8/2/2019 acido urico antioxidante

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P r o c . N a t L A c a d . S c i . U S AV o l . 7 8 , N o . 1 1 , p p . 6 8 5 8 - 6 8 6 2 , N o v e m b e r 1 9 8 1B i o c h e m i s t r y

U r i c a c i d p r o v i d e s a n a n t i o x i d a n t d e f e n s e i n humans a g a i n s to x i d a n t - a n d r a d i c a l - c a u s e d a g i n g a n d c a n c e r : A h y p o t h e s i s( l i p i d p e r o x i d a t i o n / a s c o r b i c a c i d / p r i m a t e e v o l u t i o n / e r y t h r o c y t e a g i n g )B R U C E N . A M ES * , R I C H A R D C AT H C AR T * , E L I Z A B E T H S C H W I E R S * , AND PAUL H O C H S T E I N t* D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , B e r k e l e y , C a l i f o r n i a 9 4 7 2 0 ; a n d t I n s t i t u t e f o r T o x i c o l o g y a n d D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o fS o u t h e r n C a l i f o r n i a , L o s A n g e l e s , C a l i f o r n i a 9 0 0 3 3C o n t r i b u t e d b y B r u c e N . A m e s , A u g u s t 2 7 , 1 9 8 1A B S T R A C T D u r i n g p r i m a t e e v o l u t i o n , a m a j o r f a c t o r i nl e n g t h e n i n g l i f e - s p a n a n d d e c r e a s i n g a g e - s p e c i f i c c a n c e r r a t e sm a y h a v e b e e n i m p r o v e d p r o t e c t i v e m e c h a n i s m s a g a i n s t o x y g e nr a d i c a l s . We p r o p o s e t h a t o n e o f t h e s e p r o t e c t i v e s y s t e m s i s p l a s m au r i c a c i d , t h e l e v e l o f w h i c h i n c r e a s e d m a r k e d l y d u r i n g p r i m a t ee v o l u t i o n a s a c o n s e q u e n c e o f a s e r i e s o f m u t a t i o n s . U r i c a c i d i sa p o w e r f u l a n t i o x i d a n t a n d i s a s c a v e n g e r o f s i n g l e t o x y g e n a n dr a d i c a l s . We s h o w t h a t , a t p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s , u r a t e r e -d u c e s t h e o x o - h e m e o x i d a n t f o r m e d b y p e r o x i d e r e a c t i o n w i t hh e m o g l o b i n , p r o t e c t s e r y t h r o c y t e g h o s t s a g a i n s t l i p i d p e r o x i d a -t i o n , a n d p r o t e c t s e r y t h r o c y t e s f r o m p e r o x i d a t i v e d a m a g e l e a d i n gt o l y s i s . U r a t e i s a b o u t a s e f f e c t i v e a n a n t i o x i d a n t a s a s c o r b a t e i nt h e s e e x p e r i m e n t s . U r a t e i s m u c h m o r e e a s i l y o x i d i z e d t h a n d e o x y -n u c l e o s i d e s b y s i n g l e t o x y g e n a n d i s d e s t r o y e d b y h y d r o x y l r a d i c a l sa t a c o m p a r a b l e r a t e . T h e p l a s m a u r a t e l e v e l i n h u m a n s ( a b o u t 3 0 0I L M ) i s c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n t h e a s c o r b a t e l e v e l , m a k i n g i t o n eo f t h e m a j o r a n t i o x i d a n t s i n h u m a n s . P r e v i o u s w o r k o n u r a t e r e -p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e s u p p o r t s o u r e x p e r i m e n t s a n d i n t e r p r e -t a t i o n s , a l t h o u g h t h e f i n d i n g s w e r e n o t d i s c u s s e d i n a p h y s i o l o g i c a lc o n t e x t .T o x i c i t y b y o x y g e n r a d i c a l s h a s b e e n s u g g e s t e d a s a m a j o r c a u s eo f c a n c e r , h e a r t d i s e a s e , a n d a g i n g ( 1 - 1 3 ) . O x y g e n r a d i c a l s a n do t h e r o x i d a n t s a p p e a r t o b e t o x i c i n l a r g e p a r t b e c a u s e t h e y i n i -t i a t e t h e c h a i n r e a c t i o n o f l i p i d p e r o x i d a t i o n ( r a n c i d i t y ) . L i p i dp e r o x i d a t i o n g e n e r a t e s v a r i o u s r e a c t i v e s p e c i e s - s u c h a s r a d i -c a l s , h y d r o p e r o x i d e s , a l d e h y d e s , a n d e p o x i d e s - w i t h t h e c a -p a b i l i t y o f c a u s i n g d a m a g e t o D N A , R N A , p r o t e i n s , c e l l u l a rm e m b r a n e s , a n d c e l l u l a r o r g a n i z a t i o n . A e r o b i c o r g a n i s m s h a v ea n a r r a y o f p r o t e c t i v e m e c h a n i s m s b o t h f o r p r e v e n t i n g t h e f o r -m a t i o n o f o x i d a n t s a n d l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d f o r r e p a i r i n g o x -i d a t i v e d a m a g e . T h e p r o t e c t i v e s y s t e m s i n c l u d e e n z y m e s , s u c ha s s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( 1 2 ) a n d t h e s e l e n i u m - c o n t a i n i n g g l u -t a t h i o n e p e r o x i d a s e ( 9 , 1 0 ) , a n d a n t i o x i d a n t s a n d r a d i c a l s c a v -e n g e r s , s u c h a s a - t o c o p h e r o l ( v i t a m i n E ) a n d a - c a r o t e n e i n t h el i p i d p o r t i o n o f t h e c e l l a n d g l u t a t h i o n e a n d a s c o r b i c a c i d i n t h ea q u e o u s p h a s e ( 9 , 1 0 ) . T h e s e p r o t e c t i v e m e c h a n i s m s a r e n o wb e i n g r e c o g n i z e d a s a n t i c a r c i n o g e n i c a n d , i n s o m e c a s e s , e v e na s l i f e - s p a n e x t e n d i n g ( 5 - 7 ) .A m a r k e d i n c r e a s e i n l i f e - s p a n h a s o c c u r r e d i n h u m a n e v o -l u t i o n d u r i n g t h e d e s c e n t f r o m p r o s i m i a n s o v e r t h e p a s t 6 0m i l l i o n y e a r s ( 4 ) . A t t h e s a m e t i m e a n e n o r m o u s d e c r e a s e i n t h ea g e - s p e c i f i c c a n c e r r a t e h a s o c c u r r e d i n h u m a n s c o m p a r e d t os h o r t - l i v e d m a m m a l s ( 1 4 , 1 5 ) . I t s e e m s l i k e l y t h a t a m a j o r f a c t o ri n l e n g t h e n i n g l i f e - s p a n a n d d e c r e a s i n g a g e - s p e c i f i c c a n c e r r a t e sm a y h a v e b e e n t h e e v o l u t i o n o f e f f e c t i v e p r o t e c t i v e m e c h a n i s m sa g a i n s t o x y g e n r a d i c a l s ( 2 - 7 , 1 0 ) . We p r o p o s e t h a t o n e s u c hm e c h a n i s m i s h i g h p l a s m a u r i c a c i d .

MATERIALS A ND M E T HOD S' y - R a y I r r a d i a t i o n . S o l u t i o n s o f s u b s t r a t e ( 0 . 3 m M ) i n p o t a s -s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( 2 0 mM, pH 7 . 4 ) w e r e p u r g e d w i t h 2 ,

N 2 , o r N 2 0 , s e a l e d , a n d i r r a d i a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t ha 6 0 C o y - r a y s o u r c e [ 1 2 . 7 k r a d s / m i n ( 1 2 7 g r a y s / m i n ) ] .S i n g l e t O x y g e n O x i d a t i o n . S e n s i t o x I I ( C h e m i c a l D y n a m i c s ,S o u t h P l a i n f i e l d , N J ) , a p o l y m e r - s u p p o r t e d R o s e B e n g a l , w a sa d d e d a t 1 0 m g / m l t o s o l u t i o n s o f s u b s t r a t e ( 0 . 3 mM i n 2 5 mMp o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 6 ) . T h e s e w e r e t h e n p u r g e dw i t h o x y g e n a n d i r r a d i a t e d f o r v a r i o u s t i m e s i n a n i c e b a t h b ya t u n g s t e n / h a l o g e n l a m p ( S y l v a n i a ) a t a d i s t a n c e o f 1 5 c m . A l i -q u o t s w e r e r e m o v e d a t v a r i o u s t i m e s , a n d t h e S e n s i t o x w a s r e -m o v e d b y r a p i d f i l t r a t i o n o f t h e s a m p l e t h r o u g h a M i l l i p o r ef i l t e r .C h r o m a t o g r a p h i c A n a l y s i s . A f t e r t r e a t m e n t w i t h e i t h e r s i n -g l e t o x y g e n o r y - i r r a d i a t i o n , t h e a m o u n t o f u n r e a c t e d s u b s t r a t ew a s d e t e r m i n e d b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h yo n a S u p e l c o ( B e l l e f o n t e , P A ) 5 - , u m C 1 8 c o l u m n . T h e c h r o -m a t o g r a p h i c e q u i p m e n t c o n s i s t e d o f W a t e r s 4 4 0 d e t e c t o r ( 2 5 4n m ) , M - 6 0 0 0 A p u m p s , WISP 7 1 0 B , a n d 7 2 0 S y s t e m C o n t r o l l e ra n d a S p e c t r a - P h y s i c s S P 4 0 2 0 a n d S P 4 0 0 0 i n t e g r a t o r . C h r o -m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n s w e r e : p u m p A , 2 5 mM K P O 4 , pH 7 . 0 ;p u m p B , a c e t o n i t r i l e / H 2 0 , 4 0 : 6 0 ( v o l / v o l ) ; f l o w r a t e , 1 . 5 m l /m i n ; 2 m i n i s o c r a t i c , 0 - 1 0 % B 1 5 m i n , a n d 1 0 - 3 0 % B i n 7 m i n .U r a t e ( o r a s c o r b a t e ) c h r o m a t o g r a p h y w a s i s o c r a t i c : t h e s o l u t i o n sw e r e a n 8 0 : 2 0 m i x t u r e ( 9 5 : 5 f o r a s c o r b a t e ) o f 5 mM t e t r a b u t y l -a m m o n i u m p h o s p h a t e ( p H 7 . 5 ) a n d 4 0 : 6 0 a c e t o n i t r i l e / w a t e r a t2 m / m i n .H e m e - C a t a l y z e d P e r o x i d a t i o n . We f o l l o w e d t h e p r o c e d u r eo f H o w e l l a n d W y n g a a r d e n ( 1 6 ) . E x p e r i m e n t s w e r e d o n e w i t hh e m a t i n o r h e m o g l o b i n a t pH 7 . 4 a n d 3 mM t - b u t y l h y d r o -p e r o x i d e o r h y d r o g e n p e r o x i d e . O x i d a t i o n o f 5 0 , u M u r a t e o ra s c o r b a t e w a s f o l l o w e d a t 2 9 2 nm a n d a t 2 6 0 n m , r e s p e c t i v e l y .H e m o l y s i s o f Human E r y t h r o c y t e s . V e n o u s b l o o d ( 2 0 - 6 0m l ) w a s o b t a i n e d f r o m h e a l t h y d o n o r s a n d d r a w n i n t o h e p a r i n( 1 4 USP u n i t s / m l ) . T h e b l o o d w a s c e n t r i f u g e d a n d t h e p l a s m aa n d b u f f y c o a t s w e r e r e m o v e d . T h e c e l l s w e r e w a s h e d t h r e et i m e s , e a c h w i t h a n e q u a l v o l u m e o f i s o t o n i c b u f f e r ( 1 0 mMp h o s p h a t e , pH 7 . 4 / 1 5 2 mM N a C l ) a n d r e s u s p e n d e d i n t h i sb u f f e r t o g i v e a 5% h e m a t o c r i t . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n e d2 . 5 m l o f t h e r e s u s p e n d e d c e l l s a n d v a r i o u s a d d i t i o n s ( i n i s o t o n i cb u f f e r ) i n a t o t a l v o l u m e o f 5 m l . T h e m i x t u r e w a s t h e n i n c u b a t e da t 3 7 C i n a 5 0 - m l E r l e n m e y e r f l a s k i n a s h a k i n g w a t e r b a t h .A t t h e a p p r o p r i a t e t i m e , a 0 . 5 - m l a l i q u o t o f t h e m i x t u r e w a sr e m o v e d a n d a d d e d t o 4 . 5 m l o f i s o t o n i c b u f f e r c o n t a i n i n g 1 0 0mg o f NaCN a n d 3 0 0 mg o f K 3 F e ( C N ) 6 p e r l i t e r . A f t e r c e n -t r i f u g a t i o n ( 1 5 0 0 x g , 1 0 m i n ) t o r e m o v e u n l y s e d c e l l s , t h e a b -s o r b a n c e o f t h e s u p e r n a t a n t a t 5 4 0 nm w a s d e t e r m i n e d . A 1 0 0 %h e m o l y s i s v a l u e w a s d e t e r m i n e d f r o m a n i d e n t i c a l r e a c t i o n a l i -q u o t p l a c e d i n t h e c y a n i d e s o l u t i o n w i t h o u t t h e s a l i n e . I n i n i t i a l

6 8 5 8

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e -m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

8/2/2019 acido urico antioxidante

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B i o c h e m i s t r y : A m e s e t a l .e x p e r i m e n t s , t h e b l o o d wa s d r a w n i n t o 0 . 0 4 M c i t r i c a c i d / 0 . 0 7M s o d i u m c i t r a t e / 0 . 1 2 M g l u c o s e .L i p i d P e r o x i d a t i o n i n M e m b r a n e G h o s t s . W a s h e d e r y t h r o -c y t e s , p r e p a r e d a s a b o v e , were l y s e d i n 1 0 mM p h o s p h a t e b u f -f e r , p H 7 . 4 . T h e m e m b r a n e s were p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n( 2 0 , 0 0 0 x g , 4 0 m i n ) a n d t h e n w a s h e d t w i c e i n 1 0 mM p h o s -p h a t e b u f f e r : t h e m e m b r a n e s s t i l l c o n t a i n e d c o n s i d e r a b l eh e m o g l o b i n a n d were r e d . P e r o x i d a t i o n o f t h e m e m b r a n eg h o s t s wa s c a r r i e d o u t i n 1 m l t o t a l v o l u m e , c o n t a i n i n g 3 mgp r o t e i n . A d d i t i o n s were m a d e i n p h o s p h a t e b u f f e r a n d r e a c t i o n swere f o r 2 0 m i n a t 3 7 C i n a s h a k i n g w a t e r b a t h a n d weres t o p p e d b y a d d i t i o n o f 0 . 5 m l o f 2 0 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . A f t e rc e n t r i f u g a t i o n , t h e s u p e r n a t a n t wa s m i x e d w i t h 2 / 3 v o l o f 0 . 6 7 %t h i o b a r b i t u r i c a c i d a n d h e a t e d f o r 1 5 m i n a t 1 0 0 C ( 1 7 ) . T h ea b s o r b a n c e wa s m e a s u r e d a t 5 3 5 nm.

RESULTSU r a t e as a S i n g l e t O x y g e n S c a v e n g e r . U r a t e h a s b e e n f o u n dt o b e an e x c e l l e n t scavenger o f s i n g l e t oxygen ( 1 8 ) ( F i g . 1 . ) . We

c h o s e a c o n c e n t r a t i o n o f u r a t e ( 3 0 0 , u M ) a n d a pH ( 7 . 6 ) t h a t area p p r o x i m a t e l y t h o s e o f p l a s m a . F i g . 1 s h o w s t h a t , a f t e r 5 m i no f exposure t o s i n g l e t o x y g e n , 5 5 % o f t h e u r a t e a n d 2 0 % o f t h ea s c o r b a t e were d e s t r o y e d , c o m p a r e d t o o n l y a b o u t 1 0 % o f t h ed e o x y n u a n o s i n e a n d n e g l i g i b l e a m o u n t s o f t h e o t h e r d e o x y n u -c l e o s i d e s .S e n s i t i v i t y o f U r a t e t o H y d r o x y l R a d i c a l s G e n e r a t e d D u r i n gV - I r r a d i a t i o n . We f o u n d u r i c a c i d a n d t h e f o u r d e o x y n u c l e o -s i d e s t o b e d e s t r o y e d b y h y d r o x y l r a d i c a l s a t a b o u t t h e s a m er a t e . S a m p l e s were i r r a d i a t e d f o r v a r i o u s t i m e s i n t h e presenceo f n i t r o u s o x i d e . [ N i t r o u s o x i d e e n h a n c e s t h e y i e l d o f h y d r o x y lr a d i c a l s i n i r r a d i a t e d w a t e r ( 9 ) . ] T h e d o s e o f r a d i a t i o n r e q u i r e dt o d e s t r o y 5 0 % o f d e o x y c y t i d i n e or uric a c i d wa s 4 0 k r a d s o r 6 0k r a d s , r e s p e c t i v e l y . S i m i l a r r e s u l t s were o b t a i n e d w h e n s a m p l e swere i r r a d i a t e d i n e i t h e r oxygen or n i t r o g e n .O x i d a t i o n o f U r a t e b y H e m o g l o b i n a n d P e r o x i d e . H o w e l la n d W y n g a a r d e n ( 1 6 ) s h o w e d t h a t u r a t e wa s - o x i d i z e d b y h y -d r o g e n p e r o x i d e i n t h e presence o f h e m a t i n or m e t h e m o g l o b i n .We c o n f i r m e d t h i s r e s u l t ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) a n d , i na d d i t i o n , f o u n d t h a t u r a t e ( 5 0 % o x i d a t i o n i n 4 m i n ) i s a b o u t a se f f e c t i v e a s a s c o r b a t e ( 5 0 % o x i d a t i o n i n 1 . 5 m i n ) i n t h i s s y s t e m( p H 7 . 4 , h e m a t i n , h y d r o g e n p e r o x i d e ) . t - B u t y l h y d r o p e r o x i d ea n d h y d r o g e n p e r o x i d e were f o u n d t o g i v e c o m p a r a b l e r e s u l t s( 5 0 % o x i d a t i o n o f u r a t e i n 4 m i n ) . T h e f o u r d e o x y n u c l e o s i d e ss h o w e d n o d e s t r u c t i o n ( < 1 % ) u n d e r c o n d i t i o n s s u c h t h a t >80%o f t h e u r a t e wa s d e s t r o y e d .

1 0 0

' 0 1 0 'E

10 20 -30 40 50 60~Reaction Time (m i n ute s)

F I G . 1 . D e s t r u c t i o n o f s u b s t r a t e s ( a l l a t 3 0 0 A M ) b y s i n g l e t oxygen.T h e o x i d a t i o n wa s d e p e n d e n t on oxygen, l i g h t , a n d S e n s i t o x , w i t h nom e a s u r a b l e d e s t r u c t i o n o b s e r v e d i n t h e a b s e n c e o f a n y o f t h e s e , e x c e p tw i t h a s c o r b a t e w h i c h , even i n t h e a b s e n c e o f S e n s i t o x , wa s d e s t r o y e da t a b o u t 3 0 % o f t h e r a t e s h o w n ( t h i s b l a n k h a s b e e n s u b t r a c t e d ) .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 8 ( 1 9 8 1 ) 6 8 5 9T a b l e 1 . L i p i d p e r o x i d a t i o n o f e r y t h r o c y t e m e m b r a n e g h o s t s

E x p . 1 E x p . 2A d d i t i o n s A % A %

t - B u t y l h y d r o p e r o x i d e a t 1 mM 0 . 2 6 2 1 0 0 0 . 4 8 4 1 0 0+ U r a t e a t 30MM 0 . 1 1 5 4 45 0 , u M 0 . 3 5 4 7 36 0 , u M 0 . 0 6 0 2 31 0 0 L M 0 . 1 1 9 2 5

1 2 0 p M 0 . 0 2 4 9+ A s c o r b a t e a t 3 0 u M 0 . 0 9 2 3 55 0 u t M 0 . 1 4 4 3 06 0 j u M 0 . 0 4 4 1 71 0 0 P u M 0 . 0 6 4 1 31 2 0 I . t M 0 . 0 1 8 7+ G l u t a t h i o n e a t 3 0 p M 0 . 1 8 2 6 91 2 0 , u M 0 . 1 2 2 4 7D a t a s h o w n a r e a b s o r b a n c e a t 5 3 5 nm i n t h e t h i o b a r b i t u r a t e a s s a yf o r l i p i d p e r o x i d a t i o n p r o d u c t s ( m a l o n d i a l d e h y d e a n d i t s p r e c u r s o r s ) .

T h e b l a n k ( n o t - b u t y l h y d r o p e r o x i d e ) h a d n e g l i g i b l e a b s o r b a n c e . T h et h r e e r e d u c i n g a g e n t s w e r e s h o w n n o t t o i n t e r f e r e w i t h c o l o r f o r m a t i o no f a m a l o n d i a l d e h y d e s t a n d a r d . I n 1 0 e x p e r i m e n t s , u s i n g b l o o d f r o md i f f e r e n t i n d i v i d u a l s , s o m e v a r i a t i o n w a s s e e n i n t h e a m o u n t o f l i p i dp e r o x i d a t i o n : w i t h o n l y t - b u t y l h y d r o p e r o x i d e , t h e m e a n ( S E M ) a v -e r a g e A w a s 0 . 4 7 0 . 0 9 . T h e r e w a s a l s o v a r i a t i o n i n t h e d e c r e a s ec a u s e d b y u r a t e ( e . g . , 2 5 - 7 5 % a t 1 0 0 p M u r a t e ) . A l l e x p e r i m e n t s u t i -l i z e d b l o o d - c o l l e c t e d i n c i t r a t e / g l u c o s e b u t s i m i l a r r e s u l t s w e r e o b -t a i n e d l a t e r w i t h b l o o d , c o l l e c t e d i n h e p a r i n .U r a t e P r o t e c t s E r y t h r o c y t e M e m b r a n e G h o s t s f r o m P e r -o x i d a t i o n . T a b l e 1 s h o w s t h e p r o t e c t i o n b y u r a t e a g a i n s t p e r -o x i d a t i o n o f e r y t h r o c y t e m e m b r a n e g h o s t s i n d u c e d b y t - b u t y l -h y d r o p e r o x i d e . U r a t e a n d a s c o r b a t e w e r e e f f e c t i v e i n p r e v e n t i n gl i p i d p e r o x i d a t i o n a t c o n c e n t r a t i o n s c o n s i d e r a b l y b e l o w t h o s e

n o r m a l l y f o u n d i n p l a s m a . G l u t a t h i o n e w a s a l s o p a r t i a l l y e f f e c -t i v e , a l t h o u g h g l u t a t h i o n e i s n o t n o r m a l l y f r e e i n p l a s m a a t as i g n i f i c a n t c o n c e n t r a t i o n ( 1 9 ) . T h e f o u r d e o x y n u c l e o s i d e s a n dg l u c o s e ( s e e b e l o w ) w e r e i n e f f e c t i v e i n i n h i b i t i n g l i p i d p e r o x i -d a t i o n ( > 9 5 % ) a t t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n a s u r a t e ( 1 0 0 A M ) .E x p e r i m e n t s w i t h w e l l - w a s h e d e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s , c o n -t a i n i n g n o v i s i b l e h e m o g l o b i n , s h o w e d l i t t l e l i p i d p e r o x i d a t i o na n d i n d i c a t e t h a t t h e h e m o g l o b i n i s e s s e n t i a l .S i m i l a r e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g 1 0 0 , u M c u m e n eh y d r o p e r o x i d e ( a d d e d a s a s o n i c a t e d s u s p e n s i o n i n b u f f e r ) . I nt h e s e e x p e r i m e n t s , u r a t e a l s o p r o t e c t e d t h e m e m b r a n e s ( 5 0 %i n h i b i t i o n a t 2 0 , u M ) w h e r e a s u r a c i l , g u a n i n e , a n d h y p o x a n t h i n ea t 1 0 0 i M d i d n o t p r o t e c t a p p r e c i a b l y . We p r e f e r r e d t o u s e t -b u t y i h y d r o p e r o x i d e a s a m o d e l i n i t i a t o r b e c a u s e i t i s s o l u b l e i nw a t e r a t t h e c o n c e n t r a t i o n s u s e d .U r a t e P r o t e c t s I n t a c t E r y t h r o c y t e s f r o m L y s i s b y P e r o x i d e s .T a b l e 2 s h o w s t h a t e v e n s m a l l a m o u n t s ( 1 0 A M ) o f u r a t e a n da s c o r b a t e p r o t e c t i n t a c t e r y t h r o c y t e s f r o m l y s i s b y t - b u t y l h y d r o -p e r o x i d e . T h e h y d r o p e r o x i d e i n i t i a t e s l i p i d p e r o x i d a t i o n i n t h em e m b r a n e w h i c h r e s u l t s i n c e l l d a m a g e ( 2 0 ) . E x p e r i m e n t s w i t hc u m e n e h y d r o p e r o x i d e s h o w e d s i m i l a r p r o t e c t i o n b y u r a t e . Wea l s o i n i t i a t e d e r y t h r o c y t e l y s i s b y x a n t h i n e o x i d a s e a n d a c e t a l -d e h y d e a n d f o u n d t h a t u r a t e p r o t e c t s , a s r e p o r t e d b y K e l l o g ga n d F r i d o v i c h ( 2 1 ) .I n e x p e r i m e n t s u s i n g b l o o d t h a t w a s c o l l e c t e d i n c i t r a t e /g l u c o s e ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) , w e o b s e r v e d r e l a t i v e l yl i t t l e l y s i s o f t h e e r y t h r o c y t e s i n d u c e d b y t h e h y d r o p e r o x i d e .T h i s w a s f o u n d t o b e d u e t o t h e p r e s e n c e o f t h e g l u c o s e , a n dw e t h e n s t a n d a r d i z e d o u r b l o o d c o l l e c t i o n b y u s i n g o n l y h e p -a r i n . I t s e e m s l i k e l y t h a t e r y t h r o c y t e g l u c o s e m e t a b o l i s m r e s u l t si n g l u t a t h i o n e r e g e n e r a t i o n ( 2 2 ) ( s e e D i s c u s s i o n ) w h i c h i n t u r np r e v e n t s p e r o x i d a t i o n . T h i s i n t e r p r e t a t i o n i s s u p p o r t e d b y t h ef o l l o w i n g e x p e r i m e n t w i t h N - e t h y l m a l e i m i d e , w h i c h i n a c t i v a t e s

8/2/2019 acido urico antioxidante

3/5

6 8 6 0 B i o c h e m i s t r y : A m e s e t a l .T a b l e 2 . E f f e c t o f u r a t e a n d a s c o r b a t e o n t - b u t y l h y d r o p e r o x i d e -i n d u c e d h e m o l y s i s o f h u m a n e r y t h r o c y t e s

. % h e m o l y s i sA d d i t i o n s 4 h r 7 h r 2 0 h r

N o n e 0 0 3 1t - B u t y l h y d r o p e r o x i d e a t ' 2 0 0 u M 5 1 1 4 + 1 1 0 0 2+ U r a t e a t 1 0 M 0 4 1 1 7 25 0 1 M 0 0 5 11 0 0 A M 0 0 6 1+ A s c o r b a t e a t 1 0 , u M 0 2 1 9 25 0 M M 0 0 5 11 0 0 P L M 0 0 4 1

V a l u e s a r e t h e m e a n ( S E M ) o f t r i p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s f r o m t w oe x p e r i m e n t s : 1 0 0 % = 0 . 4 A a t 5 4 0 n m . I n a s e p a r a t e e x p e r i m e n t , p r o -t e c t i o n w a s p r o v i d e d b y g l u c o s e ( 3 % h e m o l y s i s a t 1 0 0 1 A M ) a n d b l o o dp l a s m a ( 4 % h e m o l y s i s a t 5 0 % b l o o d p l a s m a ) . C i t r a t e , a l l a n t o i n , a d -e n i n e , x a n t h i n e , h y p o x a n t h i n e , e r g o t h i o n e i n e , a n d d i m e t h y l f u r a n d i dn o t p r o t e c t a t 1 0 0 g M ( > 9 0 % h e m o l y s i s ) .g l u t a t h i o n e . B l o o d w a s c o l l e c t e d i n m e d i a w i t h g l u c o s e ( c i t r a t e /g l u c o s e ) a n d w i t h o u t g l u c o s e ( h e p a r i n ) . T h e e r y t h r o c y t e s w e r et h e n w a s h e d i n t h e u s u a l m a n n e r e x c e p t t h a t a p o r t i o n o f e a c hs a m p l e w a s w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d i n i s o t o n i c b u f f e r c o n -t a i n i n g N - e t h y l m a l e i m i d e ( 0 . 2 5 m M ) . E r y t h r o c y t e l y s i s w a s c a r -r i e d o u t w i t h 3 0 0 A M t - b u t y l h y d r o p e r o x i d e . T h e p r e p a r a t i o n sf r o m b l o o d c o l l e c t e d i n h e p a r i n ( w i t h o r w i t h o u t N - e t h y l m a l -e i m i d e ) a n d t h o s e f r o m b l o o d c o l l e c t e d i n c i t r a t e / g l u c o s e a n dw a s h e d i n i s o t o n i c b u f f e r p l u s N - e t h y l m a l e i m i d e s h o w e d 7 5 %l y s i s . T h e b l o o d c o l l e c t e d i n c i t r a t e / g l u c o s e a n d w a s h e d w i t hi s o t o n i c b u f f e r a l o n e s h o w e d o n l y 1 0 % l y s i s . E r y t h r o c y t e s w e r ea l s o p r o t e c t e d a g a i n s t l y s i s w h e n g l u c o s e w a s a d d e d t o t h e i n -c u b a t i o n m i x t u r e s ( l e g e n d t o T a b l e 2 ) .

DISCUSSIONP r o t e c t i v e R o l e o f U r a t e i n B l o o d . V a r i o u s h e m e - c o n t a i n i n gp r o t e i n s h a v e b e e n s h o w n t o c a t a l y z e o x i d a t i o n o f u r i c a c i d b yh y d r o g e n p e r o x i d e o r a n o r g a n i c p e r o x i d e ; t h e s e i n c l u d e h e m o -g l o b i n , m y e l o p e r o x i d a s e , c a t a l a s e , c y t o c h r o m e c ( 1 6 , . 2 3 ) , a n dp r o s t a g l a n d i n h y d r o p e r o x i d a s e ( 2 4 ) .O n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t o f t h e s e r e a c t i o n s i n h u m a n s i sl i k e l y t o b e t h a t i n v o l v i n g h e m o g l o b i n . A h u m a n c o n t a i n s a b o u t7 5 0 g o f h e m o g l o b i n , a n d i t h a s b e e n e s t i m a t e d t h a t 3% o f t h i s( 2 2 g ) u n d e r g o e s a u t o x i d a t i o n e a c h d a y t o y i e l d m e t h e m o g l o b i nw i t h t h e c o n c o m i t a n t p r o d u c t i o n o f s u p e r o x i d e ( 2 5 ) . T h e l a r g eq u a n t i t y o f s u p e r o x i d e p r o d u c e d i s d i s m u t a t e d b y s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t o h y d r o g e n p e r o x i d e a n d 0 2 . T h e h y d r o g e n p e r -o x i d e , o r p o s s i b l y l i p i d h y d r o p e r o x i d e s , m a y r e a c t w i t h t h e i r o ni n t h e h e m o g l o b i n t o f o r m o x o - h e m e o x i d a n t s ( 1 6 ) , w h i c h m a yb e s i m i l a r t o c o m p o u n d I o r c o m p o u n d I I o f c a t a l a s e a n d p e r -o x i d a s e s ( 2 6 ) . T h es e o x o - h e m e o x i d a n t s m a y b e i m p o r t a n t i n i -t i a t o r s o f l i p i d p e r o x i d a t i o n i n e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s . L i p i dp e r o x i d a t i o n i s l i k e l y t o b e a m a j o r f a c t o r i n e r y t h r o c y t e a g i n g( 2 0 ) . We p o s t u l a t e t h a t o n e r o l e o f u r a t e i s t o h e l p s u p p r e s s l i p i dp e r o x i d a t i o n i n e r y t h r o c y t e s . O t h e r f a c t o r s m a y i n f l u e n c e t h eh e m o g l o b i n r e a c t i o n w i t h p e r o x i d e s - e . g . , m e t h e m o g l o b i n r e -d u c t a s e ( N A D H ) k e e p s t h e s t e a d y - s t a t e l e v e l o f m e t h e m o g l o b i ni n h u m a n s b e l o w 1 % , a n d g l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e d e s t r o y s p e r -o x i d e s ( 2 2 ) . O u r e x p e r i m e n t s w i t h . N - e t h y l m a l e i m i d e a n d g l u -c o s e [ w h i c h p r o v i d e s NADPH f o r g l u t a t h i o n e r e g e n e r a t i o n ( 2 0 ) ]e m p h a s i z e t h e i m p o r t a n c e o f g l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e . O x y g e nr a d i c a l s a r e a l s o g e n e r a t e d i n t i s s u e s b y n o r m a l m e t a b o l i s m( e . g . , b y m a c r o p h a g e s ) ( 1 0 ) .U r a t e i s p r e s u m a b l y p r o t e c t i n g n o t o n l y e r y t h r o c y t e s . b u t a l s ot h e D N A - c o n t a i n i n g a n d l o n g e r - l i v e d T a n d B l y m p h o c y t e s a n dm a c r o p h a g e s . I n a d d i t i o n , u r a t e m a y a l s o p r o t e c t o t h e r . t i s s u e s

b e c a u s e t h e y p r e s u m a b l y a r e i n e q u i l i b r i u m w i t h t h e b l o o du r a t e . A t r a n s p o r t s y s t e m h a s b e e n d e s c r i b e d t h a t t r a n s p o r t su r a t e o r h y p o x a n t h i n e i n t o h u m a n e r y t h r o c y t e s ( 2 7 , 2 8 ) , a n d t h i sm a y e n s u r e t h e a v a i l a b i l i t y o f u r a t e a t i n t r a c e l l u l a r s i t e s .U r a t e a s a S c a v e n g e r o f S i n g l e t O x y g e n . S i n g l e t o x y g e n i sa n e f f e c t i v e i n i t i a t o r o f l i p i d p e r o x i d a t i o n ( 2 9 ) . I t i s f o r m e d i nv i t r o o r p h y s i o l o g i c a l l y b y t h e e n e r g y o f l i g h t b e i n g a b s o r b e db y d y e s a n d t h e n t r a n s m i t t e d t o d i o x y g e n ( 2 9 ) - e . g . , w h e n l i g h tr e a c h e s b l o o d p i g m e n t s ( 3 0 ) . I t c a n a l s o b e f o r m e d b y t h e d e -c o m p o s i t i o n o f e n d o p e r o x i d e s ( 2 9 ) . U r a t e a n d , t o a l e s s e r e x t e n t ,a s c o r b a t e s c a v e n g e s i n g l e t o x y g e n v e r y e f f e c t i v e l y c o m p a r e d t ot h e d e o x y n u c l e o s i d e s ( F i g . 1 ) . A s c o r b a t e , h o w e v e r , i s m u c hm o r e e a s i l y a u t o x i d i z e d t h a n u r a t e ( l e g e n d t o F i g . 1 ) . S i m o n a n dV a n V u n a k i s ( 1 8 ) r e p o r t e d t h a t u r i c a c i d w a s m o r e e a s i l y o x i -d i z e d t h a n g u a n i n e i n t h e p r e s e n c e o f d y e p l u s l i g h t . A l t h o u g hu r a t e i s a n e x c e l l e n t s i n g l e t o x y g e n s c a v e n g e r , t h e t o x i c o l o g i c a li m p o r t a n c e o f s i n g l e t o x y g e n r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d .U r a t e a s a S c a v e n g e r o f H y d r o x y l R a d i c a l s . R a d i a t i o n i sk n o w n t o g e n e r a t e t h e e x t r e m e l y r e a c t i v e h y d r o x y l r a d i c a l f r o mw a t e r , a n d t h i s i s t h o u g h t t o b e t h e m a i n s p e c i e s c a u s i n g DNAd a m a g e , m e m b r a n e p e r o x i d a t i o n , a n d o t h e r c e l l d a m a g e ( 9 ) .A l t h o u g h w e s h o w t h a t t h e s e n s i t i v i t i e s o f t h e d e o x y n u c l e o s i d e sa n d u r a t e t o o x i d a t i o n b y h y d r o x y l r a d i c a l s a r e c o m p a r a b l e ,u r a t e , b e c a u s e o f i t s h i g h c o n c e n t r a t i o n , m i g h t b e i m p o r t a n t a sa h y d r o x y l r a d i c a l s c a v e n g e r i n v i v o . H ow e l l a n d W y n g a a r d e n( 1 6 ) s h o w e d t h a t h y d r o x y l r a d i c a l s g e n e r a t e d b y h y d r o g e n p e r -o x i d e p l u s e i t h e r F e S O 4 o r U V l i g h t a r e s c a v e n g e d b y u r a t e .U r a t e a s a S c a v e n g e r o f O x o - H e m e O x i d a n t s . H e m e i s t h ea c t i v e s i t e c a t a l y s t f o r m a n y o x i d a t i v e e n z y m e s , s u c h a s c y t o -c h r o m e P 4 5 0 a n d c a t a l a s e . T h e e x t r e m e l y r e a c t i v e o x o - h e m ei n t e r m e d i a t e s , s u c h a s c o m p o u n d I a n d I I o f c a t a l a s e o r p e r -o x i d a s e , a r e t h o u g h t t o b e F e I V = O a n d F e v = O s p e c i e s . A l -t h o u g h t h e r o l e o f h e m o g l o b i n i s t h a t o f a n o x y g e n c a r r i e r , i tc a n b e o x i d i z e d t o a n o n s p e c i f i c o x i d a s e w h i c h m a y b e d e l e t e -r i o u s f o r t h e o r g a n i s m b e c a u s e i t i s a c a t a l y s t f o r i n i t i a t i n g l i p i dp e r o x i d a t i o n .H o w e l l a n d W y n g a a r d e n ( 1 6 ) s h o w e d t h a t m e t h e m o g l o b i no r h e m a t i n i n t h e p r e s e n c e o f h y d r o g e n p e r o x i d e o x i d i z e d u r i ca c i d t o a l l a n t o i n . T h e y p o s t u l a t e d t h a t t h i s w a s i n i t i a t e d b y ao n e - e l e c t r o n o x i d a t i o n o f u r a t e t o a u r a t e r a d i c a l b y a " h e m e -p e r o x i d e " c o m p o u n d . We r e p e a t e d t h e i r e x p e r i m e n t s a n df o u n d , i n a d d i t i o n , t h a t a s c o r b a t e i s a b o u t a s e f f e c t i v e a s u r a t ea n d t h a t t - b u t y l h y d r o p e r o x i d e g a v e r e s u l t s c o m p a r a b l e t o t h o s ew i t h h y d r o g e n p e r o x i d e . H o w e l l a n d W y n g a a r d e n i n t e r p r e t e dt h e i r r e s u l t s t o m e a n t h a t h y d r o x y l r a d i c a l s w e r e n o t i n v o l v e di n t h e i n i t i a l o x i d a t i o n o f u r a t e . O u r e x p e r i m e n t s s u p p o r t t h i sc o n c l u s i o n . T h u s , w e s h o w t h a t o x o - h e m e i s d i f f e r e n t i n i t sp r o p e r t i e s f r o m f r e e h y d r o x y l r a d i c a l s i n t h a t t h e f o r m e r o x i d i z e su r a t e e x t r e m e l y w e l l a n d s h o w s n o d e t e c t a b l e o x i d a t i o n o f p y -r i m i d i n e d e o x y n u c l e o s i d e s w h e r e a s h y d r o x y l r a d i c a l s ( f r o m r a -d i a t i o n ) o x i d i z e b o t h e q u a l l y w e l l . O u r f i n d i n g t h a t h y d r o g e np e r o x i d e a n d t - b u t y l h y d r o p e r o x i d e a r e e q u a l l y e f f e c t i v e i n t h eH o w e l l - W y n g a a r d e n s y s t e m i s a l s o c o n s i s t e n t w i t h t h i s i n t e r -p r e t a t i o n . T h e l a c k o f o x i d a t i o n o f d e o x y g u a n o s i n e , w h i c h i so x i d i z e d b y s i n g l e t o x y g e n ( s e e F i g . 1 ) , i s a l s o e v i d e n c e a g a i n s ts i n g l e t o x y g e n b e i n g i n v o l v e d i n t h e h e m e s y s t e m . A h e m a t i n /c u m e n e h y d r o p e r o x i d e s y s t e m c a n o x i d i z e N - h y d r o x y - 2 - a c e -t y l a m i n o f l u o r e n e , t h u s m i m i c k i n g c y t o c h r o m e P 4 5 0 ( 3 1 ) .H a w c o e t a l . ( 3 2 ) a l s o i n v e s t i g a t e d a l i p i d p e r o x i d e / h e m a t i ns y s t e m a n d c o n c l u d e d t h a t s i n g l e t o x y g e n w a s a p r o d u c t , a l -t h o u g h t h e y c o u l d f i n d n o e v i d e n c e f o r t h i s w i t h a c u m e n e h y -d r o p e r o x i d e / h e m a t i n s y s t e m . R o s e n a n d R a u c k m a n ( 3 3 ) i n v e s -t i g a t e d t h e c u m e n e h y d r o p e r o x i d e / h e m a t i n s y s t e m w i t h s p i nt r a p p i n g r e a g e n t s a n d p o s t u l a t e d t h a t t h e a c t i v e o x i d a n t c o u l db e a c u m e n e h y d r o p e r o x y r a d i c a l .We h a v e u s e d e r y t h r o c y t e m e m b r a n e g h o s t s a s a m o d e l s y s -

P r o c . N a d A c a d . S c i . U S A 7 8 ( 1 9 8 1 )

8/2/2019 acido urico antioxidante

4/5

B i o c h e m i s t r y : A m e s e t a l .t e m f o r t h e d e l e t e r i o u s e f f e c t s o f o x o - h e m e i n h e m o g l o b i n , a n dw e h a v e s h o w n t h a t u r a t e p r o t e c t s f r o m t h i s o x i d a n t . T h i s m o d e lc o m b i n e s t h e m e t h e m o g l o b i n / p e r o x i d e a c t i v i t y w i t h t h e e r y t h -r o c y t e m e m b r a n e a n d s u g g e s t s t h a t t h e o x o - h e m e o x i d a n t c a nc a u s e m e m b r a n e p e r o x i d a t i o n w i t h i t s c o n s e q u e n t c y t o t o x i ca c t i v i t y . T a b l e 1 s h o w s t h a t h e m o g l o b i n a n d p e r o x i d e b o t h a r en e c e s s a r y f o r l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d t h a t u r a t e a n d a s c o r b a t ep r o t e c t .We s h o w i n T a b l e 2 t h a t l y s i s i n i n t a c t e r y t h r o c y t e s i s c a u s e db y p e r o x i d e a n d t h a t l o w l e v e l s ( 1 0 1 M ) o f u r a t e a n d a s c o r b a t ep r o t e c t . I n i n t a c t e r y t h r o c y t e s , l i p i d p e r o x i d a t i o n l e a d s t o h e m -o l y s i s ( 2 0 ) . I n e x p e r i m e n t s s i m i l a r t o t h o s e s h o w n i n T a b l e 2 ,w e h a v e o b s e r v e d a m a r k e d a n d p o s s i b l y i n t e r e s t n g v a r i a b i l i t yi n h e m o l y s i s w i t h b l o o d f r o m d i f f e r e n t i n d i v i d u a l s . A s i m i l a ro b s e r v a t i o n h a s b e e n r e p o r t e d b y K e l l o g g a n d F r i d o v i c h ( 2 1 )w h o a l s o s h o w e d t h a t 0 . 5 mM u r a t e , a m o n g a n u m b e r o f o t h e rs u b s t a n c e s , i n h i b i t s h e m o l y s i s o f e r y t h r o c y t e s c a u s e d b y t h ex a n t h i n e o x i d a s e / a c e t a l d e h y d e s y s t e m . T h e y p o s t u l a t e d t h a tt h i s w a s d u e t o t h e s c a v e n g i n g o f s i n g l e t o x y g e n o r h y d r o x y l

r a d i c a l s .A l l a n t o i n i s a m a j o r e n d p r o d u c t o f u r a t e o x i d a t i o n i n t h ep e r o x i d e / h e m e s y s t e m ( 1 6 , 2 3 ) . B e c a u s e h u m a n s l a c k u r i c a s e ,w h i c h c o n v e r t s u r a t e t o a l l a n t o i n , t h e a l l a n t o i n l e v e l s i n u r i n e( a b o u t 2 5 m g / d a y ) ( 3 4 ) a n d i n b l o o d ( a b o u t 2 5 m g p e r p e r s o n )( 3 5 ) m a y b e o f c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t a s a n i n d i c a t o r o f u r a t e o x -i d a t i o n i n v i v o ( 3 4 ) . T h e s o u r c e o f t h i s a l l a n t o i n h a s b e e n a t -t r i b u t e d m o s t l y t o f e c a l b r e a k d o w n o f u r a t e ( 3 4 ) , b u t w e b e l i e v et h i s s h o u l d b e r e e x a m i n e d .U r a t e a n d A s c o r b a t e B l o o d L e v e l s D u r i n g P r i m a t e E v o l u -t i o n . C o m p a r e d t o t h e b l o o d l e v e l o f a b o u t 5 mg o f u r a t e p e r1 0 0 m l i n m a n , c l o s e t o t h e m a x i m u m s o l u b i l i t y , m o s t m a m m a l s ,s u c h a s t h e r a t o r p r o s i m i a n s , h a v e l e v e l s < 0 . 5 m g / 1 0 0 m l ( 3 6 ) .T h e i n c r e a s e i n u r a t e l e v e l o c c u r r e d d u r i n g t h e c o u r s e o f a b o u t6 0 m i l l i o n y e a r s o f e v o l u t i o n a n d c o i n c i d e d w i t h a l a r g e i n c r e a s ei n b o t h l i f e - s p a n a n d b r a i n s i z e . A n u m b e r o f m u t a t i o n s a p p e a rt o h a v e b e e n n e c e s s a r y f o r t h e i n c r e a s e d b l o o d u r a t e . M o n k e y sh a v e a l a b i l e u r i c a s e a n d m a n y , b u t n o t a l l , h a v e h i g h e r u r a t el e v e l s t h a n p r o s i m i a n s b u t l e s s t h a n t h e l o n g e r - l i v e d a p e s ( 3 6 ) .H u m a n s ( w i t h a n e v e n l o n g e r l i f e - s p a n a n d h i g h e r u r a t e l e v e l s )a n d a p e s h a v e c o m p l e t e l y l o s t u r i c a s e . I n a d d i t i o n , h u m a n s a c -t i v e l y r e a b s o r b u r a t e f r o m t h e i r k i d n e y s . I n m a n , >90% o f t h eu r a t e i s r e a b s o r b e d f r o m t h e k i d n e y ( 3 7 ) . T h e d e v e l o p m e n t o fa n e f f i c i e n t r e a b s o r p t i o n m e c h a n i s m a p p e a r s a l s o t o h a v e b e e nc r i t i c a l f o r h i g h p l a s m a u r a t e l e v e l s , b e c a u s e h u m a n m u t a n t sw h o d o n o t a c t i v e l y r e a b s o r b u r a t e f r o m t h e k i d n e y h a v e a b -n o r m a l l y l o w u r a t e l e v e l s ( 0 . 2 - 1 . 8 m g / 1 0 0 m l ) ( 3 6 ) . I t a l s o m a yb e r e l e v a n t t h a t , i n t h e e v o l u t i o n o f p r o s i m i a n s t o m o n k e y s ,

a s c o r b a t e s y n t h e s i s w a s l o s t ( 3 8 ) . I t m a y b e t h a t a s c o r b a t e l o s sa n d u r a t e g a i n w e r e r e l a t e d t o e a c h o t h e r a n d t h a t u r a t e r e p l a c e ds o m e ( b u t n o t a l l ; s e e f o l l o w i n g s e c t i o n o n b r a i n ) a n d s u p p l e -m e n t e d o t h e r o f t h e a n t i o x i d a n t f u n c t i o n s o f a s c o r b a t e d u r i n gp r i m a t e e v o l u t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e u s e f u l n e s s o f a s c o r b a t ea s a n a n t i o x i d a n t m a y b e l i m i t e d b y i t s p r o p e n s i t y , u n d e r c e r t a i nc o n d i t i o n s , t o a u t o x i d i z e a n d g e n e r a t e o x y g e n r a d i c a l s ( e . g . , s e eF i g . 1 a n d r e f . 3 9 ) a n d m u t a g e n s ( 4 0 ) .F o r c o m p a r a t i v e p u r p o s e s t h e a n t i o x i d a n t l e v e l s o f v a r i o u ss u b s t a n c e s i n h u m a n p l a s m a a r e s h o w n i n T a b l e 3 ; t h e l e v e l o fu r a t e i s s e v e r a l f o l d h i g h e r t h a n t h a t o f a s c o r b a t e .U r a t e C o n c e n t r a t i o n i n B l o o d i n Humans I s D e t e r m i n e d b yS e v e r a l F a c t o r s . U r a t e i s f o r m e d f r o m p u r i n e d e g r a d a t i o n ; p a r to f t h e p u r i n e s come f r o m d i e t a r y s o u r c e s a n d p a r t f r o m b i o s y n -t h e s i s d e n o v o ( 3 7 ) . P l a s m a u r a t e v a l u e s d e c l i n e a b o u t 3 5 % w h e nh e a l t h y m a l e s a r e p l a c e d o n a p u r i n e - f r e e d i e t . P l a s m a u r a t e c a nb e i n c r e a s e d b y i n g e s t i o n o f y e a s t R N A , b u t n o t b y i n g e s t i o no f u r a t e , a n d l e v e l s i n man i n c r e a s e l i n e a r l y a t a b o u t 1 m g / 1 0 0m l p e r g o f RNA i n g e s t e d u p t o a l e v e l o f 8 g RNA p e r d a y ( 3 7 ) .

P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S A 7 8 ( 1 9 8 1 ) 6 8 6 1T a b l e 3 . P l a s m a c o n c e n t r a t i o n s o f n a t u r a l a n t i o x i d a n t s

m g /A n t i o x i d a n t 1 0 0 m l AMU r a t e :M a l e s ( 3 7 ) 2 . 6 - 7 . 5 1 6 0 - 4 5 0

P r e m e n o p a u s a l f e m a l e s ( 3 7 ) 2 . 0 - 5 . 7 1 2 0 - 3 4 0A s c o r b a t e :N o r m a l a d u l t ( 4 1 ) 0 . 9 0 . 4 5 0 2 0N o r m a l a d u l t ( 4 2 ) 0 . 7 - 2 . 5 4 0 - 1 4 0+ 2 - g s u p p l e m e n t ( 4 2 ) 1 . 7 - 2 . 8 1 0 0 - 1 6 0G l u t a t h i o n e ( 1 9 ) ( 6 5 ) * ( 2 1 0 0 ) *V i t a m i n E ( 4 3 ) 0 . 5 - 1 . 6 1 0 - 4 0C a r o t e n o i d s ( 4 3 ) 0 . 0 9 - 0 . 1 2 t 2 t* W h o l e b l o o d ; n o a p p r e c i a b l e a m o u n t i n p l a s m a .t C h i l d r e n ( m o l a r i t y c a l c u l a t e d a s a - c a r o t e n e ) .U r a t e i s p r e s e n t a s t h e s o d i u m s a l t i n p l a s m a a t pH 7 . 4 ( u r i c a c i dh a s a p K o f 5 . 8 ) . I t s c o n c e n t r a t i o n ( T a b l e 3 ) i n m a l e s a p p r o a c h e st h e m a x i m u m s o l u b i l i t y ( s a t u r a t i o n o c c u r s a t a b o u t 7 m g / 1 0 0m l ) a n d i t i s w e l l k n o w n t h a t p e o p l e w i t h h i g h e r l e v e l s t h a n t h i sa r e s u s c e p t i b l e t o g o u t ( 3 7 , 4 4 ) . T h e l e v e l i n m e n i s h i g h e r t h a nt h a t i n w o m e n ( T a b l e 3 ) . T h e l e v e l o f u r a t e i n w o m e n d e c r e a s e sd u r i n g t h e f i r s t p a r t o f p r e g n a n c y ( 4 5 ) a n d i n c r e a s e s a f t e r m e n -o p a u s e . T h e r e n a l r e a b s o r p t i o n a n d e x c r e t i o n r a t e s a r e o f c o n -s i d e r a b l e i m p o r t a n c e , a n d e x t r e m e e x a m p l e s o f t h i s a r e h u m a n sw i t h a n i n h e r i t e d d e f e c t i v e r e a b s o r p t i o n w h o h a v e l o w p l a s m au r a t e l e v e l s a n d w h o a r e d i s c u s s e d a b o v e . A b o u t 5 0 0 mg o f u r a t ei s e x c r e t e d p e r d a y p e r n o r m a l a d u l t m a l e ( 3 m m o l ) , a n d t h e p o o lo f u r a t e i s a b o u t 1 2 0 0 mg ( 3 7 ) .I n c r e a s e i n U r a t e L e v e l s i n R e s p o n s e t o O x i d a t i v e S t r e s s .S o m e h u m a n s ( t w o o f s i x s t u d i e d ) s h o w a m a r k e d i n c r e a s e i nl i p i d p e r o x i d a t i o n d u r i n g h e a v y e x e r c i s e ( 4 6 ) . I t i s k n o w n t h a t

u r a t e l e v e l s i n b l o o d i n c r e a s e w i t h e x e r c i s e , a n d w e i n t e r p r e tt h i s a s a p o s s i b l e p h y s i o l o g i c a l m e c h a n i s m t o h e l p c o p e w i t h t h ei n c r e a s e d o x i d a t i v e s t r e s s . T h e m e c h a n i s m o f t h i s i n c r e a s e i st h o u g h t t o b e t h e m a r k e d i n h i b i t i o n o f r e n a l c l e a r a n c e o f u r a t eb y t h e l a c t a t e a n d f h y d r o x y b u t y r a t e t h a t a c c u m u l a t e d u r i n ge x e r c i s e ( 4 7 ) . L e a d e x p o s u r e , h i g h a l c o h o l i n g e s t i o n , a n d o b e s -i t y a l l a r e a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d u r a t e l e v e l s i n m a n ( 4 7 ) .B e c a u s e e a c h o f t h e s e h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h l i p i d p e r o x i -d a t i o n ( 4 8 - 5 0 ) , t h e r e m a y b e a c a u s a l c o n n e c t i o n .U r a t e i n A l i m e n t a r y T r a c t . S a l i v a c o n t a i n s a l m o s t a s m u c hu r a t e a s d o e s b l o o d , a b o u t 3 m g / 1 0 0 m l i n m e n a n d 2 m g / 1 0 0m l i n w o m e n ( 3 4 ) . I t h a s b e e n e s t i m a t e d t h a t s e v e r a l h u n d r e dm i l l i g r a m s , a l m o s t o n e - t h i r d o f t h e u r a t e t u r n e d o v e r , e n t e r st h e a l i m e n t a r y t r a c t . T h e s a l i v a a c c o u n t s f o r a b o u t 4 0 m g / d a ya n d t h e r e s t i s f r o m g a s t r i c j u i c e ( 5 - 1 0 mg o f u r a t e p e r l i t e r ) ,b i l e , a n d p a n c r e a t i c a n d i n t e s t i n a l j u i c e s ( 3 4 ) . A s c o r b a t e i sk n o w n t o b e e f f e c t i v e a s a t r a p f o r n i t r o s a t i n g r a d i c a l s d e r i v e df r o m n i t r i t e ( 5 1 ) , w h i c h c a n f o r m c a r c i n o g e n i c n i t r o s a m i n e s f r o ms e c o n d a r y a m i n e s a t t h e a c i d i c pH o f t h e s t o m a c h , a n d u r a t em i g h t b e e q u a l l y e f f e c t i v e . U r a t e i s a n e f f e c t i v e a n t i o x i d a n t a ta l k a l i n e a n d n e u t r a l pH ( 5 2 ) a n d i n a c i d ; a s t a n d a r d m e t h o d f o ri t s a n a l y s i s i n v o l v e s i t s u s e a s a r e d u c t a n t o f t h e a c i d p h o s p h o -t u n g s t a t e c o m p l e x t o f o r m a b l u e c o l o r ( 5 3 ) .U r a t e a n d t h e B r a i n . T h e h u m a n b r a i n u t i l i z e s a b o u t o n e -f i f t h o f t h e o x y g e n t a k e n i n e a c h d a y ( 5 4 ) a n d c o n t a i n s l i p i d i cm a t e r i a l w i t h a h i g h c o n t e n t o f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s . T h u s ,a n t i o x i d a n t d e f e n s e m e c h a n i s m s a g a i n s t l i p i d p e r o x i d a t i o n - i nt h e b r a i n s h o u l d b e o f c r i t i c a l i m p o r t a n c e . T h e c o n c e n t r a t i o no f u r a t e i n t h e h u m a n c e r e b r o s p i n a l f l u i d i s a b o u t 0 . 3 m g / 1 0 0m l , o n l y 7% o f t h a t i n p l a s m a ( 2 8 , 5 5 ) . T h e a s c o r b a t e c o n c e n -t r a t i o n i n h u m a n c e r e b r o s p i n a l f l u i d , h o w e v e r , i s 1 . 8 m g / 1 0 0m l ( 5 6 ) , e v e n h i g h e r t h a n i t i s i n p l a s m a ( T a b l e 3 ) . T h u s , a s -c o r b a t e m a y b e a m o r e i m p o r t a n t a n t i o x i d a n t i n c e r e b r o s p i n a l

8/2/2019 acido urico antioxidante

5/5

P r o c . N a t d A c a d . S c i . USA 7 8 ( 1 9 8 1 )f l u i d t h a n u r a t e , a n d t h e r o l e o f u r a t e i n t h e b r a i n r e m a i n s t ob e e v a l u a t e d . A c o n n e c t i o n b e t w e e n p l a s m a u r a t e l e v e l a n d i n -t e l l i g e n c e ( 5 7 ) h a s b e e n p o s t u l a t e d , a s w e l l a s a c o n n e c t i o n b e -t w e e n RNA i n g e s t i o n ( w h i c h i n c r e a s e s u r a t e l e v e l s ) a n d mem-o r y ( 5 8 ) ; t h e s e a r e d i f f i c u l t a r e a s t o e v a l u a t e .H y p o u r i c e m i a . E v a l u a t i o n o f t h e m e d i c a l l i t e r a t u r e o n h y -p o u r i c e m i a a n d x a n t h i n u r i a a n d new s t u d i e s o n u r a t e l e v e l s a sr e l a t e d t o l o n g e v i t y , c a n c e r , a n d o t h e r d i s e a s e s may t e s t s o m eo f t h e i d e a s p r e s e n t e d h e r e .

We a r e i n d e b t e d t o D a n i e l H e r s h f o r r e v i e w i n g t h e l i t e r a t u r e o nu r a t e a n d e v o l u t i o n , t o T h o m a s P h i l b e r t a n d E d i t h Y a m a s a k i f o r s o m eo f t h e e x p e r i m e n t s o n u r a t e o x i d a t i o n b y r a d i a t i o n o r s i n g l e t o x y g e n ,t o S y l v i a M o n t e s t r u q u e a n d D a v i d C h a n f o r e x p e r i m e n t s o n e r y t h r o c y t el y s i s , t o R . M . Lemmon a n d F . N g o f o r h e l p w i t h y - i r r a d i a t i o n , a n d t oJ . E . S e e g m i l l e r a n d R . C u t l e r f o r h e l p f u l s u g g e s t i o n s . T h i s w o r k w a ss u p p o r t e d b y D e p a r t m e n t o f E n e r g y C o n t r a c t D E - A T 0 3 - 8 0 - E V 7 0 1 5 6t o B . N . A . , b y N a t i o n a l I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a l H e a l t h a n d S a f e t yC e nt e r G r a nt E S 0 1 8 9 6 , b y N a t i o n a l I n s t i t u t e o n A g in g G r an t A G 0 0 4 7 1t o P . H . , a n d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t a l H e a l t h a n d S a f e t yP o s t d o c t o r a l F e l l o w s h i p t o R . C .

1 . T o t t e r , J . R . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A 7 7 , 1 7 6 3 - 1 7 6 7 .2 . O b e r l e y , L . W . , O b e r l e y , T . D . & B u e t t n e r , G . R . ( 1 9 8 0 ) M e d .H y p o t h e s e s 6 , 2 4 9 - 2 6 8 .3 . T o l m a s o f f , J . M . , O n o , T . & C u t l e r , R . G . ( 1 9 8 0 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . U S A 7 7 , 2 7 7 7 - 2 7 8 1 .4 . C u t l e r , R . G . ( 1 9 7 6 ) I n t e r d i s c i p . T o p . G e r o n t o l . 9 , 8 3 - 1 3 3 .5 . S o h a l , R . S . & B u c h a n , P . B . ( 1 9 8 1 ) M e c h . A g e i n g D e v . 1 5 ,2 4 3 - 2 4 9 .6 . H a r m a n , D . ( 1 9 8 0 ) A g e 3 , 1 0 0 - 1 0 2 .7 . L e i b o v i t z , B . E . & S i e g e l , B . V . ( 1 9 8 0 ) J . G e r o n t o l . 3 5 , 4 5 .8 . A m e s , B . N . , H o l l s t e i n , M . C . & C a t h c a r t , R . ( 1 9 8 1 ) i n L i p i d P e r -o x i d e i n B i o l o g y a n d M e d i c i n e , e d . Y a g i , S . ( A c a d e m i c , Ne wY o r k ) , i n p r e s s .9 . P r y o r , W. A . ( 1 9 8 1 ) F r e e R a d i c a l s i n B i o l o g y ( A c a d e m i c , Ne wY o r k ) , V o l s . 1 - 5 .1 0 . H a l l i w e l l , B . ( 1 9 8 1 ) i n A g e P i g m e n t s , e d . S o h a l , R . S . ( E l s e v i e r ,A m s t e r d a m ) , 1 - 6 2 .1 1 . P i e t r o n i g r o , D . D . , J o n e s , W . B . G . , K a l t y , K . & D e m o p o u l o s ,H . B . ( 1 9 7 7 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 6 7 , 7 8 - 7 9 .1 2 . F r i d o v i c h , I . ( 1 9 7 8 ) S c i e n c e 2 0 1 , 8 7 5 - 8 8 0 .1 3 . T a p p e l , A . L . ( 1 9 7 3 ) F e d . P r o c . F e d . A m . S o c . E x p . B i o l . 3 2 ,1 8 7 0 - 1 8 7 4 .1 4 . P e t o , R . ( 1 9 7 8 ) i n O r i g i n s o f Human C a n c e r , e d s . H i a t t , H . H . ,W a t s o n , J . D . & W i n s t e n , J . A . ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ,C o l d S p r i n g H a r b o r , N Y ) , p p . 1 4 0 3 - 1 4 2 8 .1 5 . D i x , D . & C o h e n , P . ( 1 9 8 0 ) J . T h e o r . B i o l . 8 3 , 1 6 3 - 1 7 3 .1 6 . H o w e l l , R . R . & W y n g a a r d e n , J . B . ( 1 9 6 0 ) J . B i o l C h e m . 2 3 5 ,3 5 4 4 - 3 5 5 0 .1 7 . W i l b u r , K . M . , B e r n h e i m , F . & S h a p i r o , 0 . W . ( 1 9 4 9 ) A r c h .B i o c h e m . 2 4 , 3 0 5 - 3 1 3 .1 8 . S i m o n , M . I . & V a n V u n a k i s , H . ( 1 9 6 4 ) A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s .1 0 5 , 1 9 7 - 2 0 6 .1 9 . B e u t l e r , E . , D u r o n , 0 . & K e l l y , B . M . ( 1 9 6 3 ) J . L a b . C l i n . M e d .6 1 , 8 8 2 - 8 8 8 .2 0 . H o c h s t e i n , P . & J a i n , S . K . ( 1 9 8 1 ) F e d . P r o c . F e d . Am . S o c . E x p .B i o l . 4 0 , 1 8 3 - 1 8 9 .2 1 . K e l l o g g , E . W. & F r i d o v i c h , I . ( 1 9 7 7 ) J . B i o l C h e m . 2 5 2 ,6 7 2 1 - 6 7 2 8 .2 2 . C o h e n , G . & H o c h s t e i n , P . ( 1 9 6 3 ) B i o c h e m i s t r y 2 , 1 4 2 0 - 1 4 2 8 .2 3 . C a n e l l a k i s , E . S . , T u t t l e , A . L . & C o h e n P . P . ( 1 9 5 5 ) J . B i o lC h e m . 2 1 3 , 3 9 7 - 4 0 4 .2 4 . O g i n o , N . , Y a m a m o t o , S . , H a y a i s h i , 0 . & T o k u y a m a , T . ( 1 9 7 9 )B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 8 7 , 1 8 4 - 1 9 1 .

2 5 . C a r e l l , R . W . , K r i s n a m o o r t h y , R . & W i n t e r b o u r n , C . C . ( 1 9 7 9 )i n T h e R e d C e l l , e d . B r e w e r , G . J . ( L i s s , Ne w Y o r k ) , p p .6 8 7 - 6 9 5 .2 6 . G r o v e s , J . T . , H a n s h a l t e r , R . C . , N a k a m u r a , M . , N e m o , T . E .& E v a n s , B . J . ( 1 9 8 1 ) J . A m . C h e m . S o c . 1 0 3 , 2 8 8 4 - 2 8 8 6 .2 7 . L a s s e n , U . V . ( 1 9 6 1 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 3 , 5 5 7 - 5 6 9 .2 8 . M u l l e r , M . M . , K a i s e r , E . & S e e g m i l l e r , J . E . , e d s . ( 1 9 7 7 ) A d v .E x p . M e d . B i o l . 7 6 B .2 9 . F o o t e , C . S . ( 1 9 7 6 ) i n F r e e R a d i c a l s i n B i o l o g y , I I I , e d . P r y o r ,W . A . ( A c a d e m i c , Ne w Y o r k ) , p p . 8 5 - 1 3 3 .3 0 . L a m o l a , A . A . , Y a m a n e , T . & T r o z z o l o , A . M . ( 1 9 7 3 ) S c i e n c e 1 7 9 ,1 1 3 1 - 1 1 3 3 .3 1 . F l o y d , R . A . & S o o n g , R . N . ( 1 9 7 7 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m -m u n . 7 4 , 2 4 4 - 2 4 9 .3 2 . H a w c o , F . J . , O ' B r i e n , C . R . & O ' B r i e n , P . J . ( 1 9 7 7 ) B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 7 6 , 3 5 4 - 3 6 1 .3 3 . R o s e n , G . M . & R a u c k m a n , E . J . ( 1 9 8 0 ) M o l P h a r m a c o l 1 7 ,2 3 3 - 2 3 8 .3 4 . S o r e n s e n , L . B . ( 1 9 7 8 ) i n U r i c A c i d , H a n d b o o k o f E x p e r i m e n t a lP h a r m a c o l o g y , e d s . K e l l e y , W . N . & W e i n e r , I . M . ( S p r i n g e r ,New Y o r k ) , V o l . 5 1 , p p . 3 2 5 - 3 3 6 .3 5 . A r c h i b a l d , R . M . ( 1 9 4 4 ) J . B i o l C h e m . 1 5 6 , 1 2 1 - 1 4 2 .3 6 . R o c h - R a m e l , F . & P e t e r s , G . ( 1 9 7 8 ) i n U r i c A c i d , H a n d b o o k o fE x p e r i m e n t a l P h a r m a c o l o g y , e d s . K e l l e y , W . N . & W e i n e r , I .M . ( S p r i n g e r , New Y o r k ) , V o l . 5 1 , p p . 2 1 1 - 2 5 5 .3 7 . W y n g a a r d e n , J . B . & K e l l e y , W . N . ( 1 9 7 6 ) G o u t a n d H y p e r u r i -c e m i a ( G r u n e & S t r a t t o n , New Y o r k ) .3 8 . N a k a j i m a , Y . , S h a n t h r a , T . R . & B o u r n e , G . H . ( 1 9 6 9 ) H i s t o -c h e m i e 1 8 , 2 9 3 - 3 0 1 .3 9 . C a m p b e l l , G . D . , S t e i n b e r g , M . H . & B o w e r , J . D . ( 1 9 7 5 ) A n n .I n t e r n . M e d . 8 2 , 8 1 0 .4 0 . R o s i n , M . P . , S a n , R . H . C . & S t i c h , H . F . ( 1 9 8 0 ) C a n c e r L e t t .8 , 2 9 9 - 3 0 5 .4 1 . K o h , E . T . , C h i , M . S . & L o w e n s t e i n , F . W. ( 1 9 8 0 ) A m . J . C l i n .N u t r . 3 3 , 1 8 2 8 - 1 8 3 5 .4 2 . K o c h , P . , S i d l o i , M . & T o n k s , D . B . ( 1 9 8 0 ) C l i n . B i o c h e m . 1 3 ,7 3 - 7 7 .4 3 . F a r r e l l , P . M . , L e v i n e , S . L . , M u r p h e y , M . D . & A d a m s , A . J .( 1 9 7 8 ) A m . J . C l i n . N u t r . 3 1 , 1 7 2 0 - 1 7 2 6 .

4 4 . S e e g m i l l e r , J . E . ( 1 9 8 0 ) i n M e t a b o l i c C o n t r o l a n d D i s e a s e , e d s .B o n d y , P . K . & R o s e n b e r g , L . E . ( S a u n d e r s , P h i l a d e l p h i a ) , p p .7 7 7 - 9 3 7 .4 5 . B o y l e , J . A . , C a m p b e l l , S . , D u n c a n , A . M . , G r e i g , W. R . &B u c h a n a n , W. W . ( 1 9 6 6 ) J . C l i n . P a t h o l . 1 9 , 5 0 1 - 5 0 3 .4 6 . D i l l a r d , C . J . , L i t o v , R . E . , S a v i n , W. M . , D u m e l i n , E . E . &T a p p e l , A . L . ( 1 9 7 8 ) J . A p p l P h y s i o l . 4 5 , 9 2 7 - 9 3 2 .4 7 . E m m e r s o n , B . T . ( 1 9 7 8 ) i n U r i c A c i d , H a n d b o o k o f E x p e r i m e n t a lP h a r m a c o l o g y , e d s . K e l l e y , W . N . & W e i n e r , I . M . ( S p r i n g e r ,New Y o r k ) , V o l . 5 1 , p p . 2 8 7 - 3 2 4 .4 8 . L e v a n d e r , 0 . A . , M o r r i s , V . C . & F e r r e t t i , R . J . ( 1 9 7 7 ) J . N u t r .1 0 7 , 3 6 3 - 3 7 2 .4 9 . S i f r i , E . M . & H o e k s t r a , W. G . ( 1 9 7 8 ) F e d . P r o c . F e d . A m . S o c .E x p . B i o l . 3 7 , 7 5 7 .5 0 . L i t o v , R . E . , G e e , D . L . , D o w n e y , J . E . & T a p p e l , A . L . ( 1 9 8 1 )L i p i d s 1 6 , 5 2 - 5 7 .5 1 . K a l u s , W . H . & F i l b y , W . G . ( 1 9 8 0 ) E x p e r e n t i a 3 6 , 1 4 7 - 1 4 8 .5 2 . F r i d o v i c h , I . & H a n d l e r , P . ( 1 9 5 8 ) J . B i o l C h e m . 2 3 3 , 1 5 8 1 - 1 5 8 5 .5 3 . F o l i n , 0 . & D e n i s , W. ( 1 9 1 2 ) J . B i o l C h e m . 1 3 , 4 6 9 .5 4 . S o k o l o f f , L . ( 1 9 6 0 ) i n H a n d b o o k o f P h y s i o l o g y - S e c t i o n 1 ( N e u -r o p h y s i o l o g y ) , e d . F i e l d , J . ( A m . P h y s i o l . S o c . , W a s h i n g t o n ,D C ) , V o l . 3 , 1 8 4 3 - 1 8 6 4 .5 5 . R o s e n b l o o m , F . M . , K e l l e y , W. N . , M i l l e r , J . , H e n d e r s o n , J . F .& S e e g m i l l e r , J . E . ( 1 9 6 7 ) J . A m . M e d . A s s o c . 2 0 2 , 1 7 5 - 1 7 7 .5 6 . S p i e g e l - A d o l f , M . , W y c i s , H . T . & S p i e g e l , E . A . ( 1 9 5 1 ) J . N e r v .M e n t . D i s . 1 1 3 , 5 2 9 - 5 3 7 .5 7 . P a r k , K . - S . , I n o u y e , E . & A s a k a , A . ( 1 9 8 0 ) J a p . J . Hum. G e n e t .2 5 , 1 9 3 - 2 0 2 .5 8 . G l a s s m a n , E . ( 1 9 6 9 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 3 7 , 6 0 5 - 6 4 5 .

U 6 0 0 6 2 B i o c h e m i s t r y : A m e s e t a l .