Actividad de Hprt 2

8/9/2019 Actividad de Hprt 2

1/4

2692

S h o r t c o m m u n i c a t i o n s

D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y

a n d T o x i c o l o g y

Mi c h i gan S t a t e Un i v e r s i t y

Eas t Lans i ng , M I 48824 , U . S . A .

K AT H E RI NE S HILLIKER

MICHELLE IMLAY

ROBERT A. ROTH*

REFERENCES

1 . E . K . M cL ean , P h a r m a c . R e v . 22, 429 (1970) .

2 . B . M e y r i c k , W . G a m b l e a n d L . R e i d ,

Am. J . Phy s i o l .

239 , H 692 (1980) .

3 . K . S . H i l l i ke r , T . G . B e l l and R . A . R o th ,

A m . J .

Phy s i o l .

242 , H 573 (1982) .

4 . J . M . K a y , P . M . K e a n e , K . L . S u y a m a a n d D . G a u -

th i e r , T h o r a x 37, 88 (1982) .

5 . L . M e r k o w a n d J . K l e i n e r m a n , Lab . I nv e s t . 15, 547

(1966) .

6 . C . A . W a g e n v o o r d t a n d N . W a g e n v o o r d t ,

Ci r c u l a t i on

42, 1163 (1970) .

7 . Y . I w a s a w a , C . N . G i l l is a n d G . A g h a j a n i a n ,

J . Phar -

mac. exp . Ther . 186, 498 (1973) .

8 . A . F . Junod , J . Phar mac . e x p . The r . 183, 341 (1972).

* A u t h o r t o w h o m a ll c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e

a d d r e s s e d .

9 . C . N . G i l l i s , R . J . H ux tab l e and R . A . R o th ,

Br. J .

P h a r m a c .

63, 435 (1978) .

1 0. R . H u x t a b l e , D . C i a r a m i t a r o a n d D . E i s e n s t e i n ,

Mol e c .

P h a r m a c .

14, 1189 (1978) .

11 . T . E . N icho l a s , J . M . S t rum , L . S . A nge lo and A . F .

J u n o d , Ci r c u l a t i on Re s . 35, 670 (1974) .

12 . Y . Iw asaw a and C . N . G i l l i s , J . Phar mac . e x p . The r .

188, 386 (1974) .

13 . M . J . S o l e , M . D rob ac , L . S chw ar t z , M . N . H u ssa in

a n d E . F . V a u g h n - N e i l ,

Ci r c u l a t i on

60, 160 (1979) .

1 4 . M . H . G e w i t z , B . R . P i t t , H . L a k s , G . L . H a m m o n d ,

N . S . T a lne r and C . N . G i l l i s , Pe d i a t . Phar mac . 2, 57

(1982) .

1 5. T . K o n d o , K . O g a w a , M . B a n , E . W a t a n a b e a n d T .

S a t a k e ,

Jap. Circul . J .

45, 1243 (1981) .

16 . R . A . R o th ,

Am. J . Phy s i o l .

242 , H 844 (1982) .

17 . F . N . M ina rd and D . S . G ra n t ,

B i o c h e m . M e d .

6, 46

(1972) .

1 8. R . M . F u l t o n , E . C . H u t c h i n s o n a n d A . M . J o n e s , Br.

He ar t J . 14, 413 (1952) .

19 . C . N . G i l l i s and B . R . P i t t , A n n . R e v . P h y s i o l. 44 , 269

(1982) .

20 . K . S . H i l l i ke r , C . M . G arc i a and R . A . R o th ,

Re s .

C o m m u , . C h e m . P a t h . P h a r m a c .

40, 179 (1983) .

2 1 . A . M o l t e n i , W . F . W a r d , C . T s ' a o a n d N . S o l l i d ay ,

Fe dn . Pr oc . 4 2 , 7 7 8 ( 1 9 7 3 ) .

Biochemical Pharmacology,

Vo l. 33, No. 16, pp. 2692-2695, 1984.

Printed in G reat Britain.

0006-2952/84 $3.00 + 0.00

~) 1984 Pergamon Press Ltd.

H y p o x a n t h i n e - g u a n i n e p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e - i n d e p e n d e n t t o x i c i t y o f

a z a t~ h io p r in e i n h u m a n l y m p h o b l a s t s

R e c e i v e d

23

N o v e m b e r

1983;

ac c e p t e d

21

F e b r u a r y

1984)

6 - M e r c a p t o p u r i n e ( 6 - M P * ) a n d i t s i m i d a z o l e d e r i v a t i v e ,

a z a t h i o p r i n e ( A Z ) , a r e c l i ni c a ll y u s e f u l i m m u n o s u p p r e s s i v e

a g e n t s . A Z i n p a r t i c u l a r h a s g a i n e d w i d e s p r e a d u s e a n d h a s

b e e n c i t e d as t h e m o s t w i d e l y u s e d c y t o to x i c

i m m u n o s u p p r e s s i v e a g e n t in c l in i c a l m e d i c i n e [ 1] . T h e

b i o c h e m i c a l a n d m e t a b o l i c e f f e c ts o f t h e s e t h i o p u r i n e s h a v e

b e e n r e v i e w e d [ 1 -- 4] . H o w e v e r , t h e p r e c i s e m e c h a n i s m o f

t h e i r i m m u n o s u p p r e s s i v e a c t i v it y is n o t c l e a r l y u n d e r s t o o d

[1 2].

T h e c y t o t o x i c i t y o f 6 - M P i s d e p e n d e n t u p o n i t s p h o s -

p h o r i b o s y l a t i o n t o t h i o i n o s i n i c a ci d ( T I M P ) w h i c h i s c a t a -

l y ze d b y t h e e n z y m e h y p o x a n t h i n e - g u a n i n e p h o s p h o -

r i b o s y l t r a n s f e r a s e ( H P R T , E C 2 . 4 .2 . 8 ) . C e l l l in e s w h i c h

a r e r e s i s t a n t t o 6 - M P h a v e b e e n s h o w n t o l a c k H P R T

a c t iv i t y [ 5 ], a n d n e i t h e r 6 - M P n o r A Z h a s a c t i v i ty in H P R T -

d e f i c i e n t p a t i e n t s [ 6 ] . T I M P i s a n e f f e c t i v e i n h i b i t o r o f

p u r i n e n u c l e o t i d e b i o s y n t h e s i s a n d i n t e r c o n v e r s i o n ( s e e

F ig . 1 ) . I t i s a com p e t i t i ve i nh ib i t o r o f adeny l su cc ina t e

s y n t h e t a s e , a d e n y l s u c c i n a t e l y a s e , a n d I M P d e h y d r o -

g e n a s e , a n d i t i s a p s e u d o f e e d b a c k i n h i b i t o r o f g l u t a m i n e -

p h o s p h o r i b o s y l p y r o p h o s p h a t e a m i d o t r a n s f e r a s e , t h e f i r s t

e n z y m e u n i q u e t o t h e

d e n o v o

p u r i n e n u c l e o t i d e b i o s y n -

t h e t i c p a t h w a y [ 3 ,4 ] . O t h e r e f f e c t s o f T I M P i n c l u d e i n -

c o r p o r a t i o n i n t o n u c l e i c a c id , t h e i n h i b i t i o n o f c o e n z y m e

f o r m a t i o n a n d f u n c t i o n , a n d t h e i n h i b i t i o n o f p r o t e i n s y n -

thesis [3 ,4] .

M a n y o f th e m e t a b o l i c e ff e ct s o f A Z a r e d e p e n d e n t u p o n

i ts c l e a v a g e to 6 - M P a n d t h e s u b s e q u e n t p h o s p o r i b o s y l a t i o n

t o T I M P . H o w e v e r , t h e r e h a s b e e n i n c r e a s i n g e v i d e n c e

w h i c h i n d i c a t e s t h a t A Z h a s m e t a b o l i c e f f e c t s w h i c h m a y

a c c o u n t f o r i t s d i s ti n c t a n d m o r e w i d e s p r e a d c l in i c a l a p p l i-

* A b b r e v i a t i o n s : 6 - M P , 6 - m e r c a p t o p u r in e ; A Z ,

a z a t h i o p r i n e ; T I M P , t h i o i n o s i n i c a c i d ; a n d H P R T , h y p o -

x a n t h i n e - g u a n i n e p h o s p h o r i b o s y la t r a n s fe r a s e .

c a b i l i t y a s a n i m m u n o s u p p r e s s a n t a s c o m p a r e d t o 6 - M P

[1- -4 ,7 ,8 ]. T he se e f f ec t s m ig h t be a t t r i bu t a b l e t o b io log i ca l l y

a c t i v e m e t a b o l i t e s u n i q u e t o A Z o r c o u l d p o s s i b l y b e d u e

t o t h e r e a c t i o n o f t h e m e t h y l n i t r o i m i d a z o l e m o i e t y w i t h

a c t i v e m e t a b o l i t e s o r w i t h p o t e n t i a l l y r e a c t i v e g r o u p s o n

ce l l u l a r p ro t e in s [2] .

I n t h i s s t u d y , u t i li z i n g H P R T a n d H P R T - d e f i c i e n t

h u m a n l y m p h o b l a s t o i d c e l l l i n e s , w e h a v e f o u n d e v i d e n c e

w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e c y t o t o x i c it y o f A Z i n c e l l c u l t u r e ,

u n l i k e t h a t o f 6 - M P , i s , i n p a r t , i n d e p e n d e n t o f H P R T

act ivi ty .

M a t e r ia l s a n d m e t h o d s

Che mi c a l s .

A z a t h i o p r i n e , 6 - m e r c a p t o p u r in e , g l u t a m in e

a n d t h e p u r i n e n u c l e o s i d e s a n d b a s e s u s e d w e r e p u r c h a s e d

f r o m t h e S i g m a C h e m i c a l C o . H e a t - i n a c t i v a t e d h o r s e s e r u m

a n d R P M I 1 64 0 m e d i u m w e r e p u r c h a s e d f r o m t h e G r a n d

I s l a n d B i o l o g i c a l C o . R P M I 1 6 4 0 c o n t a i n s g l u t a t h i o n e

( 1 m g / l ) a s o n e o f i t s c o m p o n e n t s .

Cel l l ines . H u m a n l y m p h o b l a s t o i d c e l l l i n e s w e r e m a i n -

t a i n e d in R P M 1 1 6 4 0 m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % h e a t -

i n a c ti v a t e d h o r s e s e r u m a n d 2 m M g l u ta m i n e . T h e M G L -

8 c e ll li n e ( H P R T ) w a s d e r i v e d f r o m a n o r m a l i n d i v i d u a l

a n d w a s a g i ft f r o m J . E p s t e i n , J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y .

T h e G M - 1 3 0 c e l l l i n e , d e r i v e d f r o m a n o r m a l i n d i v i d u a l ,

a n d t h e G M - 4 6 7 ( H P R T - d e f i c i e n t , m u t a g e n i z e d ) c e l l l i n e

w e r e o b t a i n e d f r o m t h e H u m a n G e n e t i c s M u t a n t C e l l

R e p o s i t o r y . T h e H P R T - d e f i c i e n t c e l l l i n e H D w a s d e r i v e d

f r o m a p a t i e n t p r e s e n t in g w i t h t h e L e s c h - N y h a n S y n d r o m e

b y E p s t e i n - B a r r v i r u s t r a n s f o r m a t i o n b y t h e m e t h o d

d e s c r i b e d p r e v i o u s l y [ 9] . T h e M O L T - 4 c e l l l i n e ( H P R T + ) ,

o r i g i n al l y d e r i v e d f r o m a p a t i e n t p r e s e n t i n g w i t h t h e L e s c h -

N y h a n S y n d r o m e b y E p s t e i n - B a r r v i ru s t r a n s fo r m a t i o n b y

t h e m e t h o d d e s c r i b e d p r e v i o u s l y [ 9] . T h e M O L T - 4 c e ll l i n e

( H P R T ) , o r i g i n a ll y d e r i v e d f r o m a p a t i e n t w i t h a c u te


2/4

S h o r t c o m m u n i c a t i o n s 2 69 3

R i b o s e - 5 - P + A T P

5 - P h o s p h o r i b o s y l - l - P y r o p h o s p h a t e (P R P P ) + G l u t a m i n e

.~,o ................... ( ~ 1 ....................... ~'~

, , . ~ i . . . . . .

5 - - P h o s p h o r i b o s y l - - 1 - A m i n e ~ u ', ~ o . .

~ . ~ ' . . .. . I ~ G l y c i n e . ./ .. % p6

, : - [ , ' ,

-. ~ F o r m a t e . . .

N u c l e i c A c i d s " .. " ". N u c l e i c A c i d s

= j

' ' . . . .

G u a n y l ic A c i d ~ I n o s in i c A c i d ~ ~ A d e n y l i c A c i d

G u a n o ~ n e , ~ . q ? ( ~ , , ~ , % I n o r l n e ' A d e n o s in e A d J n i n e

- - ~ " / / ~ H ~ n o x a n t h i n e I

L ~ u a n l n e ~ T ~ - l

X a n h i n e 2 , 8 d i o x y a d e n i n e

U r i c A c i d

F i g . 1 . P u r i n e m e t a b o l i c p a t h w a y s . T h e p h o s p h o r i b o s y l a t i o n o f 6 -M P t o t h i o i n o s i n i c a c i d ( T I M P ) i s

c a t a l y z e d b y ( 1 ) h y p o x a n t h i n e - g u a n i n e p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e ( H P R T ) . T I M P c a n p o t e n t i a l ly i n t e r -

f e r e w i t h p u r i n e n u c l e o t i d e b i o s y n t h e s i s b y i n h i b i t in g t h e a c t i v it i e s o f ( 2 ) p h o s p h o r i b o s y l p y r o p h o s p h a t e

a m i d o t r a n s f e r a s e , ( 3 ) I M P d e h y d r o g e n a s e , ( 4 ) a d e n y l s u c c i n a t e s y n t h e t a s e , ~ /n d ( 5 ) a d e n y l s u c c i n a t e ly a s e

[2-4] .

l y m p h o b l a s t ic l e u k e m i a , w a s o b t a i n e d f ro m H E M

R e s e a r c h . T h e l e v e ls o f H P R T e n z y m e a c t iv i ty in t h e M G L -

8 a n d G M - 1 3 0 c e l l l i n e s w e r e r e p o r t e d t o b e 1 8 .4 - + 1 .5 a n d

1 1 .4 - 2 . 5 m U / m g , r e s p e c t i v e ly , w h i l e t h e l e v e ls o f H P R T

i m m u n o r e a c t i v e p r o t e i n i n t h e s e c e l l l i n e s w e r e r e p o r t e d

a s 442 -+ 45 a nd 264 - 19 ng HP RT / m g r e s pe c t i ve l y [ 9 ] .

U s i n g s i m i la r m e t h o d o l o g y , t h e G M - 4 6 7 a n d H D c e ll li n es

w e r e f o u n d t o h a v e u n d e t e c t a b l e H P R T e n z y m e a c t i vi ty o r

H P R T i m m u n o r e a c t i v e p r o t e i n ( d a ta n o t s h o w n ) .

Growth studies

A l l l y m p h o b l a s t g r o w t h s t u d i e s w e r e

i n i t i a t e d a t a c e l l de ns i t y o f a pp r o x i m a t e l y 2 . 0 x 1@ c e l l s /

m l . A f t e r 3 d a y s o f i n c u b a t i o n a t 3 7 , v i a b l e c e l l s we r e

c o u n t e d u s i n g a h e m a c y t o m e t e r , w i t h t r y p a n b l u e d y e

e x c l u s i o n u s e d a s a n i n d e x o f v i a b i l i ty . T h e t o x ic e f f e c t s o f

A Z a n d 6 - M P o n t h e g r o w t h o f H P R T + a n d H P R T - d e f ic i e n t

h u m a n l y m p h o b l a s t s w e r e e v a l u a t e d b y d e t e r m i n i n g t h e

c o n c e n t r a t i o n o f e a c h d r u g a t w h i c h t h e r e w a s a 5 0

r e d u c t i o n i n t h e c o n t r o l c e l l d e n s i t y a f te r 3 d a y s o f i n c u -

ba t i on 0c 50 ) .

Results and discussion

T h e e f f e c t s o f 6 - M P a n d A Z o n t h e g r o w t h o f n o r m a l

( H P R T ) a n d H P R T - d e f i c i e n t h u m a n l y m p h o b l a s ts a r e

s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 a n d i n F ig . 2 . T h e H P R T l y m p h o -

b l a s ts w e r e s e n s it iv e to b o t h 6 - M P a n d A Z , w i t h A Z

a p p e a r i n g t o b e s o m e w h a t le s s t o x i c t h a n 6 - M P a t e q u i m o l a r

d o s e s , e s p e c i a l l y i n t h e H P R T T l y m p h o b l a s t s . T h e

a v e r a g e I c s0 v a l u e s o f 6 - M P a n d A Z f o r t h e H P R T B c e ll s

w e r e 1 . 8 a n d 3 . 8 / ~ M r e s p e c ti v e l y . I n t h e H P R T + T c e l l

l i n e , M O L T - 4 , t h e I cs 0 f o r 6 - M P w a s 1 . 0 / t M a n d f o r A Z ,

7 . 6 / z M . T h e l o w e r t o x i ci t y o f A Z a s c o m p a r e d t o 6 - M P a t

e q u i v a l e n t d o s e s i s i n a c c o r d a n c e w i t h p r e v i o u s r e p o r t s ,

a n d h a s b e e n p o s t u l a te d a s a n e x p l a n a t io n f o r t h e r e p o r t e d

c l in i c a l e f fi c a cy o f A Z a s c o m p a r e d t o 6 - M P [ 2] . A s

e x p e c t e d , b a s e d o n t h e i n a b i l i t y o f t h e c e i l s t o c o n v e r t 6 -

M P t o t h i o i n o s i n i c a c i d , t h e g r o w t h o f t h e H P R T - d e f i c i e n t

B l y m p h o b l a s t c u l t u r e s w a s u n a f f e c t e d b y 6 - M P c o n -

c e n t r a t i o n s a s h i g h a s 2 0 0 / ~ M , t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n

u s e d i n t h e s e e x p e r im e n t s . H o w e v e r , A Z w a s f o u n d to b e

t o xi c t o b o t h t h e c h e m i c a ll y m u t a g n e n i z e d H P R T - d e f ic i e n t

B c e l l l i n e ( G M - 4 6 7 ) a n d t h e B l y m p h o b l a s t o i d c e l l l i n e

d e r i ve d f r o m a p a t i e n t p r e s e n t in g w i t h t h e L e s c h - N y h a n

S y n d r o m e ( H D ) , w i t h r e s p e c t i v e I C5 0 v a l u e s o f 3 0 a n d

3 2 / J M . T h e s e v a l u e s a r e a p p r o x i m a t e l y 8 - fo l d h i g h e r t h a n

t h e I cs 0 v a l u e s f o r t h e H P R T + B l y m p h o b l a s t s , i n d i c a t in g

t h a t t h e r e w a s s o m e r e s i s t a n c e t o t h e t o x i c e f f e c ts o f A Z i n

t h e H P R T - d e f i c i e n t c e l l s ; h o w e v e r , t h e s e c e l l l i n e s w e r e

r e s i s t a n t t o 6 - M P c o n c e n t r a t i o n s a t l e a s t 1 0 0 - f o l d g r e a t e r

t h a n t h e I c5 0 o f 6 - M P f o r t h e H P R T B l y m p h o b l a s t s . T h e

d i s c r e p a n c y b e t w e e n t h e r e s i s t a n c e o f t h e H P R T - d e f i c i e n t

c e l ls to 6 - M P a n d A Z i n d i c a t e s t h a t , u n l i k e t h e t o x i c it y o f

6 - M P , t h e t o x i c i t y o f A Z a t c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n

2 5/ tI V I w a s i n d e p e n d e n t o f H P R T a c t iv i ty .

S u p p l e m e n t a t i o n o f c u l t u r e s w i t h e i t h e r a d e n i n e o r i n o -

s i ne p r o t e c t e d H P R T l y m p h o b l a s t s f ro m g r o w t h i n h i b i ti o n

b y 6 - M P a t c o n c e n t r a t i o n s a t l e a s t a s h i g h a s 1 8 0 /~ M ( T a b l e

1 a n d F i g . 2 A ) . S u p p l e m e n t a t i o n o f c u l t u r e s w i t h a d e n o -

s i n e , d e o x y a d e n o s i n e , d e o x y i n o s i n e , o r h y p o x a n t h i n e

s i m i l ar l y p r o t e c t e d t h e s e c e l l s f r o m g r o w t h i n h i b i t i o n b y

6 - M P ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , s u p p l e m e n t a t i o n o f

c u l t u r e s w i t h g u a n o s i n e , d e o x y g u a n o s i n e , o r x a n t h o s i n e

d i d n o t a p p e a r t o a f f e c t t h e t o x i c i t y o f 6 - M P ( d a t a n o t

s h o w n ) . B o t h g u a n o s i n e a n d d e o x y g u a n o s i n e c a n b e c o n -

v e r t e d t o g u a n i n e i n t h e s e c e l l s . B e c a u s e g u a n i n e a n d

h y p o x a n t h i n e a r e b o t h s u b s t r a t e s f o r H P R T , i t i s h i g h l y

u n l i k e l y t h a t t h e e f f e c t o f t h e o t h e r p u r i n e s w a s d u e s o l e l y

t o c o m p e t i t i o n fo r H P R T b y h y p o x a t h i n e a c c u m u l a te d a s

a m e t a b o l i t e o f t h e s e p u r i n e s . T h e p r i n c i p a l m e c h a n i s m b y

w h i c h t h e m e t a b o l i t e s o f 6 - M P e x e r t t o x i c i t y i s t h r o u g h

t h e i n h i b i t i o n o f de novo p u r i n e b i o s y n t h e s i s a n d p u r i n e

n u c l e o t i d e i n t e r c o n v e r s i o n s [ 1- 4 ] . T h e p u r i n e s w h i c h p r o -

t e c t t h e c e l l s f r o m t h e t o x i c i t y o f 6 - M P c a n b e u t i li z e d b y

t h e p u r i n e s a l v a g e a n d n u c l e o t i d e i n t e r c o n v e r s i o n p a t h w a y s

i n t h e H P R T ly m p h o b l a s t s t o f o r m b o t h a d e n i n e a n d

g u a n i n e n u c l e o t i d e s ( F ig . 1 ). H o w e v e r , g u a n o s i n e a n d

d e o x y g u a n o s i n e c a n o n l y b e u t i l i z e d t o f o r m g u a n i n e

n u e l e o t i d e s a s t h e a b i l i t y t o c o n v e r t g u a n i n e n u c l e o t i d e s t o

a d e n i n e n u c l e o t i d e s i s a b s e n t i n m a m m a l i a n c e l ls [ 10 ]. I t

a p p e a r s m o s t l i k e l y th a t , b y p r o v i d i n g a n a l t e r n a t i v e s o u r c e

f o r p u r i n e n u c l e o t i d e s y n t h e s i s , p u r i n e s u p p l e m e n t a t i o n

p r o t e c t s t h e c e l ls f r o m e f f e c ts o f t h e i n h i b i t i o n o f t h e

de

novo

p u r i n e b i o s y n t h e t ic p a t h w a y b y T I M P a n d o t h e r

m e t a b o l i t e s o f 6 - M P .

T h e a d d i t i o n o f 5 0 /d V l i n o s i n e o r a d e n i n e t o c u l t u r e s o f


3/4

2694

S h o r t c o m m u n i c a t io n s

H P R T B l y m p h o b l a s ts i n c u b a t e d w i t h 6 - M P r a is e d t h e

I cs 0 f o r 6 - M P i n t he s e c e l l l i ne s by ove r 1 00 - f o l d ( f r om 1 . 8

t o > 1 8 0 / ~ M f o r 5 0 / z M i n o s i n e a n d t o > 1 8 0 / d V l f o r 50 g M

a d e n i n e ) . H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f i n o s i n e f u r t h e r p r o -

t e c t e d t h e c e l l s f r o m g r o w t h i n h i b i t i o n b y 6 - M P ( F ig . 2 A ) .

I n c o n t r a s t , w h e n 5 0 p M a d e n i n e o r i n o s i n e w a s a d d e d t o

c u l tu r e s o f H P R T B l y m p h o b l a s t s i n c u b a t e d w i t h A Z , t h e

ICs0 f o r A Z i n t he s e c e l l s wa s r a i s e d a p p r ox i ma t e l y 10 - f o l d

I

~ O

o

6

3

4

U

2O

O o

~ ~.~ +IO0, /aM Ino l ine

0 ~ .

. o s o . o o o z o o

[ 6 - M P ] ~ M

I

B

0 + 50 ~M Ino l line

6

o3

(D

4

U 2

0

1 .0 5 I 0 50 I00 2

[ A Z ] ~ M

F i g . 2 . E f f e c t o f i n o s i n e o n t h e t o x i c i t y o f ( A ) 6 - M P a n d

( B ) A Z i n n o r m a l ( H P R T ) B l y m p h o b l a s t s ( M G L - 8 ) . T h e

e f fe c t o f e a c h d ru g a l o n e ( O - - - - - ~ ) i s c o m p a r e d t o t h e

e f f e c t o f t h e d r u g i n t h e p r e s e n c e o f 5 0 / A V I i n o s i n e

( O O ) a n d , f o r 6 - M P , 1 0 0 / A V l i n o s i n e ( A A ) .

T h e r e w a s l i t t l e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e e f f e c t s o f 1 0 0 / a M

i n o s i n e a n d 5 0 M i n o s i n e o n t h e t o x i c i ty o f A Z ( s e e

Ta b l e 1 ) .

( T a b l e 1 a n d F i g . 2 B ) . H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f e i t h e r

a d e n i n e o r i n o s i n e d i d n o t f u r t h e r a f f e c t t h e t o x ic i t y o f A Z .

I n t e r e s t i n g l y , t he I c5ov a l u e s o f A Z f o r t h e H P R T c el l l in e s

s u p p l e m e n t e d w i t h a d e n i n e o r i n o s i n e a re c o m p a r a b l e t o

t h o s e o b s e r v e d i n t h e H P R T - d e f i c i e n t c e l l l i n e s . N e i t h e r

a d e n i n e n o r i n o s i n e h a d a n y m a r k e d e f fe c t o n t h e g r o w t h

i n h i b i t i o n o f t h e H P R T - d e f i c i e n t l y m p h o b l a s t s b y A Z .

A l t h o u g h i n o s i n e c a n n o t b e u t i l i z e d a s a p u r i n e s o u r c e i n

H P R T - d e f i c i e n t c e l l s si n c e B l y m p h o b l a s t s l a c k t h e a b i l i ty

t o p h o s p h o r y l a t e i n o s i n e , a d e n i n e c a n b e u t i l i z e d i n t h e s e

c e l l s t o f o r m b o t h a d e n i n e a n d g u a n i n e n u c l e o t i d e s . I n

a d d i t i o n w e o b s e r v e d n o e f f e c t o n t h e t o x i ci t y o f A Z f r o m

t h e a d d i t i o n o f 5 0 g M a d e n i n e t o c u l t u r e s o f a n a d e n i n e

p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e ( E C 2 . 4 . 2 .7 ) - d e f ic i e n t h u m a n B

l y m p h o b l a s t c e l l l i n e w h i c h c a n n o t u t il i z e a d e n i n e t o f o r m

p u r i n e n u c l e o t i d e s . I n c o n t r a s t , 5 0 M i n o s i n e r a is e d t h e

t cs 0 o f A Z i n t h i s c e l l l i n e f r o m 2 . 7 t o 3 9 M . A g a i n , t h i s

i s c o m p a r a b l e t o t h e IC so o f A Z i n t h e H P R T - d e f i c i e n t c e l l

l i n es . I n t h e H P R T l y m p h o b l a s t s , s u p p l e m e n t i n g c u l tu r e s

w i t h a d e n o s i n e , d e o x y d e n o s i n e , d e o x y i n o s i n e o r h y p o -

x a n t h i n e h a d e f f e c t s o n t h e t o x i c i t y o f A Z w h i c h w e r e

s i m i l a r t o t h o s e o f a d e n i n e a n d i n o s i n e , a n d s u p p l e m e n t i n g

t h e c u l t u r e s w i t h g u a n o s i n e , d e o x y g u a n o s i n e o r x a n t h o s i n e

d i d n o t a p p e a r t o a f f e c t A Z t o x i c i t y ( d a t a n o t s h o w n ) .

A g a i n , o n l y s u p p l e m e n t a t i o n o f c u l t u r e s w i t h p u r i n e s w h i c h

c a n b e u t i l i z e d t o f o r m b o t h a d e n i n e a n d g u a n i n e n u c l e o -

t i d e s a f f e ct s t h e t o x i c i ty o f A Z . T h e s e r e s u l ts s u g g e s t t h a t

t h e a d d i t i o n o f p u r in e r e l ie v e s o n ly t h e H P R T - d e p e n d e n t

t o x i c it y o f A Z , p r e s u m a b l y b y c i r c u m v e n t i n g th e e f f e c t s

o f t h e i n h i b i t i o n o f

e n o v o

p u r i n e b i o s y n t h e s i s a n d / o r

n u c l e o t i d e i n t e r c o n v e r s i o n s . B e c a u s e a d d e d p u r i n e s d o n o t

p r o t e c t c e ll s f r o m t h e H P R T - i n d e p e n d e n t e f f e c ts o f A Z ,

t h e s e e f f e c ts a r e p r o b a b l y n o t d i r e c t ly d u e t o p u r i n e n u c l e o -

t i d e d e p l e t i o n .

T h e d a t a p r e s e n t e d i n t h i s c o m m u n i c a t i o n s t r o n g l y s u g -

g e s t t h a t t h e c y t o t o x i c i ty o f A Z , u n l i k e t h a t o f 6 - M P , i s , i n

p a r t , i n d e p e n d e n t o f H P R T a c ti v it y . T h e H P R T - i n d e -

p e n d e n t t o x i c i t y o f A Z w a s n o t a f f e c t e d b y p u r i n e s u p -

p l e m e n t a t i o n a n d i s t h e r e f o r e u n l i k e l y t o b e a s s o c i a t e d w i t h

t h e i n h i b i t i o n o f

e n o v o

p u r i n e b i o s y n t h e t i c o r i n t e r -

c o n v e r s io n p a t h w a y s . T h e c u l tu r e m e d i u m c o n c e n t r a ti o n s

a t w h i c h t h e H P R T - i n d e p e n d e n t t o x i c i t y o f A Z e x c e e d s

t h e r e p o r t e d t h e r a p e u t i c p l a s m a r a n g e c o n c e n t r a t i o n

( u p p e r l i m i t 7 M [ 2 ] ) f o r A Z i n m a n , a n d t h e r e l a t io n s h i p

o f o u r o b s e r v a t i o n s t o c l in i c a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n A Z a n d

6 - M P , r e m a i n u n e s t a b l i s h e d . A p r e l i m i n a r y r e p o r t o f o u r

r e s u l t s wa s p r e s e n t e d e a r l i e r [ 11 ] .

T a b l e 1 . E f f e ct s o f 6 -M P a n d A Z o n t h e g r o w t h o f n o r m a l ( H P R T ) a n d H P R T - d e f i c i e n t h u m a n l y m p h o b l a st s *

ICs0 ~M)

6 - M e r c a p t o p u r i n e A z a t h i o p r i n e

I n o s in e A d e n i n e I n o s in e

A d e n i n e

Ce l l l i ne 6 - MP 50 gM 100 gM 50 / z M 100 / ~M A Z 50 / a M 100 paM 50 ~ tM 100 ~M

B l y m p h o b l a s t s

M G L - 8 1 .8 1 79 > 1 8 0 > 1 8 0 > 1 8 0 3 . 7 3 5 4 2 5 4 3 8

G M - 1 3 0 1 . 7 > 1 8 0 > 1 8 0 > 1 8 0 > 1 8 0 4 . 0 4 0 3 4 4 3 4 1

H P R T - d e f i c i e n t B L y m p h o b l a s t s

G M - 4 6 7 > 2 0 0 . . . . 30 29 21 34 36

H D > 2 0 0 . . . . 32 31 2 6 46 33

T L y m p h o b l a s t s

M O L T - 4 1 . 0 1 75 > 2 0 0 > 2 0 0 > 2 0 0 7 . 6 3 6 4 1 4 0 3 4

* T h e t o x i c e ff e ct s o f A Z a n d 6 - M P o n n o r m a l ( H P R T ) a n d H P R T - d e f i c ie n t h u m a n l y m p h o b l a s t s w e r e e v a l u a t e d b y

d e t e r m i n i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f e a c h d r u g w h i c h c a u s e d a 5 0 % i n h i b i t i o n o f t h e g r o w t h o f t h e c u l t u r e o v e r a 3 - d a y

i n c u b a t i o n ( Ic s0 ) r e l a t iv e t o c o n t r o l c u l t u r e s ( n o d r u g a d d e d ) . T h e i n i ti a l c e ll d e n s i t y in t h e s e e x p e r i m e n t s w a s a p p r o x i m a t e l y

2 x 10~ c e l ls / m l . T h e g r o w t h o f e a c h c u l t u r e w a s d e t e r m i n e d b y s u b t r a c t i n g t h e i n i t i a l c e ll d e n s i t y f r o m t h e c e l l d e n s i t y

a f t e r a 3 - d a y i n c u b a t i o n a t 3 7 . E a c h I cs 0 v a l u e r e p r e s e n t s o n e t o e l e v e n d e t e r m i n a t i o n s .


4/4

S h o r t c o m m u n i c a t i o n s 2 6 95

T o s u m m a r i z e , t h e t o x i c ef f ec t s o f A Z a n d 6 - M P o n

n o r m a l H P R T +) a n d H P R T - d e f i c i e n t h u m a n ly m p h o b l a s t s

w e r e e v a l u a t e d . H P R T - d e f i c i e n t B ly m p h o b l a s t s w e r e

r e s i s t a n t t o 6 - M P a t c o n c e n t r a t i o n s a s h i g h a s 1 0 0 - f o l d

g r e a t e r t h a n f o r H P R T + ly m p h o b l a s t s . I n c o n t r a s t , t h e I Cs0

v a l u es f o r A Z i n t h e H P R T - d e f i c ie n t l y m p h o b l a s t s w e r e

l e s s t h a n 1 0 - fo l d g r e a t e r t h a n f o r t h e H P R T + B c e l l l i n es .

T h e d a t a s u g g e s t t h a t t h e g r o w t h - i n h i b i t o r y e f f e c ts o f A Z ,

u n l i k e t h o s e o f 6 - M P , a r e , i n p a r t , i n d e p e n d e n t o f p h o s -

p h o r i b o s y l a ti o n b y H P R T . W e a l so f o u n d t h a t s u p-

p l e m e n t i n g t h e c e l ls w i t h a p u r i n e w h i c h c o u l d b e u t i l iz e d

t o f o r m b o t h a d e n i n e a n d g u a n i n e n u c l e o t i d e s p r e v e n t e d

t h e F I P R T - d e p e n d e n t i n h i b it i o n o f l y m p h o b l a s t g ro w t h ,

p r e s u m a b l y b y a l l e v i a t in g t h e e f f e c t s o f t h e i n h i b i t i o n o f de

novo p u r i n e b i o s y n t h e s i s . H o w e v e r , a d d e d p u r i n e s d i d n o t

p r o t e c t t h e c e l l s f r o m t h e H P R T - i n d e p e n d e n t e f f e c t s o f

A Z , w h i c h s u g g e s ts t h a t t h e s e e f f e c ts a r e n o t d u e t o p u r i n e

n u c l e o t i d e d e p l e t i o n .

Departments of lnternal Medicine

and Biological Chemistry

University of Michigan Medical

Center

Ann Arbor MI and

Veterans Administration Medical

Center

Ann Arbor MI U.S.A.

A. PAULETFE DALKE

IRENE S. KAZMERS

WILLIAM N. KELLEY*

R E F E R E N E S

1 . A . W i n k e l s t e i n , J. Immunopharmac. 1 , 4 2 9 1 9 7 9 ) .

2 . G . B . E l i o n a n d G . H . H i t c h i n g s , i n Handbook of

Experimental Pharmacology E d s . A . C . S a r t o r e l l i a n d

D. G . J ohn s ) , Vo l . 38 , p . 404 . Sp r i ng e r , Be r l i n 1975 ) .

3 . J . Ba c h , The Mode of Action of lmmunosuppressive

Agents

C h a p . 3 , p . 9 3 . N o r t h H o l l a n d P u b l i s h i n g ,

A m s t e r d a m 1 9 7 5 ) .

4 . G . B . E l i on , Fedn Proc. 2 6 , 3 9 8 1 9 6 7 ) .

5 . R . W . B r o c k m a n , Cancer Res. 20, 643 1960) .

6 . W . N . K e l l e y , F . M . R o s e n b l o o m a n d J . E . S e e g m i l l e r,

J. clin. Invest. 46, 1581 1967) .

7 . J . L . M e d z i h r a d s k y , R . P . H o l l o w e l l a n d G . B . E l i o n ,

J. Immunopharmac. 3, 1 1981) .

8 . J . L . M e d z i h r a d s k y , C . K l e i n a n d G . B . E l i o n , J .

lmmun. 129, 145 198 2).

9 . J . M . W i l s o n , B . W . B a u g h e r , P . M . M a t t e s , P . E .

D a d d o n a a n d W . N . K e l l ey , J. clin. Invest. 69, 706

1982) .

1 0. A . L . M u r r a y , D . C . E l i o t a n d M . R . A t k i n s o n , Prog.

nucleic. Acid Res. molec. Biol. 10, 87 1970) .

11 . P . Da l k e , I . S . Ka z m e r s a nd W . N . Ke l l e y ,

J. clin.

Chem. Clin. Biochem. 20, 362 1982) .

* A d d r e s s c o r r e s p o n d e n c e t o : W i l l i a m N . K e l l e y , M . D . ,

P r o f e s so r a n d C h a i r m a n , D e p a r t m e n t o f I n t e rn a l M e d i -

c i n e , U n i v e r s it y o f M i c h ig a n M e d i c a l C e n t e r , A n n A r b o r ,

MI 48109.

Documents

Actividad de Hprt 2