of these are characterised or partially characterised 300, 301, 303. Many, if not 

all, of the antibodies/antigens so far identified have not been shown to be 

specific to AMD. Most perplexing of all, the very same autoantibodies are 

found in a large percentage of (and in some cases, all) normal control sera, 

making it difficult to argue that they are pathological. 

 

One explanation is that only high autoantibody titres are associated with 

disease.  The evidence for anti‐CEP autoantibodies appears to support this 

view 301. However, Joachim et al found that certain autoantibodies were 

found in significantly lower amounts (based on western blot densitometry) 

in AMD sera compared to controls 303. This observation can only be explained 

by accepting that a least some of the autoantibodies detected are naturally 

occurring autoantibodies, or “natural autoantibodies”. 

 

Natural autoantibodies are present in all normal individuals 304, 305. They are 

encoded by germline B cell genes, and are produced in the absence of 

immunisation with antigen 306. Thus, they are considered part of the innate 

immune system and react with a large number of self‐epitopes 307. An 

individual’s natural autoantibody repertoire appears to be stable over time 

308.  

69

 

Some natural autoantibodies recognise highly conserved pathogen‐

associated molecular patterns, such as phosphorylcholine, which allow them 

to neutralise invading pathogens rapidly. However they also react with 

cytoskeletal proteins, nuclear proteins and DNA 309, suggesting that they are 

involved in the removal of apoptotic cells, cellular debris and other altered 

self antigens. In fact, immunoadsorbent assays show that the majority of 

antibodies in human sera are self‐reactive 310. Mono‐reactive, highly specific 

antibodies generated by adaptive immunity appear to represent a very small 

proportion of total serum immunoglobulin. This is consistent with the 

emerging view that innate immunity evolved not only as first line defence 

against pathogens, but for the equally critical role of “housekeeping”, or 

keeping the extracellular compartment “debris‐free”.

70

Table 2‐3 Autoantibodies in AMD: summary of studies 

 Year Authors AMD phenotype Method(s) Serum dilution Autoantibody Ig

classAutoantibody targets % Postive

(disease sera)% Positive (control

sera)

1985 Chant et al "macular degeneration" (n=2) Direct immunofluorescence using human retinae not specified IgG, IgM Rod outer segments [1] 50% 2%

1990 Penfold et al

Drusen (n=13) Pigmentary disturbance (n=40) Geographic atrophy (n=21) Disciform scar (n=44)

Direct immunofluorescence on human, rat and mouse

retinae1:10 not specified Staining similar to GFAP labelling,

targeting predominantly astrocytes 29-78% [2] 20%

Indirect immunofluorescence on human and monkey

retinae

1:2 1:4 IgG

Photoreceptor outer segments (prominent); outer plexiform and

outer nuclear layers (weak)

Western blotting using human, bovine and monkey

retinal homogenates

1:200 1:1000 IgG

Between 58-62kD. Cross reaction with 68kD bovine neurofilament

protein

1993 Chen et al "AMD" (n=41) Western blotting Not available [3] Not available 28-32kD, 38-42kD, 48-52kD, 62-65kD or 110-130kD 66% 18%

ELISA using synthesised carboxyethylpyrrole (CEP)

protein adducts [4]1:20 IgG CEP adducts 53% 21% [5]

Immunohistochemistry (to localise CEP in mouse and

human retinae)

CEP localised strongly to photoreceptor outer segments and RPE and weakly to inner plexiform

layer

Indirect immunofluorescence using murine retinal tissue

1:10 1:100 IgG

Choroid, Bruch's membrane, RPE, photoreceptors, inner nuclear layer,

ganglion cell layer83-94% [6] 9%

Western blotting using murine retinal homogenates 1:500 IgG 28-49kD

Western blotting using bovine retinal homogenates 1:40 IgG Complex staining, multiple

antigens in 10-180kD range 100% 100%

Liquid choromatography tandem mass spectrometry

alpha-crystallin (18kD); alpha-enolase (46kD); GFAP (52kD)

Joachim et al 2006

"weak or none"

2003 Gu et al

1991 Gurne et al

Wet AMD (n=39)

47%

2005 Patel et al

Bilateral drusen (n=5) Atrophic AMD (n=6) Exudative AMD (n=19)

"AMD" (n=19)

ARM (n=64) CNV (n=51)

 

71

Table 2.6.1. Autoantibodies in AMD: summary of studies 

[1] It is not clear whether this was the staining pattern for the two macular degeneration 

patients or for the retinitis pigmentosa patients in this study 

[2] Highest for pigmentary disturbance, lowest for geographic atrophy 

[3] Chinese language journal 

[4] Product of lipid peroxidation 

[5] All controls had anti‐CEP autoantibodies. These percentages indicate high titre anti‐CEP 

autoantibodies 

[6] highest for bilateral drusen  

 

72

In the context of AMD pathology, it is reasonable to postulate that the 

presence of abnormal extracellular debris (in the form of BLamD, BLinD and 

soft drusen), and cell signalling by damaged RPE, may lead to an increased 

production of natural autoantibodies, in tandem with other opsonising 

molecules of the innate immune system.  

 

The antigenic targets so far characterised for AMD seem to support this view. 

GFAP is a cytoskeletal protein normally expressed by astrocytes, and by 

Muller cells after retinal injury as part of the neuroprotective gliosis reaction 

Astrocyte and Muller cell GFAP expression has been shown to increase with 

age, and particularly in the presence of drusen 311. Alpha‐crytallin is a 

member of the small heat shock protein family, with molecular chaperone‐

like properties that prevent the precipitation of denatured proteins 312. Alpha‐

crystallin was one of the most frequently found proteins in drusen 202 and 

appears to accumulate in Bruch’s membrane and the choroid in AMD eyes 

313. Alpha‐enolase is an important glycolytic enzyme, as well as a heat shock 

protein, produced in response to hypoxic stress 314. Interestingly, higher titres 

of autoantibodies to α‐enolase are found in a number of autoimmune, 

degenerative and inflammatory conditions 315. And, as already discussed, 

CEP adducts are products of lipid peroxidation. The extracellular lipids 

found in drusen are vulnerable to oxidation, and CEP adducts have been 

found in drusen 202.  

 

Immunoglobulins themselves have also been found in drusen 191, 251, 253, 

Bruch’s membrane 251 and the abnormal RPE overlying drusen 191 in AMD 

eyes. If they are indeed natural autoantibodies, they may have a protective 

role in the removal of extracellular debris. Natural autoantibody‐mediated 

clearance of debris may be particularly relevant under pathological 

conditions that involve accumulation of stress‐induced structures, such as 

73

atherosclerosis, where autoantibodies against heat shock proteins have been 

shown to prevent plaque formation (reviewed in 213). 

 

However, the setting of rapidly accumulating extracellular debris and an 

altered immune microenvironment may also favour the development of 

pathological antibodies. There is some evidence that pathological 

autoantibodies (such as rheumatoid factor) may derive from the natural 

autoantibody pool 316. The difficulty remains in determining which 

autoantibodies are pathological, and which are protective. One way is to 

examine whether there is “subclass restriction”, since restriction of 

autoantibodies to one IgG subclass is a feature of pathological autoimmunity 

317. Another way to determine whether autoantibodies are pathological is to 

determine their association with disease progression. Chapter 4 summarises 

preliminary studies that examine the autoantibody profile in normal controls 

and in individuals with early, neovascular and atrophic AMD. Autoantibody 

association with disease progression in early and neovascular AMD is also 

examined. 

 

74

2 . 7 T H E S I S A I M S

The past two decades have brought valuable insights to AMD disease 

pathogenesis. However, many questions remain. The definition of AMD 

phenotypes, particularly early in the disease process, requires clarification. 

The first part of Chapter 3 is a clinicopathological study of eyes with early 

AMD, which sought to answer the following questions: 

 

(i) What is the histopathological threshold that distinguishes normal 

ageing from early AMD? 

(ii) How do BLamD and membranous debris influence disease 

progression and what are their clinical correlates? 

(iii) Is there clinicopathological evidence for distinct early AMD 

phenotypes? 

 

An emerging theme in the pathogenesis of AMD is the contribution of 

macrophages to the maintenance of choroidal/Bruch’s membrane health. The 

second part of Chapter 3 examines the influence of BLamD and membranous 

debris accumulation on both resident choroidal macrophages and Bruch’s 

membrane macrophages. The following questions were addressed: 

 

(i) In what histopathological context are Bruch’s membrane 

macrophages first found? 

(ii) What is the clinical fundus appearance when Bruch’s membrane 

macrophages are present? 

(iii) What is relationship between Bruch’s membrane macrophages and 

subclinical neovascularisation? 

(iv) Does the progressive accumulation of BLamD and membranous 

debris alter the immunophenotype of Bruch’s membrane 

macrophages and/or resident choroidal macrophages? 

75

 

A further emerging theme is the recognition of the significant role 

inflammation plays in AMD pathogenesis. While there is growing evidence 

implicating altered innate immunity in AMD, the relationship between anti‐

retinal autoantibodies and AMD remains poorly defined. Chapter 4 

summarises preliminary studies which addressed the following questions: 

 

(i) Does the anti‐retinal autoantibody profile differ significantly 

between normal individuals and those with early AMD, 

neovascular AMD or geographic atrophy? 

(ii) Can baseline anti‐retinal autoantibodies predict progression to 

advanced AMD in individuals with early AMD? 

(iii) Can baseline anti‐retinal autoantibodies predict vision loss in 

individuals with neovascular AMD? 

76

 

 

H I S T O P A T H O L O G I C A L   S T U D I E S  

3

77

3 . 1 R E L A T I O N S H I P O F B A S A L L A M I N A R D E P O S I T A N D

M E M B R A N O U S D E B R I S T O T H E C L I N I C A L P R E S E N T A T I O N O F

E A R L Y A G E - R E L A T E D M A C U L A R D E G E N E R A T I O N

3.1.1 Introduction  

The development of interventional and preventative strategies in AMD will 

depend on an understanding of the early stages of the disease. It is important, 

therefore, to describe the evolution of the two deposits pathologically significant 

to AMD, BLamD and membranous debris, in order to better understand the 

threshold at which aging becomes AMD and to correlate their further 

accumulation with changes in fundus appearance and visual acuity. 

 

The basal deposits are not directly visible on fundoscopy and hence their 

relationship to the clinical evolution of AMD is not well documented.  The present 

study reviews a clinicopathologic series of 132 eyes in which diffuse basal deposits 

had been identified previously 10. Although membranous debris in the BLinD can 

be demonstrated only by electron microscopy (EM), the focal basal mounds and 

soft drusen can be identified by light microscopy, so that the respective influence 

each exerts on the progress of degeneration can also be assessed in histologic 

specimens. The type and thickness of BLamD are correlated with the sites of 

membranous debris accumulation and with the clinical findings. The threshold at 

which aging becomes early AMD is discussed.   

 

 

78

3.1.2 Methods  

3 . 1 . 2 . 1 P a t i e n t s   a n d  Ey e s  

In earlier studies a large clinicopathologic collection of aged eyes had been 

divided into histopathologic groups according to the appearance of the BLamD 

under the macula 10.  Briefly, eyes with no BLamD (group I) and patchy BLamD 

(group II) were considered normal.  The eyes chosen for the present study were 

those with a thin (group III) or thick (group IV) continuous layer of BLamD, 

considered to represent the pathologic changes preceding advanced AMD (groups 

V and VI).  A total of 132 eyes belonging to 75 patients (69 males and 6 females) 

aged 67 to 97 years at death (mean 82 +/‐8 years) met the inclusion criteria (Table 

3.1.1). 

 

All the patients had been examined clinically, and follow up ranged from 0 to 120 

months (mean 24 +/‐32 months).  Examination included best corrected visual 

acuity, direct fundoscopy and, unless unobtainable, fundus photography using the 

Zeiss 30° fundus camera. Fluorescein angiography was carried out where 

appropriate.  Eyes in which the fundus could not be adequately visualized, or 

demonstrated other pathology, were excluded.  The last examination ranged from 

two weeks to 75 months prior to death (mean 19 +/‐17 months).    

 

The study was conducted in keeping with the tenets of the Declaration of Helsinki 

and approved by the University of New South Wales Human Research Ethics 

Committee. Written consent was obtained from all patients. 

 

 

3 . 1 . 2 . 2 H i s t o p a t h o l o g i c a l  Me t h o d s   a n d  De f i n i t i o n s  

A review of archival material, including slides of 107 eyes prepared for light 

microscopy (LM) and electronmicrographs of 25 eyes, was conducted. Preparation 

79

of eye tissue is described in detail elsewhere 10, 179. Briefly, for LM, serial sections 

8μm thick were cut horizontally through the disc and macula and every 10th 

section stained and examined.  Three sections closest to the centre of the fovea and 

80μm apart were examined with a Leitz Dialux microscope. Objectives used were 

the APO 25x (NA=0.65) and PL APO 40x (NA‐0.75).  The microscope was 

calibrated using a standard 0.01mm objective micrometer graticule (Olympus, 

Japan) and measurements were obtained with an eyepiece graticule, one division 

equaling 2.8μm with the 40x objective and 4.5μm with the 25x objective.  

 

Histologically BLamD was distinguished most readily with the picro‐Mallory 

method, an early type showing faint antero‐posterior striations and staining blue, 

while a later type was hyalinized and stained red.  These staining characteristics 

are the result of the acid fuchsin (red staining) and aniline blue (blue staining) 

components of the picro‐Mallory stain. Acid fuchsin is a smaller molecule than 

aniline blue. Early type BLamD has a looser arrangement of molecules than late 

type, allowing the smaller acid fuchsin to wash away while trapping aniline blue. 

Late type BLamD is composed of more condensed material, imperveant to the 

large aniline blue molecule while trapping acid fuchsin. BLamD was then graded 

according to 2 parameters: thickness and staining characteristics.  Maximum 

BLamD thickness was recorded as thin if it was less than half the height of the 

normal RPE (<7μm) and thick if greater (>7μm) 318.  BLamD staining was graded in 

the following degree of progression:  i) blue‐staining early type only (Figure 3.1‐

1A); ii) patchy late BLamD appearing either as small, rounded inclusions 

approximately 4μm in diameter lying within the early BLamD (Figure 3.1‐1C), or 

as larger nodular elevations occurring singly or in rows on the internal surface of 

the early BLamD, each nodule being overlain by a single RPE cell (Figure 3.1‐1D);   

(iii) continuous late BLamD comprising segments ≥ 250μm in length (Figure 3.1‐

2B,C). On electron microscopy (EM) the earliest form of BLamD was fibrillar and 

was continuous with the original basement membrane of the RPE, but the 

80

predominant constituent of early BLamD was the banded form.  This consists 

primarily of long‐spacing collagen (Figure 3.1‐1B) accounting for the striations 

seen on light microscopy. Late BLamD had a more condensed structure and 

appeared to be produced in waves as the overlying RPE retracted (Figure 3.1‐2 

inset). 

 

Membranous debris was defined on EM as coiled membranes with a trilaminar 

appearance (Figure 3.1‐3) and was assessed by EM in 25 eyes (from 18 patients, 

mean age 79 +/‐7.14 years). The membranes often had a vesicular outline and may 

have contained lipids lost during processing 182, so that the term “membranous” is 

used herein as an ultrastructural description only. BLinD was defined as a layer of 

this membranous debris lying between the RPE basement membrane and the 

inner collagenous zone of Bruch’s membrane 126, 176, 179. The maximum number of 

layers of BLinD was recorded for each eye examined by EM.  Basal mounds 

(Figure 3.1‐4) were defined on EM as pockets of membranous debris 176 lying 

internal to the RPE basement membrane and early BLamD.  In histologic sections, 

they appeared a washed‐out pale blue with Picro‐Mallory staining, were at least 

half the height of an RPE cell, and were mostly 1‐2 RPE cells wide. For each eye 

the maximum number of mounds in any one of the 3 sections through the macula 

was recorded. 

 

Soft drusen were defined as focal accumulations of the BLinD with sloping 

margins measuring over half the height of the normal RPE, up to 350μm wide 

when confluent (Figure 3.1‐4), and up to 500μm wide in two cases with drusenoid 

detachment. Like basal mounds they stain blue with the picro‐Mallory method, 

but unlike basal mounds, soft drusen lay below the RPE basement membrane. 

Drusen contents were recorded as predominantly membranous or predominantly 

granular, those with granular contents being regarded as regressing.  

 

81

Hard drusen (or “nodular drusen” 126) had a globular, hyalinised appearance and 

stained red with picro‐Mallory method. A few hard drusen are not considered 

part of AMD. One to two per section were seen in 85 study eyes.  

 

Histologic abnormalities of the RPE at the macula were graded as mild, moderate 

or severe depending on the degree of irregularity, hypertrophy and 

hyperpigmentation, or attenuation. 

 

3 . 1 . 2 . 3 C l i n i c a l  P a r am e t e r s  

The best corrected visual acuity was converted to logMar for statistical purposes. 

The fundoscopic appearance of the macula was graded as: (i) normal, which 

included a few (< 5) small (<63μm) drusen; (ii) multiple small drusen (<63μm) 

involving an area >125μm; (iii) intermediate drusen (63 – 124μm) with or without 

pigment; (iv) large drusen ( ≥125μm) with or without pigment; or (v) pigment 

abnormalities  alone. 

 

3 . 1 . 2 . 4 S t a t i s t i c a l  Me t h o d s  

Statistics were performed using SPSS for Windows (v15.0; SPSS Inc, Chicago, IL, 

USA). Contingency tables of histopathological versus clinical parameters were 

evaluated by the χ2 test. Comparison of mean age and visual acuities was 

evaluated using the student’s t‐test. Correlations between BLamD type, BLamD 

thickness, and histopathologic RPE abnormalities were performed using 

Spearman’s correlation for non‐parametric data. A p ≤ 0.05 was considered 

statistically significant.  

 

82

3.1.3 Results  

The clinical and histopathologic features of the study eyes are summarised in 

Table 1.  

3 . 1 . 3 . 1 B a s a l   l am i n a r   d e p o s i t   a n d  RPE   c h a n g e s  

The RPE was not normal even in eyes in which BLamD was exclusively of the 

early type, exhibiting a loss of uniformity and increase in pigmentation (Figure 

3.1‐1A).  However, it was the amount of late type BLamD that correlated 

positively with increasingly severe histological RPE abnormalities (r = 0.435, p< 

0.001), first appearing as patchy late BLamD in the form of inclusions (Figure 3.1‐

1C) and then nodules (or “nodular excrescences” 319) (Figure 3.1‐1D). In the 

presence of severe RPE abnormality, late BLamD formed an unbroken layer 

exceeding 250μm in length (Figure 3.1‐2B&C) – termed “continuous late BLamD” 

here and also described as “diffuse thickening of  the internal aspect of Bruch’s 

membrane” 204. The late form always lay on or near the internal aspect of the early 

type, closest to the base of the retracting RPE.  

 

BLamD in Group III eyes formed a thin layer, ranging in thickness from 1.0 – 

7.0μm (3.2 +/‐ 1.6μm) and in 66 of 95 eyes (69%), was exclusively of the early type.  

Patchy late BLamD was present in the remaining 29 Group III eyes (31%).  By 

contrast, continuous late BLamD was found in all 37 group IV eyes (100%), and 

ranged in thickness from 8 – 25μm (10.7 +/‐ 4.2μm).  Overall, there was a strong 

positive correlation between BLamD thickness and the proportion of late type 

BLamD (r = 0.650, p < 0.001) (Table 3.1‐2). 

83

Table 3‐1 Clinical and histopathological characteristics of study eyes 

 

III IV

(thin continous BLamD) (thick continuous BLamD)Number of eyes/patients 95/53 37/22

Mean +/- SD 81 +/-8 84 +/- 6

Range 67 - 97 74 - 92

Sex M/F 49/4 20/2

Mean +/- SD 21 +/- 18 12 +/- 8

Range 0 - 36 1 - 28

Mean +/- SD 23 +/- 32 28 +/- 31

Range 0 - 120 0 - 99

Mean +/- SD 0.276 +/-0.228 0.611 +/- 0.401

Range 0.000 - 1.000 0.000 - 1.300

Normal 50 0

Pigment Only 16 20

Drusen* Only 18 0

Drusen* + Pigment 11 17

Number of eyes examined by EM 21 4

BLamD thickness (microns) 3.2 +/-1.6 10.7 +/- 4.2

Early Only 66 0

Patchy late 29 0

Continuous Late 0 37

*Clinical drusen defined as intermediate or large drusen

Visual Acuity (logMar)

Fundus Appearance

BLamD type

Histopathological Group

Age at death (years)

Interval between last visit and death (months)

Total clinical follow up

84

Figure 3.1‐1  Basal Laminar Deposit 

 

 

 

85

Figure 3.1‐1  Basal Laminar Deposit 

 

(A) Early type BLamD forming a blue‐staining continuous layer beneath the RPE 

(asterisk).   Note it is less than half the height of an RPE cell.  Fundus at age 67 had shown 

a few small soft drusen. Patient died aged 71. Bar marker 25μm.   

 

(B) Electron micrograph illustrating changes between RPE and choriocapillaris (CC).   

Early BLamD (bracket) lies internal to RPE basement membrane (vertical arrows) and 

comprises mostly banded material resembling long‐spacing collagen.  Other phenotypes 

comprise a darker and denser material with an enveloping rim of pale fibrillar material.   

Between the clumps of BLamD lie membrane fragments (horizontal arrow) that also form 

a layer external to the basement membrane, the basal linear deposit (asterisk), and can be 

traced even into Bruch’s membrane.   Bar marker 1μm.  

 

(C) Early type BLamD containing small hyalinised clumps of late type (arrows).  These 

stain red with picro‐Mallory and are found close to the RPE.   Fundus at age 75 had 

shown early focal hyperpigmentation related to small soft drusen, patient died age 76. Bar 

marker 20μm.  

 

(D) Further build up of late BLamD forms nodular excrescences on internal surface of 

early type, each nodule overlain by single RPE cell.  Fundus had shown pigment changes 

and small soft distinct drusen 4 years before death at age 85.Bar marker 50μm     

 

86

Figure 3.1‐2  Continuous Late Basal Laminar Deposit 

 

87

Figure 3.1‐2.  Continuous Late Basal Laminar Deposit 

 

(A) Eye of 79‐year‐old man photographed 2 years before death, showing ring of pigment 

clumps around foveal perimeter (arrow).  

 

(B). Section through fovea of eye illustrated in (A), showing thick layer of late type 

BLamD. Pigment clumps in fundus correspond to large, hyperpigmented RPE cells 

(arrow). 

Bar marker 200μm    Picro‐Mallory stain. 

 

(C). Higher magnification of (B).  A thick confluent layer of late BLamD lies on internal 

surface of early type.   

Bar marker 30μm   Picro‐Mallory stain 

 

INSET.  Electron micrograph of late type, showing amorphous structure apparently laid 

down in waves as grossly abnormal RPE retracts from Bruch’s membrane.  

 Magnification x 1200.  

88

Figure 3.1‐3  High magnification membranous debris 

 

 

 

Electron micrograph of membranous debris (approx. X31 000) in the eye of an 81‐year‐old 

woman with normal fundus and 20/30 vision.  Higher magnification (inset) shows two 

dark laminae enclosing a single electron lucent lamina (arrow), giving rise to a 

ʺtrilaminarʺ appearance (approx. X 100 000). 

89

 Figure 3.1‐4   Basal mounds 

 

90

Figure 3.1‐4 Basal mounds 

 

(A, B, C) Section through macula of clinically normal eye of 79‐year‐old man.  Thin 

BLamD (arrowheads) contains several basal mounds that can be recognized histologically 

as unstained spaces (arrows).  

Bar markers A 60μm, B 50μm, C 50μm    Picro‐Mallory stain 

 

(D) Semithin section from eye of 80‐year‐old man with basal mounds (asterisk). Basal 

linear deposit can be recognized as a narrow interval beneath the RPE and BLamD 

(arrow). 

Bar marker 30μm.  Methylene blue and basic fuchsin.  

 

E) Electron micrograph of basal mound internal to RPE basement membrane (arrows).  

Patient aged 83, fundus had shown small drusen.  Asterisk = BLamD.  Bar marker 5μm 

91

3 . 1 . 3 . 2 BL amD   –   c l i n i c a l   c o r r e l a t i o n s  

Clinically, 41 of 66 eyes (62%) with early BLamD had a normal fundus at the last 

clinical examination.  Eyes with early BLamD alone were 10.4 times (95% CI 4.4 – 

24.6, p < 0.001) more likely to have a normal fundus than eyes showing any late 

BLamD, clinical pigment changes being present in all those in which late BLamD 

was continuous. Only 10 eyes had clinical pigment changes without evidence of 

late BLamD, and 4 of these eyes were subsequently reclassified as adult vitelliform 

lesions. Increasing formation of late BLamD was associated with poorer vision, the 

mean logMar visual acuity for eyes with continuous late BLamD being 0.335 units 

worse than the other eyes (95% CI 0.194 – 0.477, p < 0.001). Continuous late 

BLamD also occurred in eyes that were on average 3 years older (95% CI 0.3 – 6 

years, p = 0.013) than eyes with early BLamD (Table 3.1‐2). 

 

3 . 1 . 3 . 3 Memb r a n o u s   d e b r i s ‐   l o c a l i z a t i o n   a n d   c o r r e l a t i o n  w i t h  BL amD  

Coiled membrane fragments were found at several levels reflecting their 

presumed transit, i.e., blebbing from the basolateral RPE surface, scattered within 

early BLamD, traversing the RPE basement membrane to form BLinD, and in the 

inner and outer collagenous layers of Bruch’s membrane (Figure 3.1‐1B).  BLinD 

was present in all eyes examined by EM and ranged from 2 to 11 layers in 

maximum thickness. 

 

A greater quantity of debris formed basal mounds and soft drusen (Figure 3.1‐5).  

Since basal mounds were found only in the presence of BLinD, and since they can 

be recognized in histological sections, the mounds were considered a surrogate 

marker for the presence of BLinD at the light microscopic level. Membranous 

debris accumulation was limited to basal mounds in 44 eyes while in 50 eyes it 

extended to soft drusen formation.  Although basal mounds were seen in the 

absence of soft drusen, soft drusen never occurred in the absence of basal mounds.  

92

 

Basal mounds increased in number as early type BLamD thickened, but then 

plateaued with the formation of late BLamD.  On EM there was also loss of some 

of their membranous contents.  Additionally, soft drusen in eyes with continuous 

late BLamD were predominantly of the granular type (12/15, 80%).  This gradual 

reduction in membranous debris mirrored the progressive degeneration of the 

RPE and fallout of photoreceptors. 

 

3 . 1 . 3 . 4 Memb r a n o u s   d e b r i s   –   c l i n i c a l   c o r r e l a t i o n s  

Although histopathologically, soft drusen as small as 20μm were found, they 

never occurred in the absence of larger drusen visible clinically. Thus, 

histopathological soft drusen correlated very well with clinically observed 

intermediate and large drusen (r = 0.953, p < 0.001). Only in 4 eyes (2 patients) 

were soft drusen (intermediate‐sized) found on histological examination when the 

fundus was clinically normal.  The interval between last examination and death 

was 5 and 3 years in these cases. There were also 5 eyes from 3 patients with 

multiple small drusen clinically, that were found to be soft drusen on 

histopathology.  

 

In group III, the fundus appeared normal in 28 of 38 eyes (74%) in which 

membranous debris was limited to BLinD, confirming that BLinD in conjunction 

with early BLamD represents threshold AMD.  Basal mounds did not appear until 

early BLamD had thickened sufficiently, indicating that membranous debris and 

early BLamD continue to develop together.  However, in 18 of 24 (75%) of Group 

III eyes with basal mounds alone, the fundus remained normal. It was not until 

patchy late BLamD appeared that the majority of fundi exhibited abnormality.  

 

In Group IV, all eyes had continuous late BLamD and there was little further 

increase in membranous debris.  In eyes in which the debris remained confined to 

93

basal mounds, the mean segment length of late‐continuous BLamD was 413 μm 

longer (95% CI 87 – 740μm, p = 0.015) than in eyes with soft drusen. These eyes 

belonged to patients who were on average 6 years older (95% CI 2 – 9 years, p< 

0.001) with poorer visual acuities (mean difference 0.402 logMar units; 95% CI 

0.167 – 0.637, p< 0.001). Table 3.1‐3 summarizes the clinical findings of eyes in 

groups III and IV according to the amount of membranous debris present.   

 

94

Figure 3.1‐5  Membranous debris: basal mounds and soft drusen 

 

 

 

 

 

 

   

95

Figure 3.1‐5 Membranous drusen 

 

(A) Semithin section from 75‐year‐old man, with clinical large drusen.  Mounds of 

membranous debris (basal mounds) (m) are seen above BLamD (asterisk).  Basal linear 

deposit has built up into soft drusen (d). 

Bar marker 100μm.  Methylene blue and basic fuchsin.   

 

(B) Electron micrograph of subclinical soft druse from eye illustrated in (A) above, 

demonstrating membranous contents.  Asterisk indicates late BLamD overlying early 

BLamD.   

Bar marker 5μm. 

 

(C) Fundus of fellow eye of same patient at age 71, showing soft drusen measuring up to 2 

vein widths (250μm).   

 

 

96

 Table 3‐2   Basal laminar deposit – clinical and histopathological correlations 

 

 

Early Only Patchy Late Continuous Late

No. of Eyes 66 29 37*Clinical drusen defined as intermediate or large drusen**Demonstrated on EM

0.0%Drusen* only 16.7% 24.1%

BLamD

Pigment changes only

Soft Drusen

Mean Visual Acuity (logMar)

RPE Abnormalities

Membranous Debris

Normal

Drusen* with pigment changes

Mean Age (years)

62.1%

Membranous contents Contents becoming increasingly granular

Pathological

Fundus Appearance

Clinical

31.0% 0.0%

15.2% 20.7% 54.1%

BLinD** (no. layers)

Basal Mounds 1.7 +/- 2.5 3.1 +/- 1.92.7 +/- 1.1

Mild Moderate Severe

7.0 +/- 2.3 6.0 +/-0.0 5.8 +/- 2.1

0.275 +/- 0.242 0.280 +/- 0.197 0.611 +/- 0.401

6.1% 24.1% 45.9%

80 +/-8 82 +/-8 84 +/-6

 

97

 Table 3‐3  Membranous debris – clinical and histopathological correlations 

 

 

Membranous Debris Number of eyes

BLamD thickness (microns)

BLamD Mean Age (years)

Mean VA (logMar)

Approx Snellen

EquivalentNormal 28Pigment Only 10Drusen 0Drusen + Pigment 0Normal 18Pigment Only 6Drusen 0Drusen + Pigment 0Normal* 4Pigment Only 0Drusen 18Drusen + Pigment 11Normal 0Pigment Only 20Drusen 0Drusen + Pigment 0Normal 0Pigment Only 0Drusen 0Drusen + Pigment 17

*Clinical drusen defined as intermediate or large drusen** From 2 patients. Eyes were normal at last clinical examination. Found to have soft drusen on histopathological examination 3 and 5 years later

Group III: Thin Continuous

BLamD

BLinD onlyEarly Only 38 Patchy Late 0 Continuous Late 0

Basal mounds onlyEarly Only 12 Patchy Late 12 Continuous Late 0

Basal mounds + soft drusen

80 +/-8 0.245 +/- 0.206 6/10 20/302.5 +/- 1.2

6/12 20/404.5 +/- 1.6

83 +/-6 0.273 +/- 0.114 6/12 20/402.9 +/- 1.4

Early Only 16 Patchy Late 17 Continuous Late 0

81 +/-8 0.311 +/- 0.298

Group IV: Thick Continuous

BLamD

Basal mounds only 20Early Only 0 Patchy Late 0 Continuous Late 20

Basal mounds + soft drusen 17

Early Only 0 Patchy Late 0 Continuous Late 17

86 +/-5 0.796 +/- 0.362 6/37.5 20/12511.3 +/- 5.3

81 +/-5 0.394 +/- 0.337 6/15 20/509.9 +/- 2.1

Fundus Appearance*

38

24

33

 

98

3.1.4 Discussion  

Zarbin proposed that the biological changes associated with tissue aging, whilst 

present in AMD eyes, do not inevitably lead to AMD 116.  The present study was 

undertaken to trace the evolution of BLamD and membranous debris in order to 

determine their relationship to aging and AMD.   

 

The study found that the first appearance of BLinD coincides with a continuous 

layer of early BLamD. Since membranous debris is not found in eyes without 

BLamD (group I) and occurs only as occasional, isolated fragments in eyes with 

patchy BLamD (group II) 196, the presence of both BLinD and continuous early 

BLamD represents threshold early AMD, and can be considered a continuum of 

normal aging. Also described as “incipient AMD” 168, 176, the findings confirm that 

the majority of these eyes have a normal fundus and good vision.  

 

The appearance of late BLamD signals severe RPE abnormality, and corresponds 

to clinical pigment changes. Once produced, BLamD is remarkably resilient, 

persisting even in areas of geographic atrophy and in disciform scars 8. BLamD is 

not lost during processing, remaining detectable using routine H&E and PAS 

staining and, although not specific for AMD, it is found in all eyes with the 

disease. These properties make it a useful and reliable histopathologic marker for 

AMD.  In terms of the disease process, however, BLamD appears inert. Rather, it is 

the degree of membranous debris accumulation that appears to influence the 

course of disease. In the current study, the number of basal mounds increased as 

BLamD progressively thickened but, once RPE cells lost their ability to support the 

overlying photoreceptors, membrane production ceased. This was heralded by the 

appearance of continuous late BLamD and a loss of the membranous contents of 

the mounds. Soft drusen likewise became less membranous and more granular, 

interpreted as the onset of drusen regression. 

 

99

However, in some eyes membranous debris production did not progress beyond 

the formation of basal mounds.  Even in the ninth decade these eyes show no 

histopathological evidence of soft drusen, instead developing pigment changes 

associated with poor vision. Continuous late BLamD is always present in these 

eyes, and in longer segments than in eyes with soft drusen, suggesting 

longstanding RPE dysfunction. By contrast, soft drusen can occur in relatively 

young eyes with good vision, prior to the appearance of continuous late BLamD. 

Clinically, intermediate and large drusen are known to increase in size, number 

and confluence comparatively rapidly 178, implying a rapid outpouring of 

membranes. However, the resulting thickening of BLinD is not uniform, causing it 

to develop undulations, the larger of which become visible as soft drusen (Figure 

3.1‐4). In these eyes, soft drusen do not appear to develop from an earlier stage 

when only basal mounds are present, i.e. soft drusen and basal mounds appear 

concurrently.  

 

Epidemiologic data support the concept of two pathways leading to the 

development of advanced AMD, depending on the amount of accumulated 

membranous debris. Eyes with a  large amount of membranous debris, in the form 

of large drusen, are at highest risk of developing advanced AMD over a 5‐ or 10‐

year period 33, 320, particularly the blinding effects of CNV 37, 39, 321, 322. Eyes with 

pigment changes alone are at lower risk of developing advanced AMD over the 

same period 33, 320, consistent with an alternate and slower course of disease.  

 

This clinicopathologic study represents an overview of the basal deposits in the 

evolution of AMD, but makes no attempt to correlate with the clinical fundus 

grades or severity scales used in recent epidemiologic studies.  It has two obvious 

limitations.  Firstly, the sometimes long interval between the last examination and 

death, with drusen a particular concern since the clinical appearance can change 

relatively rapidly.  With a few exceptions, however, there was good correlation 

100

between histopathological soft drusen and clinical intermediate and large drusen, 

and the main study findings were unchanged by the exclusion of eyes with an 

interval longer than 36 months.  Secondly, differences in the post‐fixation method 

for EM prevented comparison of membranous debris with other recent studies of 

this material 182.  It should thus be emphasized that the terms “BLinD”, “basal 

mounds” and “soft drusen” are pathological descriptors of membranous debris 

location, and that the biochemical nature of this material has not been completely 

defined. 

 

BLamD and membranous debris may be products of two distinct cell‐survival 

strategies of RPE under stress. Early BLamD can be thought of as excess basement 

membrane secreted by the RPE, a common strategy employed by cells attempting 

to recover from injury, allowing them to remain attached to a tissue’s 

“scaffolding”.  As BLamD thickens it progressively separates the basal RPE 

surface from its original basement membrane and choroidal blood supply, 

exacerbating the metabolic insufficiency caused by decreasing Bruch’s membrane 

permeability 148, 150, 151, 323.  The production of late type BLamD signals a critical point 

in RPE damage at which the basement membrane material becomes more 

condensed and, once this forms continuous segments, the RPE cells become 

hyperpigmented, enlarge, lose their microvilli and round off. These phenotypic 

changes are initially accompanied by expression of the cytoskeletal protein 

vimentin 324. The RPE at this stage is severely compromised and can no longer 

support the photoreceptors.   Eventually, affected RPE cells lose their anchoring to 

both the basement membrane and to adjacent cells and are shed into the sub‐

retinal space 3. 

 

The production of membranous debris, on the other hand, may reflect another 

survival mechanism adopted by RPE under stress. Ultrastructurally, the earliest 

membranes appear to bleb from the basolateral surface of the RPE. Non‐apoptotic 

101

membrane blebbing has been observed in cultured RPE cells subjected to oxidative 

stress 201, and is considered a non‐specific cellular response to ischaemic, oxidative 

or other injury which allows the expulsion of damaged cellular constituents 199, 200. 

Other studies show that membranous debris contains solid lipid particles 182, and 

that dysregulated lipid trafficking by abnormal RPE may also contribute to its 

formation 185, 325.  Since the appearance of BLinD coincides with a continuous layer 

of early BLamD, a threshold level of RPE injury (perhaps ischaemic) may trigger 

the production of membranous debris.  

 

In summary, late BLamD occurs in eyes with clinical pigment changes and 

indicates a severely compromised RPE. It is membranous debris, however, that 

appears to influence the course of the disease (Table 3.1‐4).  Eyes in which 

membranous debris accumulation is limited to basal mounds present with 

pigment abnormalities alone.  These eyes eventually develop “primary” or 

“drusen‐unrelated” 3, 8 geographic atrophy. If there is a more rapid accumulation 

of debris, early AMD presents with intermediate or large drusen, is at greater risk 

of CNV 37, 39, 321, 322 and earlier vision loss, and eventually progresses to “drusen‐

related” geographic atrophy 3.  These two pathways share a common threshold 

stage when both BLinD and a continuous layer of early BLamD are present (Figure 

3.1‐6).  However, since the majority of these eyes will be normal in terms of fundus 

appearance and visual acuity, identifying “at‐risk” eyes will come to rely on more 

sophisticated clinical tests, possibly combined with genetic screening. 

102

 Figure 3.1‐6   Influence of basal deposits on the progression of AMD 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Continuous early BLamD together with BLinD represent the threshold for onset of early 

AMD. The pathway then followed depends on the degree of membranous debris 

production.  A large build up manifests as intermediate or large drusen, whereas if 

limited to BLinD and basal mounds, the fundus initially remains normal.  At the same 

time, BLamD reflects the degree of RPE damage, clinical pigment abnormalities becoming 

apparent when late BLamD appears.  Both pathways then progress towards geographic 

atrophy.  

 

MD – membranous debris

Continuous early BLamD+/- Patchy late BLamD

Basal mounds

BLinD + Soft drusen

Cont thin early BLamD

BLinD

Continuous late BLamDBasal mounds

BLinD

Continuous late BLamDBasal mounds

BLinD + Granular drusen

MD production remains limitedOlder group, poorer vision

Excess production MD(High risk CNV)

Drusen-unrelatedGeographic atrophy

= RPE basement membrane.

None or patchy early BLamD

No BLinD

Continuous early BLamD+/- Patchy late BLamD

Basal mounds

BLinD + Soft drusen

Drusen-relatedGeographic atrophy

Normal Aging

Threshold early AMDFundus normal 74%

Pigment changes (25%)

Pigment changes (100%)

Intermediate or large drusen

Intermediate or large drusen,may show signs of regression

Pigment changes (100%)

103

 Table 3‐4   Basal laminar deposit ‐ a summary  

 

 BLamD Type Site LM Appearance EM Appearance Clinical Correlation Significance

Early

Basement membrane‐like extracelluar material between RPE basal plasma membrane and its BM

Stains blue on P‐M. Shows feint vertical stirations and may contain small unstained spaces. May be absent, patchy or continous. When continuous, may be associated with early AMD. Reaches maximum height of 7mm. 

Exists in 3 forms: fibrillar, amorphous (light and dark) and polymerised (banded). The polymerised form is similar to long‐spacing collagen. The light amorphous form is continuous with the RPE BM.

Not seen. May be compatible with a normal fundus.

The presence of fibronectin, laminin and glycoproteins imply it is abnormal basement membrane material. Considered inert, but reflects the escalating damage to RPE.

All late BLamD stains red on  P‐M. 

Late BLamD has a more compact appearance than early BLamD. It has a wave‐like appearance, described previously as ʺflocculentʺ or ʺmultilaminarʺ.

(i) Inclusions of late BLamD: small, globular bodies in the order of 4mm lying within early BLamD.

(i) Inclusions are seen beneath a segment or portion of RPE plasma membrane which becomes indented. May appear within membranous debris.

Not seen. May be compatible with a normal fundus.

(ii) Nodular late BLamD: are nodular excrecenses up to 7mm (1 RPE cell) in size. The overlying RPE cell becomes hypertrophied and hyperpigmented initially, and eventually attenuates.

(ii) Appear multilaminar. Distinct from hard drusen.

May be compatible with a normal fundus or seen as focal hyperpigmentation.

Results from contiued production of late BLamD by a single RPE cell. 

(iii) Continous (confluent) BLamD: also known as ʺdiffuse thickening of the internal aspect of Bruchʹs membraneʺ. Seen as a confluent layer internal to early BLamD, up to 7mm in thickness.

(iii) Produced by several RPE cells. 

Not compatible with a normal fundus. Likely to have pigmentary changes without soft drusen.Usually seen as hyperpigmentation, followed by hypopigmentation and atrophy.

A sign of severe RPE dysfunction. Pre‐atrophy.

Late

Being a later development, lies above (internal to) the early form. Occurs in 3 stages in order of severity:

 

 

104

Table 3‐5  Membranous debris – a summary 

 

 Relationship to 

RPE BMEntity Site LM Appearance EM Appearance Clinical Correlation Significance

Membrane Fragments

Membrano‐vesicular material between RPE basal plasma membrane and its BM

Not seenBleb from basal surface of RPE cells. Found between strands of early BLamD

Not seen. Compatible with a normal fundus

Basal Membrane Mounds

Rounded collections of membranous debris between the RPE basal plasma membrane and its BM. 

Small, unstained spaces with rounded margins between attenuated RPE cells internally, and early BLamD externally. RPE cells overlying mounds are grossly abnormal in shaped becoming attenuated over mounds but attached by their tight junctions. The smallest mound is at least half the height of an RPE cell. Mounds beneach adjacent cells may fuse, the largest up to 7 RPE cells wide and one RPE cell in height.

**

Patients with basal mounds less likely to have normal fundus. Increasing numbers of mounds correlates with poorer visual acuity. If over 30mm in diameter, may account for dot‐like drusen.

WithinMembrane Fragments

Membrano‐vesicular material apparently transiting through RPE BM

Not seenVesicles are smaller and more compact than at other sites.

Not seen. Compatible with a normal fundus

Basal Linear Deposit

Forms a layer lying between the RPE BM and the inner collagenous zone of Bruchʹs membrane

Not seen in histological sections. In semithin sections, appears as an unstained narrow interval between the RPE and Bruchʹs membrane.

A layer of membranous debris, thickest when adjacent to soft drusen. 

Not seen. May be compatible with a normal fundus.

Forms a cleavage plane in which new vessels can spread.

Soft Drusen

Focal accumulation of BLinD between the RPE BM and the inner collagenous zone of Bruchʹs membrane

Seen between the RPE and Bruchʹs membrane. May be all sizes , the smallest defined as at least half the height of an RPE cell. Regressing drusen may become granular.

Composed of membranous debris. 

Soft Drusen

Membrane Fragments

Withing the outer collagenous zone of Bruchʹs membrane

Not seen. Not seen.

Contribute to the increasing thickness of Bruchʹs membrane seen with age. May attract macrophages.

ApicalApical Membrane Mounds

Found at apex of RPE, within the subretinal space

Only seen in well‐preserved eyes as empty spaces between shortened photoreceptor outer segments and apical surface of RPE

Mounds of debris overlying RPE cells which have lost their microvilli.

If over 30mm may account for dot‐like drusen in patients with pigment clumps or adult vitelliform degeneration.

External

Internal

 

 

105

3 . 2 C H O R O I D A L A N D B R U C H ’ S M E M B R A N E M A C R O P H A G E S I N

E A R L Y A N D A D V A N C E D A M D

3.2.1 Introduction  

Macrophages were first implicated in the pathogenesis of age‐related macular 

degeneration (AMD) when early morphological studies found them within drusen 

179, 215, 218 and choroidal neovascular membranes 219. Significantly, macrophages 

were also found adjacent to breaks in Bruch’s membrane (BrM), through which 

subclinical new vessels grew from the choroid 10, 179, 222. Later studies supported the 

idea that macrophages facilitated choroidal neovascularisation (CNV) by 

interrupting BrM and releasing pro‐angiogenic factors such as vascular 

endothelium‐derived growth factor (VEGF) 121, 174, 226, 227, 229, 326, 327. Thus, macrophage 

infiltration of BrM or the subretinal space is considered pathological. However, 

another local population of macrophages can be found residing in the choroid of 

normal eyes.  

 

Extensive networks of resident choroidal macrophages have been demonstrated in 

normal mouse 244 and rat 328 eyes. Although their human equivalents are not well 

characterised, this population of macrophages appear to be programmed for 

phagocytosis without eliciting inflammation. Indeed, recent animal models of 

AMD suggests that the normal recruitment and turnover of resident choroidal 

macrophages may prevent the development of AMD‐like lesions 231, 233, 

presumably by facilitating the efficient removal of BrM debris. 

106

 

It is not clear, however, how these two populations of macrophages – resident 

choroidal macrophages and macrophages that infiltrate BrM – are influenced by 

the progressive accumulation of the characteristic basal deposits found in the 

macula of human AMD eyes – basal laminar deposit (BLamD) and membranous 

debris. 

 

BLamD, an abnormal basement membrane‐like material, is found between the 

plasma membrane of the retinal pigment epithelium (RPE) and its basement 

membrane. Its accumulation correlates with progressive RPE abnormalities 5 and it 

is found in all eyes with early or advanced AMD 8, 126, 169, 174‐176. Membranous debris 

appears to be composed of membrane fragments 179, 180 and lipid 142, 181, and is 

specific for AMD 176. It is first found in eyes with early AMD as basal linear deposit 

(BLinD), a thin layer external to the RPE basement membrane 126, 176, 179. 

Membranous debris can also accumulate as small focal collections internal to the 

RPE basement membrane, forming basal mounds 329. Larger collections external to 

the RPE basement membrane become soft drusen 176. 

 

Macrophages are a highly heterogenous group of cells. Early inflammatory 

macrophages, for example, are phenotypically and functionally distinct from 

resident tissue macrophages. Pro‐inflammatory (“classically activated”) 

macrophages recruited to sites of injury or infection express inducible nitric oxide 

107

synthase (iNOS), whereas resident macrophages do not 330.  This enzyme allows 

macrophages to convert L‐arginine to nitric oxide, a damaging reactive nitrogen 

species with cytotoxic 331, 332 and pro‐angiogenic properties 220, 248.  In the context of 

AMD, we hypothesise that: (i) resident choroidal macrophages do not express 

iNOS in normal eyes; (ii) the progressive accumulation of BLamD or membranous 

debris attracts macrophages to BrM and may favour the recruitment of classically 

activated, iNOS‐ expressing macrophages; (iii) the presence of BrM breaks and 

subclinical CNV is associated with a high BrM macrophage count; and (iv) iNOS‐

expressing macrophages are likely to be found where active neovascular processes 

are taking place. 

 

In this study, macrophages were identified using CD68 immunohistochemistry in 

a total of 16 human eyes, representing normal (2), normal aged (2), early AMD (7), 

geographic atrophy (2) and disciform scars (2). iNOS immunohistochemistry was 

used to determine whether macrophages were classically activated in these eyes. 

A submacular BrM macrophage count was undertaken in a further 125 eyes, 

representing normal (18), normal aged (20), early AMD (78) and geographic 

atrophy (9).  CD68/iNOS immunohistochemistry and BrM macrophage counts 

were correlated with BLamD and membranous debris accumulation, and with 

subclinical CNV. Results were also correlated with clinical data, including age, 

visual acuity and fundus appearance. 

 

108

3.2.2 Methods  

3 . 2 . 2 . 1 Ey e s  

Archival slides of human eyes were selected from a large clinicopathologic 

collection of over 600. Eyes were previously graded according to the appearance of 

BLamD 10 (see below). All of the eyes were examined (best corrected visual acuity 

and direct fundoscopy) and most photographed (Zeiss 30° fundus camera) during 

life. Eyes were paraffin embedded with 8μm serial sections cut horizontally 

through the disc and macula, and every 10th section stained using the picro‐

Mallory method 10.  

 

For histopathology and BrM macrophage counts, the best sub‐foveal sections of 

125 eyes, representing histopathological groups I to V, were examined with a Leitz 

Dialux microscope, using the PL APO 40x (NA‐0.75) objective. For CD68 and 

iNOS immunohistochemistry, unstained sections of 16 eyes, belonging to 

histopathological groups I to VI, were used. Informed consent was obtained before 

the collection of all eyes. The study was carried out in keeping with the 

Declaration of Helsinki and was approved by the Human Research Ethics 

Committee of the University of NSW.  

 

3 . 2 . 2 . 2 C l i n i c a l   d e f i n i t i o n s  

Clinical data from the last follow up prior to death was used. Best corrected visual 

acuity was converted from Snellen to logMar for statistical purposes. The fundus 

was graded as: (i) normal, which included up to 5 small (<63mm) hard drusen; (ii) 

extensive small hard drusen; (iii) soft drusen (≥63μm) without pigment 

abnormalities; (iv) soft drusen (≥63μm) with pigment abnormalities; and (v) 

pigment abnormalities alone. 

 

 

109

3 . 2 . 2 . 3 H i s t o p a t h o l o g i c a l   d e f i n i t i o n s   a n d   g r a d i n g :  BL amD  

Eyes were graded based on the extent of submacular BLamD present, according to 

the system proposed by Sarks 10, modified by the inclusion of BLamD type. Early 

type BLamD stains blue with the picro‐Mallory method (Figure 3.2‐2a), while the 

late type stains red and is found internal to the early type 329 (Figure 3.2‐2b). Group 

I represented normal eyes and had no BLamD. Group II represented normal aged 

eyes in which there was patchy early BLamD. Groups III and IV represented early 

AMD. In group III, BLamD was present in a thin continuous layer, and consisted 

of early or patchy late type. In group IV, BLamD was present in a thick continuous 

layer, and consisted of continuous segments (>250μm) of the late type. Group V 

eyes had geographic atrophy and Group VI eyes had disciform scars. 

 

3 . 2 . 2 . 4 H i s t o p a t h o l o g i c a l   d e f i n i t i o n s   a n d   g r a d i n g :  memb r a n o u s   d e b r i s  

Due to the exclusive use of light microscopy in this study, the presence of BLinD, 

an ulstrastructural finding, was not determined. However, BLinD is found in all 

eyes in which there is a thin continuous layer of BLamD 329. Since soft drusen are 

large focal collections of membranous debris, and basal mounds are small focal 

collections, in eyes with early AMD (groups III and IV), the amount of submacular 

membranous debris was thus graded: soft drusen > basal mounds > no basal 

mounds (presumed BLinD).  

 

3 . 2 . 2 . 5 B rM  ma c r o p h a g e   c o u n t s  

BrM macrophages were defined morphologically by their abundant pale pink‐

staining cytoplasm, large oval or kidney‐shaped nuclei and granular chromatin, 

and by their presence within the zone bounded by the inner margin of the inner 

collagenous zone and the outer margin of the choroidal capillaries/intercapillary 

pillars (Figure 3.2‐1b). Counts were not performed on group VI eyes, since the 

110

large numbers of macrophages, fibroblasts and other cells within disciform scars is 

well established.  

 

An eyepiece graticule which equalled 280μm in total with the 40X objective was 

used to examine the foveal field and one graticule length on either side, giving a 

total of three fields (840μm). In eyes with hard drusen, soft drusen or RPE 

changes, additional fields (up to five, all within the inner macula) were examined. 

Cell counts were divided by the number of fields examined, multiplied by three, 

and expressed as mean count per three 40X fields.  

 

3 . 2 . 2 . 6 Immun o h i s t o c h em i s t r y  

CD68 is a glycosylated protein (part of the scavenger receptor superfamily) found 

in all cells from the monocyte/macrophage lineage 333. CD68 

immunohistochemistry is commonly used to identify macrophages/histiocytes in 

paraffin sections, and stains intracytoplasmic granules. 

 

Detailed methods for CD68 and iNOS immunohistochemistry, and the antibodies 

use, as described in the Appendices (A‐C). Briefly, sections were deparaffinised in 

xylene, rehydrated and treated in 1% hydrogen peroxide in alcohol for 30 min to 

block endogenous peroxidase. Non‐specific binding was blocked by incubation in 

10% normal horse serum for 20 min. For iNOS detection, sections were incubated 

with monoclonal mouse anti‐human iNOS (Transduction Laboratories BD 

Biosciences, San Jose, CA, USA), diluted 1:400, for 1hr at 37oC. . For CD68 

detection, antigen retrieval with pepsin digestion for 5 min at 37oC preceded the 

blocking step, which was followed by incubation with monoclonal mouse anti‐

human CD68 antibody (Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), neat, for 1hr at 

37oC. After washing with tris, sections were incubated with biotinylated anti‐

111

mouse IgG antibody (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), diluted 1:200, 

for 30min at 37oC. Sections were then washed with tris, incubated with 1:500 ABC 

(Vector Laboratories) for 30 min at room temperature. For iNOS detection, this 

was followed by 3 changes of nickel ammonium phosphate tris solution and final 

incubation with DAB (Sigma‐Aldrich, St Louis, MO, USA) in nickel ammonium 

sulphate and peroxide solution for 10 min at room temperature, resulting in a dark 

grey colour product. For CD68 detection, incubation with ABC was followed by 

washing with tris and incubation with Vector SC Blue (Vector Laboratories) for 10 

min at room temperature, resulting in a dark blue colour product. All sections 

were then washed with tris followed by distilled water, dehydrated and 

coverslipped in DPX (ProSciTech, Kirwan, QLD, Australia).  

 

3 . 2 . 2 . 7 S t a t i s t i c s  

Statistical analysis was performed using SPSS for Windows (v15.0; SPSS Inc, 

Chicago, IL, USA).  The student t test was used to compare mean BrM 

macrophage counts and visual acuity measurements between histopathological 

groups. Contingency tables of histopathological group versus the presence of 

subclinical CNV were evaluated by the χ2 and Fisher’s exact tests. A p value ≤ 0.05 

was considered statistically significant. 

112

3.2.3 Results  

3 . 2 . 3 . 1 Gr o u p s   I  &   I I ‐  n o rm a l   a n d  n o rm a l   a g e d   e y e s  

The fundus was normal in all 18 eyes from group I (Table 3‐2.1). 

Histopathologically, the RPE appeared normal and BrM hyalinisation ranged from 

non‐existent (Figure 3.2‐a) to extending a short distance down the intercapillary 

pillars. Group II eyes were also fundoscopically normal, with the exception of two 

eyes with pigment abnormalities in which extensive hard drusen of intermediate 

size were present (Table 3.2‐1). BrM hyalinisation extended down the 

intercapillary pillars to reach the base of the choroidal capillaries, resulting in 

widened intercapillary spaces (Figure 3.2‐1b).  

 

BrM macrophages were absent in group I and II eyes (confirmed by CD68 

immunohistochemistry), except in the two group II eyes with pigment changes, in 

which occasional macrophages were found beneath small hard drusen. 

Occassionally, cells with small nuclei and scanty cytoplasm were found in the 

place of choroidal capillaries (Figure 3.2‐1b). 

 

CD68 immunohistochemistry revealed numerous ramified cells in the choroid, 

within the choroidal melanocyte network, in all group I and II eyes (Figures 3.2‐1c 

& d). Expression of iNOS was not found in either BrM or choroidal macrophages, 

but was occasionally seen in the basal aspect of RPE cells (Figure 3.2‐1e). 

 

3 . 2 . 3 . 2 Gr o u p s   I I I  &   I V –   e a r l y  AMD  

In group III eyes, the fundus was normal in 15 (79%) eyes without basal mounds 

(presumed BLinD), and 6 (40%) eyes with basal mounds, while all group IV eyes 

had clinically evident pigment changes, with or without soft drusen. Resident 

choroidal macrophages ‐ CD68‐positive ramified cells among the choroidal 

melanocytes‐were found in all group III and IV eyes (Table 3.2‐2). BrM 

113

macrophages were also seen in group III and IV eyes, and were found in the place 

of a choroidal capillary (Figure 3.2‐2a & c), or an intercapillary pillar (Figure 3.2‐

2b). Interestingly, BrM macrophages were only found in group III eyes with 

clinical pigment changes or soft drusen, apart from three eyes with normal fundus 

(which belonged to older patients).  

 

iNOS expression was again seen in the basal aspect of RPE cells. However, 

choroidal ramified cells also expressed iNOS (Figure 3.2‐2d) in group III and IV 

eyes, as did choroidal vascular endothelial cells (3.2‐2e), and perivascular ramified 

cells (3.2‐2f).  

 

 

114

Table 3‐6  Clinical and histopathological features of study eyes 

 

Light

microscopyImmunohisto-

chemistryNormal Drusen*

alonePigment

aloneDrusen* + Pigment

I No BLamD 18 2 64.5 +/-9.6 0.080 +/-0.105

18 (100%) 0 0 0

II Patchy BLamD 20 3 74.4 +/-8.9 0.110 +/-0.120

18 (90%) 0 2

(10%) 0

III Thin continuous BLamD 49 4 81.8 +/-7.4 0.277 +/-

0.21321

(43%)13

(27%)10

(20%)5

(10%)

IV Thick continuous BLamD 29 3 84.1 +/-6.3 0.593 +/-

1.164 0 0 17 (59%)

12 (41%)

V Geographic atrophy 9 2 80.9 +/-5.9 1.096 +/-

1.004 0 - - -

VI Disciform scar 0 2 78.5 +/-2.1 2.000 +/- 0.000 0 - - -

BLamD basal laminar deposit; VA visual acuity* intermediate or large drusen

logMar VA Fundus appearanceGroup Pathology

Number of Eyes Age at Death (yrs)

 

115

Table 3‐7  BLamD, membranous debris and macrophages in early AMD 

Cell count* CD68 immunohistochemistry iNOS immunohistochemistry CD68 immunohistochemistry iNOS immunohistochemistry

I No BLamD 0 None None [occasional basal RPE expresson]

Ramified cells intermixed with chroidal melanocytes

None

II Patchy BLamD 0.03 +/-0.14 None None [basal RPE expresson]

Ramified cells intermixed with chroidal melanocytes

None

III Thin continuous BLamD

3.14 +/-5.82 Round to epitheliod cells within BrM

None [basal RPE expresson]

Ramified cells intermixed with chroidal melanocytes

Occassional ramified cells intermixed with choroidal melanocytes

IV Thick continuous BLamD

7.14 +/-5.90 Round to epitheliod cells within BrM

None [basal RPE expresson]

Ramified cells intermixed with chroidal melanocytes [some large & plump]

Frequent ramified cells intermixed with choroidal melanocytes, or in

perivascular region [choroidal endothelial cell expression]

V Geographic atrophy

2.72 +/-3.03 At edges of atrophy None Few cells beneath area of atrophy None

VI Disciform scar - Numerous, within fibrovascular membrane/scar in both active CNV

and disciform scar

Little within CNV or disciform scar Numerous, within fibrovascular membrane/scar in both active CNV

and disciform scar

Perivascular ramified cells and endothelial cell iNOS expression in active CNV. Little in disciform scar.

BLamD basal laminar deposit; BrM Bruch's membrane* Mean macrophage count per 3 (X40) fields

Group Pathology Bruch's membrane macrophages Choroidal macrophages

 

 

116

 

Figure 3.2‐1  Morphological and immunohistochemical features of normal (group I) and 

normal aged (group II) eyes 

  ONL

RPECC

CCRPE

CCRPE

*

a

b

c d

e

ONL

RPECC

CCRPE

CCRPE

*

ONLONL

RPERPECCCC

CCRPECCCCRPERPE

CCCCRPERPE

*

a

b

c d

e

117

Figure 3.2‐1   Morphological and immunohistochemical features of normal (group I) and 

normal aged (group II) eyes 

 

(a) A group I eye from a 73 year old patient with a normal fundus. The RPE is normal, 

there is no BLamD and little BrM hyalinisation.  

 

(b) In group II eye from a 72 year old patient with a normal fundus, BrM hyalinisation 

extends down the intercapillary pillars (black arrows). Fibrous tissue (asterix) or small 

round cells (white arrow) appear in the place of lost choroidal capillaries. The black 

arrows also define the area within which BrM  macrophage were counted.  

 

(c) Ramified cells with CD68 positive granules in the choroid of a group I eye from a 62 

year old patient with a normal fundus, among choroidal melanocytes.  

 

(d)  A group I eye from the same patient as (a), with numerous CD68‐positive choroidal 

cells intermixed with melanocytes (black arrows). An intravascular monocytoid CD68 

positive cell is seen within a choroidal vessel (white arrow).  

 

(e) Occassionally, iNOS expression was seen in the basal aspect of RPE cells (arrows), such 

as in this group II eye from a 75 year old patient with a normal fundus. Neither BrM or 

choroidal cell iNOS expression was found in group I and II eyes.  

 

a‐b: picro‐Mallory stain; c‐e: CD68 and iNOS immunohistochemistry. The CD68 colour 

product is dark blue and the iNOS colour product is dark grey. 

Bar markers: approx. 100μm 

ONL – outer nuclear layer; RPE – retinal pigment epithelium; CC – choriocapillaris; iNOS – 

inducible nitric oxide synthase; BrM – Bruch’s membrane  

 

 

 

 

118

Figure 3.2‐2  Morphological and immunohistochemical features of eyes with early 

AMD (groups III and IV) 

CC

RPE

CCRPE

CCRPE

CCRPE

CCRPE

*

a

b

c

d

e f

CC

RPE

CCCC

RPERPE

CCRPECCCCRPERPE

CCRPECCCCRPERPE

CCRPECCCCRPERPE

CCRPECCCCRPERPE

*

a

b

c

d

e f

119

Figure 3.2‐2  Morphological and immunohistochemical features of eyes with early AMD 

(groups III and IV) 

 

(a) BrM macrophages (black arrows) in the place of a lost choroidal capillary or eroding 

intercapillary pillars in a group III eye from an 88 year old patient with pigment changes 

and soft drusen. There is mild RPE disorganisation and thin continuous BLamD of the 

early (pale blue staining) type (square brackets). A soft druse (asterix) appears empty due 

to loss of lipid contents during processing. A pigment laden cell (white arrow) is also 

found replacing a choroidal capillary. 

 

(b) A group IV eye from an 89 year old patient with pigment changes only. The RPE  

appears more disorganised compared to the eye in (a) and there is thick continuous 

BLamD, with continuous segments of the late, red staining type (square brackets) type 

overlying the early type. A BrM macrophage is found apparently eroding an 

intercapillary pillar (arrow). 

 

(c)  CD68 immunohistochemistry in a group IV eye from an 80 year old patient with soft 

drusen and pigment changes, confirming the presence of BrM macrophages (arrows). 

Note again the network of CD68 positive ramified cells in the choroid.  

 

(d) Ramified iNOS expressing cells in the choroid (white arrow), intermixed with 

melanocytes, in the same eye as in (c). Basal expression of iNOS by the RPE cells (black 

arrows) was also found in group III and IV eyes.   

 

(e) Choroidal vascular endothelial cell iNOS expression (arrow) in a group IV eye from a 

74 year old patient with soft drusen and pigment changes. 

 

(f)  iNOS expression by ramified cells found between choroidal melanocytes (white 

arrow) and near a choroidal vessel in the choroid (arrows) of the same eye as in (c). 

 

Bar marker: approx. 100μm 

120

3 . 2 . 3 . 3 Gr o u p s   I I I  &   I V :  B rM  ma c r o p h a g e s   a n d   s u b c l i n i c a l  CNV  

Sixteen of the 125 eyes examined histologically had subclinical CNV. With the 

exception of two eyes from group V, the remainder belonged to groups III and IV. 

Overall, eyes with subclinical CNV had significantly more macrophages on 

average (p <0.001; mean difference 10.30 +/‐1.93; 95% CI = 6.19‐14.41) than eyes 

without (Table 3.2‐4). Macrophages in eyes with subclinical CNV were found 

eroding intercapillary pillars or BrM (Figure 3.2‐3a).  Growth of fibrovascular 

tissue into the sub‐RPE space was seen in eyes with complete breaks in BrM 

(Figure 3.2‐3b). A lack of unstained tissue in these eyes prevented 

immunohistochemical characterisation of the macrophages.  

 

Subclinical CNV was associated with the amount of membranous debris present 

in eyes with thin continuous BLamD (group III), since it was only found in eyes 

with soft drusen (Table 3.2‐3). However, this relationship did not hold once thick 

continuous late BLamD was present (group IV) (Table 3.2‐3). 

 

Of the 23 pairs of eyes present in the study, when subclinical CNV was present in 

one eye, greater numbers of BrM macrophages were also found in the fellow eye 

(mean difference 9.18 +/‐2.52; 95% CI = 3.96‐14.41) compared to the fellow eyes of 

eyes without subclinical CNV (Table 3.2‐4). 

121

Figure 3.2‐3  Morphological features of eyes with subclinical CNV 

 

CCRPE

CC

RPE

*

*

a

b

CCRPE

CC

RPE

*

*

a

b

CCRPECCCCRPERPE

CC

RPE

CCCC

RPERPE

*

*

a

b

122

Figure 3.2‐3  Morphological features of eyes with subclinical CNV 

 

(a)  A group III eye from an 88 year old patient with soft drusen and pigment changes. 

Thin continuous BLamD of the early type (asterix) is overlain by mildly disorganised RPE. 

BrM macrophages are seen eroding BrM (arrow) beneath a soft druse (contents emptied 

by processing).  Elsewhere in the same eye, fibrovascular tissue is found invading the sub‐

RPE space (not shown). 

 

(b)  A group III eye from an 81 year old patient with soft drusen only. Fibrovascular tissue 

is seen invading the sub‐RPE space (asterix) via a focal break in BrM (arrow).  

 

Bar marker: approx. 100μm 

 

123

Table 3‐8  BrM macrophages, membranous debris and subclinical CNV 

 

 

Extent Type

No basal mounds* 19 80 +/-8 0.185 +/-

0.179 0.8 +/-2.5 0

Basal mounds only 15 84 +/-5 0.262 +/-

0.940 0.5 +/- 1.0 0

Soft Drusen 15 82 +/-8 0.374 +/-0.272 8.7 +/-7.7 6

Basal mounds only 17 87 +/-5 0.935 +/-

0.160 8.0 +/-6.6 5

Soft Drusen 12 80 +/-5 0.250 +/-0.117 5.9 +/-4.8 1

BLamD basal laminar deposit ; VA visual acuity ; CNV choroidal neovascularisation*presumed BLinD ** Mean macrophage count per 3 (X40) fields ***Fisher's exact p

p***pGroup Membranous

DebrisNo. eyes Age (yrs)BLamD logMar VA BrM

macrophage count**

Subclinical CNV

0.354

III

IV Thick continuous 0.359Continuous

late

Thin continuous

Early + Patchy late

0.0170.001

124

Table 3‐9  BrM macrophages and subclinical CNV in the fellow eye  

 

 

Number of eyes BrM macrophage count**

p

Subclinical CNV absent* 64 2.78 +/-4.07

Subclinical CNV present* 14 13.08 +/-6.97

Fellow eye subclinical CNV absent 20 4.24 +/-4.18

Fellow eye subclinical CNV present 3 13.42 +/-2.81CNV choroidal neovascularisation* all eyes from groups III and IV ** Mean macrophage count per 3 (X40) fields

<0.001

0.002

 

 

125

3 . 2 . 3 . 4 Gr o u p  V   –  Ge o g r a p h i c   a t r o p h y  

Compared to groups I – IV, the resident choroidal macrophage network appeared 

sparse immediately beneath areas of atrophy. BrM macrophages however, were 

found at the edges of areas of atrophy in group V eyes, aligned with the still‐viable 

RPE cells (Figure 3.2‐4a). iNOS expression was not found in BrM or the choroid of 

these eyes (Figure 3.2‐4b). 

 

3 . 2 . 3 . 5 Gr o u p  V I   –  D i s c i f o rm   s c a r r i n g  

Immunohistochemistry performed on the 2 eyes with disciform scarring showed 

differences in CD68 and iNOS staining between active and inactive scars.  In a 

clinically flat disciform lesion without haemorrhage or exudates, subretinal 

fibrous tissue surrounding a large feeder vessel was present. Numerous CD68 

positive cells were present within the scar (Figure 3.2‐4c) but iNOS staining was 

minimal (Figure 3.2‐4d). By contrast, in an exudative disciform lesion, a 

fibrovascular membrane consisting of numerous small vessels and cells, some 

pigmented, was seen. CD68 positive cells were less numerous in this eye 

compared to the inactive scar (Figure 3.2‐4e), while plump ramified CD68 positive 

cells were noted in the choroid. However, large iNOS positive cells were found in 

the perivascular region of choroidal vessels (Figure 3.2‐4f). Choroidal endothelial 

cells in this region were also iNOS positive (Figure 3.2‐4f). 

 

 

126

Figure 3.2‐4   CD68 and iNOS Immunohistochemistry in eyes with geographic atrophy 

(group V) or disciform scarring (group VI) 

 

 

CC

RPE

CC

RPE

CC

RPE

CCCC

RPERPE

CC

RPE

CCCC

RPERPE

127

Figure 3‐2.4 CD68 and iNOS Immunohistochemistry in eyes with geographic atrophy 

(group V) or disciform scarring (group VI) 

 

(a)  CD68 positive cells were seen at the edges of areas of atrophy, in line with the 

remnant RPE (arrow) in a group V eye from an 84 year old man. Few ramified CD68 

positive cells were found in the choroid immediately beneath the atrophic region.  

 

(b)  The same eye in (a). iNOS expressing cells were not found within BrM or choroid. 

 

(c)  A group VI eye from an 80 year old man with an “inactive” disciform scar. Numerous 

plump CD68 positive cells are present within the scar (arrows). 

 

(d)  The same eye in (c).  iNOS positive cells are absent. 

 

(e)  A group VI eye from 76 year old man with exudative neovascular AMD, in which 

strongly CD68 positive cells are found within the scar (arrows) and in the choroid, in 

perivascular locations (arrowhead).  

 

(f)  The same eye in (e). Choroidal perivascular cells (arrows) and endothelial cells express 

iNOS.  

 

Bar markers: approx. 100μm 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

128

3.2.4 Discussion  

The relationship between macrophages and the development of lesions specific to 

age‐related macular degeneration, particularly choroidal neovascularisation, is 

likely to be complex. Emerging evidence suggests that normal recruitment and 

turnover of the resident choroidal macrophage population may, in fact, protect 

against the development of AMD‐like lesions 231, 233.   

 

The current study suggests that resident choroidal macrophages are present in all 

eyes and, since they do not express iNOS, are phenotypically distinct from 

classically activated, inflammatory macrophages. The choroidal immune 

microenvironment appears to be tightly controlled. RPE cells express macrophage 

chemoattractant protein‐1 334, which facilitates macrophage recruitment. However, 

RPE cells also express immunomodulatory molecules such as complement factor 

H 335, transforming growth factor‐β1 162, interleukin‐1 receptor antagonist 163, 

pigment epithelium‐derived factor, somatostatin and interleukin‐10 164, preventing 

newly recruited macrophages from developing an inflammatory program. RPE 

cells can also suppress activated T cells 336 and initiate Fas‐Fas ligand mediated 

apoptosis of infiltrating immune cells 157.  

 

BrM macrophages were not found in significant numbers until eyes developed at 

least a thin, continuous layer of BLamD, together with a large amount of 

membranous debris (soft drusen). This suggests that while the RPE is relatively 

intact, local control of  macrophage recruitment and programming is not 

significantly altered until a large amount of extracellular membranous/lipid 

material accumulates. However, once moderate to severe RPE abnormalities 

develop (thick continuous late BLamD), BrM macrophages increase irrespective of 

the amount of membranous debris present. Surprisingly, iNOS expression was not 

a feature of BrM macrophages in any eye. This suggests that although some 

129

immunomodulatory capacity is lost once RPE are compromised, the mechanisms 

that prevent infiltration of BrM by classically activated macrophages appear 

robust. The same does not appear to hold for resident choroidal, or newly 

recruited choroidal macrophages, evidenced by their expression of iNOS once RPE 

abnormalities (continuous BLamD) and membranous debris are present.  

 

The presence of extracellular debris and dead or compromised cells (RPE) attracts 

components of the innate immune system, including acute phase proteins, natural 

autoantiabodies and complement components 337. Complement components and 

other acute phase proteins have been found in drusen 263 and BLamD 338. An excess 

build up of debris or inadequate regulation of innate immune activation may thus 

initiate damaging inflammatory cascades. The presence of iNOS expressing 

macrophages in the choroid of eyes with continuous BLamD and membranous 

debris suggests alteration of normal immune regulation within the choroid in 

early AMD.  

 

Macrophage nitric oxide production has cytotoxic amd proangiogenic effects in 

the choroid and retina 248 and is involved in pathological ocular neovascularisation 

339. Both iNOS and vascular endothelial growth factor expression have been noted 

in macrophages and endothelial cells in excised neovascular membranes 121, 247. The 

observation that a high BrM macrophage count is associated with subclinical CNV 

suggests that BrM macrophages may overcome local RPE immunomodulation and 

express iNOS in these eyes. Although this could not be confirmed in the current 

study, the presence of iNOS expressing cells in the choroid and scar of the active 

disciform lesion supports the idea that pro‐inflammatory macrophages are 

involved in active neovascular processes.  

 

Subclinical CNV is found in 41.7% of eyes with geographic atrophy 10, suggesting 

that neovascularisation is a self‐limiting process in many AMD eyes. However, 

130

individuals may be predisposed to progression to neovascular membrane 

formation due to environmental and/or genetic risk factors. That the fellow eye of 

eyes with subclinical CNV also had high BrM macrophage counts lends support to 

this, and is also consistent with the clinical observation that these eyes are at 

higher risk of developing CNV 340. 

 

The significance of iNOS expression by RPE cells in normal aged eyes is unclear. 

In vitro, RPE cells express iNOS after exposure to ischaemic 341 or inflammatory 342 

stimuli. As a part of normal ageing, ischaemia due to choroidal capillary fallout 

may stimulate RPE iNOS expression.  

 

Ideally, CD68 and iNOS double‐immunohistochemistry should be used for 

phenotypic studies. However, finding colour products easily co‐visualised in the 

presence of both RPE and melanocyte pigment proved challenging. Pigment also 

interferes with fluorophores, so that use of immunofluorescence double‐labelling 

can be equally problematic. It is possible some of the choroidal CD68 expressing 

cells in this study are activated dendritic cells and not macrophages, and that the 

perivascular iNOS expressing cells are pericytes. Further immunophentyping of 

the normal human resident choroidal macrophage population is needed to 

understand their role in homeostasis and AMD. 

 

In summary, while resident choroidal macrophages are present in all eyes, BrM 

macrophages are associated with accumulation of BLamD and membranous 

debris, corresponding to clinical evidence of early AMD. Choroidal macrophages 

in these eyes developed a pro‐inflammatory phenotype, suggesting an altered 

choroidal immune microenvironment. Macrophages are implicated in the 

neovascular process, in a mechanism possibly involving a switch in programming 

evidenced by iNOS expression.  

131

 

 

 

S E R U M   A U T O A N T I B O D Y   S T U D I E S

4

132

4 . 1 C O M P A R I S O N O F T H E A N T I - R E T I N A L A U T O A N T I B O D Y P R O F I L E

I N E A R L Y , N E O V A S C U L A R & A T R O P H I C A M D

4.1.1 Introduction  

A number of previous studies (reviewed in Section 2.6) have identified an 

association between serum anti‐retinal autoantibodies and early, neovascular and 

atrophic AMD. It appears more than one autoantibody may be involved, although 

their significance to AMD pathogenesis is still uncertain.  

 

This study used a single detection method, western blotting, to identify anti‐

retinal autoantibodies in the serum of normal individuals as well as those with 

early, neovascular or atrophic AMD. Since restriction of autoantibodies to one IgG 

subclass is a feature of pathological autoimmunity 317, the IgG subclass of 

autoantibodies was identified. 

133

4.1.2 Methods  

4 . 1 . 2 . 1 S t u d y   s e r um  

4.1.2.1.1 Blue Mountains Eye Study 

Control, early AMD and GA serum came from the Blue Mountains Eye Study 

(BMES), a population‐based survey conducted in a geographically defined area 

west of Sydney, Australia 18. Non‐institutionalised, permanent residents of two 

postcode areas, aged 49 years or older, were invited to participate between 1992 

and 1994. A total of 3654 (82.4% of the eligible) individuals were enrolled. Ocular 

examination and detailed grading of retinal photographs was conducted at 

baseline, and 5 343 and 10 years 344 later. The study was approved by the Western 

Sydney Area Health Service Human Research Ethics Committee and written 

consent was obtained from all participants.  

 

The Wisconsin Age‐related Maculopathy Grading System 15, with slight 

modifications, was used to define early AMD as either the presence of soft, 

indistinct or reticular drusen, or the presence of both RPE abnormalities and soft 

distinct drusen in the macula area (within a 3000 μm radius of the fovea). A total 

of 191 participants had signs of early AMD at baseline.  

 

The International Classification and Grading System 16 was used to define 

geographic atrophy as a discrete area  of retinal de‐pigmentation characterised by 

sharp borders and the presence of visible choroidal vessels, occupying an area at 

least 175μm in diameter. A total of 39 participants had geographic atrophy at 

baseline. 

 

Normal controls were aged 60 years or over and had an absence of ocular disease.  

 

 

134

4.1.2.1.2 Intravitreal Triamcinolone Study 

Serum for neovascular AMD came from the Intravitreal Triamcinolone Study 

(IVTAS), a randomised trial of a single dose of intravitreal triamcinolone acetonide 

(4mg) for neovascular AMD 345. Patients referred or presenting to the Retina Unit 

of the Sydney Eye Hospital (Sydney, Australia) were invited to participate if they 

met the following criteria: (1) newly diagnosed neovascular AMD with any classic 

component (≤3.5 Macular Photocoagulation Study disc areas, subfoveal or within 

199μm from the foveal centre) 346; (2) aged 60 years or older; (3) had visual 

symptoms less than a year; (4) visual acuity 20/200 or better; (5) with clear media; 

(6) were offered and declined laser photocoagulation. The exclusion criteria were: 

(1) other serious eye disease, including diabetic retinopathy, hypertensive 

retinopathy, macular dystrophy, angioid streaks, high myopia (>8 dioptres), 

glaucoma (with glaucomatous field loss), epiretinal membranes, macular hole and 

nystagmus; (2) the use of systemic corticosteroids (prednisone ≥5mg/d) or any 

drug that affects the macula, including chloroquine, hydroxycholoroquine 

sulphate, thioridazine and cholorpromazine; (3) any condition, physical, mental or 

social, that would affect regular follow up; and (4) any condition that would 

prevent photographic or angiographic documentation.  

 

A total of 139 participants were enrolled in the study. Informed consent was 

obtained from each participant. The study was conducted in accordance with the 

principles of the Declaration of Helsinki and was approved by the Southern 

Eastern Sydney Area Health Service Research Ethics Committee.  

 

Baseline serum was collected before administration of triamcinolone or placebo.  

 

 

 

 

135

4.1.2.1.3 Serum used in autoantibody assays 

Further inclusion criteria for all participants, from the BMES or IVTAS cohorts, 

included: (i) absence of autoimmune disease or history of autoimmune disease; (ii) 

serum that had undergone fewer than two freeze‐thaw cycles (to ensure integrity 

of serum immunoglobulins); and (iii) serum without evidence of haemolysis (to 

prevent interference with autoantibody binding). 

 

Available serum that fulfilled all the selection criteria totaled 47 participants with 

early AMD and 14 participants with GA from the BMES, and 74 participants with 

neovascular AMD from the IVTAS. A total of 16 normal controls from the BMES 

were also included. All serum was stored after collection at ‐80oC until use. 

 

4 . 1 . 2 . 2 Au t o a n t i b o d y   a s s a y  

Detailed descriptions of protein isolation and quantification, electrophoresis, 

western blotting, detection antibodies, chemiluminescence reagents and associated 

buffers can be found in the Appendices (A&D‐G). 

 

4.1.2.2.1 Preparation of human retinal proteins for electrophoresis 

Isolated human retinae within 12 hours post mortem, from 4 healthy donors 

(mean age 40.25 +/‐ 7.89 years) without eye disease, were homogenised in 

phosphate‐buffered saline (PBS) and lysis buffer containing salt buffer, sterile 

water, Mini‐Complete protease inhibitor cocktail (Boehringer Mannheim, 

Germany) and NP40. Homogenates were placed on an orbital shaker on ice at 

50rpm for 20 minutes and centrifuged at 4000rpm for 5 minutes at 4oC. 

Supernatants were collected, pooled and stored at ‐20oC until use. Protein 

concentration was determined as 7mg/ml using Bio‐Rad’s protein assay (Bio‐Rad 

Laboratories, Hercules, California, USA), in microtitre plates with bovine serum 

albumin as standard. Retinal homogenates were diluted 1:2 in SDS‐glycine buffer 

136

containing 0.02% β‐mercaptoethanol. Samples were heated for 2 minutes at 100 oC 

and clarified by centrifugation at 3000rpm for 3 minutes.  

 

4.1.2.2.2 Electrophoresis and western blotting 

Approximately 3μg of protein was applied per 1 mm of SDS‐polyacrylamide gel. 

For the early experiments, a 12% resolving gel (4% stacking) was poured and set 

prior to electrophoresis. Because of the entire range of retinal proteins is present in 

whole retinal homogenates, these gels failed to separate the higher molecular 

weight proteins well. Later experiments used a 4‐20% linear gradient SDS‐

polyacrylamide gel (Ready Gel from Bio‐Rad Laboratories). All gels used had a 

single small well for loading the protein standard (Kaleidoscope precision plus 

protein standard, Bio‐Rad Laboratories) and a large “prep” well that ran almost 

the entire length of the gel which allowed retinal proteins from the same aliquot to 

be applied across the whole gel. Proteins were separated by electrophoresis at 

200V, 100mA and at room temperature for 30‐40min (depending on ambient 

temperature). Gels were electro‐blotted onto Hybond P membrane (Amersham 

Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England) at 60V, 200mA for 4 hours on ice 

at 4oC.  

 

4.1.2.2.3 Detection of serum anti‐retinal autoantibodies 

Transblots were incubated in 5% tween tris‐buffered saline (TTBS), ph 7.4, for 1 

hour at room temperature to block non‐specific binding. Serum from each 

participant was reacted with the transblots overnight at room temperature. A 

multiscreen apparatus (Bio‐Rad Laboratories, see Appendix G) allowed the large 

area of blotted protein to be sequestered into individual chambers, such that a 

single blot could be used to test serum from up to 18 individuals. Each well had a 

total volume of 600μL, which also permitted significant savings in detection 

antibodies and reagents. From this step onwards, blots were kept in the 

multiscreen apparatus until the final wash step was complete. 

137

 

An optimal serum dilution of 1:200 (in 0.05% TTBS) was found after trials to 

minimise background reactivity. After overnight incubation in serum, transblots 

were washed twice for 10 minutes with 0.05% TTBS, and once for 10 minutes with 

TBS. Transblots were incubated with the detection antibody (see below) for 1 hour 

at room temperature, followed by two 10‐minute washes in 0.05% TTBS, and a 10‐

minute wash in TBS. Blots were removed from the multiscreen apparatus at this 

point and incubated in enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting 

detection reagent (Amersham Pharmacia Biotech) for 2 minutes in a dark room. 

Transblots were then placed in plastic sleeves and exposed to Hyperfilm ECL 

(Amersham Pharmacia Biotech) for 1‐3 minutes to detect autoantibody binding. 

Initially, the 3 minute exposure time was used. It was later found that a 1 minute 

exposure resulted in adequate films. Thus earlier blots appear much darker than 

later blots (Figures 4.1‐4.3). Equivocal ECL film results were adjudicated by two 

masked assessors. Dilution buffer without serum acted as a negative control in 

each experiment, and serum from a patient with known autoimmune retinopathy 

acted as a positive control. 

 

4.1.2.2.4 Antibodies used to detect serum autoantibodies 

To detect autoantibody binding, transblots that had been incubated in participant 

serum overnight were incubated with a HRP‐conjugated secondary antibody. 

Initially, serum from each participant was tested with a goat anti‐human IgGAM 

(Zymed Invitrogen) detection antibody. This is a polyclonal antibody that 

recognises both heavy and light chains of human IgG, IgA and IgM.  All tests were 

repeated at least once. Serum testing positive for anti‐retinal autoantibodies with 

the IgGAM detection antibody was then tested in 4 separate experiments, using 

fresh blots, with one of the following monoclonal antibodies: anti‐human IgG1, 

anti‐human IgG2, anti‐human IgG3 and anti‐human IgG4 (all HRP‐conjugated, 

mouse anti‐human, Zymed Invitrogen). Based on past reports, it was anticipated 

138

that the majority of autoantibodies would belong to the IgG class. However, an 

unexpectedly small proportion of IgGAM‐detected autoantibodies were found to 

belong to one of the four IgG subclasses. It was subsequently decided that serum 

testing positive with the anti‐IgGAM detection antibody, but negative using anti‐

IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, would be re‐tested using HRP‐conjugated monoclonal 

mouse anti‐human IgM (Zymed Invitrogen). All detection antibodies were diluted 

1:10 000 in TBS. 

 

4 . 1 . 2 . 3 S t a t i s t i c s  

Contingency tables comparing the proportions of participants with serum 

autoantibodies in the following groups: (i) controls vs. early AMD; (ii) controls vs. 

GA; (iii) controls vs. neovascular AMD; (iv) early AMD vs. neovascular AMD; (v) 

early AMD vs. GA; and (vi) neovascular AMD vs. GA, were evaluated by the χ2 

test, using SPSS (v15.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA).  

 

 

139

4.1.3 Results  

Anti‐retinal autoantibodies were found in all groups, including 25% of controls, 

when the anti‐IgGAM detection antibody was used (Table 4.1‐1). Multiple bands 

of reactivity were frequently found in the same individual (Figures 4.1‐1 – 4.1‐3). 

The complexity of the reactivity patterns made comparisons between groups 

difficult. Autoantibodies reacted against antigens in the following molecular 

weight ranges: 70‐90kD, 40‐50kD and around 30kD. High molecular weight 

(>120kD) antigens were rare. 

 

Only a small proportion of serum tested positive for IgG autoantibodies with the 

monoclonal anti‐IgG1‐4 detection antibodies (Figures 4.1‐1 – 4.1‐3). IgG4 

autoantibodies were rarest, found only in one participant with early AMD. 

Antigens were similar to those targeted by anti‐IgGAM detected autoantibodies. 

Of note, participants with early AMD and GA had the highest proportion of IgG 

autoantibodies and the largest numbers of participants with IgG autoantibodies 

belonging to more than one subclass (Table 4.1‐1). 

 

IgM autoantibodies were more frequently found in participants with neovascular 

AMD. However, it should be noted that IgM autoantibodies may be more 

prevalent than suggested in Table 4.1‐1, since only IgGAM positive and IgG1‐4 

negative serum was tested. 

 

140

Table 4‐1  Serum anti‐retinal autoantibodies in controls and in early, neovascular and atrophic AMD: summary of findings 

 

 

IgG1 IgG2 IgG3 IgG4

Control (n=16) 66.1 +/- 5.8 6/10 4/16

25%2

(13%) 0 0 2 0 0 2

Early AMD (n=47) 72.9 +/- 6.8 17/30 27/47

(49%)16

(34%) 5 8 11 1 1 10 (21%)

Neovascular AMD (n=74) 76.9 +/- 7.2 31/43 26/74

(35%)8

(11%) 2 7 0 0 7 11 (15%)

GA (n=14) 85.3 +/- 6.1 4/10 7/14

(50%)6

(43%) 4 4 5 0 1 0 (0%)

IgG autoantibodies by subclassMean Age (years +/-SD)

Sex (M/F)

Anti-IgGAM detected autoantibodies

IgM Non-IgG Non-IgM

Anti-IgG detected autoantibodies (all

subclasses)

 

 

 

Number of participants in each group with IgG autoantibodies belonging to more than one subclass: 

Control= 0; Early AMD = 8; Neovascular AMD = 2; Geographic atrophy =

141

 Figure 4.1‐1  Western blot‐detected anti‐retinal autoantibodies in normal controls and 

participants with geographic atrophy 

 

Anti-IgGAM detection antibody

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

121

79

41

31.6

202

17.8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 201 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 201 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

4131.6

202

17.8

121

79

4131.6

202

17.8

121

79

4131.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

Anti-IgG1 detection antibody

Anti-IgG2 detection antibody

Anti-IgG3 detection antibody

Anti-IgG4 detection antibody

142

Figure 4.1‐1   Western blot‐detected anti‐retinal autoantibodies in normal controls and 

participants with geographic atrophy 

 

Rows 1‐8: blots of serum from normal controls. Rows 1‐4 represent serum with anti‐

IgGAM detected autoantibodies. Rows 5‐8 represent serum without anti‐IgGAM detected 

autoantibodies  

 

Rows 9‐20: blots of serum from GA participants. Rows 9‐16 represent serum with anti‐

IgGAM detected autoantibodies. Rows 17‐20 represent serum without anti‐IgGAM 

detected autoantibodies  

 

Each column represents western blot results from the same individual 

143

Figure 4.1‐2 Western blot‐detected anti‐retinal autoantibodies in participants with early 

AMD 

 

 

Anti-IgGAM detection antibody

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 311 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

Anti-IgG1 detection antibody

Anti-IgG2 detection antibody

Anti-IgG3 detection antibody

Anti-IgG4 detection antibody

144

Figure 4.1‐2  Western blot‐detected anti‐retinal autoantibodies in participants with early 

AMD 

 

Rows 1‐27: early AMD participants with anti‐IgGAM detected autoantibodies  

 

Rows 28‐31:  early AMD participants without anti‐IgGAM detected autoantibodies  

 

Each column represents western blot results from the same individual 

145

Figure 4.1‐3 Western blot‐detected anti‐retinal autoantibodies in participants with 

neovascular AMD 

 

 

Anti-IgGAM detection antibody

Anti-IgG1 detection antibody

Anti-IgG2 detection antibody

Anti-IgG3 detection antibody

Anti-IgG4 detection antibody

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

123

79

40

31

16.9

205 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

123

79

40

31

16.9

205123

79

40

31

16.9

205123

79

40

31

16.9

205 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 311 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

121

79

41

31.6

202

17.8

146

Figure 4.1‐3   Western blot‐detected anti‐retinal autoantibodies in participants with 

neovascular AMD 

 

Rows 1‐26: neovascular AMD participants with anti‐IgGAM detected autoantibodies  

 

Row 27: positive control – patient with known autoimmune retinopathy 

 

Rows 28‐31:  neovascular AMD participants without anti‐IgGAM detected autoantibodies  

 

Each column represents western blot results from the same individual 

 

 

 

147

Participants with early AMD were four times more likely to have anti‐IGAM 

detected autoantibodies compared to controls (p= 0.0025; χ2=5.028; 95% CI = 1.1‐

14.4). Participants with neovascular or atrophic AMD were no more likely to have 

anti‐IgGAM or anti‐IgG(1‐4) detected autoantibodies than controls (Table 3.1‐2). 

 

Participants with GA were seven times more likely to have anti‐IgG(1‐4) detected 

autoantibodies compared to participants with neovascular AMD (Fisher’s exact p 

= 0.005; 95% CI = 1.9 – 26.3). 

 

Participants with early AMD were 1.6 times more likely to have anti‐IgGAM 

detected autoantibodies compared to participants with neovascular AMD (p = 

0.016, χ2 = 5.813, 95% CI = 1.6 – 2.4), and three times more likely to have anti‐IgG(1‐

4) detected autoantibodies (p = 0.001, χ2 =, 95% CI = 1.6 – 7.1). 

 

 

148

Table 4‐2  Comparison of Anti‐IgGAM and anti‐IgG detected autoantibodies in control, 

early AMD, neovascular AMD and atrophic AMD participants 

 

IgGAM autoantibodies

absent

IgGAM autoantibodies

presentp

IgG autoantibodies

absent

IgG autoantibodies

presentp

Control 12 4 14 2

Early AMD 20 27 29 18

Control 12 4 14 2

Neovascular AMD 48 26 66 8

Control 12 4 14 2

GA 6 7 7 6

Neovascular AMD 48 26 66 8

GA 6 7 7 6

Early AMD 20 27 30 17

GA 6 7 7 6

Early AMD 20 27 30 17

Neovascular AMD 48 26 66 8

0.092

0.005*

0.535

0.001*

0.143

0.227

0.817

0.016*

0.025* 0.115

10.436

 

149

4.1.4 Discussion  

The study confirms that complex repertoires of autoantibodies against retinal 

antigens can be found in all individuals, including those without evidence of eye 

disease. Despite this, individuals with early AMD had significantly more anti‐

retinal autoantibodies compared to normal controls and to participants with 

neovascular AMD.  

 

In early AMD, it is possible that anti‐retinal autoantibodies arise as a consequence 

of the accumulation of extracellular debris in the form of BLinD, BLamD and soft 

drusen. At least some of the constituents of these deposits have been shown to be 

retinal in origin (see Sections 2.2.3). Although retinal antigens regularly leave the 

ocular compartment via the blood inside ocular‐derived APCs 158, autoimmune 

responses are not mounted against them 160. This is because ocular‐derived APCs 

are programmed by a local microenvironment rich in immunosuppressive 

cytokines 159, to which RPE cells contribute significantly (see Section 2.2.1.7). RPE 

abnormalities are present in early AMD, and this may compromise their 

immunomodulatory capacity, favouring the formation of autoantibodies which, in 

this context could be considered pathological.  

 

Another explanation could be that the autoantibodies are part of the natural 

autoantibody repertoire, deployed to remove the build‐up of extracellular debris. 

In this context the autoantibodies may be protective, since the efficient removal of 

extracellular debris can prevent uncontrolled activation of inflammatory cascades 

(see Section 2.6).  

 

It is not clear why anti‐IgG detected autoantibodies were more frequently found in 

participants with GA compared to participants with neovascular AMD. The only 

previous study examining this group found the opposite – that patients with GA 

150

were less likely to have immunofluorescence‐detected autoantibodies compared to 

those with early or neovascular AMD 299 (see Section 2.6.3). In GA, Muller cell end 

processes replace the absent RPE 311 and maintain the blood‐retina barrier. There is 

some remodelling at the edges of areas of atrophy 8 and it is possible that these 

liberate cellular debris. However, it is difficult to argue that the amount of 

remodelling in GA could exceed that in neovascular AMD, a group in which 

autoantibodies were found in surprisingly few individuals. 

 

One possible explanation for this observation is that perhaps the majority of 

autoantibodies in neovascular AMD belong to the IgM class. However, results 

from this study cannot determine if this is the case, since not all IgGAM‐detected 

autoantibodies were retested with the IgM detection antibody. The results do, 

however, highlight the need to assess not just the autoantibody target antigen, but 

the autoantibody immunoglobulin class and subclass in future studies. Changes in 

the whole autoantibody repertoire will also need to be assessed, since it may be 

complex, even in normal controls 

 

The numbers of individuals with IgG autoantibodies in this sample were small 

compared with previous studies (see Table 2.6‐1, Section 2.6). This may be due to 

the highly specific nature of the monoclonal antibodies used, and the relatively 

low concentration of serum tested. Because IgG autoantibodies were less common 

than expected, and because they targeted more than one antigen, it was difficult to 

assess subclass restriction. The significance of a larger number of participants with 

IgG autoantibodies belonging to more than one class in the GA and early AMD 

groups is not known and requires further investigation.  

 

This study is limited by the small control group, which is not age‐matched. The 

use of a large control group to establish normal autoantibody patterns of reactivity 

will be important in future studies. A number of limitations are inherent in the use 

151

of Western blotting as a detection method. Firstly, proteins are separated under 

reducing conditions, such that their tertiary structure is lost, leading to loss of 

conformational epitopes. Secondly, when using retinal proteins from whole retinal 

homogenates, the molecular weight of autoantibody target proteins can only be 

approximated, since the number of proteins in each gel and transblot is large. 

Related to this limitation is the inability to measure autoantibody titres, since the 

identity of the target antigen is not known. Finally, it is likely that autoantibodies 

against oxidatively modified proteins and glycosylated proteins may be of more 

importance in AMD, and the concentrations of these proteins in normal retinae 

may be too minimal to allow autoantibody binding. The results of the following 

two sections should thus be interpreted with these limitations in mind. 

152

4 . 2 A N T I - R E T I N A L A U T O A N T I B O D I E S A N D D I S E A S E P R O G R E S S I O N

I N E A R L Y A M D

4.2.1 Introduction  

Although no anti‐retinal autoantibodies were found to be specific for AMD in the 

previous study, they were more frequently found in individuals with early AMD 

than controls. This study examined whether the presence of baseline anti‐retinal 

autoantibodies in participants with early AMD was associated with progression to 

advanced AMD 5 and 10 years later.  

 

4.2.2 Methods  

4 . 2 . 2 . 1 P a r t i c i p a n t s  

Participants with early AMD came from the BMES cohort as described in Section 

4.1.2. Follow up examinations took place 5 and 10 years from date of enrolment, at 

which ocular examination and fundus photography was carried out. Photographs 

were graded using the Wisconsin Grading System by masked graders, and side‐

by‐side comparisons between baseline and 5‐ and 10‐ year photographs were 

made.  

 

4 . 2 . 2 . 2 Au t o a n t i b o d y   a s s a y  

Autoantibodies were detected as described in Section 4.1.2. Detailed descriptions 

can also be found in the Appendices (A & D‐G). Since relatively few participants 

had IgG anti‐retinal autoantibodies, the relationship between IgGAM‐detected 

baseline autoantibodies and progression to advanced AMD was examined. 

 

153

4 . 2 . 2 . 3 S t a t i s t i c s  

The χ2 test was used to evaluate the association between baseline autoantibodies 

and progression to advanced AMD at the 5‐ and 10‐year examinations, using SPSS 

(v15.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA). A p value of < 0.05 was considered significant. 

 

154

4.2.3 Results  

A total of 11 participants (23.4%) with early AMD progressed to advanced AMD 

by the time the 10‐year follow up examinations were conducted, including 5 

participants (10.6%) who developed advanced AMD 5 years after baseline (Table 

4.2.1). Three of these 5 participants developed unilateral neovascular AMD, and 

two developed atrophic AMD in one eye and neovascular AMD in the fellow eye.  

 

No association as found between the presence of anti‐IgGAM detected 

autoantibodies at baseline and progression to advanced AMD at 5 years (χ2 = 

0.015, Fisher’s exact p = 1.00). A further four participants (12.7%) progressed to 

advanced AMD at the 10‐year follow up examination.  Two of these participants 

developed neovascular AMD and two developed atrophic AMD (Table 4.2.1). 

Additionally, 2 participants with neovascular AMD at the 5 year examination 

developed neovascular AMD in the fellow eye at the 10 year examination. There 

was no association between baseline autoantibodies and progression to advanced 

AMD over the 10 year‐period (χ2 = 0.156, Fisher’s exact p = 1.00).  

 

155

Table 4‐3   Baseline serum anti‐retinal autoantibodies and progression to advanced 

AMD at 5 and 10 years. 

 

 

No Yes No Yes

RR

95% CI

chi square

Fisher's exact p

0.30 - 6.00

0.156

1.00

0.16 - 4.90

0.150

1.00

Autoantibodies Absent

Autoantibodies Present

Advanced AMD at 5 years Advanced AMD at 10 years

18

24 24

3

3

0.90

2

3

17

1.35

 

 

 

156

4.2.4 Discussion  

This study could not find an association between the presence of baseline anti‐

retinal autoantibodies and progression to advanced AMD over a 5 to 10 year 

period. There are several possible explanations for these findings. Firstly, although 

more participants with early AMD had anti‐retinal autoantibodies than controls, it 

is possible that these are a mix of both natural and pathological autoantibodies (as 

discussed in Section 4.1.4). Secondly, it is likely that any autoantibody‐AMD 

disease associations can only be found by examining changes in the whole 

repertoire, which may be subtle and would require larger sample sizes and more 

sophisticated tests. Finally, the autoantibody repertoire in each individual is likely 

to be dynamic, and may have changed many times in the 5 to 10 years between 

follow up visits. 

 

The study is limited by the small sample size, and larger studies with more 

frequent autoantibody assays between follow up visits are necessary to confirm 

the findings. It should also be noted that participants with pigmentary changes 

alone were not included in the original BMES definition of early AMD. Since this 

group may represent a separate early AMD phenotype (see Section 3.1), its 

inclusion in future comparative studies is important. 

 

157

4 . 3 A N T I - R E T I N A L A U T O A N T I B O D I E S A N D V I S I O N L O S S I N

N E O V A S C U L A R A M D

4.3.1 Introduction  

Patients with neovascular AMD are at high risk of rapid vision loss (Section 2.1.4). 

Identifying eyes most at‐risk of rapid deterioration is thus an important part of 

assessment and management. Although the previous study found that 

neovascular AMD participants were no more likely than controls to have anti‐

retinal autoantibodies, this study examined whether the presence of baseline anti‐

retinal autoantibodies was associated with disease progression over a 24‐month 

period. Ideally, this association should be studied in a cohort of individuals with 

neovascular AMD, followed up for 12 to 24 months, without any treatment or 

interventions. However, given the availability of palliative treatments for 

neovascular AMD, such a study would be unethical to undertake and difficult to 

recruit for. 

 

The study cohort was thus selected from the IVTAS. Vision loss was chosen as the 

outcome measure because it is a continuous variable which allowed the use of 

linear mixed effects modelling to compare autoantibody‐positive and 

autoantibody‐negative participants. This was the best available statistical method 

that could account for all of the following potential interactions, for each 

individual participant, at each follow‐up time point: (i) triamcinolone (or placebo) 

treatment and vision; (ii) anti‐retinal autoantibodies and treatment; and (iii) anti‐

retinal autoantibodies and vision. 

 

158

4.3.2 Methods  

4 . 3 . 2 . 1 P a r t i c i p a n t s  

Participants with neovascular AMD came from the IVTAS, as described in Section 

4.1.2. The study took place over 12 months and was later extended to 24 months. 

Participants were randomised to receive an injection of intravitreal triamcinolone 

or subconjunctival isotonic saline, given after baseline visual acuity (VA) 

measurements. Treatment assignment and masking protocols have been described 

in detail elsewhere 345. Best‐corrected visual acuity was measured by trained 

examiners using a back‐lit, self‐calibrating logMAR chart (Lighthouse 

International, LaDalle, IL, USA) at 2.40, 0.95 and 0.60 metres. VA was evaluated at 

baseline, 3, 6, 12, 18 and 24 months after entry into the study. Angiographic 

grading of CNV as classic or occult was based on Macular Photocoagulation Study 

guidelines 346. 

 

Serum was collected prior to the administration of triamcinolone or placebo. Of 

the 139 participants (151 eyes) enrolled in the trial, baseline serum from 74 

participants (82 eyes) had undergone fewer than two freeze‐thaw cycles, was not 

haemolysed, and was thus included in this study. 

 

4 . 3 . 2 . 2 Au t o a n t i b o d y   a s s a y  

Autoantibodies were detected as described in Section 4.1.2. Detailed descriptions 

can also be found in Appendices (A&D‐G).  

 

4 . 3 . 2 . 3 S t a t i s t i c s  

S‐Plus (v6.2, Insightful Corporation, Seatle, WA, USA) was used to fit linear mixed 

effect models to VA. Eye identification number was incorporated as a random 

effect, treatment group and baseline autoantibody status as fixed effects, and 

month as a fixed covariate. In all cases, both two and three‐way interactions were 

159

fitted and dropped from the final models if not significant. Two‐tailed tests with a 

5% level of significance were used throughout.  

160

4.3.3 Results  

Participant characteristics and baseline autoantibody status are summarised in 

Table 4.3‐1. Classic neovascular lesions were present in 59 eyes, and occult lesions 

in 23 eyes. There was no difference in gender, mean age (t72 = ‐1.21, p = 0.23) or rate 

of vision loss over 24 months (t286 = ‐1.05, p = 0.30) between the triamcinolone 

(n=32) and placebo (n=42) treated groups.  

 

There were no significant differences in age (p = 0.504) or sex (p = 0.266) between 

autoantibody‐positive and autoantibody‐negative participants. Autoantibodies 

appeared to be more frequently found in participants with classic neovascular 

lesions (12%) compared to those with occult lesions (4%), although this was not 

statistically significant (p = 0.431).  

 

Linear mixed effects modelling showed that anti‐IgGAM detected baseline anti‐

retinal autoantibodies were not associated with vision loss over a 24 month period 

(t288 = ‐0.12, p = 0.91) (Figure 4.3.1). However, participants with baseline anti‐IgG(1‐

4) detected autoantibodies lost, on average, 0.7 more letters of vision on a logMAR 

chart per month (or 8.4 more letters per year) than other participants (t289 = ‐2.17, p 

= 0.03), irrespective of treatment group (Figure 4.3‐2) 

 

 

 

161

Table 4‐4   Participant characteristics and baseline anti‐retinal autoantibody status 

 

 

 

IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG

Placebo 42/42 18/24 77.4 +/- 6.6 16/42 (38%) 0 2 0 0 2 (5%)

Triamcinolone 40/32 13/19 75.3 +/- 7.8 10/32 (31%) 2 5 0 0 6 (9%)

Number of Patients/Eyes M/F Mean age

(years)IgGAM-detected autoantibodies

IgG1-4 detected autoantibodies

 

 

 

162

Figure 4.3‐1  Vision loss over 24 months in anti‐retinal autoantibody positive 

participants vs. anti‐retinal autoantibody negative participants (anti‐IgGAM detected 

autoantibodies) 

 

 

0

10

20

30

40

50

60

0 3 6 12 18 24

Month

Mea

n Lo

gMar

Acu

ity

Anti-IgGAM detected autoantibodies absent

Anti-IgGAM detected autoantibodies present

p = 0.91

163

Figure 4.3‐2  Vision loss over 24 months in anti‐retinal autoantibody positive 

participants vs. anti‐retinal autoantibody negative participants (anti‐IgG detected 

autoantibodies) 

 

 

0

10

20

30

40

50

60

0 3 6 12 18 24

Month

Mea

n Lo

gMar

Acu

ity

Anti-IgG detected autoantibodies absent

Anti-IgG detected autoantibodies present

p = 0.03

 

164

4.3.4 Discussion  

That baseline IgG anti‐retinal autoantibodies were associated with more rapid 

vision loss over 24 months in participants with neovascular AMD is surprising. 

Few participants with neovascular AMD had IgG anti‐retinal compared to those 

with early AMD or GA (see Section 4.1). The finding may thus be an indication 

that in neovascular AMD, the anti‐retinal autoantibodies are pathological and not 

a part of the natural repertoire. It is also interesting that this association was not 

observed with anti‐IgGAM detected autoantibodies, which may have belonged to 

any of three immunoglobulin classes, and were thus less specific.  

 

The neovascular disease process involves the growth of abnormal and highly 

permeable new vessels into the sub‐RPE or sub‐retinal space. The high rate of 

extracellular matrix turnover and vascular remodelling in neovascular AMD 

lesions may liberate significant cellular debris.  There is disruption of the external 

blood‐retina barrier, and the presence of local pro‐inflammatory cytokines 224. All 

of these factors may produce circumstances favourable to the initiation of 

autoimmune events. These explanations are at this stage, speculative, since the 

number of participants with IgG autoantibodies in this cohort was small and the 

findings will need to be confirmed in larger studies. However, the recruitment of 

participants with neovascular AMD into a study without interventions will 

continue to prove challenging. 

 

It should also be noted that the main outcome measure, visual acuity, may be 

influenced by other factors and may not be the most reliable indicator of disease 

progression. Outcome measures such as changes in lesion size and vessel leakage 

should be included in future studies where possible. 

165

 

 

 

S U M M A R Y   &   C O N C L U S I O N S

5

166 

The histopathological threshold at which normal ageing becomes early AMD is 

defined by the presence of both BLinD and a continuous layer of BLamD. Because 

these eyes appear clinically normal in the majority of cases, more sophisticated 

clinical tests will be required for early detection. Evidence for distinct early AMD 

phenotypes and two separate pathways along which early AMD can progress can 

be used to inform future clinical classifications systems, as well as genetic and 

epidemiological studies. 

 

BLamD and membranous debris accumulation may increase the recruitment of 

macrophages to sub‐macular Bruch’s membrane and alter the programming of 

resident choroidal macrophages.  This observation requires confirmation, 

particularly in the context of subclinical CNV. Animal models that allow 

macrophage‐associated genes to be knocked out are likely to further elaborate 

normal resident choroidal macrophage function. However, interpretation of data 

from animal models will require better characterisation of human resident 

choroidal macrophages, about which little is known.   

 

The relationship between anti‐retinal autoantibodies and AMD is probably 

complex. It is unlikely that one or two autoantibodies will be specifically 

associated with AMD. Rather, future studies will need to assess the whole 

autoantibody repertoire to discern subtle changes in the reaction patterns. For 

these studies to be meaningful, a large control group is necessary, so that normal 

patterns of reactivity can be established. A number of approaches allow the 

examination of complex autoantibody repertoires each with strengths and 

limitations.  Software designed to assess densitometry differences on western blots 

have been used 296. While this approach does not allow identification of the target 

antigens, it can be used to direct proteomic studies.  A combination of 3‐D gel 

electrophoresis and liquid chromatography/mass spectrometry can then 

determine the amino acid sequence of the target proteins.  This approach, 

167 

however, does not allow rapid screening of a large number of serum samples, a 

problem that can be overcome by the use of protein microarrays. Made‐to‐order 

arrays with thousands of purified proteins are becoming increasingly available 

and affordable. The difficulty with this approach is in determining the appropriate 

proteins for an autoantibody assay. It is likely that a combination of all three 

methods will determine the significance of anti‐retinal autoantibodies in AMD 

pathogenesis. 

168 

R E F E R E N C E S  

 

1.  Liem, A.T., Keunen, J.E., and van Norren, D., Foveal densitometry in adult‐onset diffuse drusen. American Journal of Ophthalmology, 1992. 114(2): p. 149‐57. 

2.  de Jong, P.T., Age‐related macular degeneration. New England Journal of Medicine, 2006. 355(14): p. 1474‐85. 

3.  Sarks, S.H. and Sarks, J.P., Age‐related maculopathy: Nonneovascular age‐related macular degeneration and the evolution of geographic atrophy, in Medical retina, S. Ryan, Editor. 2001, Mosby: St Louis. p. 1064‐1099. 

4.  Gass, J.D., Pathogenesis of disciform detachment of the neuroepithelium. American Journal of Ophthalmology, 1967. 63(3): p. Suppl:1‐139. 

5.  Sarks, S.H. Changes in the region of the choriocapillaris in aging and degeneration. in 23rd International Congress of Ophthalmology. 1978. Kyoto, Japan: Excerpta Medica. 

6.  Gass, J.D., Drusen and disciform macular detachment and degeneration. Archives of Ophthalmology, 1973. 90(3): p. 206‐17. 

7.  Green, W.R. and Key, S.N., 3rd, Senile macular degeneration: A histopathologic study. Transactions of the American Ophthalmological Society, 1977. 75: p. 180‐254. 

8.  Sarks, J.P., Sarks, S.H., and Killingsworth, M.C., Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye, 1988. 2(Pt 5): p. 552‐77. 

9.  Sunness, J.S., The natural history of geographic atrophy, the advanced atrophic form of age‐related macular degeneration. Molecular Vision, 1999. 5: p. 25. 

10.  Sarks, S.H., Ageing and degeneration in the macular region: A clinico‐pathological study. British Journal of Ophthalmology, 1976. 60(5): p. 324‐41. 

11.  Sunness, J.S., Gonzalez‐Baron, J., Bressler, N.M., Hawkins, B., and Applegate, C.A., The development of choroidal neovascularization in eyes with the geographic atrophy form of age‐related macular degeneration. Ophthalmology, 1999. 106(5): p. 910‐9. 

12.  Pauleikhoff, D., Neovascular age‐related macular degeneration: Natural history and treatment outcomes. Retina, 2005. 25(8): p. 1065‐84. 

13.  Ferris, F.L., 3rd, Fine, S.L., and Hyman, L., Age‐related macular degeneration and blindness due to neovascular maculopathy. Archives of Ophthalmology, 1984. 102(11): p. 1640‐2. 

14.  De la Paz, M.A., Pericak‐Vance, M.A., Haines, J.L., and Seddon, J.M., Phenotypic heterogeneity in families with age‐related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology, 1997. 124(3): p. 331‐43. 

15.  Klein, R., Davis, M.D., Magli, Y.L., Segal, P., Klein, B.E., and Hubbard, L., The wisconsin age‐related maculopathy grading system. Ophthalmology, 1991. 98(7): p. 1128‐34. 

 

169 

16.  The International Age‐Related Maculopathy Study Group, An international classification and grading system for age‐related maculopathy and age‐related macular degeneration. The international arm epidemiological study group. Survey of Ophthalmology, 1995. 39(5): p. 367‐74. 

17.  Klein, R., Klein, B.E., and Linton, K.L., Prevalence of age‐related maculopathy. The beaver dam eye study. Ophthalmology, 1992. 99(6): p. 933‐43. 

18.  Mitchell, P., Smith, W., Attebo, K., and Wang, J.J., Prevalence of age‐related maculopathy in australia. The blue mountains eye study. Ophthalmology, 1995. 102(10): p. 1450‐60. 

19.  VanNewkirk, M.R., Nanjan, M.B., Wang, J.J., Mitchell, P., Taylor, H.R., and McCarty, C.A., The prevalence of age‐related maculopathy: The visual impairment project. Ophthalmology, 2000. 107(8): p. 1593‐600. 

20.  Robman, L.D., Tikellis, G., Garrett, S.K., Harper, C.A., McNeil, J.J., Taylor, H.R., and McCarty, C.A., Baseline ophthalmic findings in the vitamin e, cataract and age‐related maculopathy (vecat) study. Australian & New Zealand Journal of Ophthalmology, 1999. 27(6): p. 410‐6. 

21.  Hofman, A., Grobbee, D.E., Jong, P.T.V.M., and Ouweland, F.A., Determinants of disease and disability in the elderly: The rotterdam elderly study. European Journal of Epidemiology, 1991. 7(4): p. 403‐422. 

22.  Age‐Related Eye Disease Study Research Group, The age‐related eye disease study system for classifying age‐related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The age‐related eye disease study report number 6. American Journal of Ophthalmology, 2001. 132(5): p. 668‐681. 

23.  Evans, J.R., Risk factors for age‐related macular degeneration. Progress in Retinal & Eye Research., 2001. 20(2): p. 227‐53. 

24.  Taylor, H.R., Keeffe, J.E., Vu, H.T., Wang, J.J., Rochtchina, E., Pezzullo, M.L., and Mitchell, P., Vision loss in australia. Medical Journal of Australia, 2005. 182(11): p. 565‐8. 

25.  Smith, W., Assink, J., Klein, R., Mitchell, P., Klaver, C.C., Klein, B.E., Hofman, A., Jensen, S., Wang, J.J., and de Jong, P.T., Risk factors for age‐related macular degeneration: Pooled findings from three continents. Ophthalmology., 2001. 108(4): p. 697‐704. 

26.  Klein, R., Peto, T., Bird, A., and Vannewkirk, M.R., The epidemiology of age‐related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology., 2004. 137(3): p. 486‐95. 

27.  Age‐Related Eye Disease Study Research Group, Potential public health impact of age‐related eye disease study results: Areds report no. 11. Archives of Ophthalmology, 2003. 121(11): p. 1621‐4. 

28.  Tomany, S.C., Wang, J.J., Van Leeuwen, R., Klein, R., Mitchell, P., Vingerling, J.R., Klein, B.E.K., Smith, W., and De Jong, P.T.V.M., Risk factors for incident age‐related macular degeneration: Pooled findings from 3 continents. Ophthalmology, 2004. 111(7): p. 1280‐7. 

29.  Klein, R., Klein, B.E.K., Knudtson, M.D., Meuer, S.M., Swift, M., and Gangnon, R.E., Fifteen‐year cumulative incidence of age‐related macular degeneration: The beaver dam eye study. Ophthalmology, 2007. 114(2): p. 253‐62. 

170 

30.  Wang, J.J., Mitchell, P., Smith, W., and Cumming, R.G., Bilateral involvement by age related maculopathy lesions in a population. British Journal of Ophthalmology, 1998. 82(7): p. 743‐7. 

31.  Gudnadottir, G.S., Magnusson, K.P., Stefansson, E., Jonasson, F., Helgadottir, G., and Sigurdsson, H., The time pattern of bilateral exudative age‐related macular degeneration. Acta Ophthalmologica Scandinavica, 2005. 83(3): p. 333‐6. 

32.  Klein, R., Klein, B.E.K., Tomany, S.C., Meuer, S.M., and Huang, G.‐H., Ten‐year incidence and progression of age‐related maculopathy: The beaver dam eye study. Ophthalmology, 2002. 109(10): p. 1767‐1779. 

33.  Wang, J.J., Foran, S., Smith, W., and Mitchell, P., Risk of age‐related macular degeneration in eyes with macular drusen or hyperpigmentation: The blue mountains eye study cohort. Arch Ophthalmol, 2003. 121(5): p. 658‐663. 

34.  van Leeuwen, R., Klaver, C.C., Vingerling, J.R., Hofman, A., and de Jong, P.T., The risk and natural course of age‐related maculopathy: Follow‐up at 6 1/2 years in the rotterdam study. Archives of Ophthalmology., 2003. 121(4): p. 519‐26. 

35.  Age‐Related Eye Disease Study Group, The age‐related eye disease study severity scale for age‐related macular degeneration: Areds report no. 17. Archives of Ophthalmology, 2005. 123(11): p. 1484‐98. 

36.  Age‐Related Eye Disease Study Research Group, A simplified severity scale for age‐related macular degeneration: Areds report no. 18. Archives of Ophthalmology, 2005. 123(11): p. 1570‐4. 

37.  Bressler, N.M., Munoz, B., Maguire, M.G., Vitale, S.E., Schein, O.D., Taylor, H.R., and West, S.K., Five‐year incidence and disappearance of drusen and retinal pigment epithelial abnormalities. Waterman study. Archives of Ophthalmology, 1995. 113(3): p. 301‐8. 

38.  Tikellis, G., Robman, L.D., Dimitrov, P., Nicolas, C., McCarty, C.A., and Guymer, R.H., Characteristics of progression of early age‐related macular degeneration: The cardiovascular health and age‐related maculopathy study. Eye, 2007. 21(2): p. 169‐76. 

39.  Klein, R., Klein, B.E., Jensen, S.C., and Meuer, S.M., The five‐year incidence and progression of age‐related maculopathy: The beaver dam eye study. Ophthalmology, 1997. 104(1): p. 7‐21. 

40.  Macular Photocoagulation Study Group, Risk factors for choroidal neovascularization in the second eye of patients with juxtafoveal or subfoveal choroidal neovascularization secondary to age‐related macular degeneration. Archives of Ophthalmology, 1997. 115(6): p. 741‐7. 

41.  Sarks, J., Tang, K., Killingsworth, M., Arnold, J., and Sarks, S., Development of atrophy of the retinal pigment epithelium around disciform scars. British Journal of Ophthalmology, 2006. 90(4): p. 442‐6. 

42.  Sunness, J.S., Margalit, E., Srikumaran, D., Applegate, C.A., Tian, Y., Perry, D., Hawkins, B.S., and Bressler, N.M., The long‐term natural history of geographic atrophy from age‐related macular degeneration: Enlargement of atrophy and implications for interventional clinical trials. Ophthalmology, 2007. 114(2): p. 271‐7. 

171 

43.  Klein, R., Klein, B.E., Linton, K.L., and DeMets, D.L., The beaver dam eye study: The relation of age‐related maculopathy to smoking. American Journal of Epidemiology, 1993. 137(2): p. 190‐200. 

44.  Seddon, J.M., Willett, W.C., Speizer, F.E., and Hankinson, S.E., A prospective study of cigarette smoking and age‐related macular degeneration in women. JAMA, 1996. 276(14): p. 1141‐6. 

45.  Thornton, J., Edwards, R., Mitchell, P., Harrison, R.A., Buchan, I., and Kelly, S.P., Smoking and age‐related macular degeneration: A review of association. Eye, 2005. 19(9): p. 935‐44. 

46.  Khan, J.C., Thurlby, D.A., Shahid, H., Clayton, D.G., Yates, J.R., Bradley, M., Moore, A.T., Bird, A.C., and Genetic Factors in, A.M.D.S., Smoking and age related macular degeneration: The number of pack years of cigarette smoking is a major determinant of risk for both geographic atrophy and choroidal neovascularisation. British Journal of Ophthalmology, 2006. 90(1): p. 75‐80. 

47.  Delcourt, C., Diaz, J.L., Ponton‐Sanchez, A., and Papoz, L., Smoking and age‐related macular degeneration. The pola study. Pathologies oculaires liees a lʹage. Archives of Ophthalmology, 1998. 116(8): p. 1031‐5. 

48.  Chan, D., Cigarette smoking and age‐related macular degeneration. Optometry & Vision Science, 1998. 75(7): p. 476‐84. 

49.  Vingerling, J.R., Hofman, A., Grobbee, D.E., and de Jong, P.T., Age‐related macular degeneration and smoking. The rotterdam study. Archives of Ophthalmology, 1996. 114(10): p. 1193‐6. 

50.  Tomany, S.C., Wang, J.J., van Leeuwen, R., Klein, R., Mitchell, P., Vingerling, J.R., Klein, B.E.K., Smith, W., and de Jong, P.T.V.M., Risk factors for incident age‐related macular degeneration:  Pooled findings from 3 continents. Ophthalmology, 2004. 111(7): p. 1280‐1287. 

51.  Klein, R., Klein, B.E., and Moss, S.E., Relation of smoking to the incidence of age‐related maculopathy. The beaver dam eye study. American Journal of Epidemiology, 1998. 147(2): p. 103‐10. 

52.  Vingerling, J.R., Dielemans, I., Bots, M.L., Hofman, A., Grobbee, D.E., and de Jong, P.T., Age‐related macular degeneration is associated with atherosclerosis. The rotterdam study. American Journal of Epidemiology, 1995. 142(4): p. 404‐9. 

53.  Seddon, J.M. and Chen, C.A., The epidemiology of age‐related macular degeneration. International Ophthalmology Clinics., 2004. 44(4): p. 17‐39. 

54.  Klein, R., Klein, B.E.K., Tomany, S.C., and Cruickshanks, K.J., The association of cardiovascular disease with the long‐term incidence of age‐related maculopathy:  The beaver dam eye study. Ophthalmology, 2003. 110(6): p. 1273‐1280. 

55.  Klaver, C.C., Kliffen, M., van Duijn, C.M., Hofman, A., Cruts, M., Grobbee, D.E., van Broeckhoven, C., and de Jong, P.T., Genetic association of apolipoprotein e with age‐related macular degeneration. American Journal of Human Genetics., 1998. 63(1): p. 200‐6. 

56.  Schmidt, S., Saunders, A.M., De La Paz, M.A., Postel, E.A., Heinis, R.M., Agarwal, A., Scott, W.K., Gilbert, J.R., McDowell, J.G., Bazyk, A., Gass, J.D., Haines, J.L., and Pericak‐Vance, M.A., Association of the apolipoprotein e gene with age‐related macular 

172 

degeneration: Possible effect modification by family history, age, and gender. Molecular Vision., 2000. 6: p. 287‐93. 

57.  Schmidt, S., Klaver, C., Saunders, A., Postel, E., De La Paz, M., Agarwal, A., Small, K., Udar, N., Ong, J., Chalukya, M., Nesburn, A., Kenney, C., Domurath, R., Hogan, M., Mah, T., Conley, Y., Ferrell, R., Weeks, D., de Jong, P.T., van Duijn, C., Haines, J., Pericak‐Vance, M., and Gorin, M., A pooled case‐control study of the apolipoprotein e (apoe) gene in age‐related maculopathy. Ophthalmic Genetics., 2002. 23(4): p. 209‐23. 

58.  Baird, P.N., Richardson, A.J., Robman, L.D., Dimitrov, P.N., Tikellis, G., McCarty, C.A., and Guymer, R.H., Apolipoprotein (apoe) gene is associated with progression of age‐related macular degeneration (amd). Human Mutation, 2006. 27(4): p. 337‐42. 

59.  Bojanowski, C.M., Shen, D., Chew, E.Y., Ning, B., Csaky, K.G., Green, W.R., Chan, C.C., and Tuo, J., An apolipoprotein e variant may protect against age‐related macular degeneration through cytokine regulation. Environmental & Molecular Mutagenesis, 2006. 47(8): p. 594‐602. 

60.  Tikellis, G., Sun, C., Gorin, M.B., Klein, R., Klein, B.E.K., Larsen, E.K.M., Siscovick, D.S., Hubbard, L.D., and Wong, T.Y., Apolipoprotein e gene and age‐related maculopathy in older individuals: The cardiovascular health study. Archives of Ophthalmology, 2007. 125(1): p. 68‐73. 

61.  Wong, T.Y., Shankar, A., Klein, R., Bray, M.S., Couper, D.J., Klein, B.E., Sharrett, A.R., and Folsom, A.R., Apolipoprotein e gene and early age‐related maculopathy: The atherosclerosis risk in communities study. Ophthalmology, 2006. 113(2): p. 255‐9. 

62.  Pang, C.P., Baum, L., Chan, W.M., Lau, T.C., Poon, P.M., and Lam, D.S., The apolipoprotein e epsilon4 allele is unlikely to be a major risk factor of age‐related macular degeneration in chinese. Ophthalmologica., 2000. 214(4): p. 289‐91. 

63.  Klein, R., Klein, B.E.K., Knudtson, M.D., Wong, T.Y., Shankar, A., and Tsai, M.Y., Systemic markers of inflammation, endothelial dysfunction, and age‐related maculopathy. American Journal of Ophthalmology, 2005. 140(1): p. 35.e1‐35.e. 

64.  Klein, R., Klein, B.E., Marino, E.K., Kuller, L.H., Furberg, C., Burke, G.L., and Hubbard, L.D., Early age‐related maculopathy in the cardiovascular health study. Ophthalmology., 2003. 110(1): p. 25‐33. 

65.  Dasch, B., Fuhs, A., Behrens, T., Meister, A., Wellmann, J., Fobker, M., Pauleikhoff, D., and Hense, H.W., Inflammatory markers in age‐related maculopathy: Cross‐sectional analysis from the muenster aging and retina study. Archives of Ophthalmology, 2005. 123(11): p. 1501‐6. 

66.  Schaumberg, D.A., Christen, W.G., Buring, J.E., Glynn, R.J., Rifai, N., and Ridker, P.M., High‐sensitivity c‐reactive protein, other markers of inflammation, and the incidence of macular degeneration in women. Archives of Ophthalmology, 2007. 125(3): p. 300‐5. 

67.  Seddon, J.M., Gensler, G., Milton, R.C., Klein, M.L., and Rifai, N., Association between c‐reactive protein and age‐related macular degeneration. JAMA, 2004. 291(6): p. 704‐10. 

68.  Seddon, J.M., George, S., Rosner, B., and Rifai, N., Progression of age‐related macular degeneration: Prospective assessment of c‐reactive protein, interleukin 6, and other cardiovascular biomarkers. Archives of Ophthalmology, 2005. 123(6): p. 774‐82. 

173 

69.  Sivaprasad, S., Adewoyin, T., Bailey, T.A., Dandekar, S.S., Jenkins, S., Webster, A.R., and Chong, N.V., Estimation of systemic complement c3 activity in age‐related macular degeneration. Archives of Ophthalmology, 2007. 125(4): p. 515‐9. 

70.  Wu, K.H.C., Tan, A.G., Rochtchina, E., Favaloro, E.J., Williams, A., Mitchell, P., and Wang, J.J., Circulating inflammatory markers and hemostatic factors in age‐related maculopathy: A population‐based case‐control study. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2007. 48(5): p. 1983‐8. 

71.  Chua, B., Flood, V., Rochtchina, E., Wang, J.J., Smith, W., and Mitchell, P., Dietary fatty acids and the 5‐year incidence of age‐related maculopathy. Archives of Ophthalmology, 2006. 124(7): p. 981‐6. 

72.  Tan, J.S.L., Mitchell, P., Rochtchina, E., and Wang, J.J., Statins and the long‐term risk of incident age‐related macular degeneration: The blue mountains eye study. American Journal of Ophthalmology, 2007. 143(4): p. 685‐687. 

73.  Age‐Related Eye Disease Study Research, G., A randomized, placebo‐controlled, clinical trial of high‐dose supplementation with vitamins c and e, beta carotene, and zinc for age‐related macular degeneration and vision loss: Areds report no. 8. Archives of Ophthalmology, 2001. 119(10): p. 1417‐36. 

74.  Chiu, C.J., Hubbard, L.D., Armstrong, J., Rogers, G., Jacques, P.F., Chylack, L.T., Jr., Hankinson, S.E., Willett, W.C., and Taylor, A., Dietary glycemic index and carbohydrate in relation to early age‐related macular degeneration. American Journal of Clinical Nutrition, 2006. 83(4): p. 880‐6. 

75.  Hammond, C.J., Webster, A.R., Snieder, H., Bird, A.C., Gilbert, C.E., and Spector, T.D., Genetic influence on early age‐related maculopathy :  A twin study. Ophthalmology, 2002. 109(4): p. 730‐736. 

76.  Seddon, J.M., Cote, J., Page, W.F., Aggen, S.H., and Neale, M.C., The us twin study of age‐related macular degeneration: Relative roles of genetic and environmental influences. Archives of Ophthalmology., 2005. 123(3): p. 321‐7. 

77.  Seddon, J.M., Ajani, U.A., and Mitchell, B.D., Familial aggregation of age‐related maculopathy. American Journal of Ophthalmology, 1997. 123(2): p. 199‐206. 

78.  Klaver, C.C., Wolfs, R.C., Assink, J.J., van Duijn, C.M., Hofman, A., and de Jong, P.T., Genetic risk of age‐related maculopathy. Population‐based familial aggregation study. Archives of Ophthalmology., 1998. 116(12): p. 1646‐51. 

79.  Assink, J.J., Klaver, C.C., Houwing‐Duistermaat, J.J., Wolfs, R.C., van Duijn, C.M., Hofman, A., and de Jong, P.T., Heterogeneity of the genetic risk in age‐related macular disease: A population‐based familial risk study. Ophthalmology, 2005. 112(3): p. 482‐7. 

80.  Conley, Y.P., Thalamuthu, A., Jakobsdottir, J., Weeks, D.E., Mah, T., Ferrell, R.E., and Gorin, M.B., Candidate gene analysis suggests a role for fatty acid biosynthesis and regulation of the complement system in the etiology of age‐related maculopathy. Hum. Mol. Genet., 2005. 14(14): p. 1991‐2002. 

81.  Klaver, C.C. and Allikmets, R., Genetics of macular dystrophies and implications for age‐related macular degeneration. Developments in Ophthalmology., 2003. 37: p. 155‐69. 

174 

82.  Conley, Y.P., Jakobsdottir, J., Mah, T., Weeks, D.E., Klein, R., Kuller, L., Ferrell, R.E., and Gorin, M.B., Cfh, elovl4, plekha1 and loc387715 genes and susceptibility to age‐related maculopathy: Areds and chs cohorts and meta‐analyses. Human Molecular Genetics, 2006. 15(21): p. 3206‐18. 

83.  Stone, E.M., Braun, T.A., Russell, S.R., Kuehn, M.H., Lotery, A.J., Moore, P.A., Eastman, C.G., Casavant, T.L., and Sheffield, V.C., Missense variations in the fibulin 5 gene and age‐related macular degeneration. New England Journal of Medicine, 2004. 351(4): p. 346‐53. 

84.  Tuo, J., Smith, B.C., Bojanowski, C.M., Meleth, A.D., Gery, I., Csaky, K.G., Chew, E.Y., and Chan, C.C., The involvement of sequence variation and expression of cx3cr1 in the pathogenesis of age‐related macular degeneration. FASEB Journal., 2004. 18(11): p. 1297‐9. 

85.  Zareparsi, S., Buraczynska, M., Branham, K.E.H., Shah, S., Eng, D., Li, M., Pawar, H., Yashar, B.M., Moroi, S.E., Lichter, P.R., Petty, H.R., Richards, J.E., Abecasis, G.R., Elner, V.M., and Swaroop, A., Toll‐like receptor 4 variant d299g is associated with susceptibility to age‐related macular degeneration. Hum. Mol. Genet., 2005. 14(11): p. 1449‐1455. 

86.  Goverdhan, S.V., Howell, M.W., Mullins, R.F., Osmond, C., Hodgkins, P.R., Self, J., Avery, K., and Lotery, A.J., Association of hla class i and class ii polymorphisms with age‐related macular degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2005. 46(5): p. 1726‐1734. 

87.  Edwards, A.O., Ritter, R., 3rd, Abel, K.J., Manning, A., Panhuysen, C., and Farrer, L.A., Complement factor h polymorphism and age‐related macular degeneration. Science, 2005. 308(5720): p. 421‐4. 

88.  Haines, J.L., Hauser, M.A., Schmidt, S., Scott, W.K., Olson, L.M., Gallins, P., Spencer, K.L., Kwan, S.Y., Noureddine, M., Gilbert, J.R., Schnetz‐Boutaud, N., Agarwal, A., Postel, E.A., and Pericak‐Vance, M.A., Complement factor h variant increases the risk of age‐related macular degeneration. Science, 2005. 308(5720): p. 419‐21. 

89.  Hageman, G.S., Anderson, D.H., Johnson, L.V., Hancox, L.S., Taiber, A.J., Hardisty, L.I., Hageman, J.L., Stockman, H.A., Borchardt, J.D., Gehrs, K.M., Smith, R.J.H., Silvestri, G., Russell, S.R., Klaver, C.C.W., Barbazetto, I., Chang, S., Yannuzzi, L.A., Barile, G.R., Merriam, J.C., Smith, R.T., Olsh, A.K., Bergeron, J., Zernant, J., Merriam, J.E., Gold, B., Dean, M., and Allikmets, R., A common haplotype in the complement regulatory gene factor h (hf1/cfh) predisposes individuals to age‐related macular degeneration. PNAS, 2005. 102(20): p. 7227‐7232. 

90.  Klein, R.J., Zeiss, C., Chew, E.Y., Tsai, J.Y., Sackler, R.S., Haynes, C., Henning, A.K., Sangiovanni, J.P., Mane, S.M., Mayne, S.T., Bracken, M.B., Ferris, F.L., Ott, J., Barnstable, C., and Hoh, J., Complement factor h polymorphism in age‐related macular degeneration. Science., 2005. 308(5720): p. 385‐9. 

91.  Chen, L.J., Liu, D.T.L., Tam, P.O.S., Chan, W.M., Liu, K., Chong, K.K.L., Lam, D.S.C., and Pang, C.P., Association of complement factor h polymorphisms with exudative age‐related macular degeneration. Molecular Vision, 2006. 12: p. 1536‐42. 

92.  Sepp, T., Khan, J.C., Thurlby, D.A., Shahid, H., Clayton, D.G., Moore, A.T., Bird, A.C., and Yates, J.R., Complement factor h variant y402h is a major risk determinant for geographic atrophy and choroidal neovascularization in smokers and nonsmokers. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2006. 47(2): p. 536‐40. 

175 

93.  DeAngelis, M.M., Ji, F., Kim, I.K., Adams, S., Capone, A., Jr., Ott, J., Miller, J.W., and Dryja, T.P., Cigarette smoking, cfh, apoe, elovl4, and risk of neovascular age‐related macular degeneration. Archives of Ophthalmology, 2007. 125(1): p. 49‐54. 

94.  Seddon, J.M., Francis, P.J., George, S., Schultz, D.W., Rosner, B., and Klein, M.L., Association of cfh y402h and loc387715 a69s with progression of age‐related macular degeneration. JAMA, 2007. 297(16): p. 1793‐1800. 

95.  Gold, B., Merriam, J.E., Zernant, J., Hancox, L.S., Taiber, A.J., Gehrs, K., Cramer, K., Neel, J., Bergeron, J., Barile, G.R., Smith, R.T., Group, A.M.D.G.C.S., Hageman, G.S., Dean, M., and Allikmets, R., Variation in factor b (bf) and complement component 2 (c2) genes is associated with age‐related macular degeneration. Nature Genetics, 2006. 38(4): p. 458‐62. 

96.  DeWan, A., Liu, M., Hartman, S., Zhang, S.S.‐M., Liu, D.T.L., Zhao, C., Tam, P.O.S., Chan, W.M., Lam, D.S.C., Snyder, M., Barnstable, C., Pang, C.P., and Hoh, J., Htra1 promoter polymorphism in wet age‐related macular degeneration. Science, 2006. 314(5801): p. 989‐992. 

97.  Yang, Z., Camp, N.J., Sun, H., Tong, Z., Gibbs, D., Cameron, D.J., Chen, H., Zhao, Y., Pearson, E., Li, X., Chien, J., Dewan, A., Harmon, J., Bernstein, P.S., Shridhar, V., Zabriskie, N.A., Hoh, J., Howes, K., and Zhang, K., A variant of the htra1 gene increases susceptibility to age‐related macular degeneration. Science, 2006. 314(5801): p. 992‐3. 

98.  Yoshida, T., DeWan, A., Zhang, H., Sakamoto, R., Okamoto, H., Minami, M., Obazawa, M., Mizota, A., Tanaka, M., Saito, Y., Takagi, I., Hoh, J., and Iwata, T., Htra1 promoter polymorphism predisposes japanese to age‐related macular degeneration. Molecular Vision, 2007. 13: p. 545‐8. 

99.  Shuler, R.K., Jr., Hauser, M.A., Caldwell, J., Gallins, P., Schmidt, S., Scott, W.K., Agarwal, A., Haines, J.L., Pericak‐Vance, M.A., and Postel, E.A., Neovascular age‐related macular degeneration and its association with loc387715 and complement factor h polymorphism. Archives of Ophthalmology, 2007. 125(1): p. 63‐7. 

100.  Tanimoto, S., Tamura, H., Ue, T., Yamane, K., Maruyama, H., Kawakami, H., and Kiuchi, Y., A polymorphism of loc387715 gene is associated with age‐related macular degeneration in the japanese population. Neuroscience Letters, 2007. 414(1): p. 71‐4. 

101.  Pulido, J.S., McConnell, J.P., Lennon, R.J., Bryant, S.C., Peterson, L.M., Berger, P.B., Somers, V., and Highsmith, W.E., Relationship between age‐related macular degeneration‐associated variants of complement factor h and loc387715 with coronary artery disease. Mayo Clinic Proceedings, 2007. 82(3): p. 301‐7. 

102.  Ross, R.J., Bojanowski, C.M., Wang, J.J., Chew, E.Y., Rochtchina, E., Ferris, F.L., III, Mitchell, P., Chan, C.‐C., and Tuo, J., The loc387715 polymorphism and age‐related macular degeneration: Replication in three case‐control samples. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2007. 48(3): p. 1128‐1132. 

103.  Schaumberg, D.A., Hankinson, S.E., Guo, Q., Rimm, E., and Hunter, D.J., A prospective study of 2 major age‐related macular degeneration susceptibility alleles and interactions with modifiable risk factors. Archives of Ophthalmology, 2007. 125(1): p. 55‐62. 

104.  Scholl, H.P.N., Fleckenstein, M., Issa, P.C., Keilhauer, C., Holz, F.G., and Weber, B.H.F., An update on the genetics of age‐related macular degeneration. Molecular Vision, 2007. 13: p. 196‐205. 

176 

105.  Brown, M.M., Brown, G.C., Sharma, S., Stein, J.D., Roth, Z., Campanella, J., and Beauchamp, G.R., The burden of age‐related macular degeneration: A value‐based analysis.[erratum appears in curr opin ophthalmol. 2006 jun;17(3):265]. Current Opinion in Ophthalmology, 2006. 17(3): p. 257‐66. 

106.  Gehrs, K.M., Anderson, D.H., Johnson, L.V., and Hageman, G.S., Age‐related macular degeneration‐‐emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine, 2006. 38(7): p. 450‐71. 

107.  Wright, S.E., Keeffe, J.E., and Thies, L.S., Direct costs of blindness in australia. Clinical & Experimental Ophthalmology, 2000. 28(3): p. 140‐2. 

108.  Brown, G.C., Brown, M.M., Sharma, S., Stein, J.D., Roth, Z., Campanella, J., and Beauchamp, G.R., The burden of age‐related macular degeneration: A value‐based medicine analysis. Transactions of the American Ophthalmological Society, 2005. 103: p. 173‐84. 

109.  Brown, M.M., Brown, G.C., Stein, J.D., Roth, Z., Campanella, J., and Beauchamp, G.R., Age‐related macular degeneration: Economic burden and value‐based medicine analysis. Canadian Journal of Ophthalmology, 2005. 40(3): p. 277‐87. 

110.  Evans, J.R., Antioxidant vitamin and mineral supplements for slowing the progression of age‐related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews, 2006(2): p. CD000254. 

111.  Guymer, R.H. and Chong, E.W., Modifiable risk factors for age‐related macular degeneration. Medical Journal of Australia, 2006. 184(9): p. 455‐8. 

112.  Smith, B.T., Joseph, D.P., and Grand, M.G., Treatment of neovascular age‐related macular degeneration: Past, present and future directions. Current Opinion in Ophthalmology, 2007. 18(3): p. 240‐4. 

113.  Rosenfeld, P.J., Brown, D.M., Heier, J.S., Boyer, D.S., Kaiser, P.K., Chung, C.Y., Kim, R.Y., and Group, M.S., Ranibizumab for neovascular age‐related macular degeneration. New England Journal of Medicine, 2006. 355(14): p. 1419‐31. 

114.  Hogan, M.J., Alvarado, J.A., and Weddell, J.E., Chapter 9. Retina., in Histology of the human eye. An atlas and textbook. 1971, W.C. Saunders Company: Philadelphia. p. 393‐522. 

115.  Bok, D. and Young, R.W., Phagocytic properties of the pigment epithelium, in The retinal pigment epithelium, K.M. Zinn and M.F. Marmor, Editors. 1979, Harvard University Press: Cambridge, MA. p. 148‐74. 

116.  Zarbin, M.A., Current concepts in the pathogenesis of age‐related macular degeneration. Arch Ophthalmol, 2004. 122(4): p. 598‐614. 

117.  Guymer, R., Luthert, P., and Bird, A., Changes in bruchʹs membrane and related structures with age. Progress in Retinal & Eye Research, 1999. 18(1): p. 59‐90. 

118.  Guo, L., Hussain, A.A., Limb, G.A., and Marshall, J., Age‐dependent variation in metalloproteinase activity of isolated human bruchʹs membrane and choroid. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1999. 40(11): p. 2676‐82. 

 

177 

119.  Elner, S.G., Elner, V.M., Kindzelskii, A.L., Horino, K., Davis, H.R., Todd, R.F., 3rd, Glagov, S., and Petty, H.R., Human rpe cell lysis of extracellular matrix: Functional urokinase plasminogen activator receptor (upar), collagenase and elastase. Experimental Eye Research., 2003. 76(5): p. 585‐95. 

120.  Korte, G.E., Reppucci, V., and Henkind, P., Rpe destruction causes choriocapillary atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1984. 25(10): p. 1135‐45. 

121.  Grossniklaus, H.E., Ling, J.X., Wallace, T.M., Dithmar, S., Lawson, D.H., Cohen, C., Elner, V.M., Elner, S.G., and Sternberg, P., Jr., Macrophage and retinal pigment epithelium expression of angiogenic cytokines in choroidal neovascularization. Molecular Vision., 2002. 8: p. 119‐26. 

122.  Higgins, G.T., Wang, J.H., Dockery, P., Cleary, P.E., and Redmond, H.P., Induction of angiogenic cytokine expression in cultured rpe by ingestion of oxidized photoreceptor outer segments. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2003. 44(4): p. 1775‐82. 

123.  Mori, K., Duh, E., Gehlbach, P., Ando, A., Takahashi, K., Pearlman, J., Yang, H.S., Zack, D.J., Ettyreddy, D., Brough, D.E., Wei, L.L., and Campochiaro, P.A., Pigment epithelium‐derived factor inhibits retinal and choroidal neovascularization. Journal of Cellular Physiology, 2001. 188(2): p. 253‐63. 

124.  Kaplan, H.J., Leibole, M.A., Tezel, T., and Ferguson, T.A., Fas ligand (cd95 ligand) controls angiogenesis beneath the retina. Nature Medicine., 1999. 5(3): p. 292‐7. 

125.  Feeney‐Burns, L., Hilderbrand, E.S., and Eldridge, S., Aging human rpe: Morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1984. 25: p. 195‐200. 

126.  Green, W.R. and Enger, C., Age‐related macular degeneration histopathologic studies. The 1992 lorenz e. Zimmerman lecture. Ophthalmology, 1993. 100(10): p. 1519‐35. 

127.  van der Schaft, T.L., Mooy, C.M., de Bruijn, W.C., and de Jong, P.T., Early stages of age‐related macular degeneration: An immunofluorescence and electron microscopy study. British Journal of Ophthalmology, 1993. 77(10): p. 657‐61. 

128.  Hogan, M.J., Alvarado, J.A., and Weddell, J.E., Chapter 8. Choroid, in Histology of the human eye. An atlas and textbook. 1971, W.C. Saunders Company: Philadelphia. p. 320‐395. 

129.  Marshall, G.E., Konstas, A.G., Reid, G.G., Edwards, J.G., and Lee, W.R., Type iv collagen and laminin in bruchʹs membrane and basal linear deposit in the human macula. British Journal of Ophthalmology, 1992. 76(10): p. 607‐14. 

130.  Chong, N.H., Keonin, J., Luthert, P.J., Frennesson, C.I., Weingeist, D.M., Wolf, R.L., Mullins, R.F., and Hageman, G.S., Decreased thickness and integrity of the macular elastic layer of bruchʹs membrane correspond to the distribution of lesions associated with age‐related macular degeneration. American Journal of Pathology, 2005. 166(1): p. 241‐51. 

131.  Ahmed, J., Braun, R.D., Dunn, R.J., and Linsenmeier, R.A., Oxygen distribution in the macaque retina. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1993. 34: p. 516‐21. 

132.  Provis, J.M., Penfold, P.L., Cornish, E.E., Sandercoe, T.M., and Madigan, M.C., Anatomy and development of the macula: Specialisation and the vulnerability to macular degeneration. Clinical & Experimental Optometry, 2005. 88(5): p. 269‐81. 

178 

133.  Ramrattan, R.S., van der Schaft, T.L., Mooy, C.M., de Bruijn, W.C., Mulder, P.G., and de Jong, P.T., Morphometric analysis of bruchʹs membrane, the choriocapillaris, and the choroid in aging. Investigative Ophthalmology & Visual Science., 1994. 35(6): p. 2857‐64. 

134.  Pauleikhoff, D., Harper, C.A., Marshall, J., and Bird, A.C., Aging changes in bruchʹs membrane. A histochemical and morphologic study. Ophthalmology, 1990. 97(2): p. 171‐8. 

135.  Yoneya, S., Tso, M.O., and Shimizu, K., Patterns of the choriocapillaris. A method to study the choroidal vasculature of the enucleated human eye. International Ophthalmology, 1983. 6(2): p. 95‐9. 

136.  Lutty, G., Grunwald, J., Majji, A.B., Uyama, M., and Yoneya, S., Changes in choriocapillaris and retinal pigment epithelium in age‐related macular degeneration. Molecular Vision, 1999. 5: p. 35. 

137.  Hogan, M.J. and Alvarado, J., Studies on the human macula. Iv. Aging changes in bruchʹs membrane. Archives of Ophthalmology, 1967. 77(3): p. 410‐20. 

138.  Sarks, S.H., New vessel formation beneath the retinal pigment epithelium in senile eyes. British Journal of Ophthalmology, 1973. 57(12): p. 951‐65. 

139.  Killingsworth, M.C., Age‐related components of bruchʹs membrane in the human eye. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 1987. 225(6): p. 406‐12. 

140.  van der Schaft, T.L., de Bruijn, W.C., Mooy, C.M., Ketelaars, D.A., and de Jong, P.T., Is basal laminar deposit unique for age‐related macular degeneration? Archives of Ophthalmology., 1991. 109(3): p. 420‐5. 

141.  Karwatowski, W.S., Jeffries, T.E., Duance, V.C., Albon, J., Bailey, A.J., and Easty, D.L., Preparation of bruchʹs membrane and analysis of the age‐related changes in the structural collagens. British Journal of Ophthalmology, 1995. 79(10): p. 944‐52. 

142.  Farkas, T.G., Sylvester, V., Archer, D., and Altona, M., The histochemistry of drusen. American Journal of Ophthalmology., 1971. 71(6): p. 1206‐15. 

143.  Handa, J.T., Verzijl, N., Matsunaga, H., Aotaki‐Keen, A., Lutty, G.A., te Koppele, J.M., Miyata, T., and Hjelmeland, L.M., Increase in the advanced glycation end product pentosidine in bruchʹs membrane with age. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1999. 40(3): p. 775‐9. 

144.  Holz, F.G., Sheraidah, G., Pauleikhoff, D., and Bird, A.C., Analysis of lipid deposits extracted from human macular and peripheral bruchʹs membrane. Archives of Ophthalmology, 1994. 112(3): p. 402‐6. 

145.  Curcio, C.A., Millican, C.L., Bailey, T., and Kruth, H.S., Accumulation of cholesterol with age in human bruchʹs membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science., 2001. 42(1): p. 265‐74. 

146.  Ruberti, J.W., Curcio, C.A., Millican, C.L., Menco, B.P., Huang, J.D., and Johnson, M., Quick‐freeze/deep‐etch visualization of age‐related lipid accumulation in bruchʹs membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science., 2003. 44(4): p. 1753‐9. 

 

179 

147.  Spaide, R.F., Ho‐Spaide, W.C., Browne, R.W., and Armstrong, D., Characterization of peroxidized lipids in bruchʹs membrane. Retina, 1999. 19(2): p. 141‐7. 

148.  Starita, C., Hussain, A.A., Pagliarini, S., and Marshall, J., Hydrodynamics of ageing bruchʹs membrane: Implications for macular disease. Experimental Eye Research, 1996. 62(5): p. 565‐72, 1996. 

149.  Starita, C., Hussain, A.A., Patmore, A., and Marshall, J., Localization of the site of major resistance to fluid transport in bruchʹs membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1997. 38(3): p. 762‐7. 

150.  Moore, D.J. and Clover, G.M., The effect of age on the macromolecular permeability of human bruchʹs membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2001. 42(12): p. 2970‐5. 

151.  Hussain, A.A., Rowe, L., and Marshall, J., Age‐related alterations in the diffusional transport of amino acids across the human bruchʹs‐choroid complex. Journal of the Optical Society of America, A, Optics, Image Science, & Vision, 2002. 19(1): p. 166‐72. 

152.  Rudolf, M., Winkler, B., Aherrahou, Z., Doehring, L.C., Kaczmarek, P., and Schmidt‐Erfurth, U., Increased expression of vascular endothelial growth factor associated with accumulation of lipids in bruchʹs membrane of ldl receptor knockout mice. British Journal of Ophthalmology, 2005. 89(12): p. 1627‐30. 

153.  Witmer, A.N., Vrensen, G.F., Van Noorden, C.J., and Schlingemann, R.O., Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease. Progress in Retinal & Eye Research., 2003. 22(1): p. 1‐29. 

154.  Medawar, P.B., Immunity to homologous grafted skin: Iii. The fate of skin homografts transplanted to the brain, to subcutaneous tissue, and to the anterior chamber of the eye. British Journal of Experimental Pathology, 1948. 29: p. 58‐69. 

155.  Roberge, F.G., Caspi, R.R., and Nussenblatt, R.B., Glial retinal muller cells produce il‐1 activity and have a dual effect on autoimmune t helper lymphocytes. Antigen presentation manifested after removal of suppressive activity. Journal of Immunology, 1988. 140(7): p. 2193‐6. 

156.  Helbig, H., Gurley, R.C., Palestine, A.G., Nussenblatt, R.B., and Caspi, R.R., Dual effect of ciliary body cells on t lymphocyte proliferation. European Journal of Immunology, 1990. 20(11): p. 2457‐63. 

157.  Griffith, T.S., Brunner, T., Fletcher, S.M., Green, D.R., and Ferguson, T.A., Fas ligand‐induced apoptosis as a mechanism of immune privilege. Science., 1995. 270(5239): p. 1189‐92. 

158.  Streilein, J.W., Immunological non‐responsiveness and acquisition of tolerance in relation to immune privilege in the eye. Eye, 1995. 9(Pt 2): p. 236‐40. 

159.  Streilein, J.W., Ksander, B.R., and Taylor, A.W., Immune deviation in relation to ocular immune privilege. Journal of Immunology, 1997. 158(8): p. 3557‐60. 

160.  Streilein, J.W., Ocular immune privilege: The eye takes a dim but practical view of immunity and inflammation. Journal of Leukocyte Biology, 2003. 74(2): p. 179‐85. 

180 

161.  Baudouin, C., Fredj‐Reygrobellet, D., Jambou, D., Gastaud, P., and Lapalus, P., Hla dr and dq expression on human retinal pigment epithelial cells in vitro. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology., 1990. 228(1): p. 86‐9. 

162.  Hollborn, M., Enzmann, V., Barth, W., Wiedemann, P., and Kohen, L., Changes in the mrna expression of cytokines and chemokines by stimulated rpe cells in vitro. Current Eye Research, 2000. 20(6): p. 488‐95. 

163.  Holtkamp, G.M., Kijlstra, A., Peek, R., and de Vos, A.F., Retinal pigment epithelium‐immune system interactions: Cytokine production and cytokine‐induced changes. Progress in Retinal & Eye Research., 2001. 20(1): p. 29‐48. 

164.  Zamiri, P., Masli, S., Streilein, J.W., and Taylor, A.W., Pigment epithelial growth factor suppresses inflammation by modulating macrophage activation. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2006. 47(9): p. 3912‐8. 

165.  Bressler, S.B., Bressler, N.M., Sarks, J.P., and Sarks, S.H., Age‐related macular degeneration: Nonneovascular early amd, intermediate amd, and geographic atrophy, in Retina, S. Ryan and A.P. Schachat, Editors. 2006, Elsevier Mosby: St Louis. p. 1041‐1074. 

166.  Sarks, S.H., Council lecture. Drusen and their relationship to senile macular degeneration. Australian Journal of Ophthalmology, 1980. 8(2): p. 117‐30. 

167.  Killingsworth, M.C., Angiogenesis in early choroidal neovascularization secondary to age‐related macular degeneration. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 1995. 233(6): p. 313‐23. 

168.  Green, W.R., Histopathology of age‐related macular degeneration. Molecular Vision, 1999. 5: p. 27. 

169.  Spraul, C.W., Lang, G.E., Grossniklaus, H.E., and Lang, G.K., Histologic and morphometric analysis of the choroid, bruchʹs membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age‐related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes. Survey of Ophthalmology., 1999. 44(Suppl 1): p. S10‐32. 

170.  Loffler, K.U. and Lee, W.R., Basal linear deposit in the human macula. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 1986. 224(6): p. 493‐501. 

171.  Hirata, A. and Feeney‐Burns, L., Autoradiographic studies of aged primate macular retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1992. 33(7): p. 2079‐90. 

172.  Grau, S., Richards, P.J., Kerr, B., Hughes, C., Caterson, B., Williams, A.S., Junker, U., Jones, S.A., Clausen, T., and Ehrmann, M., The role of human htra1 in arthritic disease. J. Biol. Chem., 2006. 281(10): p. 6124‐6129. 

173.  van der Schaft, T.L., de Bruijn, W.C., Mooy, C.M., and de Jong, P.T., Basal laminar deposit in the aging peripheral human retina. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 1993. 231(8): p. 470‐5. 

174.  Grossniklaus, H.E., Miskala, P.H., Green, W.R., Bressler, S.B., Hawkins, B.S., Toth, C., Wilson, D.J., and Bressler, N.M., Histopathologic and ultrastructural features of surgically excised subfoveal choroidal neovascular lesions: Submacular surgery trials report no. 7. Archives of Ophthalmology, 2005. 123(7): p. 914‐21. 

181 

175.  Spraul, C.W., Lang, G.E., and Grossniklaus, H.E., Morphometric analysis of the choroid, bruchʹs membrane, and retinal pigment epithelium in eyes with age‐related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science., 1996. 37(13): p. 2724‐35. 

176.  Curcio, C.A. and Millican, C.L., Basal linear deposit and large drusen are specific for early age‐related maculopathy. Archives of Ophthalmology, 1999. 117(3): p. 329‐39. 

177.  Feeney‐Burns, L. and Ellersieck, M.R., Age‐related changes in the ultrastructure of bruchʹs membrane. American Journal of Ophthalmology, 1985. 100(5): p. 686‐97. 

178.  Sarks, J.P., Sarks, S.H., and Killingsworth, M.C., Evolution of soft drusen in age‐related macular degeneration. Eye, 1994. 8(Pt 3): p. 269‐83. 

179.  Sarks, S.H., Van Driel, D., Maxwell, L., and Killingsworth, M., Softening of drusen and subretinal neovascularization. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom, 1980. 100(3): p. 414‐22. 

180.  Sarks, S., Drusen and their relationship to senile macular degeneration. Australian Journal of Ophthalmology, 1980. 8: p. 117‐130. 

181.  Pauleikhoff, D., Zuels, S., Sheraidah, G.S., Marshall, J., Wessing, A., and Bird, A.C., Correlation between biochemical composition and fluorescein binding of deposits in bruchʹs membrane. Ophthalmology, 1992. 99(10): p. 1548‐53. 

182.  Curcio, C.A., Presley, J.B., Millican, C.L., and Medeiros, N.E., Basal deposits and drusen in eyes with age‐related maculopathy: Evidence for solid lipid particles. Experimental Eye Research, 2005. 80(6): p. 761‐775. 

183.  Curcio, C.A., Presley, J.B., Malek, G., Medeiros, N.E., Avery, D.V., and Kruth, H.S., Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age‐related maculopathy. Experimental Eye Research, 2005. 81(6): p. 731‐41. 

184.  Malek, G., Li, C.M., Guidry, C., Medeiros, N.E., and Curcio, C.A., Apolipoprotein b in cholesterol‐containing drusen and basal deposits of human eyes with age‐related maculopathy. American Journal of Pathology., 2003. 162(2): p. 413‐25. 

185.  Li, C.M., Clark, M.E., Chimento, M.F., and Curcio, C.A., Apolipoprotein localization in isolated drusen and retinal apolipoprotein gene expression. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2006. 47(7): p. 3119‐28. 

186.  Li, C.M., Presley, J.B., Zhang, X., Dashti, N., Chung, B.H., Medeiros, N.E., Guidry, C., and Curcio, C.A., Retina expresses microsomal triglyceride transfer protein: Implications for age‐related maculopathy. Journal of Lipid Research, 2005. 46(4): p. 628‐40. 

187.  Souied, E.H., Benlian, P., Amouyel, P., Feingold, J., Lagarde, J.P., Munnich, A., Kaplan, J., Coscas, G., and Soubrane, G., The epsilon4 allele of the apolipoprotein e gene as a potential protective factor for exudative age‐related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology., 1998. 125(3): p. 353‐9. 

188.  Lewis, H., Straatsma, B.R., and Foos, R.Y., The prevalence of macular drusen in postmortem eyes. American Journal of Ophthalmology, 1986. 102(6): p. 801‐3. 

189.  Hageman, G.S. and Mullins, R.F., Molecular composition of drusen as related to substructural phenotype. Molecular Vision., 1999. 5: p. 28. 

182 

190.  Hageman, G.S., Mullins, R.F., Russell, S.R., Johnson, L.V., and Anderson, D.H., Vitronectin is a constituent of ocular drusen and the vitronectin gene is expressed in human retinal pigmented epithelial cells. FASEB Journal., 1999. 13(3): p. 477‐84. 

191.  Johnson, L.V., Ozaki, S., Staples, M.K., Erickson, P.A., and Anderson, D.H., A potential role for immune complex pathogenesis in drusen formation. Experimental Eye Research., 2000. 70(4): p. 441‐9. 

192.  Johnson, L.V., Leitner, W.P., Staples, M.K., and Anderson, D.H., Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research, 2001. 73(6): p. 887‐96. 

193.  Coats, G., The structure of the membrane of bruch and its relation to the formation of colloid excrescences. Royal London Ophthalm Hosp Rep, 1905. XVI: p. 164‐178. 

194.  Hogan, M.J., Role of the retinal pigment epithelium in macular disease. Transactions ‐ American Academy of Ophthalmology & Otolaryngology., 1972. 76(1): p. 64‐80. 

195.  Burns, R.P. and Feeney‐Burns, L., Clinico‐morphologic correlations of drusen of bruchʹs membrane. Transactions of the American Ophthalmological Society., 1980. 78: p. 206‐25. 

196.  Sarks, S.H., Arnold, J.J., Killingsworth, M.C., and Sarks, J.P., Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: A clinicopathological study. British Journal of Ophthalmology, 1999. 83(3): p. 358‐68. 

197.  Farkas, T.G., Sylvester, V., and Archer, D., The ultrastructure of drusen. American Journal of Ophthalmology., 1971. 71(6): p. 1196‐205. 

198.  Ishibashi, T., Patterson, R., Ohnishi, Y., Inomata, H., and Ryan, S.J., Formation of drusen in the human eye. American Journal of Ophthalmology, 1986. 101(3): p. 342‐53. 

199.  Malorni, W., Iosi, F., Mirabelli, F., and Bellomo, G., Cytoskeleton as a target in menadione‐induced oxidative stress in cultured mammalian cells: Alterations underlying surface bleb formation. Chemico‐Biological Interactions, 1991. 80(2): p. 217‐36. 

200.  Malorni, W. and Donelli, G., Cell death. General features and morphological aspects. Annals of the New York Academy of Sciences, 1992. 663: p. 218‐33. 

201.  Marin‐Castano, M.E., Csaky, K.G., and Cousins, S.W., Nonlethal oxidant injury to human retinal pigment epithelium cells causes cell membrane blebbing but decreased mmp‐2 activity. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2005. 46(9): p. 3331‐40. 

202.  Crabb, J.W., Miyagi, M., Gu, X., Shadrach, K., West, K.A., Sakaguchi, H., Kamei, M., Hasan, A., Yan, L., Rayborn, M.E., Salomon, R.G., and Hollyfield, J.G., Drusen proteome analysis: An approach to the etiology of age‐related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America., 2002. 99(23): p. 14682‐7. 

203.  Fliesler, A.J. and Anderson, R.E., Chemistry and metabolism of lipids in the vertebrate retina. Progress in Lipid Research, 1983. 22(2): p. 79‐131. 

204.  Bressler, N.M., Silva, J.C., Bressler, S.B., Fine, S.L., and Green, W.R., Clinicopathologic correlation of drusen and retinal pigment epithelial abnormalities in age‐related macular degeneration. Retina., 1994. 14(2): p. 130‐42. 

183 

205.  Curcio, C.A., Medeiros, N.E., and Millican, C.L., The alabama age‐related macular degeneration grading system for donor eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1998. 39(7): p. 1085‐96. 

206.  OʹConnell, E., Neelam, K., Nolan, J., Au Eong, K.G., and Beatty, S., Macular carotenoids and age‐related maculopathy. Ann Acad Med Singapore, 2006. 35(11): p. 821‐30. 

207.  Decanini, A., Nordgaard, C.L., Feng, X., Ferrington, D.A., and Olsen, T.W., Changes in select redox proteins of the retinal pigment epithelium in age‐related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology, 2007. 143(4): p. 607‐15. 

208.  Liles, M.R., Newsome, D.A., and Oliver, P.D., Antioxidant enzymes in the aging human retinal pigment epithelium. Archives of Ophthalmology, 1991. 109(9): p. 1285‐8. 

209.  Tate, D.J., Jr., Newsome, D.A., and Oliver, P.D., Metallothionein shows an age‐related decrease in human macular retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1993. 34(7): p. 2348‐51. 

210.  Zarbin, M., Should corticosteroids be considered as part of the standard care with photodynamic therapy? Archives of Ophthalmology, 2006. 124(4): p. 563‐71. 

211.  Cohen, S.M., Olin, K.L., Feuer, W.J., Hjelmeland, L., Keen, C.L., and Morse, L.S., Low glutathione reductase and peroxidase activity in age‐related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology, 1994. 78(10): p. 791‐4. 

212.  Delcourt, C., Cristol, J.P., Leger, C.L., Descomps, B., and Papoz, L., Associations of antioxidant enzymes with cataract and age‐related macular degeneration. The pola study. Pathologies oculaires liees a lʹage. Ophthalmology, 1999. 106(2): p. 215‐22. 

213.  Binder, C.J., Shaw, P.X., Chang, M.‐K., Boullier, A., Hartvigsen, K., Horkko, S., Miller, Y.I., Woelkers, D.A., Corr, M., and Witztum, J.L., Thematic review series: The immune system and atherogenesis. The role of natural antibodies in atherogenesis. J. Lipid Res., 2005. 46(7): p. 1353‐1363. 

214.  Handa, J.T., New molecular histopathologic insights into the pathogenesis of age‐related macular degeneration. International Ophthalmology Clinics, 2007. 47(1): p. 15‐50. 

215.  Sarks, S.H., Penfold, P.L., Killingsworth, M.C., Factors influencing choroidal neovascularization in senile macular degeneration, in Ophthalmology, K. Mizuno, Editor. 1985, Elsevier Science Publishers Biomedical Division. 

216.  Penfold, P., Killingsworth, M., and Sarks, S., An ultrastructural study of the role of leucocytes and fibroblasts in the breakdown of bruchʹs membrane. Australian Journal of Ophthalmology, 1984. 12(1): p. 23‐31. 

217.  Penfold, P.L., Killingsworth, M.C., and Sarks, S.H., Senile macular degeneration: The involvement of immunocompetent cells. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 1985. 223(2): p. 69‐76. 

218.  Killingsworth, M.C., Sarks, J.P., and Sarks, S.H., Macrophages related to bruchʹs membrane in age‐related macular degeneration. Eye, 1990. 4(Pt 4): p. 613‐21. 

184 

219.  Sarks, J.P., Sarks, S.H., and Killingsworth, M.C., Morphology of early choroidal neovascularisation in age‐related macular degeneration: Correlation with activity. Eye., 1997. 11(Pt 4): p. 515‐22. 

220.  Xiong, M., Elson, G., Legarda, D., and Leibovich, S.J., Production of vascular endothelial growth factor by murine macrophages: Regulation by hypoxia, lactate, and the inducible nitric oxide synthase pathway. American Journal of Pathology., 1998. 153(2): p. 587‐98. 

221.  Crowther, M., Brown, N.J., Bishop, E.T., and Lewis, C.E., Microenvironmental influence on macrophage regulation of angiogenesis in wounds and malignant tumors. Journal of Leukocyte Biology., 2001. 70(4): p. 478‐90. 

222.  Penfold, P.L., Provis, J.M., and Billson, F.A., Age‐related macular degeneration: Ultrastructural studies of the relationship of leucocytes to angiogenesis. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology., 1987. 225(1): p. 70‐6. 

223.  Penfold, P.L., Killingsworth, M.C., and Sarks, S.H., Senile macular degeneration. The involvement of giant cells in atrophy of the retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1986. 27(3): p. 364‐71. 

224.  Oh, H., Takagi, H., Takagi, C., Suzuma, K., Otani, A., Ishida, K., Matsumura, M., Ogura, Y., and Honda, Y., The potential angiogenic role of macrophages in the formation of choroidal neovascular membranes. Investigative Ophthalmology & Visual Science., 1999. 40(9): p. 1891‐8. 

225.  Tobe, T., Ortega, S., Luna, J.D., Ozaki, H., Okamoto, N., Derevjanik, N.L., Vinores, S.A., Basilico, C., and Campochiaro, P.A., Targeted disruption of the fgf2 gene does not prevent choroidal neovascularization in a murine model. American Journal of Pathology, 1998. 153(5): p. 1641‐6. 

226.  Ishibashi, T., Hata, Y., Yoshikawa, H., Nakagawa, K., Sueishi, K., and Inomata, H., Expression of vascular endothelial growth factor in experimental choroidal neovascularization. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 1997. 235(3): p. 159‐67. 

227.  Yi, X., Ogata, N., Komada, M., Yamamoto, C., Takahashi, K., Omori, K., and Uyama, M., Vascular endothelial growth factor expression in choroidal neovascularization in rats. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 1997. 235(5): p. 313‐9. 

228.  Tsutsumi, C., Sonoda, K.H., Egashira, K., Qiao, H., Hisatomi, T., Nakao, S., Ishibashi, M., Charo, I.F., Sakamoto, T., Murata, T., and Ishibashi, T., The critical role of ocular‐infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology., 2003. 74(1): p. 25‐32. 

229.  Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B.K., van Rooijen, N., and Ambati, J., Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2003. 44(8): p. 3578‐85. 

230.  Caicedo, A., Espinosa‐Heidmann, D.G., Pina, Y., Hernandez, E.P., and Cousins, S.W., Blood‐derived macrophages infiltrate the retina and activate muller glial cells under experimental choroidal neovascularization. Experimental Eye Research, 2005. 81(1): p. 38‐47. 

231.  Ambati, J., Anand, A., Fernandez, S., Sakurai, E., Lynn, B.C., Kuziel, W.A., Rollins, B.J., and Ambati, B.K., An animal model of age‐related macular degeneration in senescent ccl‐2‐ or ccr‐2‐deficient mice.[see comment]. Nature Medicine., 2003. 9(11): p. 1390‐7. 

185 

232.  Kamei, M., Yoneda, K., Kume, N., Suzuki, M., Itabe, H., Matsuda, K.‐I., Shimaoka, T., Minami, M., Yonehara, S., Kita, T., and Kinoshita, S., Scavenger receptors for oxidized lipoprotein in age‐related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2007. 48(4): p. 1801‐7. 

233.  Tuo, J., Bojanowski, C.M., Zhou, M., Shen, D., Ross, R.J., Rosenberg, K.I., Cameron, D.J., Yin, C., Kowalak, J.A., Zhuang, Z., Zhang, K., and Chan, C.‐C., Murine ccl2/cx3cr1 deficiency results in retinal lesions mimicking human age‐related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2007. 48(8): p. 3827‐36. 

234.  Apte, R.S., Richter, J., Herndon, J., and Ferguson, T.A., Macrophages inhibit neovascularization in a murine model of age‐related macular degeneration. PLoS Medicine / Public Library of Science, 2006. 3(8): p. e310. 

235.  Ancuta, P., Rao, R., Moses, A., Mehle, A., Shaw, S.K., Luscinskas, F.W., and Gabuzda, D., Fractalkine preferentially mediates arrest and migration of cd16+ monocytes. Journal of Experimental Medicine, 2003. 197(12): p. 1701‐7. 

236.  Yu, F.‐S.X. and Hazlett, L.D., Toll‐like eeceptors and the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2006. 47(4): p. 1255‐1263. 

237.  Elner, S.G., Petty, H.R., Elner, V.M., Yoshida, A., Bian, Z.M., Yang, D., and Kindezelskii, A.L., Tlr4 mediates human retinal pigment epithelial endotoxin binding and cytokine expression. Transactions of the American Ophthalmological Society, 2005. 103: p. 126‐35. 

238.  Kindzelskii, A.L., Elner, V.M., Elner, S.G., Yang, D., Hughes, B.A., and Petty, H.R., Toll‐like receptor 4 (tlr4) of retinal pigment epithelial cells participates in transmembrane signaling in response to photoreceptor outer segments. J. Gen. Physiol., 2004. 124(2): p. 139‐149. 

239.  Blumenkranz, M.S., Russell, S.R., Robey, M.G., Kott‐Blumenkranz, R., and Penneys, N., Risk factors in age‐related maculopathy complicated by choroidal neovascularization. Ophthalmology., 1986. 93(5): p. 552‐8. 

240.  Klein, R., Klein, B.E., and Franke, T., The relationship of cardiovascular disease and its risk factors to age‐related maculopathy. The beaver dam eye study. Ophthalmology, 1993. 100(3): p. 406‐14. 

241.  Klein, R., Klein, B.E., Tomany, S.C., and Cruickshanks, K.J., Association of emphysema, gout, and inflammatory markers with long‐term incidence of age‐related maculopathy. Archives of Ophthalmology., 2003. 121(5): p. 674‐8. 

242.  Cousins, S.W., Espinosa‐Heidmann, D.G., and Csaky, K.G., Monocyte activation in patients with age‐related macular degeneration: A biomarker of risk for choroidal neovascularization? Archives of Ophthalmology, 2004. 122(7): p. 1013‐8. 

243.  Mills, C.D., Kincaid, K., Alt, J.M., Heilman, M.J., and Hill, A.M., M‐1/m‐2 macrophages and the th1/th2 paradigm. Journal of Immunology, 2000. 164(12): p. 6166‐73. 

244.  McMenamin, P.G., Dendritic cells and macrophages in the uveal tract of the normal mouse eye. British Journal of Ophthalmology., 1999. 83(5): p. 598‐604. 

245.  Forrester, J.V., Lumsden, L., Duncan, L., and Dick, A.D., Choroidal dendritic cells require activation to present antigen and resident choroidal macrophages potentiate this response. British Journal of Ophthalmology, 2005. 89(3): p. 369‐77. 

186 

246.  Zamiri, P., Masli, S., Kitaichi, N., Taylor, A.W., and Streilein, J.W., Thrombospondin plays a vital role in the immune privilege of the eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2005. 46(3): p. 908‐19. 

247.  Hattenbach, L.O., Falk, B., Nurnberger, F., Koch, F.H., and Ohrloff, C., Detection of inducible nitric oxide synthase and vascular endothelial growth factor in choroidal neovascular membranes. Ophthalmologica, 2002. 216(3): p. 209‐14. 

248.  Ando, A., Yang, A., Mori, K., Yamada, H., Yamada, E., Takahashi, K., Saikia, J., Kim, M., Melia, M., Fishman, M., Huang, P., and Campochiaro, P.A., Nitric oxide is proangiogenic in the retina and choroid. Journal of Cellular Physiology., 2002. 191(1): p. 116‐24. 

249.  Zhang, J., Wu, L.Y., Wu, G.S., and Rao, N.A., Differential expression of nitric oxide synthase in experimental uveoretinitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1999. 40(9): p. 1899‐905. 

250.  Hageman, G.S., Luthert, P.J., Victor Chong, N.H., Johnson, L.V., Anderson, D.H., and Mullins, R.F., An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune‐mediated processes at the rpe‐bruchʹs membrane interface in aging and age‐related macular degeneration. Progress in Retinal & Eye Research., 2001. 20(6): p. 705‐32. 

251.  Newsome, D.A., Hewitt, A.T., Huh, W., Robey, P.G., and Hassell, J.R., Detection of specific extracellular matrix molecules in drusen, bruchʹs membrane, and ciliary body. American Journal of Ophthalmology. 104(4), 1987: p. 373‐81. 

252.  Russell, S.R., Mullins, R.F., Schneider, B.L., and Hageman, G.S., Location, substructure, and composition of basal laminar drusen compared with drusen associated with aging and age‐related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology, 2000. 129(2): p. 205‐14. 

253.  Mullins, R.F., Russell, S.R., Anderson, D.H., and Hageman, G.S., Drusen associated with aging and age‐related macular degeneration contain proteins common to extracellular deposits associated with atherosclerosis, elastosis, amyloidosis, and dense deposit disease. FASEB Journal, 2000. 14(7): p. 835‐46. 

254.  Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pober, J.S., Chapter 13. The complement system, in Cellular and molecular immunology. 1991, W.B. Saunders Company: Philadelphia. p. 259‐282. 

255.  Anderson, D.H., Mullins, R.F., Hageman, G.S., and Johnson, L.V., A role for local inflammation in the formation of drusen in the aging eye. American Journal of Ophthalmology., 2002. 134(3): p. 411‐31. 

256.  Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pober, J.S., Chapter 11. Cytokines, in Cellular and molecular immunology. 1991, W.B.Saunders Company: Philadelphia. p. 225‐243. 

257.  Schultz, D.R. and Arnold, P.I., Properties of four acute phase proteins: C‐reactive protein, serum amyloid a protein, alpha 1‐acid glycoprotein, and fibrinogen. Seminars in Arthritis & Rheumatism., 1990. 20(3): p. 129‐47. 

258.  Bhakdi, S., Torzewski, M., Klouche, M., and Hemmes, M., Complement and atherogenesis: Binding of crp to degraded, nonoxidized ldl enhances complement activation. Arteriosclerosis, Thrombosis & Vascular Biology., 1999. 19(10): p. 2348‐54. 

187 

259.  Fuse, N., Miyazawa, A., Mengkegale, M., Yoshida, M., Wakusawa, R., Abe, T., and Tamai, M., Polymorphisms in complement factor h and hemicentin‐1 genes in a japanese population with dry‐type age‐related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology, 1074. 142(6): p. 1074‐6. 

260.  Uka, J., Tamura, H., Kobayashi, T., Yamane, K., Kawakami, H., Minamoto, A., and Mishima, H.K., No association of complement factor h gene polymorphism and age‐related macular degeneration in the japanese population. Retina, 2006. 26(9): p. 985‐7. 

261.  Tedeschi‐Blok, N., Buckley, J., Varma, R., Triche, T.J., and Hinton, D.R., Population‐based study of early age‐related macular degeneration: Role of the complement factor h y402h polymorphism in bilateral but not unilateral disease. Ophthalmology, 2007. 114(1): p. 99‐103. 

262.  Rodriguez de Cordoba, S., Esparza‐Gordillo, J., Goicoechea de Jorge, E., Lopez‐Trascasa, M., and Sanchez‐Corral, P., The human complement factor h: Functional roles, genetic variations and disease associations. Molecular Immunology, 2004. 41(4): p. 355‐67. 

263.  Johnson, P.T., Betts, K.E., Radeke, M.J., Hageman, G.S., Anderson, D.H., and Johnson, L.V., Individuals homozygous for the age‐related macular degeneration risk‐conferring variant of complement factor h have elevated levels of crp in the choroid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006. 103(46): p. 17456‐61. 

264.  Kalayoglu, M.V., Galvan, C., Mahdi, O.S., Byrne, G.I., and Mansour, S., Serological association between chlamydia pneumoniae infection and age‐related macular degeneration. Archives of Ophthalmology., 2003. 121(4): p. 478‐82. 

265.  Robman, L., Mahdi, O., McCarty, C., Dimitrov, P., Tikellis, G., McNeil, J., Byrne, G., Taylor, H., and Guymer, R., Exposure to chlamydia pneumoniae infection and progression of age‐related macular degeneration. American Journal of Epidemiology, 2005. 161(11): p. 1013‐9. 

266.  Kalayoglu, M.V., Bula, D., Arroyo, J., Gragoudas, E.S., DʹAmico, D., and Miller, J.W., Identification of chlamydia pneumoniae within human choroidal neovascular membranes secondary to age‐related macular degeneration. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 2005. 243(11): p. 1080‐90. 

267.  Blake, G.J. and Ridker, P.M., Inflammatory bio‐markers and cardiovascular risk prediction. Journal of Internal Medicine., 2002. 252(4): p. 283‐94. 

268.  Smith, W., Mitchell, P., Leeder, S.R., and Wang, J.J., Plasma fibrinogen levels, other cardiovascular risk factors, and age‐related maculopathy: The blue mountains eye study. Archives of Ophthalmology, 1998. 116(5): p. 583‐7. 

269.  Evereklioglu, C., Doganay, S., Er, H., Cekmen, M., Ozerol, E., and Otlu, B., Serum leptin concentrations are decreased and correlated with disease severity in age‐related macular degeneration: A preliminary study. Eye., 2003. 17(3): p. 350‐5. 

270.  Vine, A.K., Stader, J., Branham, K., Musch, D.C., and Swaroop, A., Biomarkers of cardiovascular disease as risk factors for age‐related macular degeneration. Ophthalmology, 2005. 112(12): p. 2076‐80. 

271.  Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pober, J.S., Chapter 18. Diseases caused by humoral and cell‐mediated immune reactions, in Cellular and molecular immunology. 1991, W.B. Saunders Company: Philadelphia. p. 354‐376. 

188 

272.  Bouras, C., Riederer, B.M., Kovari, E., Hof, P.R., and Giannakopoulos, P., Humoral immunity in brain aging and alzheimerʹs disease. Brain Research ‐ Brain Research Reviews, 2005. 48(3): p. 477‐87. 

273.  Hansson, G.K., Libby, P., Schonbeck, U., and Yan, Z.‐Q., Innate and adaptive immunity in the pathogenesis of atherosclerosis. Circ Res, 2002. 91(4): p. 281‐291. 

274.  Witebsky, E., Rose, N.R., Terplan, K., Paine, J.R., and Egan, R.W., Chronic thyroiditis and autoimmunization. Journal of the American Medical Association, 1957. 164(13): p. 1439‐47. 

275.  Thirkill, C.E., Roth, A.M., and Keltner, J.L., Cancer‐associated retinopathy. Archives of Ophthalmology, 1987. 105(3): p. 372‐5. 

276.  Thirkill, C.E., Tait, R.C., Tyler, N.K., Roth, A.M., and Keltner, J.L., The cancer‐associated retinopathy antigen is a recoverin‐like protein. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1992. 33(10): p. 2768‐72. 

277.  Adamus, G., Guy, J., Schmied, J.L., Arendt, A., and Hargrave, P.A., Role of anti‐recoverin autoantibodies in cancer‐associated retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1993. 34(9): p. 2626‐33. 

278.  Adamus, G., Machnicki, M., and Seigel, G.M., Apoptotic retinal cell death induced by antirecoverin autoantibodies of cancer‐associated retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1997. 38(2): p. 283‐91. 

279.  Adamus, G., Machnicki, M., Elerding, H., Sugden, B., Blocker, Y.S., and Fox, D.A., Antibodies to recoverin induce apoptosis of photoreceptor and bipolar cells in vivo. Journal of Autoimmunity, 1998. 11(5): p. 523‐33. 

280.  Whitcup, S.M., Vistica, B.P., Milam, A.H., Nussenblatt, R.B., and Gery, I., Recoverin‐associated retinopathy: A clinically and immunologically distinctive disease. American Journal of Ophthalmology, 1998. 126(2): p. 230‐7. 

281.  Mizener, J.B., Kimura, A.E., Adamus, G., Thirkill, C.E., Goeken, J.A., and Kardon, R.H., Autoimmune retinopathy in the absence of cancer. American Journal of Ophthalmology, 1997. 123(5): p. 607‐18. 

282.  Heckenlively, J.R., Fawzi, A.A., Oversier, J., Jordan, B.L., and Aptsiauri, N., Autoimmune retinopathy: Patients with antirecoverin immunoreactivity and panretinal degeneration. Archives of Ophthalmology, 2000. 118(11): p. 1525‐33. 

283.  Adamus, G., Aptsiauri, N., Guy, J., Heckenlively, J., Flannery, J., and Hargrave, P.A., The occurrence of serum autoantibodies against enolase in cancer‐associated retinopathy. Clinical Immunology & Immunopathology, 1996. 78(2): p. 120‐9. 

284.  Adamus, G., Amundson, D., Seigel, G.M., and Machnicki, M., Anti‐enolase‐alpha autoantibodies in cancer‐associated retinopathy: Epitope mapping and cytotoxicity on retinal cells. Journal of Autoimmunity, 1998. 11(6): p. 671‐7. 

285.  Ohguro, H., Ogawa, K., and Nakagawa, T., Recoverin and hsc 70 are found as autoantigens in patients with cancer‐associated retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1999. 40(1): p. 82‐9. 

189 

286.  Ohguro, H., Ogawa, K., Maeda, T., Maeda, A., and Maruyama, I., Cancer‐associated retinopathy induced by both anti‐recoverin and anti‐hsc70 antibodies in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1999. 40(13): p. 3160‐7. 

287.  Alabduljalil, T. and Behbehani, R., Paraneoplastic syndromes in neuro‐ophthalmology. Current Opinion in Ophthalmology, 2007. 18(6): p. 463‐9. 

288.  Pfohler, C., Preuss, K.‐D., Tilgen, W., Stark, A., Regitz, E., Fadle, N., and Pfreundschuh, M., Mitofilin and titin as target antigens in melanoma‐associated retinopathy. International Journal of Cancer, 2007. 120(4): p. 788‐95. 

289.  Heckenlively, J.R., Aptsiauri, N., Nusinowitz, S., Peng, C., and Hargrave, P.A., Investigations of antiretinal antibodies in pigmentary retinopathy and other retinal degenerations. Transactions of the American Ophthalmological Society, 1996. 94: p. 179‐200; discussion 200‐6. 

290.  Attawia, M.A. and Nayak, R.C., Circulating antipericyte autoantibodies in diabetic retinopathy. Retina, 1999. 19(5): p. 390‐400. 

291.  Heckenlively, J.R., Jordan, B.L., and Aptsiauri, N., Association of antiretinal antibodies and cystoid macular edema in patients with retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology, 1999. 127(5): p. 565‐73. 

292.  Ikeda, Y., Maruyama, I., Nakazawa, M., and Ohguro, H., Clinical significance of serum antibody against neuron‐specific enolase in glaucoma patients. Japanese Journal of Ophthalmology., 2002. 46(1): p. 13‐7. 

293.  Maruyama, I., Ikeda, Y., Nakazawa, M., and Ohguro, H., Clinical roles of serum autoantibody against neuron‐specific enolase in glaucoma patients. Tohoku Journal of Experimental Medicine., 2002. 197(3): p. 125‐32. 

294.  Maruyama, I., Maeda, T., Okisaka, S., Mizukawa, A., Nakazawa, M., and Ohguro, H., Autoantibody against neuron‐specific enolase found in glaucoma patients causes retinal dysfunction in vivo. Japanese Journal of Ophthalmology., 2002. 46(1): p. 1‐12. 

295.  Weleber, R.G., Watzke, R.C., Shults, W.T., Trzupek, K.M., Heckenlively, J.R., Egan, R.A., and Adamus, G., Clinical and electrophysiologic characterization of paraneoplastic and autoimmune retinopathies associated with antienolase antibodies. American Journal of Ophthalmology, 2005. 139(5): p. 780‐794. 

296.  Grus, F.H., Joachim, S.C., Hoffmann, E.M., and Pfeiffer, N., Complex autoantibody repertoires in patients with glaucoma. Molecular Vision., 2004. 10: p. 132‐7. 

297.  Joachim, S.C., Grus, F.H., and Pfeiffer, N., Analysis of autoantibody repertoires in sera of patients with glaucoma. European Journal of Ophthalmology., 2003. 13(9‐10): p. 752‐8. 

298.  Chant, S.M., Heckenlively, J., and Meyers‐Elliott, R.H., Autoimmunity in hereditary retinal degeneration. I. Basic studies. British Journal of Ophthalmology, 1985. 69(1): p. 19‐24. 

299.  Penfold, P.L., Provis, J.M., Furby, J.H., Gatenby, P.A., and Billson, F.A., Autoantibodies to retinal astrocytes associated with age‐related macular degeneration. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 1990. 228(3): p. 270‐4. 

190 

300.  Gurne, D.H., Tso, M.O., Edward, D.P., and Ripps, H., Antiretinal antibodies in serum of patients with age‐related macular degeneration. Ophthalmology, 1991. 98(5): p. 602‐7. 

301.  Gu, X., Meer, S.G., Miyagi, M., Rayborn, M.E., Hollyfield, J.G., Crabb, J.W., and Salomon, R.G., Carboxyethylpyrrole protein adducts and autoantibodies, biomarkers for age‐related macular degeneration. Journal of Biological Chemistry., 2003. 278(43): p. 42027‐35. 

302.  Patel, N., Ohbayashi, M., Nugent, A.K., Ramchand, K., Toda, M., Chau, K.Y., Bunce, C., Webster, A., Bird, A.C., Ono, S.J., and Chong, V., Circulating anti‐retinal antibodies as immune markers in age‐related macular degeneration. Immunology, 2005. 115: p. 422‐30. 

303.  Joachim, S., Bruns, K., Lackner, K., Pfeiffer, N., and Grus, F., Analysis of igg antibody patterns against retinal antigens and antibodies to alpha‐crystallin, gfap, and alpha‐enolase in sera of patients with ʺwetʺ age‐related macular degeneration. Graefeʹs Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 2007. 245(5): p. 619‐626. 

304.  Avrameas, S., Natural autoantibodies: From ʹhorror autotoxicusʹ to ʹgnothi seautonʹ. Immunology Today., 1991. 12(5): p. 154‐9. 

305.  Avrameas, S. and Ternynck, T., Natural autoantibodies: The other side of the immune system. Research in Immunology., 1995. 146(4‐5): p. 235‐48. 

306.  Hayakawa, K., Asano, M., Shinton, S.A., Gui, M., Allman, D., Stewart, C.L., Silver, J., and Hardy, R.R., Positive selection of natural autoreactive b cells. Science, 1999. 285(5424): p. 113‐6. 

307.  Lacroix‐Desmazes, S., Kaveri, S.V., Mouthon, L., Ayouba, A., Malanchere, E., Coutinho, A., and Kazatchkine, M.D., Self‐reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals. Journal of Immunological Methods., 1998. 216(1‐2): p. 117‐37. 

308.  Lacroix‐Desmazes, S., Mouthon, L., Kaveri, S.V., Kazatchkine, M.D., and Weksler, M.E., Stability of natural self‐reactive antibody repertoires during aging. Journal of Clinical Immunology., 1999. 19(1): p. 26‐34. 

309.  Coutinho, A., Kazatchkine, M.D., and Avrameas, S., Natural autoantibodies. Current Opinion in Immunology., 1995. 7(6): p. 812‐8. 

310.  Guilbert, B., Dighiero, G., and Avrameas, S., Naturally occurring antibodies against nine common antigens in human sera. I. Detection, isolation and characterization. Journal of Immunology., 1982. 128(6): p. 2779‐87. 

311.  Wu, K.H., Madigan, M.C., Billson, F.A., and Penfold, P.L., Differential expression of gfap in early v late amd: A quantitative analysis. British Journal of Ophthalmology., 2003. 87(9): p. 1159‐66. 

312.  Augusteyn, R.C., Alpha‐crystallin: A review of its structure and function. Clinical & Experimental Optometry, 2004. 87(6): p. 356‐66. 

313.  Nakata, K., Crabb, J.W., and Hollyfield, J.G., Crystallin distribution in bruchʹs membrane‐choroid complex from amd and age‐matched donor eyes. Experimental Eye Research, 2005. 80(6): p. 821‐826. 

191 

314.  Aaronson, R.M., Graven, K.K., Tucci, M., McDonald, R.J., and Farber, H.W., Non‐neuronal enolase is an endothelial hypoxic stress protein. Journal of Biological Chemistry, 1995. 270(46): p. 27752‐7. 

315.  Gitlits, V.M., Toh, B.H., and Sentry, J.W., Disease association, origin, and clinical relevance of autoantibodies to the glycolytic enzyme enolase. Journal of Investigative Medicine, 2001. 49(2): p. 138‐45. 

316.  Carayannopoulos, M.O., Potter, K.N., Li, Y., Natvig, J.B., and Capra, J.D., Evidence that human immunoglobulin m rheumatoid factors can be derived from the natural autoantibody pool and undergo an antigen driven immune response in which somatically mutated rheumatoid factors have lower affinities for immunoglobulin g fc than their germline counterparts. Scandinavian Journal of Immunology., 2000. 51(4): p. 327‐36. 

317.  Adamus, G., Antirecoverin antibodies and autoimmune retinopathy. Archives of Ophthalmology, 2000. 118(11): p. 1577‐8. 

318.  Dubovy, S.R., Hairston, R.J., Schatz, H., Schachat, A.P., Bressler, N.M., Finkelstein, D., and Green, W.R., Adult‐onset foveomacular pigment epithelial dystrophy: Clinicopathologic correlation of three cases. Retina, 2000. 20(6): p. 638‐49. 

319.  Green, W.R., McDonnell, P.J., and Yeo, J.H., Pathologic features of senile macular degeneration. Ophthalmology, 1985. 92(5): p. 615‐627. 

320.  Age‐Related Eye Disease Study Research Group, Risk factors for the incidence of advanced age‐related macular degeneration in the age‐related eye disease study (areds):  Areds report no. 19. Ophthalmology, 2005. 112(4): p. 533‐539. 

321.  Bressler, S.B., Maguire, M.G., Bressler, N.M., and Fine, S.L., Relationship of drusen and abnormalities of the retinal pigment epithelium to the prognosis of neovascular macular degeneration. The macular photocoagulation study group. Archives of Ophthalmology., 1990. 108(10): p. 1442‐7. 

322.  Sarraf, D., Gin, T., Yu, F., Brannon, A., Owens, S.L., and Bird, A.C., Long‐term drusen study. Retina., 1999. 19(6): p. 513‐9. 

323.  Hillenkamp, J., Hussain, A.A., Jackson, T.L., Cunningham, J.R., and Marshall, J., The influence of path length and matrix components on ageing characteristics of transport between the choroid and the outer retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2004. 45(5): p. 1493‐1498. 

324.  Guidry, C., Medeiros, N.E., and Curcio, C.A., Phenotypic variation of retinal pigment epithelium in age‐related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science., 2002. 43(1): p. 267‐73. 

325.  Li, C.‐M., Chung, B.H., Presley, J.B., Malek, G., Zhang, X., Dashti, N., Li, L., Chen, J., Bradley, K., Kruth, H.S., and Curcio, C.A., Lipoprotein‐like particles and cholesteryl esters in human bruchʹs membrane: Initial characterization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2005. 46(7): p. 2576‐2586. 

326.  Oh, H., Takagi, H., Takagi, C., Suzuma, K., Otani, A., Ishida, K., Matsumura, M., Ogura, Y., and Honda, Y., The potential angiogenic role of macrophages in the formation of choroidal neovascular membranes. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1999. 40(9): p. 1891‐1898. 

192 

327.  Shimada, H., Kawamura, A., Mori, R., and Yuzawa, M., Clinicopathological findings of retinal angiomatous proliferation. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 2007. 245(2): p. 295‐300. 

328.  Yang, P., de Vos, A.F., and Kijlstra, A., Macrophages and mhc class ii positive cells in the choroid during endotoxin induced uveitis. British Journal of Ophthalmology, 1997. 81(5): p. 396‐401. 

329.  Sarks, S., Cherepanoff, S., Killingsworth, M., and Sarks, J., Relationship of basal laminar deposit and membranous debris to the clinical presentation of early age‐related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2007. 48(3): p. 968‐77. 

330.  Duffield, J.S., The inflammatory macrophage: A story of jekyll and hyde. Clinical Science, 2003. 104(1): p. 27‐38. 

331.  Aktan, F., Inos‐mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sciences, 2004. 75(6): p. 639‐53. 

332.  Blaise, G.A., Gauvin, D., Gangal, M., and Authier, S., Nitric oxide, cell signaling and cell death. Toxicology, 2005. 208(2): p. 177‐92. 

333.  Holness, C.L. and Simmons, D.L., Molecular cloning of cd68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood, 1993. 81(6): p. 1607‐13. 

334.  Holtkamp, G.M., De Vos, A.F., Peek, R., and Kijlsta, A., Analysis of the secretion pattern of monocyte chemotactic protein‐1 (mcp‐1) and transforming growth factor‐beta 2 (tgf‐beta2) by human retinal pigment epithelial cells. Clinical & Experimental Immunology, 1999. 118(1): p. 35‐40. 

335.  Chen, M., Forrester, J.V., and Xu, H., Synthesis of complement factor h by retinal pigment epithelial cells is down‐regulated by oxidized photoreceptor outer segments. Experimental Eye Research, 2007. 84(4): p. 635‐45. 

336.  Kaestel, C.G., Lovato, P., Odum, N., Nissen, M.H., and Ropke, C., The immune privilege of the eye: Human retinal pigment epithelial cells selectively modulate t‐cell activation in vitro. Current Eye Research, 2005. 30(5): p. 375‐83. 

337.  Richards, A., Kavanagh, D., and Atkinson, J.P., Inherited complement regulatory protein deficiency predisposes to human disease in acute injury and chronic inflammatory states. Advances in Immunology, 2007. 96: p. 141‐77. 

338.  Lommatzsch, A., Hermans, P., Weber, B., and Pauleikhoff, D., Complement factor h variant y402h and basal laminar deposits in exudative age‐related macular degeneration. Graefes Archive for Clinical & Experimental Ophthalmology, 2007. 245(11): p. 1713‐6. 

339.  Sennlaub, F., Courtois, Y., and Goureau, O., Inducible nitric oxide synthase mediates the change from retinal to vitreal neovascularization in ischemic retinopathy.[comment]. Journal of Clinical Investigation., 2001. 107(6): p. 717‐25. 

340.  Macular Photocoagulation Study Group, Argon laser photocoagulation for neovascular maculopathy. Three‐year results from randomized clinical trials. Macular photocoagulation study group. Archives of Ophthalmology, 1986. 104(5): p. 694‐701. 

193 

341.  Hangai, M., Yoshimura, N., Hiroi, K., Mandai, M., and Honda, Y., Inducible nitric oxide synthase in retinal ischemia‐reperfusion injury. Experimental Eye Research., 1996. 63(5): p. 501‐9. 

342.  Becquet, F., Courtois, Y., and Goureau, O., Nitric oxide in the eye: Multifaceted roles and diverse outcomes. Survey of Ophthalmology, 1997. 42(1): p. 71‐82. 

343.  Mitchell, P., Wang, J.J., Foran, S., and Smith, W., Five‐year incidence of age‐related maculopathy lesions: The blue mountains eye study. Ophthalmology, 2002. 109(6): p. 1092‐1097. 

344.  Wang, J.J., Rochtchina, E., Lee, A.J., Chia, E.‐M., Smith, W., Cumming, R.G., and Mitchell, P., Ten‐year incidence and progression of age‐related maculopathy: The blue mountains eye study. Ophthalmology, 2007. 114(1): p. 92‐98. 

345.  Gillies, M.C., Simpson, J.M., Luo, W., Penfold, P., Hunyor, A.B., Chua, W., Mitchell, P., and Billson, F., A randomized clinical trial of a single dose of intravitreal triamcinolone acetonide for neovascular age‐related macular degeneration: One‐year results. Archives of Ophthalmology., 2003. 121(5): p. 667‐73. 

346.  Macular Photocoagulation Study Group, Subfoveal neovascular lesions in age‐related macular degeneration. Guidelines for evaluation and treatment in the macular photocoagulation study. Macular photocoagulation study group. Archives of Ophthalmology, 1991. 109(9): p. 1242‐57. 

 

194 

 

 

 

A P P E N D I C E S  

A 

APPENDIX  A : ANTIBODIES  

 

Immunohistochemistry – primary antibodies  

 Antibody Clone Raised in Company Catalog

number

Monoclonal anti-human CD68 KP1 Mouse Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 08-0125

Monoclonal anti-human iNOS 6 Mouse BD Transduction Laboratories, San Jose, CA, USA 610328  

 

Immunohistochemistry – secondary antibody 

 Antibody Clone Raised in Company Catalog

numberBiotinylated monoclonal anti-mouse

IgG (H+L) N0403 Horse Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA BA-2000  

 

Western blotting – detection antibodies 

 Antibody Clone Raised in Company Catalog

numberPeroxidase polyclonal anti-human

IgG+A+M (H+L) N/A Goat Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 62-8320

Peroxidase monoclonal anti-human IgG1 HP6069 Mouse Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 05-3320

Peroxidase monoclonal anti-human IgG2 HP6014 Mouse Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 05-0520

Peroxidase monoclonal anti-human IgG3 HP6047 Mouse Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 05-3620

Peroxidase monoclonal anti-human IgG4 HP6025 Mouse Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 05-3820

Peroxidase monoclonal anti-human IgM HP6083 Mouse Zymed Invitrogen, Carlsbad, CA, USA 05-4900  

B 

APPENDIX  B : CD68   IMMUNOHISTOCHEMISTRY  

1.  Xylene              2 x 3 min 2.  100% alcohol             2 x 3 min 3.  95% alcohol              3 min 4.  70% alcohol              3 min 5.  Tapwater              rinse 6.   1% peroxide solution          30 min   ( 0.5ml peroxide  in 49.5ml 50% alcohol) 7.  Distilled water            rinse 8.         Tris                     rinse 9.         Pepsin digestion at 37oC          5 min   10.       Tris                rinse 11.  10% normal horse serum          20 min   (1ml normal horse serum in 9 ml Tris) 12.  Primary antibody : mouse anti‐human CD68 Neat   1 hr at 37oC   (diluted in 1% normal horse serum) 13.  Tris                3 x 5 min 14.  Secondary antibody : Biotinylated anti‐mouse IgG  30 min at 37oC 

1:200   15.  Tris                3 x 5 min 16.  ABC 1:500              30 min at RT 17.  Tris                                                        3 x 5 min 18.  Vector SG Blue                 10 min 19.  Tris                 3 x 5 min 20.  Distilled water            rinse 21.  70% alcohol              3 min 22.  95% alcohol              3 min 23.  100% alcohol             2 x 3 min 24.  Xylene              2 x 3 min 25.  Coverslip in DPX  

C 

APPENDIX  C : iNOS   IMMUNOHISTOCHEMISTRY  

1.  Xylene              2 x 3 min 2.  100% alcohol             2 x 3 min 3.  95% alcohol              3 min 4.  70% alcohol              3 min 5.  Tapwater              rinse 6.   1% peroxide solution          30 min   ( 0.5ml peroxide  in 49.5ml 50% alcohol) 7.  Distilled water            rinse 8.  Tris                rinse 9.  10% normal horse serum          20 min   (1ml normal horse serum in 9 ml Tris) 10.  Primary antibody : mouse anti‐human iNOS 1:400  1 hr at 37oC    (diluted in 1% normal horse serum) 11.  Tris                3 x 5 min 12.  Secondary antibody : Biotinylated anti‐mouse IgG  30 min at 37oC   1:200 13.  Tris                3 x 5 min 14.  ABC 1:500              30 min at RT 15.  Nickel ammonium sulphate Tris        3 x 5 min   (100mg nickel ammonium sulphate in 250ml Tris) 16.  DAB made in nickel ammonium sulphate     10 min 

+ 70μl H2O2  (1 DAB tablet dissolved in 15ml of nickel ammonium   sulphate in Tris and filter) 

17.  Tris                 3 x 5 min 18.  Distilled water            rinse 19.  70% alcohol              3 min 20.  95% alcohol              3 min 21.  100% alcohol             2 x 3 min 22.  Xylene              2 x 3 min 23.  Coverslip in DPX  

 

D 

APPENDIX  D : PREPARAT ION  OF  RET INAL  PROTE IN  FOR  

ELECTROPHORES I S  

Dissection: 1 X human eye  1 X sterile dissection kit dissection tray PBS ~20mL 6 X 1mL eppendorfs for storage  Perform in vacuum extraction hood Remove cornea and anterior chamber using curved scissors Remove vitreous Add PBS to the cup formed by remaining eye Tease out retina using fine forceps and cut at optic disc Divide retina into approx 6 pieces  Lysis: Lysis buffer ~10mL Sterile 10mL syringe Sterile drawing up or 19G needle 2 X sterile 10mL centrifuge tubes per piece of retina 10 X 1mL sterile eppendorfs per piece of retina for microfuge 10 X 1mL sterile eppendorfs per piece of retina for storage human retina ice in styrofoam container 1000μL pipetteman & sterile tips  In vacuum extraction hood: Draw up 5mL lysis buffer in syringe Add retina Homogenise by drawing up and down into 10mL centrifuge tube until homogenate macroscopically evenly mixed Place on orbital shaker on ice @ 50rpm for 20min Place in large centrifuge after balancing Spin @ 4000rpm for 5min @ 4oC Transfer supernatant into 10 eppendorf tubes Place in microfuge and spin @ 13000rpm for 5min @ RToC Transfer supernatant into 5‐10 eppendorf tubes Label and store at –20oC.  

E 

APPENDIX  E : ELECTROPHORES I S  &  WESTERN  BLOTT ING  

Electrophoresis 

1. Dilute retinal homogenates 1:2 in loading buffer (2X) 2. Heat samples for 2 minutes at 100 oC and clarify by centrifugation at 

3000rpm for 3 minutes.  3. Assemble MiniProtean cell (BioRad Laboratories) for electrophoresis & fill 

with running buffer 4. Load samples in the prep well of a 4‐20% Tris‐Glycine polyacrylamide get 

in a Load Kaleidoscope precision plus protein standard (BioRad Laboratories) in the standards well  

5. Run samples at 200V, 100mA and at room temperature for 30‐40min (depending on ambient temperature) 

 Western blotting 

1. Pre‐wet Hybond P membrane (Amersham Pharmacia Biotech) in methanol and allow to equilibrate for 10min in transfer buffer 

2. Equilibrate gels in transfer buffer after electrophoresis 3. Assemble the Mini‐Protean cell is assembled for blotting & fill with transfer 

buffer and ice block 4. Blot at 60V, 200mA for 4hrs at 4 oC  

 Autoantibody detection 

1. Block transblots for 1hr in blocking buffer (5% tween tris‐buffered saline) at room temperature 

2. Wash transblots in wash buffer  3x10min 3. Assemble multiscreen apparatus and insert transblot 4. Load each multiscreen well with serum diluted 1:200 in TBS and incubate 

overnight at room temperature 5. Wash in wash buffer  2x10min 6. Remove transblots from multiscreen apparatus and wash in TBS 1x10min 7. Mix together 10mls each of ECL solutions 1&2 (Amersham Pharmacia 

Biotech) 8. In dark room, incubate tranblot in ECL mixture for 2 min 9. Remove and blot with filter paper before inserting into plastic sleeves 10. Expose to ECL film for 1‐3min 11. Develop ECL film in photographic developer until a good signal can be 

seen and  12. Place film in photographic fixer for 5 sec 13. Rinse and dry film 

F 

APPENDIX  F :  BUFFERS  

Lysis Buffer: 1ml 10X Salt buffer 9ml sterile H2O 1 X tablet miniComplete protease inhibitor cocktail 100μL NP40  

 Loading Buffer: 

4 ml 10%  (w/v) SDS     2 ml glycerol     1 ml 0.1% (w/v) bromophenol blue     2.5 ml 0.5M Tris‐HCl (pH 6.8)     0.2 ml β‐mercaptoethanol  

10 ml deionised water   Running buffer (10X):        29g  Tris base     144g  Glycine     10g  SDS     miliQ H2O to 1000ml  Transfer buffer: 

3g tris base     14.4g glycine     200mL methanol     miliQ H2O to 1000ml  Tris‐buffered saline (10X): 

6.05g  Tris base       43.9g  NaCl         milliQ H2O to 500ml 

 Blocking buffer:     5ml  Tween 20       

1X TBS to 100ml  Wash buffer:     400μL  Tween 20     1X TBS to 800ml 

G 

APPENDIX  G :  MULT ISCREEN  APPARATUS  

  

 

 

 

 

 

 

 

 

An ECL film of a typical blot produced using the multiscreen apparatus. Protein 

standards at left. 

 

 Photograph of apparatus courtesy of Bio‐Rad Laboratories. Hercules, California USA