8/2/2019 Aflatoxin in Brewery

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A P P L I E D M I C R O B I O L O G Y , M a r . 1 9 7 5 , p . 3 1 3 - 3 1 6C o p y r i g h t 0 1 9 7 5 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y V o l . 2 9 , N o . 3P r i n t e d i n U . S . A .

S t a b i l i t y o f A f l a t o x i n B , a n d O c h r a t o x i n A i n B r e w i n gF . S . CHU,* C . C . CHANG, SAMY H . ASHOOR, AND N . PRENTICE

F o o d R e s e a r c h I n s t i t u t e a n d D e p a r t m e n t o f F o o d S c i e n c e s , U n i v e r s i t y o f W i s c o n s i n , M a d i s o n , W i s c o n s i n5 3 7 0 6 * a n d U . S . B a r l e y a n d M a l t L a b o r a t o r y , M a d i s o n , W i s c o n s i n 5 3 7 0 5R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 5 O c t o b e r 1 9 7 4

T h e s t a b i l i t y o f a f l a t o x i n B , a n d o c h r a t o x i n A i n b r e w i n g was i n v e s t i g a t e d b ya d d i n g t h e p u r i f i e d t o x i n s t o t h e raw m a t e r i a l s a t 1 a n d 1 0 y g / g l e v e l s d u r i n gm a s h i n g i n a c o n v e n t i o n a l m i c r o - b r e w i n g p r o c e s s . Th e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t b o t ht o x i n s a r e s t a b l e t o h e a t a n d a r e i n s e n s i t i v e t o c o o k e r mash t r e a t m e n t . B o t hm y c o t o x i n s were p a r t i a l l y r e m o v e d i n t h e m a s h i n g a n d b r e w i n g processes. A b o u t1 4 t o 1 8 % a n d 2 7 t o 28% o f t h e a d d e d t o x i n s were f o u n d i n t h e f i n a l b e e r s b r e w e df r o m s t a r t i n g m a t e r i a l s c o n t a i n i n g 1 a n d 1 0 A g , r e s p e c t i v e l y , o f e i t h e r t o x i n p e r g .T h e p o s s i b l e r o u t e o f t r a n s m i s s i o n o f m y c o t o x i n s i n t o b e e r i s d i s c u s s e d .

S i n c e t h e d i s c o v e r y o f a f l a t o x i n s , a s e r i e s o fp o t e n t c a r c i n o g e n s p r o d u c e d b y A s p e r i g i l l u sf l a v u s a n d A . p a r a s i t i c u s , a number o f o t h e rf u n g a l m e t a b o l i t e s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d t ob e t o x i c t o a n i m a l s ( 6 , 9 ) . Among t h e s e t o x i n s ,o c h r a t o x i n s , a s e r i e s o f n e p h r o t o x i n s p r o d u c e db y s e v e r a l s p e c i e s o f A s p e r g i l l i a a n d P e n i c i l l i a ,h a v e a l s o a t t r a c t e d a t t e n t i o n b e c a u s e o f t h e i rh i g h t o x i c i t y a n d t h e w i d e s p r e a d o c c u r r e n c e t ot o x i n - p r o d u c i n g f u n g i ( 4 ) . A f l a t o x i n s a n d 1o c h r a t o x i n s h a v e b e e n f o u n d i n many a g r i c u l -t u r a l c o m m o d i t i e s ( 4 , 6 ) , i n c l u d i n g c o r n( 1 3 - 1 5 ) . B e c a u s e o f t h e u n u s u a l s t a b i l i t y o ft h e s e t o x i n s i n a g r i c u l t u r a l c o m m o d i t i e s , t h eq u e s t i o n o f w h e t h e r t h e y c o u l d c a r r y t h r o u g ht h e f o o d p r o c e s s h a s a t t r a c t e d c o n s i d e r a b l ea t t e n t i o n . B e c a u s e o f t h e n a t u r a l o c c u r r e n c e o fo c h r a t o x i n A ( O A ) , t h e m o s t p o t e n t t o x i n i n t h eo c h r a t o x i n s e r i e s , i n b a r l e y a n d o t h e r c e r e a l s( 1 0 , 1 2 ) , s c i e n t i s t s i n t h e U n i t e d S t a t e s a n dD e n m a r k h a v e s t u d i e d t h e p o s s i b i l i t y o f t r a n s -m i t t i n g OA i n t o b e e r . F i s c h b a c h a n d R o d r i c k s( 8 ) r e p o r t e d t h a t e a r l i e r w o r k i n t h e F o o d a n dD r u g A d m i n i s t r a t i o n h a d s h o w n t h e r e t e n t i o n o fOA i n t h e b e e r p r o c e s s , b u t a s u r v e y o n OA a n do c h r a t o x i n B i n s a m p l e s o f b e e r a n d m a l t e db a r l e y f r o m e a c h o f t h e 1 3 0 b r e w e r i e s i n t h eU n i t e d S t a t e s s h o w e d n o d e t e c t i o n o f o c h r a t o x -i n s . T h e s e s a m p l e s w e r e t e s t e d b y u s i n g a na n a l y t i c a l m e t h o d s e n s i t i v e t o 0 . 0 1 g g / g ( 1 0j i g / k g ) . R e c e n t e x p e r i m e n t s b y K r o g h e t a l . ( 1 1 )d e m o n s t r a t e d , h o w e v e r , t h a t OA w a s d e s t r o y e dd u r i n g t h e m a l t i n g a n d b r e w i n g p r o c e s s i n g . Tod e t e r m i n e t h e s t a b i l i t y o f a f l a t o x i n B , ( A f l a B j )a n d OA i n b r e w i n g , w e a d d e d t h e p u r i f i e dt o x i n s a t t w o s t a g e s ( t o e i t h e r m a l t o r c o r n g r i t s )d u r i n g a m i c r o - b r e w i n g p r o c e s s . T h i s p a p e r

p r e s e n t s d a t a o n t h e s t a b i l i t y o f t h e s e t w o t o x i n si n f i v e m a j o r o p e r a t i o n s o f b r e w i n g .MATERIALS AND M E T H O D S

M a t e r i a l s . A f l a B , a n d OA w e r e p r e p a r e d b y t h em e t h o d s o f C h u ( 3 ) a n d Chu a n d B u t z ( 5 ) . M a l t w a sp r e p a r e d f r o m L ar k er b a r l e y ( H o r d e u m v u l g a r e L . )t h a t w a s g r o w n i n N o r t h D a k o t a i n 1 9 7 2 . P o r t i o n s ( 1 7 0g , d r y b a s i s ) w e r e s t e e p e d i n w a t e r a t 1 6 C u n t i l t h em o i s t u r e c o n t e n t w a s 4 5 % . T h e b a r l e y w a s a l l o w e d t og r o w a t t h i s t e m p e r a t u r e i n t h e d a r k . T h e m a l t i n g( g r o w t h ) c h a m b e r i s a m o d i f i e d d r u m t y p e t h a t s l o w l yr o t a t e s 3 6 p e r f o r a t e d c a n s c o n t a i n i n g t h e p o r t i o n s o fb a r l e y . M o i s t u r e - c o n d i t i o n e d a i r w a s c i r c u l a t e dt h r o u g h t h e c h a m b e r a n d t h e s a m p l e s d u r i n g t h e5 - d a y m a l t i n g p e r i o d . T h e g e r m i n a t e d b a r l e y w a st h e n k i l n e d a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g p r o g r a m : 9 h a t3 5 C , 7 h a t 4 4 C , 5 h a t 5 5 C , 5 h a t 6 5 C , a n d 2 h a t8 5 C . R o o t l e t s w e r e r e m o v e d a f t e r k i l n i n g , a n d t h em a l t w a s g r o u n d i n a M i a g m i l l ( M i a g C o . , B r a u n s c h -w e i g , W e s t G e r m a n y ) p r i o r t o m a s h i n g . C o r n ( Z e am a y s L . ) g r i t s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e K r a u s e M i l l i n gC o . , M i l w a u k e e , W i s . A d s o r b o s i l - 5 a n d S i l i c a G e l Gw e r e o b t a i n e d f r o m A p p l i e d S c i e n c e L a b o r a t o r i e s( S t a t e C o l l e g e , P a . ) a n d t h e B r i n k m a n n I n s t r u m e n tC o . ( W e s t b u r y , N . Y . ) , r e s p e c t i v e l y . A l l o t h e r s o l v e n t sa n d c h e m i c a l s w e r e e i t h e r a n a l y t i c a l r e a g e n t g r a d e o rc h e m i c a l l y p u r e .M i c r o - b r e w i n g p r o c e d u r e s . T h e b r e w i n g p r o c e -d u r e w a s t h a t d e s c r i b e d b y B u r k h a r t e t a l . ( 2 ) , i nw h i c h 9 0 % o f t h e m a l t i s u s e d i n t h e m a l t m a s h a n d1 0 % i n t h e c o o k e r m a s h . T h e e s s e n t i a l s o f t h e o p e r a -t i o n a r e a s f o l l o w s .( i ) C o o k e r m a s h . M a l t ( 2 2 g ) , c o r n g r i t s ( 9 4 g ) , a n dw a t e r ( 4 8 9 m l ) w e r e m i x e d a n d h e l d a t 4 5 C f o r 1 0m i n . T h e t e m p e r a t u r e w a s i n c r e a s e d a t 5 - m i n i n t e r -v a l s t o 5 3 , 6 1 , 6 9 , 7 7 , 8 5 , 9 3 , a n d 1 0 0 C . Th e mash w a sb o i l e d f o r 1 5 m i n .( i i ) M a l t m a s h . M a l t ( 1 8 9 g ) a n d w a t e r ( 7 1 8 m l )w e r e m i x e d a t 3 8 C f o r 1 0 m i n . Th e m i x t u r e was

3 1 3

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A P P L . M I C R O B I O L .a l l o w e d t o s t a n d a t 3 8 C w i t h o u t s t i r r i n g f o r 5 0 m i n f o ro p t i m a l h y d r o l y s i s o f p r o t e i n s .( i i i ) C o m b i n e d m a s h . T h e c o o l e d c o o k e r m a s h w a sa d d e d , a n d t h e t e m p e r a t u r e w a s r a i s e d t o 7 2 C . T h em a s h w a s m a i n t a i n e d a t t h i s t e m p e r a t u r e f o r 2 0 m i nf o r o p t i m a l c a r b o h y d r a t e h y d r o l y s i s . T h e m a s h t e m -p e r a t u r e w a s t h e n r a i s e d t o 7 5 C , a n d t h e m i x t u r e w a sf i l t e r e d .( i v ) W o r t . T h e e n t i r e f i l t r a t e ( w o r t ) w a s b o i l e d w i t h1 . 5 g o f h o p s f o r 9 0 m i n . T w e n t y m i n u t e s b e f o r e t h eb o i l i n g w a s c o m p l e t e d a n a d d i t i o n a l 2 . 0 g o f h o p s w a sa d d e d . T h e b o i l e d w o r t w a s f i l t e r e d a n d c o o l e d t o1 2 C .F e r m e n t a t i o n a n d s t o r a g e . T h e w o r t w a s p i t c h e dw i t h 5 g o f m o i s t c a k e y e a s t ( 1 g , d r y b a s i s ) ( S a c -c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) a n d f e r m e n t e d i n a c o v e r e d ,b u t n o t s e a l e d , f l a s k a t 1 2 C f o r 8 d a y s . A 6 4 - m ga m o u n t o f c o m m e r c i a l c h i l l - p r o o f i n g p r e p a r a t i o n( c r u d e p a p a i n ) w a s a d d e d , a n d t h e b e e r w a s t r a n s -f e r r e d t o a s t o r a g e f l a s k a n d m a i n t a i n e d a t 0 C u n d e r1 2 l b / i n 2 p r e s s u r e o f c a r b o n d i o x i d e f o r 1 4 d a y s . T h eb e e r w a s t h e n f i l t e r e d a n d b o t t l e d u n d e r 1 2 l b / i n 2c a r b o n d i o x i d e p r e s s u r e . F o r p a s t e u r i z a t i o n t h e b o t -t l e d b e e r w a s k e p t a t 6 0 C f o r 2 0 m i n a n d t h e n c o o l e dt o r o o m t e m p e r a t u r e i n 1 5 m i n . T h e b e e r w a s s t o r e dt h e r e a f t e r a t 1 2 C .S p i k i n g o f t h e p u r i f i e d t o x i n s . F o r A f l a B la p p r o p r i a t e a m o u n t s o f t o x i n i n 5 m l o f c h l o r o f o r mw e r e a d d e d t o t h e m a l t o r c o r n g r i t s a t t h e b e g i n n i n go f t h e c o o k e r a n d m a l t m a s h i n g s t a g e s a t 0 , 1 , a n d 1 0M g / g l e v e l s ( w e i g h t b a s i s ) . T h e c h l o r o f o r m w a s r e -m o v e d b y e v a c u a t i o n . F o r O A , t h e t o x i n w a s d i s s o l v e di n 1 t o 2 m l o f 1 % N a H C O . a n d a d d e d t o c o o k e r a n dm a l t m a s h d i r e c t l y b e f o r e p r o c e s s i n g . D u p l i c a t e e x -p e r i m e n t s w e r e m a d e f o r e a c h l e v e l o f t o x i n s a d d e d .T h e a m o u n t s o f t o x i n s s p i k e d i n e a c h s t e p w e r e : ( i )c o o k e r m a s h e s : 0 , 1 1 6 , a n d 1 , 1 6 0 M g o f t o x i n s ; ( i i ) m a l tm a s h e s : 0 , 1 8 9 , a n d 1 , 8 9 0 M g o f t o x i n s ; ( i i i ) c o m b i n e dm a s h e s : 0 , 1 8 9 , a n d 1 , 8 9 0 A g t o x i n s ; ( i v ) w o r t s : 0 , 1 8 9 ,a n d 1 , 8 9 0 g g o f a f l a t o x i n ( m a d e f r o m c o o k e r m a s h e sw i t h o u t t o x i n a n d m a l t m a s h e s w i t h e a c h t o x i n l e v e l ) ,o r 0 , 3 0 5 , a n d 3 , 0 5 0 j g o f o c h r a t o x i n ( m a d e f r o mc o o k e r m a s h e s w i t h e a c h l e v e l o f t o x i n a n d m a l tm a s h e s w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g l e v e l o f t o x i n ) ; a n d ( v )b e e r s : 0 , 1 8 9 , a n d 1 , 8 9 0 , g g o f t o x i n s c o n t r i b u t e d b y t h em a l t m a s h .E x t r a c t i o n o f b r e w i n g p r e p a r a t i o n s a n d t o x i na n a l y s e s . D u p l i c a t e s a m p l e s w e r e a n a l y z e d a t f i v es t a g e s d u r i n g t h e b r e w i n g p r o c e s s : ( i ) t h e c o m p l e t e dc o o k e r m a s h ; ( i i ) t h e m a l t m a s h a t t h e e n d o f t h ep r o t e i n h y d r o l y s i s s t a g e ; ( i i i ) t h e c o m b i n e d m a s h a tt h e e n d o f t h e c a r b o h y d r a t e h y d r o l y s i s s t a g e ; ( i v ) t h ew o r t a f t e r a d d i t i o n o f h o p s a n d b o i l i n g ; a n d ( v ) t h eb o t t l e d b e e r a f t e r p a s t e u r i z a t i o n . T h e f o l l o w i n g p r o c e -d u r e s w e r e u s e d f o r t o x i n a n a l y s i s .( i ) A f l a B l . F o r A f l a B , , o f f i c i a l m e t h o d s o f a n a l y s i sw e r e f o l l o w e d ( 1 ) . S a m p l e s o f 1 0 0 g o r 1 0 0 m l w e r ee x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m a c c o r d i n g t o S e c t . 2 6 . 0 1 8( a ) ( r e f . 1 ) . A f t e r e v a p o r a t i o n o f t h e c h l o r o f o rm f r o mt h e e x t r a c t s , t h e s a m p l e s w e r e r e d i s s o l v e d i n 1 t o 2 m lo f c h l o r o f o r m a n d c h r o m a t o g r a p h e d a s d e s c r i b e d i nS e c t . 2 6 . 0 1 9 ( a ) ( r e f . 1 ) . T h e c h l o r o f o r m e l u t i o nf r a c t i o n w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s , r e d i s s o l v e d q u a n -t i t a t i v e l y i n 1 t o 5 m l o f c h l o r o f o r m , a n d t h e n

c h r o m a t o g r a p h e d o n a g l a s s p l a t e ( 2 0 b y 2 0 c m ) w i t h a2 5 0 - u m l a y e r o f A d s o r b o s i n - 5 ; m e t h a n o l - c h l o r o f o r m( 3 : 9 7 ) w a s t h e d e v e l o p i n g s o l v e n t . Q u a n t i t a t i o n s w e r em a d e b y a f l u o r o d e n s i t o m e t r i c m e t h o d ( 5 ) , e x c e p tt h a t a p h o t o v o l t d e n s i t o m e t e r m o d e l I I I T u r n e r f l u o -r o m e t e r TLC s c a n n e r ( G . K . T u r n e r A s s o c i a t e s , P a l oA l t o , C a l i f . ) w i t h p r i m a r y a n d s e c o n d a r y f i l t e r s o fT u r n e r n o . 1 1 0 - 8 1 1 a n d 1 1 0 - 8 1 6 w a s u s e d .( i i ) OA. F o r OA d e t e r m i n a t i o n , 1 0 0 g e a c h o ft r e a t e d b r e w i n g p r o d u c t a n d a c o n t r o l w a s b l e n d e dw i t h 1 0 0 m l o f 2% N a H C O , s o l u t i o n f o r 5 m i n a n dt h e n c e n t r i f u g e d a t 3 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n . T h es u p e r n a t a n t s w e r e t r a n s f e r r e d t o s e p a r a t o r y f u n n e l s .T h e r e s i d u e s w e r e b l e n d e d t w i c e w i t h 1 5 0 m l o f 1 %N a H C O , f o r 5 m i n a n d c e n t r i f u g e d a g a i n a s d e s c r i b e da b o v e . A l l o f t h e s u p e r n a t a n t s o f e a c h b a t c h w e r e t h e np o o l e d a n d a c i d i f i e d w i t h c o n c e n t r a t e d H C l t o p H 2 .L i k e w i s e , 1 0 0 m l o f b e e r w a s d i r e c t l y a c i d i f i e d t o p H2 . 0 w i t h H C l . T h e a c i d i f i e d s o l u t i o n s w e r e e x t r a c t e dt w i c e w i t h e q u a l v o l u m e s o f c h l o r o f o r m i n s e p a r a t o r yf u n n e l s . T h e c h l o r o f o r m e x t r a c t w a s t h e n e v a p o r a t e dt o d r y n e s s a n d d i s s o l v e d q u a n t i t a t i v e l y i n 8 m l o fc h l o r o f o r m f o r t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y a n a l y s i s o nA d s o r b o s i l - 5 a s d e s c r i b e d b e f o r e ; t h e s o l v e n t s y s t e mw a s b e n z e n e - a c e t i c a c i d ( 9 : 1 ; 7 ) . Q u a n t i t a t i o n w a sd o n e o n a T u r n e r f l u o r o m e t e r a s d e s c r i b e d f o r A f l a B l -

RES ULTS AND DISCUSSIONT h e v a l i d i t y o f t h e p r e s e n t d a t a r e s t s p r i m a r -i l y o n t h e m e t h o d o f e x t r a c t i o n a n d a n a l y s i s ;t h u s , c o n t r o l e x p e r i m e n t s , i n w h i c h t e s t m y c o -t o x i n s w e r e a d d e d t o t h e b r e w i n g p r o d u c t s a f t e re a c h p r o c e s s , w i t h s u b s e q u e n t a n a l y s i s o f t o x i n

c o n t e n t , w e r e c a r r i e d o u t . T h e r e s u l t s s h o w e dt h a t t h e t o x i n r e c o v e r y r a n g e d f r o m 7 8 t o 9 1 %f o r e a c h s t e p , w i t h a n o v e r a l l a v e r a g e o f 8 5 % .S i n c e t h e r e c o v e r y y i e l d f a l l s i n t o t h e r a n g e o fm y c o t o x i n a n a l y s i s i n o t h e r f o o d ( 4 ) , t h e a n a l y t -i c a l m e t h o d s u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y m i g h ta l s o b e u s e d f o r r o u t i n e a n a l y ' s i s o f t h e s e m y c o -t o x i n s i n b e e r o r r e l a t e d p r o d u c t s . T h e p r e s e n c eo f a l c o h o l was r e m o v e d b y e v a p o r a t i o n u n d e rv a c u u m , a n d t h e r e m a i n i n g m a t e r i a l was a n a -l y z e d f o r t o x i n s . Th e r e s u l t s s h o w e d t h a t b o t ht h e t r e a t e d ( a l c o h o l r e m o v e d ) a n d t h e u n t r e a t e ds a m p l e s g a v e s i m i l a r r e c o v e r i e s ( 8 6 . 6 v e r s u s8 9 . 3 % ) . Th e t o x i n s w e r e t h e n d i r e c t l y e x t r a c t e df r o m t h e b e e r o r a c i d i f i e d b e e r ( f o r O A ) w i t ho r g a n i c s o l v e n t s b e f o r e a n a l y z i n g .Th e l e v e l s o f A f l a B , a n d O A i n b r e w i n g a tf i v e s t a g e s a r e g i v e n i n T a b l e 1 . I n g e n e r a l , b o t hm y c o t o x i n s w e r e p a r t i a l l y l o s t d u r i n g t h e b r e w -i n g . T h e p a t t e r n s f o r t h e l o s s o f b o t h m y c o t o x i n sw e r e s i m i l a r ; b o t h w e r e r e l a t i v e l y s t a b l e i n t h ec o o k e r mash s t e p b u t w e r e more s e n s i t i v e t ol a t e r t r e a t m e n t s , e s p e c i a l l y t h e p r o t e i n h y d r o l -y s i s , w o r t b o i l i n g , a n d f i n a l f e r m e n t a t i o n . S i n c eb o t h m y c o t o x i n s a r e r e l a t i v e l y s t a b l e t o h e a t ( 4 ,9 , 1 6 ) , i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t m o r e t h a n 90% o f

3 1 4 C H U ET A L .

8/2/2019 Aflatoxin in Brewery

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STABILITY OF AFLA B , AND OA I N BREWINGT A B L E 1 . S t a b i l i t y o f t o x i n s i n b r e w i n g

T o x i n a d d e d ( f i g ) T o x i n r e c o v e r e d ( j t g ) % R e c o v e r yT r e a t m e n t A f l a t o x i n O c h r a t o x i n A f l a t o x i n O c h r a t o x i n A f l a t o x i n O c h r a t o x i nC o m p l e t e c o o k e r m a s h 1 , 1 6 0 1 , 1 6 0 9 3 8 9 4 6 8 1 ( 9 5 ) a 8 2 ( 9 6 ) a1 1 6 1 1 6 7 4 9 0 6 3 ( 7 4 ) 7 7 ( 9 1 )M a l t m a s h a f t e r p r o t e i n h y d r o l y s i s 1 , 8 9 0 1 , 8 9 0 1 , 3 9 2 1 , 4 1 5 7 4 ( 8 7 ) 7 5 ( 8 8 )1 8 9 1 8 9 1 1 8 1 2 2 6 2 ( 7 3 ) 6 5 ( 7 6 )C o m b i n e d m a s h a f t e r c a r b o h y d r a t e 1 , 8 9 0 1 , 8 9 0 1 , 2 2 5 1 , 3 5 5 6 5 ( 7 6 ) 7 2 ( 8 5 )h y d r o l y s i s 1 8 9 1 8 9 9 8 1 0 9 5 2 ( 6 1 ) 5 8 ( 6 8 )B o i l e d w o r t 1 , 8 9 0 3 , 0 5 0 8 0 0 1 , 6 4 4 4 2 ( 4 9 ) 4 6 ( 5 4 )1 8 9 3 0 5 6 5 1 0 6 3 4 ( 4 0 ) 4 1 ( 4 8 )C o m p l e t e d b e e r 1 , 8 9 0 1 , 8 9 0 4 4 0 4 4 6 2 3 ( 2 7 ) 2 4 ( 2 8 )1 8 9 1 8 9 2 8 2 4 1 5 ( 1 8 ) 1 2 ( 1 4 )

V a l u e s i n p a r e n t h e s e s i n d i c a t e a c o r r e c t i o n o f 1 5 % d u e t o l o s s i n t h e a n a l y s i s .t h e a d d e d t o x i n s w e r e i n t h e s a m p l e a f t e r c o o k e rm a s h t r e a t m e n t . R e m o v a l o f t o x i n f r o m t h ep r o d u c t w a s v e r y s i g n i f i c a n t i n t h e m a l t mash( w i t h a l o s s o f 1 2 % f o r a 1 0 M g / g s a m p l e a n d 2 4 t o2 7 % f o r a 1 A g / g s a m p l e ) , i n b o i l e d w o r t ( 2 0 t o3 0 % l o s s o f m a t e r i a l a d d e d t o t h e m a l t m a s h ) ,a n d i n t h e f i n a l f e r m e n t a t i o n ( a n o t h e r 2 0 t o 3 0 %l o s s f r o m t h e b o i l e d w o r t s t e p ) s t e p s . S i n c e i th a s b e e n o b s e r v e d t h a t OA c a n b e h y d r o l y z e db y a c i d a n d s o m e p r o t e a s e s t o o c h r a t o x i n a a n dp h e n y l a l a n i n e ( 4 ) a n d s i n c e o c h r a t o x i n a h a sb e e n d e t e c t e d i n t h e w o r t w h e n O A - c o n -t a m i n a t e d b a r l e y w a s u s e d i n t h e b r e w i n g ( 1 0 ) ,r e m o v a l o f OA i n t h e b r e w i n g p r o c e s s mayp r i m a r i l y b e d u e t o s u c h h y d r o l y s i s . T h e m e c h -a n i s m o f A f l a B l r e m o v a l , h o w e v e r , i s n o tk n o w n . T h e s i g n i f i c a n t l o s s o f b o t h m y c o t o x i n sb e t w e e n t h e c o m b i n e d mash a n d b o i l e d w o r ts t e p s may b e d u e t o t h e n o n s p e c i f i c i n t e r a c t i o no r a d s o r p t i o n o f b o t h m y c o t o x i n s b y t h e s o l i dp a r t i c l e s r e m o v e d b y t h e f i l t r a t i o n p r o c e s s .B o t h m y c o t o x i n s w e r e p a r t i a l l y r e m o v e d i nb r e w i n g , b u t c o n s i d e r a b l e a m o u n t s w e r e t r a n s -f e r r e d i n t o t h e b e e r , e s p e c i a l l y i f t h e c o n t a m i n a -t i o n l e v e l w a s h i g h . A p p r o x i m a t e l y 2 5 % o f t h ea d d e d t o x i n s w e r e f o u n d i n t h e f i n a l p r o d u c tw h e n 1 0 u g o f t h e t o x i n p e r g i n t h e c e r e a l w a st e s t e d . A t t h e l o w e r t e s t i n g l e v e l ( 1 A g / g ) ,r e c o v e r y w a s a b o u t 1 5 % . O u r r e s u l t s o n OAd i f f e r f r o m t h o s e r e p o r t e d b y K r o g h e t a l . ( 1 1 ) .T h e y f o u n d s i g n i f i c a n t l o s s i n m a s h i n g ( 7 0 % l o s tb e f o r e b o i l e d w o r t ) , a n d l e s s t h a n 1 0 % o f OAw a s r e c o v e r e d w h e n b a r l e y , c o n t a i n i n g 1 t o 5 , u go f t o x i n p e r g , w a s u s e d i n t h e b r e w i n g . I t i s n o tk n o w n w h e t h e r t h e s e c o n t r a d i c t i o n s a r e d u e t o ad i f f e r e n c e i n t h e i r b r e w i n g p r o c e s s e s , i n w h i c hl a c t i c a c i d a n d b a c t e r i a l e n z y m e s w e r e u s e d , o r

t o t h e m e t h o d o f e x t r a c t i o n a n d a n a l y s i s f o rw h i c h r e c o v e r y y i e l d i n t h e c o n t r o l s a m p l e w a sn o t r e p o r t e d b y t h e i n v e s t i g a t o r s .I n a s m u c h a s m y c o t o x i n s i n c o n t a m i n a t e dm a t e r i a l s a r e n o t c o m p l e t e l y r e m o v e d f r o m t h eb e e r i n b r e w i n g a n d m i g h t b e c o n v e r t e d t o s o m eu n k n o w n p r o d u c t s w h i c h m i g h t a l s o b e t o x i c ,t h e b e s t p r o t e c t i o n w o u l d b e t o p r e v e n t t h e u s eo f c o n t a m i n a t e d r a w m a t e r i a l s i n b r e w i n g . I no rd e r t h a t b a r l e y g e r m i n a t e a n d g r o w ( m a l t )s a t i s f a c t o r i l y , a n d t h e r e f o r e m e e t t h e r e q u i r e -m e n t s o f t h e m a l t i n g i n d u s t r y , i t m u s t b e s t o r e du n d e r c o n d i t i o n s w h i c h w o u l d n o t p r o m o t e t h eg r o w t h o f s t o r a g e m o l d s . A l t h o u g h K r o g h e t a l .( 1 1 ) d e m o n s t r a t e d t h a t w h e n b a r l e y w a s h e a v i l yc o n t a m i n a t e d w i t h OA i t t h u s f a i l e d t o g e r m i -n a t e a n d w o u l d b e r e j e c t e d f o r m a l t i n g , i t i s n o tk n o w n w h e t h e r o r n o t a f l a t o x i n w o u l d a l s oa f f e c t t h e m a l t i n g p r o c e s s . M o r e o v e r , t h e m a t e -r i a l u s e d a s a d j u n c t ( t h e c o n s t i t u e n t o t h e r t h a nm a l t i n t h e c o o k e r m a s h ) f u n c t i o n s p r i m a r i l y a sa s o u r c e o f s t a r c h a n d o t h e r c a r b o h y d r a t e sw h i c h a r e l a r g e l y h y d r o l y z e d t o m a l t o s e d u r i n gt h e " c o n v e r s i o n " o r c a r b o h y d r a t e h y d r o l y z i n gs t a g e o f m a s h i n g . P o s s i b l y t h e s e a d j u n c t s ( c o r ns y r u p s , g r o u n d r i c e , a n d g r o u n d b a r l e y a r ec o m m o n l y u s e d ) , i f t h e y a r e a l r e a d y c o n t a m i -n a t e d i n t h e f i e l d o r i f t h e y a r e s t o r e d u n d e ra d v e r s e c o n d i t i o n s , c o u l d c o n t r i b u t e m y c o t o x -i n s t o t h e m a s h .

ACKNOWLEDGMENTT h e B a r l e y a n d M a l t L a b o r a t o r y i s s u p p o r t e d b y a g r a n tf r o m t h e M a l t i n g B a r l e y I m p r o v e m e n t A s s o c i a t i o n .

LITERATURE CITED1 . A s s o c i a t i o n o f O f f i c i a l A n a l y t i c a l C h e m i s t s . 1 9 7 0 . O f f i c i a lm e t h o d s o f a n a l y s i s , 1 1 t h e d . A s s o c i a t i o n o f O f f i c i a l

3 1 5O L . 2 9 , 1 9 7 5

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A P P L . M I C R O B I O L .A n a l y t i c a l C h e m i s t s , W a s h i n g t o n , D . C .2 . B u r k h a r t , B . A . , 0. J . O t i s , an d A . D . D i c k s o n . 1 9 6 0 . Am i c r o b r e w e r y f o r t h e e a r l y q u a l i t y e v a l u a t i o n o f h y b r i db a r l e y s e l e c t i o n , p. 1 2 3 - 1 2 8 . I n P r o c . Am . S o c . B r e w .C h e m . , 1 9 6 0 . A m e r i c a n S o c i e t y o f B r e w i n g C h e m i s t s ,S t . P a u l , M i n n .3 . C h u , F . S . 1 9 7 1 . C h r o m a t o g r a p h y o f c r u d e a f l a t o x i n s onA d s o r b o s i l - 5 . J . A s s o c . O f f . A n a l . C h e m . 5 4 : 1 3 0 4 - 1 3 0 6 .4 . C h u , F . S . 1 9 7 4 . S t u d i e s on o c h r a t o x i n s . C r i t . R e v .T o x i c o l . 2 : 4 9 9 - 5 2 4 .5 . C h u , F . S . , a n d M . E . B u t z . 1 9 7 0 . S p e c t r o p h o t o f l u o r o d e n -s i t o m e t r i c measurement o f o c h r a t o x i n A i n c e r e a lp r o d u c t s . J . A s s o c . O f f . A n a l . C h e m . 5 3 : 1 2 5 3 - 1 2 5 7 .6 . D e t r o y , R . W . , E . B . L i l l e h o j , a n d A . C i e g l e r . 1 9 7 1 . A f l a -t o x i n a n d r e l a t e d c o m p o u n d s , p . 4 - 1 7 8 . I n S . J . A j l e ta l . ( e d . ) , M i c r o b i a l t o x i n s , v o l . 6 . A c a d e m i c P r e s s I n c . ,Ne w Y o r k .7 . E p p e y , R . M . 1 9 6 8 . S c r e e n i n g m e t h o d f o r z e a r a l e n o n e ,a f l a t o x i n a n d o c h r a t o x i n . J . A s s o c . O f f . A n a l . C h e m .5 1 : 7 4 - 7 8 .8 . F i s c h b a c h , H . , a n d J . H . R o d r i c k s . 1 9 7 3 . C u r r e n t e f f o r t so f t h e F o o d a n d D r u g A d m i n i s t r a t i o n t o c o n t r o l myco-t o x i n s i n f o o d . J . A s s o c . O f f . A n a l . C h e m . 5 6 : 7 6 7 - 7 7 0 .9 . G o l d b l a t t , L . A . 1 9 6 9 . A f l a t o x i n , s c i e n t i f i c b a c k g r o u n d ,c o n t r o l , a n d i m p l i c a t i o n s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , NewY o r k .

1 0 . K r o g h , P . , B . H a l d , P . E n g l u n d , L . R u t q v i s t , a n d 0.S w a h n . 1 9 7 4 . C o n t a m i n a t i o n o f S w e d i s h c e r e a l s w i t ho c h r a t o x i n A . A c t a P a t h o l . M i c r o b i o l . S c a n d .3 2 : 3 0 1 - 3 0 2 .1 1 . K r o g h , P . , B . H a l d , P . G j e r t s e n , a n d R . M y k e n . 1 9 7 4 .F a t e o f o c h r a t o x i n A a n d c i t r i n i n d u r i n g m a l t i n g a n db r e w i n g e x p e r i m e n t s . A p p l . M i c r o b i o l . 2 8 : 3 1 - 3 4 .1 2 . S c o t t , P . M . , W . va n W a l b e e k , B . K e n n e d y , a n d D .A n y e t i . 1 9 7 2 . M y c o t o x i n s ( o c h r a t o x i n A , c i t r i n i n , a n ds t e r i g m a t o c y s t i n ) a n d t o x i g e n i c f u n g i i n g r a i n s a n do t h e r a g r i c u l t u r a l p r o d u c t s . A g r . F o o d C h e m .2 0 : 1 1 0 3 - 1 1 0 9 .1 3 . S h o t w e l l , 0. L . , C . W . H e s s e l t i n e , a n d M. L . G o u l d e n .1 9 6 9 . O c h r a t o x i n A : occurrence as n a t u r a l c o n t a m i n a n to f a corn s a m p l e. A p p l . M i c r o b i o l . 1 7 : 7 6 5 - 7 6 6 .1 4 . S h o t w e l l , 0. L . , C . W . H e s s e l t i n e , M. L . G o u l d e n , a n d E .E . V a n d e g r a f t . 1 9 7 0 . S u r v e y o f corn f o r a f l a t o x i n ,z e a r a l e n o n e a n d o c h r a t o x i n . C e r e a l C h e m . 4 7 : 7 0 0 - 7 0 7 .1 5 . S h o t w e l l , 0. L . , C . W. H e s s e l t i n e , E . E . V a n d e g r a f t , a n dM . L . G o u l d e n . 1 9 7 1 . S u r v e y o f corn f r o m d i f f e r e n tr e g i o n s f o r a f l a t o x i n , o c h r a t o x i n , a n d z e a r a l e n o n e .C e r e a l S c i . T o d a y 1 6 : 2 6 6 - 2 7 3 .1 6 . T r e n k , H . L . , M. E . B u t z , a n d F . S . C h u . 1 9 7 1 . P r o d u c -t i o n o f o c h r a t o x i n s i n d i f f e r e n t c e r e a l p r o d u c t s b yA s p e r g i l l u s o c h r a c e u s . A p p l . M i c r o b i o l . 2 1 : 1 0 3 2 - 1 0 3 5 .

3 1 6 C H U ET A L .