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manual to counting urinary elements
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I Mestrado Anlises Clnicas
Joana Selada Domingues - 1 -
IINNTTRROODDUUOO
A actividade profissional decorreu no Laboratrio de Anlises Clnicas (LAC)
Maria Celeste Formosinho Fernandes, com sede na Rua Egas Moniz, Lisboa.
Este LAC possui um corpo tcnico qualificado para executar as valncias de
Imunologia, Endocrinologia, Bioqumica, Hematologia e Microbiologia, constitudo
pelo Director Tcnico, especialista em Anlises Clnicas pela Ordem dos
Farmacuticos, trs especialistas em Anlises Clnicas, tcnicos de anlises clnicas,
auxiliares de laboratrio, assistentes de consultrio e de limpeza.
Os servios encontram-se completamente informatizados, possuindo uma rede
de computadores com terminais ligados directamente aos aparelhos, o que permite a
informatizao dos servios desde a abertura de fichas at emisso de boletins,
passando pelo envio directo dos pedidos e retorno dos respectivos resultados para a
ficha do utente. Softlab foi o programa informtico escolhido pelo laboratrio.
O laboratrio encontra-se apetrechado com moderno equipamento automatizado.
As metodologias a aplicar so escolhidas em funo do desempenho pretendido, de
forma apropriada s condies do laboratrio, e de acordo com o equipamento e
reagentes.
O funcionamento passa pelo atendimento dos utentes com a organizao do
dossier do utente, por via informtica. Procede-se recolha dos produtos biolgicos,
segundo as regras exigidas para o efeito, e de acordo com o tipo de anlises solicitadas.
Os equipamentos so preparados diariamente, no que respeita a reagentes,
calibradores e controle, segundo as recomendaes do fabricante para cada tipo de
aparelho. As anlises, na sua grande maioria, so realizadas em equipamentos
automatizados, os resultados so validados pelos especialistas e/ou tcnico superior.
O LAC adoptou um Sistema de Gesto da Qualidade, so aplicados e cumpridos
os requisitos da Norma NP EN ISO 9001:2000, das Normas para o Laboratrio Clnico
da Ordem dos Farmacuticos e do Manual de Boas Prticas Laboratoriais.
I Mestrado Anlises Clnicas
Joana Selada Domingues - 2 -
TTCCNNIICCAASS // EEQQUUIIPPAAMMEENNTTOOSS UUTTIILLIIZZAADDOOSS
BBIIOOQQUUIIMMIICCAA
Equipamento Parmetro
Tcnica Manual Clculo Urinrio/Renal
Contagem de Addis
Espermograma
Grau de Digesto das Fezes
Pesquisa de Drogas de Abuso - Canabinides,
Herona, Morfina, Opiceos
Pesquisa de Protenas de Bence Jones
Pesquisa de Protenas na Urina
Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes
Sedimento Urinrio
Microtech 672 Electroforese de Protenas
Modular Analytics SWA cido Flico
cido rico
Albumina
-Amilase
Alanina-aminotransferase - ALT/GPT
Aspartato-aminotransferse - GOT/AST
Bilirrubina Directa
Bilirrubina Total
Clcio
Colesterol
Creatinafosfoquinase - CPK e CPK-MB
Creatinina
Desidrogenase lctica - LDH
Fosfatase cida
Fosfatase Alcalina - ALP
Fosfatase cida No Prosttica
Ferritina
Ferro
Fsforo
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Gama-Glutamiltransferase - GGT
Glucose
Hemoglobina glicosilada
Imunoglobulinas
Insulina
Ionograma - Potssio, Sdio, Cloro
Lipoprotenas de alta densidade - HDL
Lipoprotenas de baixa densidade LDL
Lipoprotenas de muito baixa densidade -
VLDL, Lpidos totais
Magnsio
Paratormona PTH
Protenas totais
Transferrina
Triglicridos
Ureia
Vitamina B12
Urisys 2400 Urina tipo II
11.. CCLLCCUULLOO UURRIINNRRIIOO
Colorimtrico
1.1. Fundamento do mtodo
Determinao semi-quantitativa dos componentes mais importantes do clculo
urinrio: clcio, oxalato, fosfato, magnsio, amnia, cido rico e cistina.
O mtodo tritimtrico usado para o clcio e o mtodo colorimtrico para os
restantes componentes.
Clcio: a determinao titrimtrica com soluo titriplex (sal dissdico do cido
etilenodinitrotetractico) sendo usado o cido calconcarboxilico como indicador.
Oxalato: o complexo corado formado pelo ferro (III) e cido sulfosalicilico
descolorado pelo oxalato.
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Amnio: com a adio do reagente de Nessler (tetraiodomercurato de potssio),
o amnio d origem a uma soluo amarela acastanhada.
Fosfato: o cido fosfomolibdico formado pela adio de molibdato de amnio
reduzido a molibdnio azul pela aco de agentes redutores. (disulfito de sdio, sulfato
4-metilaminofenol)
Magnsio: em meio tamponado o magnsio reage com um reagente corado (1-
azo-2-hidroxi-3-(2,4-dimetil-carboxanilido)-naftaleno-1-(2-hidroxibenzeno-5-sodio
sulfonato) para formar um complexo vermelho.
cido rico: em meio tamponado o cido molibdatofosfrico reduzido pelo
cido rico formando azul de molibdnio
Cistina: a cistina reduzida a cistena pelo sulfito de sdio. Em meio alcalino a
cistena origina uma colorao vermelha na presena de nitroprussiato de sdio.
Os componentes determinados encontram-se na forma dos seguintes elementos,
nos quais os clculos so baseados: Oxalato de clcio (CaC2O4.H2O), fosfato de
magnsio e amnio (MgNH4PO4.6H2O), hidrogeno fosfato de clcio (CaHPO4.2H2O),
fosfato triclcico (Ca10(PO4)8(OH)2), urato de amnio, cido rico e cistina. (bula
Merckognostics)
22.. CCOONNTTAAGGEEMM DDEE AADDDDIISS
Contagem em Cmara
2.1. Fundamento do mtodo
A contagem de Addis uma medida quantitativa da excreo de eritrcitos,
leuccitos e cilindros na urina colhida perodo de 12 horas. A excreo de protenas e a
densidade da amostra tambm so determinadas. Permite a monitorizao doena renal.
Medir o volume da amostra de urina de 12 horas. Homogeneizar e medir 10ml.
Centrifugar, rejeitando o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1ml de soro
fisiolgico. Homogeneizar e encher a cmara de contagem. Contar isoladamente as
hemcias, leuccitos e cilindros nos 9 quadrados de 1mm.
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N= S/V n V/10
N = n de cada elemento no volume total
S = vol. cm3 da suspenso soro fisiolgico (1 cm3)
V = vol. cm3 onde foi feita a contagem (0.0009 cm3)
V = volume total de urina
N = n cilindros (pequena ampliao), n hemcias (grande ampliao),
n leuccitos (grande ampliao)
33.. EESSPPEERRMMOOGGRRAAMMAA
3.1. Fundamento do mtodo
Amostra:esperma colhido at 30 min antes. Abstinncia de 3-4 dias.
Avaliao dos seguintes parmetros fsicos e exame microscpico:
- pH: avaliao do pH com papel indicador;
- Tempo de liquefaco: tempo de passagem de gel a lquido aps colheita;
- Viscosidade: 30 minutos aps a colheita avaliar a viscosidade; homogeneizar a
amostra, com uma pipeta Pasteur tomar uma alquota e deixar cair
espontaneamente; se a queda ocorrer gota a gota a viscosidade normal;
- Exame microscpico directo: assinalar a presena de espermatozides,
aglutinao, clulas epiteliais, leuccitos, eritrcitos, clulas de
espermatognese, cristais de fosfato de espermina, muco e Trichomonas.
Quando no se observam espermatozides, centrifuga-se todo o volume
ejaculado, despreza-se o sobrenadante e observa-se o sedimento ao microscpio;
- Mobilidade: realizar um exame a fresco entre lmina e lamela aquecidas a
37C, observar vrios campos com a objectiva de 40 contando pelo menos 200
espermatozides; avaliar o movimento classificando em rectilneo rpido, lento,
in situ ou imveis;
- Vitalidade: os espermatozides mortos so permeveis eosina enquanto os
vivos permanecem incolores; misturar uma gota de esperma com uma gota de
Giemsa a 10%, deixar em contacto 20 segundos, fazer o esfregao e observar ao
microscpio.
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- Morfologia: observar no exame microscpico os espermatozides normais ou
anormais (alteraes da cabea, do colo, da cauda ou alteraes mistas);
- Contagem em cmara: clculo do nmero de espermatozdes/mL = n
espermatozides contados 100.000.
44.. GGRRAAUU DDEE DDIIGGEESSTTOO DDAASS FFEEZZEESS
Exame macroscpico, microscpico, caracteres fsicos
Para este exame o utente deve submeter-se a um regime alimentar em que
entrem hidratos de carbono, gorduras e protenas.
4.1. Fundamento do mtodo
O estudo do grau de digesto das fezes permite apreciar o estado da funo
digestiva e rapidez do trnsito intestinal.
As fezes devero ser avaliadas em relao aos caracteres fsicos: consistncia,
forma, cheiro, cor e reaco (pH).
No exame macroscpico dever ser realizada a pesquisa de elementos anormais:
muco, sangue, ps, parasitas, fibras musculares, gordura, detritos vegetais
Para o exame microscpico, depois das fezes bem homogeneizadas, preparar
uma soluo com soro fisiolgico. Fazer trs preparaes, uma s com soro fisiolgico
e fezes, outra com lugol e fezes e a terceira com sudam III e fezes. Proceder ao
reconhecimento dos seguintes elementos:
- Resduos alimentares de origem animal (fibras musculares, gorduras)
- Resduos alimentares de origem vegetal (amido, cristais, celulose digestvel e
no digestvel)
- Substncias de origem intestinal (muco, leuccitos, hemcias e clulas epiteliais)
55.. PPEESSQQUUIISSAA DDEE DDRROOGGAASS DDEE AABBUUSSOO
Imunocromatografia
5.1. Fundamento do mtodo
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Amostra: Urina colhida no laboratrio.
Imunoensaio cromatogrfico baseado no princpio de vnculos competitivos. As
drogas que podem estar presentes na urina competem com a droga conjugada para
formar pontes com o anticorpo.
Durante o teste, a amostra de urina migra por aco capilar, se a droga no
estiver presente na amostra, no ocorrer a saturao das pontes do anticorpo. As
partculas revestidas de anticorpo sero capturadas por conjugado da droga imobilizado
e uma linha colorida visvel aparecer na regio da linha teste. Se a droga estiver
presente na amostra, no se formar uma linha visvel, pois ocorrer uma saturao de
todas as pontes de anticorpo anti-droga.
66.. PPEESSQQUUIISSAA DDEE PPRROOTTEENNAASS DDEE BBEENNCCEE JJOONNEESS
Turbidimetria
6.1. Fundamento do mtodo
As protenas de Bence Jones so protenas anormais que apresentam
precipitao a 40-60C, redissolvendo-se a temperaturas de 100C.
Aparecem com grande frequncia em pacientes com mieloma mltiplo, podendo
surgir tambm em processos neoplsicos do osso, leucemias e nefrite crnica.
Centrifugar a amostra de urina de 24 horas. Em tubo de ensaio colocar cerca de
4ml de urina e 1ml do tampo de acetato e misturar. O pH final dever ser de 5.
Colocar em banho-maria a 56C durante 15 minutos. Um precipitado indica a
presena de protenas Bence Jones.
Caso haja turvao ou precipitao, aquecer o tubo em banho de gua fervente
por 3 minutos e observar a diminuio da turvao. A protena Bence Jones redissolver-
se- a 100C.
Um aumento da turvao ou precipitao ao ferver indicar a presena de
albumina e globulina, que ir mascarar o resultado. Neste caso, filtrar o contedo do
tubo imediatamente aps retir-lo do banho fervente e observar o filtrado. Se for claro e
se tornar turvo medida que arrefece e voltar a ficar claro quando retorna temperatura
ambiente a prova positiva para a protena de Bence Jones.
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77.. PPEESSQQUUIISSAA DDEE PPRROOTTEENNAASS NNAA UURRIINNAA
Turbidimetria
7.1. Fundamento do mtodo
Proteinria definida como o aumento da quantidade de protenas na urina.
Apenas uma pequena parte das protenas est presente na urina (20 a 150mg/dia), sendo
a maioria albumina. O restante consiste, na quase totalidade, na proteina Tamm-
Horsfall, provavelmente secretada pelos tubulos distais. O aumento da permeabilidade
da membrana glomerular tem como primeiro sinal o aumento da albuminria. A perda
de selectividade demonstrada pelo aparecimento na urina de protenas de elevado peso
molecular. A diminuio da reabsoro tubular sugerida pelo aumento da
concentrao de protenas de baixo peso molecular na urina. (1)
A pesquisa protenas realizada pela adio de cido sulfossalicilico amostra
de urina. Em caso positivo haver turvao proporcional quantidade de protenas Esta
tcnica baseia-se no princpio da desnaturao proteica com formao de meta-
protenas.
Se o resultado da pesquisa anterior for positivo dever proceder-se ao
doseamento da protena. O reagente de Esbach, formado por cido picrico e cido
citrico, utilizado para este doseamento. Atravs de um albuminmetro, onde se junta a
urina acidificada e o reagente de Esbach, mede-se a altura do densimetro na escala em
g%0.
88.. PPEESSQQUUIISSAA DDEE SSAANNGGUUEE OOCCUULLTTOO NNAASS FFEEZZEESS
Imunocromatografia
8.1. Fundamento do mtodo
As causas mais comuns de sangue oculto nas fezes so a lcera pptica, a
gastrite erosiva, o carcinoma gstrico, o carcinoma e plipos adenomatosos do clon.
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A membrana encontra-se coberta com anticorpo anti-hemoglobina na regio da
linha teste. Durante o teste a amostra reage com a partcula coberta com anticorpo anti-
hemoglobina. A mistura migra por cima da membrana por aco capilar para reagir com
o anticorpo anti-hemoglobina, originando uma linha colorida. A presena da linha
colorida indica um resulta positivo, enquanto a sua ausncia indica um resultado
negativo.
99.. MMIICCRROOTTEECCHH 667722 PPCC ((DDEENNSSIITTOOMMEETTRRIIAA))
O Microtech 672 PC (figura 1) um sistema completamente automatizado,
concebido para a anlise electrofortica de rotina. Realiza todos os passos necessrios
para a separao electrofortica de seroprotenas, lipoprotenas e hemoglobina, em
pequenas tiras suportadas de acetato de celulose, recorrendo leitura densitomtrica das
amostras e padres.
9.1. Fundamento do mtodo
Amostra: Soro
A anlise do padro electrofortico das protenas pode elucidar acerca de vrias
situaes patolgicas, como sejam, o pico gama monoclonal e policlonal, a ponte do
cirrtico, perfil de inflamao, entre outras. A razo albumina/globulina tambm poder
alertar para a possibilidade de determinadas alteraes devidas a inflamao, cirrose
heptica, glomerulonefrite e sndrome nefrtico.
O termo electroforese refere-se migrao de partculas com carga num meio
lquido sobre a influncia de um campo elctrico.
A tcnica de electroforese separa as protenas sricas com base na premissa de
que as espcies proteicas tm diferentes mobilidades quando sujeitas a um campo
elctrico. Cada molcula possui uma carga elctrica devido presena de grupos
carregados positiva e negativamente. A carga total dita as caractersticas de migrao
das espcies a um dado pH. (1)
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Figura 1
A electroforese de zona em acetato de celulose ocorre em vrias etapas:
aplicao das amostras (soro), migrao, colorao, descolorao, diafanizao,
secagem e leitura pela luz de digitalizao. As protenas so separadas a um pH alcalino
(8,9) utilizando o princpio de electroforese de zona em suporte adequado, acetato de
celulose. O tampo confere carga negativa s protenas e determina a passagem de
corrente. Esta primeira fase, separativa, consiste na migrao das protenas no sentido
ctodo nodo a diferentes velocidades, quando sujeitas a um campo elctrico. A
mobilidade da albumina superior da globulina alfa 1, seguindo-se a alfa 2, beta e
finalmente a fraco gama, permitindo assim separar as vrias fraces. Quando a
migrao est completa, as protenas so ento sujeitas a um processo de colorao com
Vermelho S de Ponceau. O corante, Ponceau S, cora as fraces proteicas de vermelho,
tendo igual afinidade para todas as fraces. A colorao s possvel em meio
fortemente cido. Os banhos com descolorante permitem a descolorao de tudo o que
no seja protenas. A tira ento sujeita a uma leitura por densitometria e os resultados
apresentados graficamente. Os resultados so obtidos em percentagem, percentagem
essa que em funo da rea corada e da intensidade da cor.
1100.. MMOODDUULLAARR AANNAALLYYTTIICCSS SSWWAA ((FFOOTTOOMMEETTRRIIAA//EEQQLL//IISSEE))
O Modular Analytics SWA (figura 2) um sistema completamente
automatizado, controlado por software e destinado a anlises de bioqumica e
imunoensaios. Foi concebido para determinaes quantitativas e qualitativas in vitro
usando uma ampla variedade de testes para anlise.
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Figura 2
O sistema descrito constitudo por 5 unidades hardware: uma unidade de
controlo, uma unidade central (core), um mdulo ISE, um mdulo P e um mdulo E.
Efectua anlises fotomtricas no mdulo P, anlises de electroquimioluminiscncia no
mdulo E e testes selectivos para ies no mdulo ISE.
A unidade core transporta as amostras atravs de cada mdulo analtico,
possuindo um leitor de cdigos de barra da amostra e permitindo a utilizao de
diversos tipos de tubos de amostra, primrios ou secundrios, com diferentes alturas e
volumes. Apresenta uma rea de entrada para amostras de urgncia., com prioridade na
pipetagem.
O mdulo ISE (figura 3) confere ao sistema um mtodo electrnico, por
potenciometria indirecta, para analisar amostras de sdio, potssio e cloro. Os principais
componentes consistem em trs cartuchos de medio, um elctrodo de referncia, trs
pipetadores, um poo de diluio e uma unidade de desgaseificao. Pode processar at
900 testes por hora.
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Figura 3
O mdulo P (figura 4) proporciona ao sistema um mtodo fotomtrico, capaz de
analisar at 800 testes in vitro por hora. Os principais componentes so o sistema de
pipetagem, o sistema de reagentes, o sistema do disco de reaco e a rea das teclas de
funo. O sistema de medio fotomtrica possui uma lmpada de halognio tungstnio,
como fonte de luz, e um espectrofotmetro de comprimento de onda mltiplo. Quanto
s caractersticas deste sistema, tem capacidade para reagentes com cdigos de barra,
armazenamento refrigerado para 90 frascos de reagente, 160 cuvetes de reaco semi-
descartveis, funes de manuteno automatizadas, notificao de calibrao
automtica, qumicas de parmetro de ponto final, cintica e isoenzima, branco de
amostra automtico, qumicas no lineares (logit-log de trs, quatro e cinco parmetros).
Figura 4
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O mdulo E (figura 5) um sistema de imunoensaio multi-teste com acesso
aleatrio e com capacidade para 170 testes por hora. Os principais componentes
consistem nas reas de reagente, medio, consumveis e preclean. Apresenta
capacidade para reagentes com cdigos de barra, armazenamento regulado por
temperatura para 25 embalagens de reagente, 1008 cuvetes e pontas de ensaio
descartveis, funes de manuteno automatizadas, assim como notificao de
calibrao automtica.
Figura 5
Os principais benefcios que este equipamento apresenta devem-se juno da
qumica clnica e imunologia num s aparelho; optimizao do fluxo de amostras,
com transporte prioritrio de emergncia; ao fluxo flexvel de informao; solues
flexveis com actualizao possvel, sistema back up, mascara de mdulos.
Com a reduo de manipulao por parte do operador h uma reduo efectiva
da probabilidade de erros no laboratrio e um aumento de segurana.
O facto de poder ter todos os reagentes a bordo refrigerados evita a manipulao
e aumenta a estabilidade dos mesmos, o que melhora a reprodutibilidade dos resultados.
10.1 ELECTROQUIMIOLUMINISCNCIA (EQL) / MODULO E
10.1.1 Fundamento do mtodo
EQL um processo no qual espcies altamente reactivas so geradas a partir de
precursores estveis na superfcie de um elctrodo, reagindo depois umas com as outras
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levando produo de luz. A EQL baseia-se no uso de um complexo de rutnio e
tripropilamina, sendo o produto final quimioluminiscente.
As reaces de quimioluminiscncia que levam emisso de luz a partir do
complexo de rutnio so iniciadas electricamente, aplicando voltagem aos complexos de
rutnio que so ligados a micropartculas revestidas com estreptavidina.
10.1.1 a) cido Flico/Vitamina B12
O cido flico intervm em muitas reaces metablicas como transportador de
grupos carbono. A deficincia em cido flico pode ocorrer por m absoro intestinal,
ingesto insuficiente, aumento das necessidades (gravidez, doena maligna) ou por
interferncia de outros frmacos (metotrexato, por exemplo). A vitamina B12 est
envolvida na maturao dos eritrcitos e no metabolismo geral das clulas somticas. A
deficincia em vitamina B12 pode estar associada falta de factor intrnseco, pode ser
secundria a patologias gastro-intestinais (gastrectomia, inflamao, etc.). (1)
O mtodo para a determinao do cido flico e vitamina B12 baseia-se no
princpio da competio.
A amostra (soro para o cido flico; soro ou plasma para a vitamina B12)
incubada com os reagentes de pr-tratamento. Uma nova incubao da amostra com a
protena de fixao do folato/factor intrnseco marcada com rutnio, forma um
complexo de folato/vitamina B12, cuja quantidade depende da concentrao do analito
na amostra. Aps a incorporao das microparticulas revestidas de estreptavidina e de
folato/vitamina B12 marcado com biotina, os locais no ocupados da protena de fixao
do folato/ factor intrnseco marcado com rutnio so ocupados, formando-se um
complexo entre a protena de fixao do folato/ factor intrnseco marcada com rutnio e
o folato /vitB12-biotinilado. O complexo formado liga-se fase slida pela interaco da
biotina e da estreptavidina. A mistura da reaco aspirada para a clula de leitura,
onde as micropartculas so fixadas magneticamente superfcie do electrodo. Os
elementos no ligados so removidos. A aplicao de uma corrente elctrica ao
elctrodo induz uma emisso quimioluminiscente que medida por um
fotomultiplicador.
10.1.1 b) Ferritina/Paratormona (PTH) /Insulina
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A ferritina consiste no complexo ferro-apoferritina, o qual uma das formas
principais de armazenamento de ferro no organismo. A paratormona uma hormona
peptdica que estimula os osteoclastos a aumentar os nveis de clcio no sangue. A
determinao da paratormona til no diagnstico diferencial de hipo e hipercalcmia,
em doentes com insuficincia renal e na avaliao da funo da paratiroide em
desordens do metabolismo sseo e mineral. A insulina uma hormona proteica que
diminui as concentraes sricas de glucose. A principal aplicao clnica do
doseamento da insulina a avaliao de indivduos com diabetes mellitus que requerem
tratamento com insulina. (1)
O doseamento da ferritina, PTH e insulina recorre tcnica de sandwich.
A amostra (soro ou plasma), um anticorpo monoclonado biotinilado especfico
anti-ferritina/PTH/insulina e um anticorpo monoclonal especfico anti-
ferritina/PTH/insulina marcado com o complexo de rutnio reagem entre si e formam
um complexo sandwich. Aps a incorporao das micropartculas revestidas de
estreptavidina, o complexo formado liga-se fase slida pela interaco da biotina e da
estreptavidina. A mistura da reaco aspirada para a clula de leitura, onde as
micropartculas so fixadas magneticamente superfcie do elctrodo. Os elementos
no ligados so removidos. A aplicao de uma corrente elctrica ao elctrodo induz
uma emisso quimioluminiscente que medida por um fotomultiplicador.
10.2 IMUNOENSAIO DE INIBIO TURBIDIMTRICA/MODULO
10.2.1. Fundamento do mtodo
A hemoglobina glicosilada consiste numa molcula de hemoglobina ligada a um resduo
de acar, permitindo realizar um controlo da glicmia a longo termo. (1)
Este mtodo utiliza brometo de tetradeciltrimetilamnio (TTAB) como detergente no
reagente hemolisante para eliminar a interferncia dos leuccitos, uma vez que o TTAB
no faz a lise dos leuccitos. Todas as variantes de hemoglobina que so glicadas no
terminal N da cadeia e que apresentam regies reconhecveis por anticorpos idnticas
s da HbA1c so determinadas com este ensaio. Assim, ao contrrio do que acontece
com os mtodos cromatogrficos, o estado metablico dos doentes diabticos que
apresentem hemoglobinopatias ou uremia pode ser determinado com o presente ensaio.
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A glicohemoglobina (HbA1c) da amostra (sangue total) reage com o anticorpo
anti-HbA1c e forma complexos antignio-anticorpo solveis. Os polihaptenos reagem
com o excesso de anticorpos anti-HbA1c, formando um complexo anticorpo-
polihapteno insolvel que pode ser determinado turbidimetricamente.
A concentrao de hemoglobina determinada num segundo canal. A
hemoglobina libertada na amostra hemolisada convertida num derivado que tem um
espectro de absoro caracterstico que medido bicromaticamente.
10.3 IMUNOTURBIDIMETRIA/MODULO P
10.3.1. Fundamento do mtodo
O uso de anticorpos especficos para quantificao das protenas sricas tornou-
se uma valiosa ferramenta de diagnstico. As propriedades de disperso da luz dos
agregados de antignio-anticorpo foram observadas pela primeira vez por Pope e
Healey, em 1938. Ritchie utilizou leituras turbidimtricas para quantificar protenas
especficas. Lizana e Hellsing descreveram a intensificao da polimerizao com
polietilenoglicol (PEG) para melhorar a sensibilidade e aumentar a taxa de formao do
complexo Ag-Ac, permitindo a rpida progresso da reaco at ao fim e reduzindo o
risco de falsos negativos em amostras que contenham antignio em excesso. (bula
Roche)
Concentraes elevadas de antignio podem originar o efeito de hook, do qual
resultam falsas concentraes baixas. (1)
10.3.1 a) Albumina
A albumina tem como funo principal manter a presso osmtica nos espaos
intra e extravascular. Nveis elevados ocorrem em desidratao aguda, enquanto a
diminuio dos seus nveis ocorre em situaes variadas como inflamao, doena
heptica, perda urinria, perda gastrointestinal, ascite e edema. (1)
O aumento de excreo urinria de albumina (microalbuminria) precede e
altamente preditivo de nefropatia diabtica. (1)
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Os anticorpos anti-albumina reagem com o antignio na amostra (soro, plasma
ou urina) e formam complexos antignio-anticorpo. Estes, aps a aglutinao, so
determinados por turbidimetria.
10.3.1. b) Imunoglobulinas
Alteraes nos valores das imunoglobulinas podem ocorrer por infeces
crnicas, infeces por parasitas, doenas autoimunes ou doenas hepticas. O aumento
monoclonal pode dever-se a proliferao maligna ou benigna de um nico clone. A
deficincia em imunoglobulinas est associada a linfomas, mielomas, sndrome
nefrtico, enteropatia, queimaduras, entre outras causas. (1)
Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao
quantitativa de imunoglobulinas. Os anticorpos anti-Ig A, G ou M reagem com o
antignio na amostra (soro ou plasma) e formam um complexo Ag-Ac. Aps a
aglutinao, a determinao feita por turbidimetria.
Podem ocorrer resultados falsamente baixos devido a um excesso de antignio
(efeito zona). Estes antignios bloqueiam o anticorpo impedindo a formao do
complexo Ag-Ac. Esta situao pode ser detectada aps diluio apropriada da amostra.
As chamadas paraprotenas secretadas nas gamopatias monoclonais
(imunoglobulinmia monoclonal) podem diferir das respectivas imunoglobulinas de
origem policlonal, na composio e tamanho dos seus aminocidos. Tambm neste
caso, a ligao ao anticorpo pode ser prejudicada. Assim, as amostras de soro de
pacientes com um diagnstico clnico incerto devem ser sujeitas a uma electroforese de
protenas para identificar um eventual excesso de antignio ou gamopatia monoclonal.
10.3.1 c) Transferrina
A avaliao dos nveis plasmticos de transferrina til no diagnstico
diferencial da anemia e monitorizao do tratamento da anemia ferropnica. (1)
O doseamento da transferrina baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica.
Os anticorpos anti-transferrina reagem com o antignio na amostra (soro ou plasma) e
formam um complexo antignio-anticorpo. Aps a aglutinao, a determinao feita
por turbidimetria. A adio de PEG permite a progresso rpida da reaco at ao fim e
aumenta a sensibilidade.
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Antignio transferrina + anticorpo anti-transferrina complexo antignio-anticorpo
10.4 POTENCIOMETRIA/MODULO ISE
10.4.1. Fundamento do mtodo
A potenciometria a medio da diferena de potencial entre dois elctrodos
numa clula electroqumica. Um elctrodo consiste num condutor metlico em contacto
com uma soluo electroltica. (1)
Os elctrodos selectivos so sensores com capacidade para medir directamente
fluidos biolgicos. Os elctrodos selectivos de ies medem sdio, potssio e cloro
(amostra de soro).
O potencial de cada elctrodo medido relativamente a um elctrodo de
voltagem estvel fixa por cloreto de prata, o elctrodo de referncia. Um elctrodo
selectivo de io desenvolve uma voltagem que varia com a concentrao do io ao qual
responde. A relao entre a voltagem desenvolvida e a concentrao do io detectado
logaritmica, sendo expressa pela equao de Nernst.
10.5 TESTE COLORIMTRICO
10.5.1. Fundamento do mtodo
Nas anlises colorimtricas, pela comparao da cor de uma amostra com a de
um padro, em circunstncias adequadas, podemos saber a concentrao de uma dada
substncia na amostra. (2)
A espectrofotometria consiste na medio da intensidade luminosa da luz a um
comprimento de onda seleccionado, designando-se de espectrofotometros os
equipamentos que seleccionam o comprimento de onda desejado. Os testes
colorimtricos baseiam-se na medio das variaes de absoro na zona visvel (entre
400 e 700 nm). (1)
10.5.1 a) Bilirrubina Directa
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A bilirrubina resulta do catabolismo do heme. O aumento de bilirrubina d
origem a ictercia, a qual pode ter diferentes causas como hemlise, doena
hepatocelular, obstruo intra ou extraheptica, hereditrias e fisiolgicas (neonatal). (1)
O doseamento qumico o mais comum na determinao da bilirrubina, sendo
utilizado o cido sulfanlicodiazotado o qual consiste em cido sulfanlico e nitrato de
sdio, diazoreagente.
Depois da introduo do mtodo diazo para a determinao da bilirrubina por
Ehrlich, em 1883, foram propostas vrias modificaes com o objectivo de melhorar a
reaco. Em 1938, Jendrassik e Grof apresentaram um teste que produziu resultados
fiveis. As vantagens deste mtodo so a maior preciso e a interferncia reduzida por
pigmentos.
O cido sulfanlico diazotado, produzido a partir da reaco do nitrito de sdio
acidificado com cido sulfanlico, reage com a bilirrubina da amostra (soro ou plasma)
para formar azobilirrubina. No ensaio da bilirrubina directa, apenas a bilirrubina
conjugada reage com o cido sulfanlico diazotado. A intensidade da cor vermelha do
corante azo formado directamente proporcional concentrao de bilirrubina directa
(conjugada) e pode ser determinada fotometricamente.
Bilirrubina + io diaznio azobilirrubina.
Os problemas que podem surgir na determinao da bilirrubina esto associadas
sua fotosensibilidade, que aumenta com a temperatura, uma vez que a luz cinde pontes
de hidrognio tornando-a mais solvel. A hemoglobina um interferente negativo, deve
sempre rejeitar-se a amostra hemolisada.
10.5.1 b) Bilirrubina total
A determinao da bilirrubina total baseia-se no mtodo desenvolvido por
Wahlefeld et al., no qual utilizado um detergente para acelerar a reaco e prevenir a
precipitao da protena. O reagente diazo utilizado o 2,5-diclorofenil diaznio
tetrafluoroborato (DPD) que, em condies de acidez, se liga muito rapidamente
bilirrubina da amostra (soro ou plasma) e forma azobilirrubina. A intensidade da cor da
azobilirrubina produzida proporcional concentrao de bilirrubina total e pode ser
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medida fotometricamente. O procedimento simples e correlaciona-se bem com o
mtodo de Jendrassik-Grof.
10.5.1 c) Clcio
Certas patologias podem estar associadas ao aumento ou diminuio nas
concentraes de clcio no sangue. Algumas causas comuns de hipocalcmia so a
insuficincia renal crnica, hipoparatiroidosmo, osteomalcia e hemorragia aguda. A
hipercalcmia pode estar associada a doenas malignas, alteraes da tiride e
hiperparatiroidismo. (1) (3)
A determinao do clcio baseia-se na reaco deste com a complexona de o-
cresolftalena em soluo alcalina. A intensidade da cor do complexo prpura formado
directamente proporcional concentrao de clcio da amostra (soro, plasma ou urina) e
medida fotometricamente.
10.5.1 d) Creatinina
A creatinina produzida a nvel endgeno e libertada a velocidade constante,
sendo os nveis plasmticos mantidos em limites estreitos. A sua clearence renal um
indicador de taxa de filtrao glomerular. (1)
O mtodo de Jaff Compensado baseia-se na reaco de Jaff descrita por
Popper et al, em 1886, e modificada por Bartels. Esta verso modificada tem uma
sensibilidade mais elevada e melhor preciso do que o mtodo Jaff original. a
reaco mais usada para dosear a creatinina.
Em soluo alcalina, a creatinina da amostra (soro, plasma ou urina) forma um
complexo amarelo-laranja com picrato, o complexo de Janovski. A intensidade da cor
directamente proporcional concentrao de creatinina e pode ser medida
fotometricamente. Nos ensaios em que utilizado o branco de amostra cintico, a
interferncia da bilirrubina minimizada. O complexo de cor vermelha medido entre
500 e 520nm. O io picrato absorve significativamente a inferior a 500 nm, logo a
leitura do complexo deve ser a superior a 500 nm.
A desvantagem do mtodo Jaff devem-se s numerosas interferncias que
podero ocorrer, desde a temperatura, uma vez que a altas temperaturas (> 30C) a
glucose, cido rico e cido ascrbico reagem com o picrato, originando uma
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interferncia positiva. Exige uma amostra livre de protenas, j que os grupos cetometil
e cetometileno reagem com o picrato alcalino originando compostos altamente corados.
Tambm podero ocorrer interferncias negativas, por oxidao de certos compostos na
presena de bases fortes, formando-se produtos de degradao, bilirrubina e
hemoglobina, que causam a interferncia. (1)
Vrias tcnicas tm sido propostas no sentido de retirar interferentes, tendo
como objectivo o aumento da especificidade. Uma dessas tcnicas o mtodo de Jaff
cintico que se baseia no facto de certas substncias interferentes reduzirem lentamente
o picramato alcalino, como glucose, cido ascrbico e cido rico, enquanto outras
reagem mais prontamente, como cetoacidos (acetoacetato), piruvato, protenas e
cefalosporinas. Assim, executa-se um mtodo espectrofotomtrico a 2 tempos (ensaio
colorimtrico cintico): no primeiro tempo (20 seg.), temos interferentes que reagem
rapidamente; no segundo tempo (80 seg.), reage tudo excepto os interferentes que
reagem lentamente, depois dos 80 seg. (protenas e outros interferentes).
2 tempo - 1 tempo = janela de creatinina
10.5.1 e) Ferro
A alterao do metabolismo do ferro est relacionada com vrias outras
patologias, incluindo anemia, doena cardiovascular, hepatite crnica, doena renal
terminal e infeces. (1)
Foram descritos diversos mtodos fotomtricos para determinao do ferro.
Todos eles tm em comum a libertao de ies de Fe3+ do complexo de transferrina,
atravs do uso de cidos ou detergentes, seguida de reduo dos ies Fe3+ a Fe2+, com
reaco dos ies Fe2+ para produo de um complexo corado.
Assim, em condies acdicas (pH
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A deficincia de magnsio est associada ao desenvolvimento de
hiperirritabilidade neuromuscular com tetania, induo da secreo de PTH e arritmia
cardiaca. Por outro lado, a hipermagnesmia manifesta-se por depresso do sistema
neuromuscular. (1)(4)
Este mtodo baseia-se na reaco do magnsio da amostra (soro, plasma ou
urina) com o azul de xilidilo numa soluo alcalina com EGTA para mascarar o clcio
na amostra. Em soluo alcalina, o magnsio forma um complexo prpura com o azul
de xilidilo, um sal de diaznio. A concentrao de magnsio medida
fotometricamente, atravs da diminuio da absorvncia de azul de xilidilo (ponto de
viragem).
10.5.1. g) Protenas Totais
As alteraes mais comuns na concentrao de protenas, com relevncia para o
laboratrio clnico, resultam da reaco de fase aguda, uma resposta inespecfica
inflamao ou dano tecidular. (1)
O biureto resulta da condensao de duas molculas de ureia, a quente.
Observou-se inicialmente que quatro molculas biureto formavam um complexo de cor
violeta com o cobre (Cu2+). Posteriormente, verificou-se que o mesmo ocorria com as
protenas e pptidos, passando a utilizar-se este mtodo para o doseamento proteico. Na
determinao de protenas pelo mtodo do biureto parte-se do pressuposto que todas as
protenas reagem da mesma forma com o io cprico. (1)
Em soluo alcalina, o cobre bivalente reage com as ligaes do pptido proteico
e forma o complexo de biureto com o caracterstico tom prpura. O trtaro sdico-
potssico impede a precipitao do hidrxido de sdio e o iodeto de sdio impede a
auto-reduo do cobre. A intensidade cromtica, ou seja, o nmero de complexos
formados, directamente proporcional concentrao de protenas da amostra (soro ou
plasma) que pode ser determinada fotometricamente.
Protena + Cu2+ Complexo Cu-protena
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O mtodo do biureto simples, estvel, preciso, especfico (poucos
interferentes), com baixa sensibilidade (1,5 a 12 g/dl), no sendo por isso adequado
deteco de protenas na urina, mas o mtodo ideal para as protenas sricas. A
linearidade bastante alargada e amostras com concentraes elevadas podem ser
diludas a fim de se situarem na zona de linearidade. Os nicos interferentes so os
dextranos de baixo peso molecular usados no tratamento da hipotenso como
expansores de plasma.
No caso de soros muito ictricos, lipmicos ou hemolisados (libertao de
hemoglobina que actua como interferente positivo) necessrio preparar um branco de
amostra para compensar a turvao ou cor.
10.6 TESTE ENZIMTICO COLORIMTRICO/MODULO P
10.6.1. Fundamento do mtodo
As enzimas podem ser usadas como reagentes na determinao de um analto, ou
serem elas prprias o analto a determinar. Tem sido crescente o uso de enzimas como
reagentes analticos, uma vez que oferecem a vantagem de maior especificidade para o
substracto a ser determinado. (1)
Os mtodos enzimticos so mais rpidos, mais sensveis e menos trabalhosos
do que os mtodos qumicos. Os reagentes enzimticos conservam-se bem quando
liofilizados, no entanto, uma vez hidratados tm um perodo de utilizao muito
reduzido pois difcil a sua conservao.
10.6.1 a) Alfa-Amilase
A amilase usada principalmente no despiste de doena pancretica. Alm da
pancreatite aguda, esta enzima pode encontrar-se elevada nas situaes de ascite,
peritonite, apendicite, doena neoplsica, colecistite e insuficincia renal. (1)
O mtodo cintico descrito baseia-se num procedimento de clivagem pela alfa-
amilase e hidrlise subsequente de todos os produtos de degradao a p-nitrofenol
(cromforo) pela aco da alfa-glucosidase. A intensidade da cor do p-nitrofenol
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formado directamente proporcional concentrao da actividade da alfa-amilase da
amostra (soro, plasma ou urina), podendo ser determinada fotometricamente.
-amilase
5-etilideno-G7PNP + 5 H2O 2-etilideno-G5 + 2 G2PNP + 2-etilideno-G4 + 2 G3PNP +
etilideno-G3 +
-glucosidase
2 G2PNP + 2 G3PNP + G4PNP + 14H2O 5 PNP + 14G
10.6.1 b) cido rico
O cido rico o principal produto do catabolismo das purinas. A hiperuricmia
pode estar associada a consumo excessivo de purinas na dieta, doena maligna,
psoriase, insuficincia renal crnica e deficinca primria em enzimas do metabolismo
das purinas. Este aumento pode ser responsvel pelo sndrome de gota, o qual pode
estar na origem de artrite e nefropatia. (1)
No mtodo desenvolvido por Town et al, a amostra incubada com uma mistura
de reagentes que contm ascarbato oxidase e um sistema de aclaramento. importante a
eliminao do cido ascrbico, na reaco preliminar, de forma a impedir a interferncia
deste na reaco subsequente com a peroxidase.
A oxidao do cido rico pela uricase seguida pela reaco do perxido na
presena de peroxidase com formao de um corante imino-quinona, cuja intensidade
da cor vermelha proporcional concentrao de cido rico da amostra (soro, plasma
ou urina), sendo determinada fotometricamente:
uricase
cido rico + 2 H2O alantona + CO2 + H2O2
peroxidase
2 H2O2 + H+ + 4-aminofenazona + TOOS corante diimino-quinona + 4 H2O
TOOS: N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina
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A uricase uma enzima oxidoredutase. A reaco tem de ocorrer em meio
tamponado alcalino para que o CO2 passe a bicarbonato e as bolhas no interfiram na
reaco.
Esta reaco poder ter como interferentes certas substncias que actuam como
dadores de H+, reagindo com o oxignio libertado, impedindo a oxidao do
cromogneo. Tambm a hemoglobina pode actuar sobre o cromogneo prematuramente,
resultando numa interferncia positiva.
10.6.1 c) Colesterol
Na bioqumica clnica, o termo lpidos refere-se ao metabolismo lipoproteico e
ateroesclerose, uma das causas de doena cardiaca coronria. A reduo das
concentraes plasmticas de colesterol reduz a incidncia de doena cardaca
coronria. A hipercolesterolmia definida em termos de risco de doena cardiada
coronria. (1)(3)
O mtodo CHOD-PAP baseia-se na determinao da 4colestenona aps
clivagem enzimtica do ster de colesterol pela colesterol-oxidase e medio
subsequente, pela reaco de Trinder, do perxido de hidrognio formado. O colesterol
determinado de modo enzimtico utilizando colesterol esterase e colesterol oxidase.
colesterol esterase
steres do colesterol + H2O colesterol + RCOOH
Os steres de colesterol so clivados atravs da aco do colesterol esterase e
produzem colesterol livre e cidos gordos.
Colesterol oxidase
Colesterol + O2 4colestenona + H2O2
Com a ajuda da colesterol-oxidase, o colesterol transformado em
4colestenona e perxido de hidrognio pela aco do oxignio.
peroxidase
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2H2O2 + 4-aminofenazona + fenol 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona+ 4 H2O
O perxido de hidrognio produzido origina uma colorao vermelha atravs da
reaco coma 4-aminofenazona e o fenol, sob a aco cataltica da peroxidase. A
intensidade da cor directamente proporcional concentrao de colesterol da amostra
(soro ou plasma com heparina ou EDTA), podendo ser determinada fotometricamente.
Nesta ltima reaco, a reaco indicadora, recorre-se ao mtodo de Trinder.
Este mtodo apresenta interferentes, como a bilirrubina que interfere
negativamente. Sendo o colesterol usado para avaliar a colestase, situao em que a
bilirrubina elevada (> 5mg), a interferncia anteriormente referida ser ainda mais
importante.
10.6.1 d) Colesterol HDL
Na presena de sulfato de magnsio, o sulfato de dextrano forma selectivamente
complexos hidrossolveis com LDL, VLDL e quilomicrons que so resistentes s
enzimas modificadas por PEG.
A concentrao de HDL determinada enzimaticamente, pela colesterol esterase
e colesterol oxidase acopladas com PEG aos grupos amino.
Sob influncia da colesterol esterase, os steres do colesterol so
quantitativamente decompostos em colesterol livre e cidos gordos. Na presena de
oxignio, o colesterol oxidado pela colesterol oxidase a colestenona e perxido de
hidrognio. O perxido de hidrognio formado reage com a 4-amino-antipirina e com a
N-(2-hidroxi-3- sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina de sdio (HSDA) para formar um
corante prpura-azul. A intensidade da colorao directamente proporcional
concentrao de colesterol da amostra (soro ou plasma tratado com heparina) e
medida fotometricamente.
PEG-colesterol esterase
ster do colesterol HDL + H2O colesterol + RCOOH
Colesterol HDL + O2 4colestenona + H2O2
2 H2O2 + 4-amino-antipirina + HSDA+ H+ + H2O pigmento prpura-azul + 5 H2O
10.6.1 e) Colesterol LDL
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Este mtodo usa um complexo de sulfato de ciclodextrina, sulfato de dextrano
(MOPS, POD, HSDA) e magnsio para estabilizar as molculas de VLDL e
quilomicrans. Um segundo reagente contm um detergente que forma micelas estveis
com o HDL e as VLDL e quilomicrans previamente estabilizadas, inibindo a sua
reaco com a colesterol esterase e oxidase. Aps a reaco do LDL da amostra (soro
ou plasma tratado com heparina) com a colesterol esterase e oxidase, o perxido de
hidrognio formado reage com 4-aminoantipireno formando um produto corado que
medido fotometricamente.
colesterol esterase
steres colesterol LDL + H2O colesterol + RCOOH
Colesterol LDL + O2 4colestenona + H2O2
2 H2O2 + 4-amino-antipirina + HSDA+ H+ + H2O pigmento prpura-azul + 5 H2O
10.6.1 f) Fosfatase cida e Fosfatase cida No Prosttica
A fosfatase cida srica constituida por cinco isoenzimas produzidos,
sobretudo, pelos eritrcitos, plaquetas, clulas reticuloendoteliais do bao e fgado e
clulas epiteliais dos rins, osso e prstata. (1)
A fosfatase cida no prosttica encontra-se aumentada nas situaes de
hipermetabolismo sseo, nomeadamente, hiperparatiroidismo, doena de Paget e
invaso maligna de tecido sseo. A fraco prosttica pode estar aumentada na
existncia de doena maligna da prstata. (1)
O ensaio utilizado consiste numa modificao do mtodo descrito por Hillmann.
O 1-naftol libertado durante a hidrlise enzimtica do 1-naftilfosfato convertido num
corante azico atravs de acoplao com o 2-amino-5-clorotolueno diazotado, sendo
determinado por fotometria. A adio de 1,5-pentanediol aumenta a actividade da
fosfatase cida prosttica (amostra de soro).
Na determinao da fosfatase no prosttica, o tartarato utilizado como
inibidor especfico da fosfatase cida prosttica.
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Fosfatase cida
1-naftilfosfato + H2O 1-naftol + fosfato
1-naftol + 2-amino-5-clorotolueno corante azico
10.6.1. g) Fosfatase Alcalina
A determinao dos nveis sricos de fosfatase alcalina de particular interesse
na avaliao da doena hepatobiliar e doena ssea associada ao aumento da actividade
osteoblstica. (1)(3)
Este mtodo baseia-se no ensaio desenvolvido por King e Armstrong. Na
presena de ies magnsio e zinco, o fosfato de p-nitrofenilo (substracto) hidrolisado
por fosfatases e forma fosfato e p-nitrofenol. O p-nitrofenol libertado proporcional
actividade da ALP da amostra (soro ou plasma) e pode ser medido fotometricamente.
ALP
Fosfato de p-nitrofenilo + H2O fosfato + p-nitrofenol
A grande dificuldade destes mtodos resulta das impurezas, quer do substracto
quer dos tampes, que originam produtos de degradao inibidores da enzima. A
utilizao de tampes amino-lcoois complica a cintica da reaco enzimtica, uma
vez que a reaco ir depender no s da concentrao de substracto, mas tambm da
concentrao do tampo aceitador de fosfato que actua como co-substracto. Os
resultados esto muito dependentes da temperatura (a enzima degrada-se com o calor),
tampo, pH. por isso uma determinao difcil de estandardizar.
10.6.1 h) Gama-glutamiltransferase (GGT)
A GGT tem origem no sistema hepatobiliar, estando a sua actividade elevada em
todas as formas de doena heptica. O seu aumento mais marcado, 5 a 30 vezes o
valor normal, em casos de obstruo biliar intra-heptica ou ps-heptica. a enzima
heptica mais sensivel na deteco de ictercia obstrutiva, colangite e colecistite. (1) (5)
Nesta determinao cintica a gama-glutamiltransferase da amostra (soro ou
plasma) transfere o grupo -glutamilo da L--glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida para a
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glicilglicina. A quantidade libertada de 5-amino-2-nitrobenzoato proporcional
actividade de GGT e pode ser medida fotometricamente.
-GT
L--glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + glicilglicina L--glutamil-glicilglicina + 5-
amino-2-nitrobenzoato
10.6.1 i) Triglicridos
Os triglicridos constituem 95% do armazenamento de tecido gordo no
organismo. As quilomicrons contm na sua composio 85% de triglicridos. (1)
Todos os mtodos de quantificao dos triglicridos se baseiam na quantificao
do glicerol. O mtodo GPO-PAP baseia-se no trabalho de Wahlefeld, utilizando uma
lipoprotena lipase de microorganismos para a hidrlise rpida e completa dos
triglicridos da amostra (soro ou plasma) a glicerol, seguida de oxidao para fosfato de
dihidroxiacetona e perxido de hidrognio. O perxido de hidrognio produzido reage
depois com 4-aminofenazona e 4-clorofenol sob a aco cataltica da peroxidase, para
formar um corante vermelho (reaco de ponto final de Trinder), o qual ser
determinado por fotometria.
LPL
TG + 3H2O glicerol + 3 RCOOH
GK
Glicerol + ATP glicerol-3-fosfato + ADP
Mg2+
GPO
Glicerol-3-fosfato + O2 fosfato de dihidroxiacetona + H2O2
peroxidase
H2O2 + 4-aminofenazona + 4-clorofenol 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona +
H2O + HCl
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Os mtodos enzimticos usam uma hidrlise enzimtica, por intermdio de uma
lipase. Como vantagens apresentam a rapidez, ausncia de reagentes casticos e
extraco com solventes orgnicos. No entanto, estes mtodos tambm tm
desvantagens, no descontando o glicerol endgeno, que poder ser mais ou menos alto,
consoante a liplise dos triglicridos ou o armazenamento no tecido adiposo. O glicerol
endgeno pode aumentar 50 a 100 vezes em situao de stress (adrenalina), doena
(diabetes, deficincia em glicerolquinase) ou infuses intra-venosas. (1)
10.7 TESTE ENZIMTICO-UV/MODULO P
10.7.1. Fundamento do mtodo
O laboratrio clnico tem necessidade de avaliar alteraes na actividade ou
concentraes de enzimas no soro que so predominantemente intracelulares e esto
normalmente presentes em baixas concentraes. Pela deteco de alteraes nos nveis
destas enzimas durante situaes patolgicas, possvel inferir a localizao e natureza
da patologia. (1)
A quantidade de substracto transformado em produto durante uma reaco
catalizada por uma enzima pode ser medido por um mtodo analtico apropriado, como
por exemplo alteraes nas caractersticas de absorvncia de um componente do sistema
analtico. Os coenzimas NADH ou NADPH podem ser monitorizados por alteraes na
absorvncia a 340nm, durante a oxidao ou reduo. (1)
10.7.1 a) Alanina-aminotransferase/Transaminase glutamicapiruvica (ALT/GPT)
As transaminases permitem a deteco de hepatites, mas apesar do aumento dos
nveis sricos de AST e ALT nas situaes de leso da integridade do hepatcito, a ALT
uma enzima mais especfica do fgado e a elevao das suas concentraes persistem
por um perodo mais alargado do que a AST. (1) (5)
A enzima ALT da amostra (soro e plasma) catalisa reaco de equilbrio a seguir
descrita. O aumento do piruvato determinado numa reaco indicadora catalisada pela
lactato-desidrogenase. O NADH oxidado a NAD. A velocidade de diminuio do
NADH, medido fotometricamente, directamente proporcional velocidade de
formao do piruvato e, logo, actividade da ALT (determinao cintica).
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ALT
L-alanina + -cetoglutarato piruvato + L-glutamato
LDH
Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+
10.7.1 b) Aspartato-aminotransferase/Transaminase glutamicaoxaloactica (AST/ GOT)
A enzima AST, alm de estar associada a doena heptica, pode tambm ser um
indicador de enfarte do miocrdio, distrofia muscular e embolia pulmonar. (5)
A enzima AST da amostra (soro ou plasma) catalisa a reaco de equilbrio a
seguir descrita, com determinao cintica.. O aumento do oxaloacetato determinado
numa reaco indicadora catalisada pela malato-desidrogenase. O NADH oxidado a
NAD. A velocidade de diminuio do NADH, medida fotometricamente, directamente
proporcional velocidade de formao do oxaloacetato e, logo, actividade da AST.
AST
L-aspartato + -cetoglutarato oxaloacetato + L-glutamato
MDH
Oxaloacetato + NADH + H+ L-malato + NAD+
10.7.1 c) Creatinafosfoquinase (CPK)
A actividade da CPK encontra-se elevada em diversas patologias do sistema
musculo-esqueltico, cardiaco, sistema nervoso central e tiroide. (1) (6)
O mtodo de ensaio utilizando o fosfato de creatinina e ADP foi inicialmente
descrito por Oliver. A CPK rapidamente inactivada por oxidao dos grupos sulfidrilo
no seu centro activo. A enzima pode ser reactivada pela adio de acetilcistena. A
interferncia da adenilatoquinase prevenida atravs da adio de pentafosfato de
diadenosina e AMP.
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CPK
Fosfato de creatinina + ADP creatina + ATP
HK
Glucose + ATP glucose-6-P + ADP
G6P-DH
Glucose-6-p + NADP+ gluconato-6-P + NADPH+ + H+
Formam-se quantidades equimolares de NADPH e ATP mesma velocidade. A
taxa de formao de NADPH medida fotometricamente proporcional actividade de
creatinafosfoquinase da amostra (soro ou plasma).
10.7.1 d) Glucose
A determinao da glucose permite o despiste de patologias associadas a hiper e
hipoglicmia. A patologia mais pesquisada a Diabetes Mellitus constitui um grupo de
desordens metablicas dos carbohidratos, no qual h intolerncia glucose, originando
hiperglicmia. (1)
Segundo os ltimos critrios da Direco-Geral da Sade, o diagnstico da
Diabetes Mellitus baseia-se na glicmia em jejum 126mg/dl ou sintomas clssicos com
glicmia ocasional 200mg/dl ou glicmia 200mg/dl, na PTOG com 75g de glucose,
s 2 horas. A Tolerncia Diminuda Glucose apresenta glicmia de jejum
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Joana Selada Domingues - 33 -
HK
Glucose + ATP G-6-P + ADP
A hexoquinase catalisa a fosforilao da glucose em glucose-6-fosfato por ATP.
G-6-PDH
G-6-P + NADP+ gluconato-6-P + NADPH + H+
A frutose poder interferir neste ensaio, contudo, este acar no existe em
jejum e, no ps-prandial, um indivduo normal tem nveis extremamente baixos e num
tempo reduzido. Torna-se necessrio considerar esta interferncia positiva nas provas de
sobrecarga em frutose. um mtodo muito especfico, sem interferncia dos redutores.
10.7.1 e) Lactato desidrogenase (LDH)
No laboratrio clnico, a LDH til na avaliao de enfarte do miocrdio,
miocardite, insuficincia cardaca, hemlise, doena maligna e doena renal. (1)
A LDH da amostra (soro ou plasma) catalisa a converso de piruvato em lactato
e o NADH oxidado a NAD. A velocidade de reduo de NADH directamente
proporcional actividade de LDH.
LDH
Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+
10.7.1 f) Ureia
A principal utilidade clnica da determinao srica da ureia baseia-se no clculo
da razo ureia/creatinina usada na discriminao da urmia pr e ps-renal. (1)
Em 1965, Talke e Schubert publicaram um mtodo totalmente enzimtico para
determinao da ureia usando o sistema enzimtico acoplado urease/glutamato-
desidrogenase (GLDH). O decorrente ensaio baseia-se neste mtodo, tendo sido
optimizado para analisadores que permitem leituras cinticas.
A ureia da amostra (soro, plasma ou urina) hidrolisada pela urease e forma
CO2 e amnia. A amnia reage com o -cetoglutarato e o NADH na presena da GLDH
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e produz glutamato e NAD+. A reduo da absorvncia causada pelo consumo do
NADH medida fotometricamente.
urease
Ureia + H2O 2NH4+ + CO2
GLDH
-cetoglutarato + NH4+ + NADH L-glutamato + NAD+ + H2O
A hidrlise enzimtica pela urease (amido hidrolase) e quantificao do io
amnio, poder originar erros diferentes consoante se trate de uma amostra de urina ou
soro porque a quantidade de amnio que existe nos dois diferente, sendo superior na
urina. Tem ainda como inconveniente o facto do io amnio ser um contaminante do
laboratrio e da gua, devendo ser desamoniada. Apresenta a vantagem de ser uma
reaco muito especfica uma vez que a urease s reage com a ureia. Tendo em conta a
possibilidade da ureia ser degradada por aco bacteriana, a amostra deve ser analisada
poucas horas aps a colheita ou conservada por refrigerao. (1)
10.8 TESTE UV/MODULO P
10.8.1. Fundamento do mtodo
Consiste na deteco de variaes de absorvncia na zona dos ultra-violetas.
10.8.1 a) Fsforo
A determinao da fosfatmia permite detectar situaes patolgicas associadas
a hipofosfatmia, como o hiperparatiroidismo, alcalose respiratria, aumento da
secreo de insulina; e a hiperfosfatmia, como a insuficincia renal,
hipoparatiroidismo, acidose respiratria, entre outras. (1) (4)
O mtodo do molibdato baseia-se na reaco do fosfato da amostra (soro plasma
ou urina) com o molibdato de amnio e a formao de fosfomolibdato de amnio sem
reduo. A adio de um acelerador provoca uma taxa de reaco mais rpida e a
aplicao do branco da amostra produz resultados mais precisos.
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O fosfato inorgnico forma um complexo de fosfomolibdato de amnio,
(NH4)3PO4(MoO3)12, com molibdato de amnio na presena de cido sulfrico. O
complexo determinado fotometricamente na regio dos UV (340nm).
1111.. UURRIISSYYSS 22440000 ((FFOOTTOOMMEETTRRIIAA DDEE RREEFFLLEECCTTNNCCIIAA))
11.1. Fundamento do mtodo
A anlise de urinas envolve trs princpios bsicos: a avaliao visual da cor e
aspecto da amostra de urinas, a deteco de determinadas substncias usando tiras teste,
e o exame microscpico do sedimento urinrio. No exame microscpico do sedimento
urinrio confirmam-se alguns dos parmetros fornecidos pelas tiras teste e avalia-se a
presena de clulas epiteliais, leuccitos, eritrcitos, cilindros e cristais (com semi-
quantificao).
O Urisys 2400 (figura 6) um sistema totalmente automtico de anlise de
urinas, destinado determinao qualitativa ou semi-quantitativa in vitro de analitos da
urina, incluindo leuccitos, nitritos, protenas, glicose, cetonas, urobilinognios,
bilirrubina e eritrcitos, assim como o pH, a densidade especfica, a cor e o aspecto.
As principais funes deste analisador incluem a identificao de amostras,
distribuio automtica de tiras teste, pipetagem automtica de amostras e leituras
fotomtricas. Est optimizado para analisar entre 100 a 1000 amostras de urina por dia.
Figura 6
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Joana Selada Domingues - 36 -
O Urisys 2400 um fotmetro de reflectncia, os resultados dos testes baseiam-
se na leitura da intensidade de luz reflectida pela tira teste. A cabea de leitura contm
dodos de emisso de luz (LED) de trs comprimentos de onda diferentes. A leitura
ocorre aps a reaco qumica e desenvolvimento de cor. A luz reflectida medida
electro-opticamente. Um LED transmite luz com um comprimento de onda definido,
num ngulo ideal, para a superfcie de uma banda reactiva. A luz incide na superfcie da
banda reactiva e reflectida com uma intensidade que depende da cor da banda
reactiva. Um detector de fotododo recebe a luz reflectida e transmite um sinal elctrico
analgico para o conversor analgico-para-digital, o qual converte o sinal analgico
num valor digital. Um microprocessador ajusta o valor digital e converte-o num valor
relativo utilizando uma escala padronizada de calibrao. O microprocessador calcula
um valor de reflectncia. O resultado semi-quantitativo da concentrao determinado,
comparando o valor da reflectncia com o valor dos limites de intervalo.
A leitura da densidade especfica efectuada numa clula de fluxo que
preenchida com a amostra de urina. Um LED transmite luz clula de fluxo. Um
dispositivo de carga acoplada determina o ngulo de reflexo total. O ndice refractivo
da amostra calculado a partir do ngulo de reflexo total, utilizando uma curva de
calibrao.
O pH determinado por intermdio dos indicadores vermelho de metilo,
fenolftalena e azul de bromotimol, que reagem especificamente com os ies H+. Os
leuccitos so revelados pela presena das esterases granulocitrias, as quais
decompem um ster indoxlico em indoxil, que reage com o sal de diaznio,
produzindo um corante violeta. O teste para deteco de protenas baseia-se no princpio
do erro proteico de um indicador de pH. O teste para nitritos baseado na prova de
Griess. A determinao da glucose baseada na reaco especfica da glucose-
oxidase/peroxidase (mtodo GOD/POD). O teste para os corpos cetnicos baseia-se no
princpio da prova de Legal. Na determinao do urobilinognio e bilirrubina, estes
reagem com um sal de diaznio originando um corante azico. A hemoglobina catalisa
a oxidao do indicador atravs do perxido de hidrognio orgnico contido na zona
teste, originando uma colorao azul-esverdeada.
Nos casos em que o volume de amostra inferior a 200ml, a anlise pelo
equipamento no possvel, sendo ento realizada a tcnica manual em que uma tira
teste mergulhada na amostra e a leitura feita por comparao visual das cores obtidas
com tabela respectiva.
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IIMMUUNNOOLLOOGGIIAA
Endocrinologia
Doseamentos hormonais Hormonas do Eixo Hipotlamo-epifisrio:
FSH, LH, TSH, LH, Progesterona, Prolactina
Hormonas da Tiride: T3, T4, FT3, FT4,
Hormonas da Paratiride: Paratormona;
Hormonas das Gnadas: Progesterona, Beta-
hCG, 17-Beta-Estradiol, Testosterona
Imunologia
Imunoqumica Crioglobulinas (ttulo e pesquisa)
Complemento (C3 e C4)
Imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgE)
Protena C reactiva (PCR)
Waller-Rose
Factor reumatide (FR)
Auto Imunidade Anticorpos anti-nucleares (anti-ANA)
Anticorpos anti-antignios nucleares extraveis
(ENA): SS-A, SS-B, Sm, Rnp
Anticorpos anti-DNA
Anticorpos anti-tiroideus: anti-Tiroglobulina
(TG), anti-Peroxidase da Tiride (TPO)
Imunoserologia Anticorpos anti-HVC (Virus Hepatite C)
Anticorpos anti-HBc, HBe, HBs; Antignios
Hbe e HBs (Virus Hepatite B)
Anticorpos anti-HVA (IgG, IgM) (virus
hepatite A)
Anticorpos anti-CMV (IgG, IgM)
(citomegalovirus)
Anticorpos anti-Clamydea Trachomatis (IgG,
IgM)
Anticorpos anti-Helicobacter pylori (IgG)
Anticorpos anti-HIV I e II (vrus
imunodeficincia adquirida)
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Anticorpos anti-Toxoplasma (IgG, IgM)
Anticorpos anti-Rubola (IgG, IgM)
Ttulo anti-estreptolisina O (TASO)
Ag febril (Reaco de Widal)
Sfilis (RPR)
Brucelose (Rosa bengala)
Marcadores tumorais Alfa-fetoprotena
CEA, CA-19.9, CA-125, CA-15.3
PSA, FPSA
11.. AAGGLLUUTTIINNAAOO DDIIRREECCTTAA
LE Teste em Latex
O LE Teste utilizado na deteco dos anticorpos associados ao Lpus
Eritematoso Sistmico (SLE). O soro dos doentes portadores de SLE contem quase
sempre anticorpos dirigidos contra um ou vrios antignios nucleares. Estes anticorpos
antinucleares (ANA), que podem ser da classe IgG, IgA ou IgM, esto presentes,
aproximadamente, em 95% dos pacientes no tratados, mas no so completamente
especficos para o diagnstico de SLE. Muitas vezes, a taxa de ANA em circulao
corresponde actividade do SLE, mas por vezes no existe qualquer correlao. A
utilizao deste teste permite, principalmente, excluir o diagnstico de SLE.
A nvel dos dados laboratoriais, o SLE geralmente acompanhado de
trombocitopnia, anemia hemoltica, dados compatveis com insuficincia renal,
positividade para diversos auto-anticorpos e hipocomplementmia.
1.1. Fundamento do mtodo
As reaces de aglutinao e precipitao constituem a base de muitas das
tcnicas aplicadas no laboratrio de imunologia. Enquanto as reaces de precipitao
so quantificveis, as tcnicas de aglutinao so apenas semiquantitativas. A principal
vantagem das reaces de aglutinao inclui a capacidade de avaliao visual do ponto
final da reaco, sem necessidade de recorrer a equipamento especfico. As reaces de
aglutinao podem ser classificadas em directa ou indirecta (passiva). Na tcnica
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directa, clulas ou partculas antignicas insolveis so aglutinadas directamente pelo
anticorpo. A aglutinao passiva refere-se aglutinao de clulas ou partculas inertes
ligadas a antignios que so transportadores passivos de antignios solveis. (7)
Este teste baseado numa reaco imunolgica entre as partculas de ltex
revestidas de DNP (desoxiribonucleoprotena) e os anticorpos anti-DNP da amostra.
Logo que a concentrao dos anticorpos nas amostras aumente, aparece uma
aglutinao visvel a olho n. Trata-se de um teste qualitativo que poder ser semi-
quantitativo por diluio da amostra.
Amostra: Soro
22.. AAGGLLUUTTIINNAAOO -- RROOSSAA BBEENNGGAALLAA
Brucelloslide
A brucelose uma zoonose transmitida aos seres humanos por animais
infectados. Pode ser causada por qualquer uma das 4 espcies de Brucella: Brucella
melitensis (a mais comum e mais virulenta) adquirida a partir de cabras, ovelhas e
camelos; Brucella abortus, existente no gado ovino; B.suis, nos sunos, e B.canis, nos
ces. transmitida mais frequentemente atravs da ingesto de leite e lacticnios no
tratados, podendo ser contrado por inalao durante o contacto com animais, leses
cutneas, auto-inoculao ou via conjuntival. Ocasionalmente pode ser transmitida por
via interpessoal, durante o aleitamento e actividade sexual. Possui uma manifestao
febril, sem padro distinto.
O serodiagnstico clssico das infeces agudas por Brucella baseia-se na
pesquisa e titulao dos anticorpos da classe M (aglutinantes) e IgG anti-antignios
polissacardicos A e M da parede celular, utilizando as reaces imunolgicas de
aglutinao directa de Huddleson (mtodo em lmina), de Rosa de bengala (mtodo em
lmina) e de Wright (mtodo em tubo). (8)
A reaco de Rosa de Bengala uma prova de aglutinao rpida executada em
lmina que utiliza uma suspenso antignica corada pelo Rosa de bengala. um teste
recomendado como procedimento de rastreio, para pesquisar a presena de anticorpos,
essencialmente da classe IgG, anti-Brucella no soro dos doentes com suspeita clnica de
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Brucelose. Para alm de detectar a presena de anticorpos bloqueantes (IgG1 e IgG2),
tem uma especificidade superior reaco de Huddleson e de Wright que se deve, em
grande parte, utilizao de uma meio reactivo acidificado responsvel pela
minimizao da aglutinao induzida pelos anticorpos da classe IgM. Por este facto
positiva mais tardiamente do que a reaco de Huddleson e de Wright. Uma vez que a
reaco positiva tanto nos doentes com Brucelose aguda como nos que apresentam
infeces subagudas e crnicas considerado o teste clssico e de eleio para efectuar
inquritos epidemiolgicos. (8)
2.1. Fundamento do mtodo
As tcnicas de rastreio para a pesquisa de anticorpos contra bactrias
patognicas recorrem a reaces de aglutinao. A incubao da bactria fixada com o
soro do paciente leva aglutinao das bactrias se o paciente desenvolveu uma
resposta imune contra o agente. Estas tcnicas podem apresentar reaces cruzadas. No
entanto, a sua execuo extremamente fcil e o custo baixo, pelo que continuam a
ser utilizadas. (8)
Este teste baseia-se no serodiagnstico da brucelose por aglutinao em carta
(Ag Rosa Bengala). O antignio cido tamponado, corado com Rosa Bengala, permite
uma deteco precoce das aglutininas especficas da brucelose (Brucella melitensis, B.
abortus, B. bovis e B. suis).
Falsos Positivos: indivduos recentemente imunizados contra a clera, infectados
com Yersinia enterocolitica bitipo 9 ou Francisella tularensis.
Falsos Negativos: Presena de anticorpos bloqueantes
Amostra: Soro
33.. AAGGLLUUTTIINNAAOO -- WWIIDDAALL
As salmoneloses so infeces provocadas por microorganismos gram-negativos
da famlia das enterobactrias, as Salmonelas. A serotipagem baseia-se na reactividade
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imunolgica dos antignios somticos, O, que so predominantemente
lipopolissacridos, e dos antignios capsulares, H.
As manifestaes clnicas e gravidade da infeco por microorganismos do
gnero Salmonela iro depender do serotipo envolvido. Estas podem distinguir-se
clinicamente em Salmonelas no tifides e tifides. O serotipo Salmonella typhi o
responsvel pela febre tifide. Esta uma infeco sistmica, que se apresenta com
febres altas, cefaleias e sem diarreia. Este serotipo tem o homem como nico
reservatrio e pode existir em portadores saudveis. A sua transmisso feita por
contacto directo homem-a-homem ou oral-fecal (alimentos e gua contaminados). Os
serotipos paratyphi A, B e C, provocam uma sndrome semelhante febre tifide. O
nico teste laboratorial especfico para o diagnstico da Salmonelose o seu isolamento
em cultura. Existem no entanto mtodos de serodiagnstico que, apesar da sua reduzida
inespecificidade e sensibilidade, continuam a ser muito solicitados, tais como o Teste de
Widal.
3.1. Fundamento do mtodo
Antignios febris so usados em testes de aglutinao como complemento ao
diagnstico de determinadas doenas febris, tais como doenas por Salmonella spp,
Brucella spp e Ricketsieae. O soro do paciente testado directamente para anticorpos
homlogos.
O diagnstico serolgico de Widal utilizado nas febres tifo-paratifidicas
quando a bactria, salmonela, no pode ser isolada. Baseia-se na pesquisa dos
anticorpos anti-O e anti-H sricos pela utilizao das suspenses O e H da Salmonella
typhi e paratyphi A, B, C, Salmonella typhi-murium e Salmonella enteritidis. O
aparecimento das anti-O indica uma infeco recente. No indivduo vacinado apenas as
aglutininas H persistem. Uma antibioterapia precoce pode impedir o aparecimento das
aglutininas O. (9)
A prova realizada em lmina apresenta resultados positivos quando se verifica a
presena de aglutinao. Os resultados negativos traduzem-se na ausncia de
aglutinao visvel. Define-se o ttulo como o inverso da maior diluio que d
resultado positivo.
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Tm relevncia clnica os ttulos em diluio igual ou superior a 1/80. Um
aumento de ttulo entre amostras colhidas a tempos diferentes ser sugestivo de um
diagnstico presuntivo.
Falsos Positivos: O soro de doentes normais pode apresentar aglutinao
positiva com Ags febris devido a imunizao prvia, infeco antiga ou pela presena
de anticorpos relacionados com os antignios. Em geral, os ttulos encontrados nestas
situaes sero inferiores e permanecero a um nvel constante. Os ttulos detectados
como resultado de uma infeco activa ou imunizao recente com um organismo
contendo antignios homlogos ser, geralmente, superior e tender a aumentar.
Falsos Negativos: Tal como noutros imunoensaios podero verificar-se
fenmenos de prozona. Nalgumas situaes no h desenvolvimento de aglutininas.
Amostra: Soro
44.. HHEEMMAAGGLLUUTTIINNAAOO GGEELL -- WWAALLLLEERR--RROOSSEE
POLYARTEST
A artrite reumatide e doenas relacionadas esto associadas produo de um
grupo de imunoglobulinas, denominadas factores reumatides (FR).
Os factores reumatides so um grupo heterogneo de auto-anticorpos dirigidos
contra os determinantes antignicos da regio Fc das molculas de IgG. So importantes
para o diagnstico da artrite reumatide mas tambm podem ser encontrados noutras
doenas reumticas inflamatrias e em vrias doenas no reumticas: processos
inflamatrios crnicos, doenas infecciosas como endocardite bacteriana subaguda,
malria, sfilis, lepra, leishmaniose, tuberculose e variedades de doenas auto-imunes
como o LES. Tambm so encontrados em pessoas saudveis acima dos 60 anos. (7)(10)
Os auto-anticorpos ocorrem em todas as classes de imunoglobulinas (IgG, IgA,
IgM monomrica) apesar dos mtodos analticos usuais serem limitados deteco dos
factores reumatides do tipo IgM pentamrica.
4.1. Fundamento do mtodo
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O Polyarteste utilizado como auxiliar no diagnstico imunolgico da artrite
reumatide. A reaco baseada nas propriedades de hemaglutinao especficas do
factor reumatide, como nas reaces do tipo Waller-Rose. O reagente consiste em
glbulos vermelhos de carneiro sensibilizados por um soro de coelho anti-eritrcitos de
carneiro. O factor reumatide humano aglutina estes eritrcitos de carneiro, devido a
uma reaco cruzada entre a IgG do coelho e a IgG humana.
As tcnicas de hemaglutinao utilizadas em serologia so tcnicas semi-
quantitativas que consistem em incubar diluies variveis de anti-soro em presena de
uma determinada concentrao de clulas.
O ttulo no apenas influenciado pela quantidade de anticorpos, mas tambm
pela sua afinidade. A multiplicidade destes factores explica porque a aglutinao
fornece uma informao relativa que permite classificar o anti-soro, sem permitir uma
estimao quantitativa dos anticorpos presentes.
Um factor reumatide negativo no exclui o diagnstico de artrite reumatide.
Aproximadamente 20% dos pacientes com artrite reumatide so seronegativos. Alguns
destes pacientes podem ter factores reumatides IgG, IgA ou IgM monomrica.
Inversamente, os factores reumatides tambm no aparecem s na artrite reumatide.
Esto tambm presentes em 30% dos pacientes com LES, numa elevada percentagem
(90%) de pacientes com sndrome de Sjgren e tambm em pacientes com escleroderma
ou polimiosite. Os estudos epidemiolgicos mostram que um pequeno nmero de
pessoas normais tambm tem factores reumatides.
Falsos positivos: Nalgumas doenas crnicas infecciosas, como lepra e
tuberculose. Na endocardite bacteriana subaguda ambos o teste pode se positivos
durante a doena activa e reverter para negativo medida que o paciente melhora.
Amostra: Soro
55.. IIMMUUNNOOTTUURRBBIIDDIIMMEETTRRIIAA// MMOODDUULLAARR PP
5.1. Imunoglobulinas
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Observa-se uma diminuio na concentrao de imunoglobulinas em
enteropatias com perdas proteicas, atravs da pele dos queimados e nas
imunodeficincias adquirida e congnita. O aumento dos nveis de imunoglobulinas
ocorre nas hepatopatias crnicas, doenas infecciosas e perturbaes autoimunes (artrite
reumatide, LES). (10)
5.1.1. Fundamento do mtodo
Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao
quantitativa de imunoglobulinas. Os anticorpos anti-Ig A, G ou M reagem com o
antignio na amostra e formam um complexo Ag-Ac. Aps a aglutinao, a
determinao feita por turbidimetria.
Podem ocorrer resultados falsamente baixos devido a um excesso de antignio
(efeito zona). Estes antignios bloqueiam o anticorpo impedindo-o de se formar o
complexo Ag-Ac. Esta situao pode ser detectada aps diluio apropriada da amostra.
As chamadas paraprotenas secretadas nas gamopatias monoclonais
(imunoglobulinmia monoclonal) podem diferir das respectivas imunoglobulinas de
origem policlonal, na composio e tamanho dos seus aminocidos. Tambm neste caso
a ligao ao anticorpo pode ser prejudicada.
Assim, amostras de soro de pacientes com um diagnstico clnico incerto devem
ser sujeitas a uma electroforese de protenas para identificar um eventual excesso de
antignio ou gamopatia monoclonal.
Amostra: Soro ou plasma
5.2. Anti-estreptolisina O (TASO)
Os testes imunolgicos para a determinao de anticorpos especficos dos
produtos metablicos estreptoccicos produzem informaes importantes sobre
infeces anteriores por estreptococos. Os anticorpos so produzidos contra o patognio
e os respectivos produtos metablicos. Um exemplo o anticorpo para a estreptolisina
O, uma enzima produzida pelos estreptococos -hemolticos do grupo A de Lancefield,
I Mestrado Anlises Clnicas
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Streptococcus pyogenes, um dos principais agentes da faringite. Procede-se
determinao da anti-estreptolisina O aquando da ocorrncia de patologias txicas e
sensibilizantes, como febre reumtica e a glomerulonefrite aguda ps-estreptoccica.
Existem vrios mtodos para o doseamento da anti-estreptolisina O, como a aglutinao
por ltex e inibio da hemlise.
5.2.1. Fundamento do mtodo
Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para determinao
quantitativa de anti-estreptolisina O. A estreptolisina O (antignio) que reveste o ltex
reage com os anticorpos da amostra e forma um complexo Ag-Ac por aglutinao. A
determinao final feita por turbidimetria.
possvel a ocorrncia de um efeito zona com concentraes elevadas de anti-
estreptolisina O.
Amostra: Soro ou plasma
5.3. Factor Reumatide
A artrite reumatide e doenas relacionadas esto associadas produo de um
grupo de imunoglobulinas, denominadas factores reumatides (FR).
Os factores reumatides so um grupo heterogneo de auto-anticorpos dirigidos
contra os determinantes antignicos da regio Fc das molculas de IgG. So importantes
para o diagnstico da artrite reumatide mas tambm podem ser encontrados noutras
doenas reumticas inflamatrias e em vrias doenas no reumticas: processos
inflamatrios crnicos, doenas infecciosas como endocardite bacteriana subaguda,
malria, sfilis, lepra, leishmaniose, tuberculose e variedades de doenas auto-imunes
como o LES. Tambm so encontrados em pessoas saudveis acima dos 60 anos. (8)
Os auto-anticorpos ocorrem em todas as classes de imunoglobulinas (IgG, IgA,
IgM monomrica) apesar dos mtodos analticos usuais serem limitados deteco dos
factores reumatides do tipo IgM pentamrica.
5.3.1. Fundamento do teste
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Este baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao
quantitativa de factores reumatides. A IgG (antignio) inactivada pelo calor, ligada a
partculas de ltex, reage com os anticorpos FR na amostra e forma complexos Ag-Ac.
Estes, aps a aglutinao, so determinados por turbidimetria.
O procedimento clssico de quantificao dos FRs recorre aglutinao com
eritrcitos de ovelha sensibilizados para IgG ou com partculas de ltex. Os problemas
prprios destes mtodos semiquantitativos so a fraca preciso e reprodutibilidade
interlaboratoriais, associadas a dificuldades de padronizao. Estes motivos levaram ao
desenvolvimento de novos mtodos de ensaio, como a turbidimetria e imunoensaios
enzimticos.
Amostra: Soro ou plasma
5.4. Protena C reactiva (PCR)
A PCR uma glucoprotena que normalmente no se encontra presente no soro,
sendo um indicador inespecfico de fase aguda. Esta protena aparece em infeces e
agresses com inflamao. O doseamento da PCR utilizado para detectar processos
inflamatrios sistmicos, avaliar o tratamento das infeces bacterianas com
antibiticos, fazer a distino entre a forma activa e inactiva de doenas com infeco
concomitante, por exemplo, em doentes que sofrem de SLE ou colite ulcerosa, para
controlar terapeuticamente as doenas reumticas, avaliar a teraputica anti-inflamatria
e para distinguir entre infeco e rejeio de transplante da medula ssea. (10)
Mais recentemente verificou-se a sua utilidade no prognstico de risco
cardiovascular em indivduos saudveis, com angina instvel e IAM, devido ao papel da
inflamao na fisiopatologia da aterosclerose. No entanto, a sua utilizao na avaliao
do risco cardiovascular implica a utilizao de ensaios que possuam sensibilidade igual
ou inferior a 0.1 mg/dL.
5.4.1. Fundamento do teste
Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao
quantitativa da protena C reactiva. Os anticorpos anti-PCR reagem com o antignio na
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amostra e formam um complexo Ag-Ac. Aps a aglutinao, a determinao feita por
turbidimetria.
Amostra: Soro ou plasma
66.. RREEAACCOO DDEE FFLLOOCCUULLAAOO
RPR
A sfilis uma infeco crnica sistmica causada por uma espiroqueta, o
Treponema pallidum subespcie pallidum. habitualmente transmitida por via sexual
(mas tambm de transmisso congnita) e caracteriza-se por episdios de doena activa
interrompidos por perodos de latncia. Aps um perodo mdio de incubao de 2 a 6
semanas, aparece uma leso primria frequentemente associada a linfoadenopatia
regional (Sfilis Primria). Um estadio bacterimico secundrio, associado a leses
cutneo-mucosas generalizadas (Sfilis Secundria) seguido por um perodo latente de
infeco subclnica que pode durar muitos anos (Sfilis Latente). Em cerca de 1/3 dos
casos no tratados segue-se um estdio tercirio, caracterizado por leses cutneo-
mucosas, msculo-esquelticas e parenquimatosas, progressivamente destrutivas, aortite
ou patologia sintomtica do sistema nervoso central (Sfilis Terciria). O Treponema
pallidum um microorganismo fastidioso, no cultivvel em meios de cultura habituais,
sendo a sua presena normalmente demonstrada de forma indirecta por testes
serolgicos. Pode tambm ser detectado por observao microscpica directa das leses.
Os anticorpos desenvolvidos em resposta a um contacto do organismo com o T.
pallidum classificam-se como no Treponmicos e Treponmicos. Os anticorpos no
treponemais aparecem entre 1 e 4 semanas aps a infeco e permanecem elevados at
que se inicie a teraputica antimicrobiana ou quando o paciente entra na fase tardia da
infeco. Uma vez iniciada a terapia antimicrobiana eficaz, os ttulos dos anticorpos no
treponemais comeam a declinar, frequentemente atingindo nveis no detectveis antes
do final do tratamento.
6.1. Fundamento do mtodo
I Mestrado Anlises Clnicas
Joana Selada Domingues - 48 -
O VDRL e o RPR (Rapid Plasma Reagin Test) so os dois testes no
treponmicos mais comuns. Os anticorpos no treponmicos reagem com material
lipoproteico das clulas lesadas e com a cardiolipina do Treponema, no sendo
especficos para este (podem ser produzidos noutras situaes tais como doenas