AA910 NLM 6228 IT EN ver 120911 #910-17-DI-11

0459

TOTALE PAGINE 36

BIOLOGIA MOLECOLARE

ESTRAZIONE: AA077/C NON COMPRESA

HCV RNA Real Time

Quantitativo

NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l. UFFICI OPERATIVI: Viale delle Industrie, 3 – 20090 SETTALA MI (Italy) Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37 SITO INTERNET: www.nlm.it – E-MAIL: [email protected]

NLM 6228 VER 120911

AA910 50 TEST

MQI013-3

2 N.B. :testo modificato rispetto alla precedente versione :modified text compared with the previous version

UTILIZZO REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVO fornisce i reagenti necessari per la determinazione quantitativa del virus dell’Epatite C (HCV RNA) in campioni di siero umano mediante Real Time RT-PCR della regione 5’-UTR dell’RNA virale. Nel kit sono inclusi un pannello di quattro calibratori per la quantificazione della carica virale ed un Controllo Interno che, aggiunto ai campioni in fase di estrazione, permette di monitorare tutte le fasi del test. Questo prodotto va utilizzato in abbinamento al kit di estrazione di RNA codice NLM AA077/C “Qiamp Viral RNA Mini Kit” (da ordinare separatamente). L’RNA estratto è retrotrascritto e amplificato in un unico step di RT-PCR di circa 140 minuti, utilizzando lo strumento Rotor Gene (Corbett Research). REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVO è indicato, insieme agli altri parametri di laboratorio ed al quadro clinico dei pazienti, per la gestione clinica dei pazienti affetti da HCV. Il test può essere utilizzato per valutare la risposta virale al trattamento farmacologico, espresso dalla variazione della quantità di RNA virale nei campioni di siero. Il dispositivo non va utilizzato come test di screening per la presenza di HCV RNA negli emoderivati o come test di conferma per la diagnosi di infezione da HCV.

INTRODUZIONE Il virus dell’epatite C è la principale causa di epatite acuta di origine virale che, nella maggior parte dei casi, cronicizza ed evolve in cirrosi epatica ed epatocarcinoma1. HCV è causa anche di patologie extraepatiche2-4

Il genoma virale è costituito da RNA lineare a singola catena, con un solo open reading frame; in posizione 5’ presenta una regione altamente conservata e non tradotta (5’-UTR) che rappresenta il target per i test di biologia molecolare. La variabilità genetica della regione 5’-UTR è alla base della classificazione di HCV in diversi genotipi

.

5

Il virus si trasmette per via parenterale tramite contatto con sangue infetto. L’esposizione a sangue infetto può avvenire in seguito a trasfusioni anteriori al 1992, uso di siringhe infette, trapianto di organi solidi provenienti da donatori infetti, nascita da una madre infetta, esposizione in ambito lavorativo, pratiche sessuali a rischio

.

6

Dopo una prima esposizione ad HCV, la presenza dell’RNA virale nel sangue dei pazienti può essere rilevata nell’arco di 1-3 settimane; l’infezione acuta può avere un decorso severo ma raramente è fulminante

.

6

Sebbene l’infezione acuta sia generalmente asintomatica, nell’ 85% dei casi circa si trasforma in patologia cronica: la persistenza dell’infezione viene diagnosticata dalla presenza di HCV RNA nel sangue per almeno sei mesi

.

6

La determinazione della concentrazione di HCV RNA nei campioni di siero è un parametro importante nella gestione dell’epatite C cronica. Infatti mentre nessuna correlazione è stata osservata tra la carica virale assoluta e la severità o la progressione del danno epatico, la variazione della carica virale rappresenta un’importante indicazione sulla risposta dei pazienti al trattamento farmacologico antivirale

.

6

BIBLIOGRAFIA

.

1. Sarrazin C. Diagnosis of hepatitis C: update 2004. Journal of Gastroenterology and Hepatology (2004) 19, S88-S93

2. Johnson RJ, Gretch DR, Yamabe H et al. Membranoproliferative glomerulonephritis associated with hepatitis C virus infection. N Engl J med 1993; 328: 465-470.


3. Agnello V, Chung RT, Kaplan RM. A role for hepatitis C virus infection in Type II cryoglobulinemia. N Engl J Med 1992; 327: 1490-1495.

4. Andreone P, Zignego AL, Cursaro C et al. Prevalence of monoclonal gammopathies with hepatitis C virus infection . Ann Intern Med 1998; 129: 294-298

5. Zein NN. Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes. Clinical Microbiology Reviews, Apr. 2000, p. 223-235.

6. National Institutes of Health, Consensus Conference Statement. Management of hepatitis C: 2002.

PRINCIPIO DEL TEST Il Test HCV RNA QUANTITATIVO REAL TIME si basa su due processi:

1. estrazione dell’RNA virale 2. retrotrascrizione, amplificazione e rivelazione della sequenza bersaglio mediante

Real Time RT-PCR Il kit è provvisto di un Controllo Interno (CI) che, aggiunto a ciascun campione in fase di estrazione, permette di monitorare l’andamento di tutto il saggio. Viene inoltre fornito un pannello di quattro calibratori per determinare la quantità di HCV RNA presente nei campioni clinici.

1. Estrazione dell’RNA virale Per l’estrazione di HCV RNA e del Controllo Interno a partire da campioni di siero umano si deve utilizzare “Qiamp Viral RNA Mini Kit” (Qiagen), come indicato in metodica. 2. RT-PCR e Rivelazione

La regione 5’-UTR è stata scelta come target per l’identificazione del virus in campioni di siero umano poiché si tratta di una regione altamente conservata fra i diversi genotipi di HCV.

Target selezionato per l’amplificazione

Il Controllo Interno è un trascritto di RNA sintetico contenente una regione per l’appaiamento dei primers identica a quella della sequenza target di HCV ed una sequenza interna simile per lunghezza e composizione in basi alla sequenza di HCV ma contenente una regione riconosciuta da una sonda specifica che permette di differenziare l’amplificato del CI da quello di HCV. I calibratori vengono preparati mediante diluizioni seriali di un RNA sintetico ottenuto dalla trascrizione della regione 5’-UTR di HCV clonata. Pertanto i calibratori necessitano degli stessi primers e sonda utilizzati per la sequenza target di HCV per la fase di RT-PCR.

Successivamente alla fase di estrazione HCV RNA e CI sono retrotrascritti ed amplificati in un unico passaggio di RT-PCR, utilizzando enzimi e reagenti opportunamente selezionati (enzima di amplificazione abbinato: tappo di colore viola).

Retrotrascrizione ed amplificazione

La Real Time PCR permette la rivelazione delle sequenze target durante l’amplificazione stessa, utilizzando opportune sonde marcate con molecole fluorescenti.

Rivelazione


Nella mix di amplificazione ci sono due sonde specifiche, rispettivamente per il Controllo Interno e per la regione 5’-UTR di HCV, marcate ciascuna con un fluoroforo donatore ed un fluoroforo accettore. Il fluoroforo donatore è diverso per le due sonde: FAM per HCV e JOE per il CI. In presenza di una fonte luminosa, quando le sonde sono vicine, la fluorescenza emessa dal fluoroforo donatore è assorbita dal fluoroforo accettore. Durante l’amplificazione le sonde si appaiano ciascuna al proprio target specifico e successivamente i fluorofori donatore ed accettore risultano essere lontani, permettendo così che la fluorescenza del donatore possa essere rilevata alla sua lunghezza d’onda specifica: in questo modo l’amplificazione dell’RNA virale e del CI può essere monitorata nel corso della reazione.

Il Rotor Gene comprende in un singolo strumento un termociclatore per l’amplificazione del target ed un dispositivo per la rilevazione della fluorescenza durante i cicli di PCR. Un computer collegato al sistema raccoglie i dati di fluorescenza che vengono visualizzati in un grafico mediate un apposito software (Fig.1).

Figura 1: il dato grezzo è riportato in un grafico come valori di fluorescenza rispetto al numero di cicli.

Dopo la raccolta dei dati viene effettuata l’analisi. Il dato grezzo è normalizzato per correggere il segnale di fondo, successivamente viene impostato il livello di soglia in corrispondenza del quale viene analizzato il segnale di fluorescenza (Fig.2).

Figura 2: il dato normalizzato è riportato in un grafico in scala logaritmica come fluorescenza rispetto al numero di cicli.

Il numero di cicli necessari ad un campione per raggiungere la linea di soglia è chiamato CT (ciclo soglia) ed è in relazione alla quantità iniziale di RNA target: più alto è il titolo iniziale del target più precocemente si ha l’innalzamento del segnale di fluorescenza.


Se nella seduta vengono aggiunti degli standard con la rispettiva concentrazione, l’analisi della regressione lineare produce una curva standard in base alla quale si può determinare la concentrazione dei campioni incogniti. La curva standard viene generata automaticamente mediante un grafico che riporta il ciclo soglia (CT) in funzione della concentrazione iniziale degli standard (IU/ml) e la retta di interpolazione dei punti che rappresentano gli standard (Fig.3).

Figura 3: la curva standard è ottenuta mediante regressione lineare dei punti ottenuti riportando in grafico il Ct dei calibratori in funzione delle rispettive concentrazioni iniziali

COMPOSIZIONE DEL PRODOTTO (Conservare a –20°C) Mix 1 5 x 145 µl Tris-HCl KCl 0,01 % gelatina MgClPEG

2

dNTPs Mix 2 5 x 80 µl Primers Sonda per HCV Sonda per IC Transcrittasi Inversa (200 U/µl) 1 x 22 µl Tris HCl NaCl EDTA DTT Nonidet Glicerolo Inibitore Delle Ribonucleasi (40 U/µl) 1 x 22 µl HEPES-KOH KCl DTT Glicerolo


Controllo negativo 1 x 1000 µl Il controllo negativo contiene siero di origine umana testato per HIV-Ab ed RNA, HCV-Ab ed RNA, HBs-Ag e DNA ed è risultato negativo. Il controllo negativo deve essere estratto Controllo positivo 5 x 14 µl Inibitore delle ribonucleasi RNA sintetico Il controllo positivo è pronto all’uso per la fase di RT-PCR Controllo interno 5 x 70 µl Inibitore delle ribonucleasi RNA sintetico Il controllo interno deve essere aggiunto ad ogni campione ed al controllo negativo prima dell’estrazione. Calibratori A, B, C, D 5 x 14 µl Templato di HCV I calibratori sono pronti all’uso. La concentrazione di ciascun calibratore può variare da lotto a lotto del dispositivo, quindi è importante assegnare ai calibratori il rispettivo titolo riportato nell’etichetta interna alla scatola del lotto di appartenenza. Sulla stessa etichetta inoltre vengono riportati gli intervalli di CT dei 4 calibratori all’interno dei quali devono cadere i valori per potere essere accettati. Anche questi intervalli possono variare da lotto a lotto, quindi è importante per l’analisi delle sedute fare riferimento ai corretti intervalli di CT.

MODULARITA'

Prima di utilizzare i calibratori accertarsi che tutta la soluzione sia sul fondo della provetta.

La modularità prevista è di 5 sedute: 10 campioni + 4 calibratori + 1 Controllo Negativo possono essere analizzati in ogni seduta. I reagenti per il Controllo Positivo non sono inclusi. Se la modularità non viene rispettata i reagenti potrebbero essere insufficienti per effettuare il numero di test previsto.

STABILITA’ E CONSERVAZIONE - Tutti i reagenti sono stabili sino alla data di scadenza riportata sull’etichetta se

conservati a -20°C. - Scongelare i reagenti in ghiaccio o a +4°C. - Dopo l’utilizzo, la Mix 1 e la Mix 2 sono stabili per un giorno se conservate a +4°C o

sino alla data di scadenza se tenute a -20°C. Questi reagenti possono essere ricongelati e scongelati una volta sola.

- La Mix 2 contiene i fluorofori FAM e JOE che sono fotosensibili: evitare prolungate esposizioni alla luce.

- La Master Mix deve essere utilizzata subito dopo la preparazione; dopo averla dispensata nelle provette da PCR, la Master Mix rimanente va scartata. Evitare prolungate esposizioni alla luce.

- Ciascuna provetta di Controllo Interno è sufficiente per 10 test; dopo l’utilizzo, il materiale rimanente va scartato.


- Il Controllo Positivo ed i Calibratori sono pronti all’uso per la RT-PCR: si raccomanda di scongelarli appena prima dell’uso per preservarne l’integrità e di aggiungere la Master Mix dopo aver dispensato i campioni nelle rispettive provette onde evitare contaminazioni.

RACCOLTA DEI CAMPIONI L’RNA virale viene isolato e purificato partendo da campioni di siero preparati entro 6 ore dal momento del prelievo. - Raccogliere i campioni di sangue secondo le comuni precauzioni per i prelievi di

sangue. - Utilizzare provette sterili prive di anticoagulanti oppure provette con setto separatore

per siero. Lasciare coagulare il sangue a temperatura ambiente e centrifugare a 1000-1500 x g per 10-15 minuti per separare il siero.

- Prelevare il quantitativo di siero necessario per l’estrazione dell’RNA (140 μl) sotto cappa sterile operando in modo da evitare la degradazione dell’RNA.

- Conservare i campioni a +4°C fino al momento dell’estrazione. Se non si procede immediatamente, si consiglia di porre i campioni a -20°C fino a 72 ore prima di congelarli a -80°C.

- Evitare ripetuti congelamenti/scongelamenti dei campioni di siero. - I campioni vanno manipolati seguendo le buone pratiche di laboratorio e devono

essere considerati come pericolosi in quanto potenziale fonte di infezione.

PRECAUZIONI - La procedura va eseguita utilizzando le buone pratiche di laboratorio ed i comuni

dispositivi di protezione individuale. - Tutti i consumabili (puntali e provette) devono essere sterili. I puntali devono avere il

filtro per evitare la contaminazione delle pipette. Utilizzare un nuovo puntale ogni volta che viene dispensato un volume.

- Eliminare il materiale monouso utilizzato, i guanti indossati e tutti i reattivi come rifiuti speciali.

- Il controllo negativo contiene siero di origine umana negativo per HIV-Ab ed RNA, HCV-Ab ed RNA, HBs-Ag e DNA. Tuttavia tale reagente deve essere maneggiato come campione potenzialmente infettivo, utilizzando i dispositivi di protezione individuale.

- Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree preposte all’esecuzione del test.

- Se vi è esposizione di occhi, cute o mucose alle sostanze utilizzate, lavare abbondantemente con acqua e contattare al più presto un medico.

- Non utilizzare reagenti scaduti. - Non mischiare reagenti di lotti diversi. - Prestare attenzione alla modularità del dispositivo (10 campioni + 1 Controllo Negativo

+ 4 Calibratori per 5 sedute). L’utilizzo del kit con una modularità inferiore determina l’insufficienza dei reagenti per poter eseguire tutti i test previsti.

- Si consiglia di eseguire l’analisi in tre zone separate: o Zona 1: pre-PCR (manipolazione dei campioni ed estrazione) o Zona 2: preparazione della Master Mix o Zona 3: post PCR (Real Time PCR)


- E’ opportuno assicurare una temperatura il più possibile costante ed uniforme in laboratorio ed evitare di posizionare gli strumenti in prossimità di fonti di calore/raffreddamento che possano comprometterne il corretto funzionamento.

MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI ZONA 1 Cappa a flusso laminare verticale Set dedicato di pipette a volume variabile Puntali con filtro e provette sterili e monouso Microcentrifuga ZONA 2 Cappa a flusso laminare verticale Set dedicato di pipette a volume variabile Puntali sterili con filtro Provette sterili da 0,2 ml con tappo piatto e parete sottile DNA polimerasi Hot Start (enzima di amplificazione abbinato: tappo di color viola) ZONA 3 RotorGene (Corbett Research) Rotor gene (software)

PROCEDIMENTO ESTRAZIONE DELL’RNA VIRALE (Sistema raccomandato: “Qiamp Viral RNA Mini kit” Qiagen, cod. NLM AA077/C) Per la preparazione, l’utilizzo e lo smaltimento dei reagenti fare riferimento alle istruzioni d’uso specifiche del kit Qiagen.

1. Preparare il numero di provette da 1,5 ml da centrifuga necessario per i campioni ed il controllo negativo da estrarre.

2. Dispensare 560 µl di Buffer AVL contenente l’RNA carrier in ciascuna provetta. 3. Aggiungere a ciascuna provetta 140 µl del rispettivo campione e 5 µl di Controllo

Interno; vortexare per circa 15 secondi. Per assicurare una lisi efficiente è essenziale che il campione sia ben miscelato con il Buffer AVL Evitare il contatto diretto tra il C.I. ed il campione di siero (l’RNA del C.I. potrebbe essere degradato dagli enzimi del campione non ancora inattivati).

4. Incubare a temperatura ambiente (15°-25°C) per 10 minuti. 10 minuti di incubazione a t.a. sono sufficienti a garantire una lisi completa del campione; incubazioni più lunghe non incidono sulla resa dell’RNA estratto. Gli agenti potenzialmente infettivi e le RNasi sono inattivati dal Buffer AVL.

5. Centrifugare brevemente le provette per rimuovere le gocce dall’interno del tappo. 6. Aggiungere 560 µl di etanolo (96-100%, non fornito) a ciascun campione, vortexare

per 15 sec. e centrifugare brevemente per rimuovere le gocce dall’interno del tappo. Contrassegnare le colonnine (fornite di provetta di raccolta) necessarie per il numero di campioni lisati da processare. Usare solo etanolo perché altri tipi di alcool possono portare ad una riduzione della resa e della purezza dell’RNA.

7. Per ogni campione dispensare 630 µl della soluzione del passaggio 6 nella rispettiva colonnina senza toccarne il bordo, chiudere il tappo e centrifugare a 6000 x g per 1 minuto. Porre ciascuna colonnina in una nuova provetta di raccolta


(fornita) ed eliminare quella contenente il materiale filtrato. Se la soluzione non è passata completamente attraverso la membrana, ricentrifugare fino a completo filtraggio.

8. Ripetere il passaggio 7. 9. Aprire con cautela le colonnine ed aggiungervi 500 µl di Buffer AW1. Centrifugare a

6000 x g per 1 minuto. Porre ciascuna colonnina in una nuova provetta di raccolta (fornita) ed eliminare quella contenente il materiale filtrato.

10. Aprire con cautela le colonnine ed aggiungervi 500 µl di Buffer AW2. Centrifugare a 20000 x g per 3-4 minuti.

11. Porre ciascuna colonnina in una nuova provetta di raccolta (non fornita) ed eseguire una centrifugazione a 20000 x g per 2 minuti in modo da eliminare eventuali tracce di etanolo che possono inibire la reazione di amplificazione.

12. Porre ciascuna colonnina in una provetta da 1,5 ml da centrifuga pulita (non fornita) ed eliminare quella contenente il materiale filtrato. Aprire con cautela le colonnine ed aggiungervi 60 µl di acqua sterile RNAsi-free ed incubare a temperatura ambiente per 1-2 minuti. Assicurarsi che l’acqua si depositi nel centro della colonnina, evitando di toccare la membrana col puntale.

13. Centrifugare le colonnine a 6000 x g per 1 minuto. 14. Eliminare le colonnine ed utilizzare l’RNA eluito per i passaggi successivi.

L’RNA può essere tenuto a +4°C se utilizzato immediatamente, altrimenti deve essere conservato a -20°C fino a 72 ore o a -80°C fino a 7 giorni. Si raccomanda di scongelare l’RNA a +4°C. REAL TIME RT-PCR

Reagenti Volume per campione Mix 1 6,7 µl Mix 2 3,5 µl

Inibitore Ribonucleasi 0,2 µl Trascrittasi inversa 0,2 µl

Taq 5 U/µl (tappo viola)

0,4 µl

- - Preparare la Master Mix per il numero di campioni estratti (campioni + controllo

negativo) + 4 calibratori + 2 volumi (per avere una quantità di mix sufficiente per tutti i campioni da processare).

Risospendere bene le mix prima del loro utilizzo.

- Miscelare delicatamente e dispensare 11 µl di Master Mix nelle provette da 0,2 ml precedentemente contrassegnate.

- Aggiungere in ciascuna provetta 14 µl del rispettivo RNA estratto e mescolare pipettando su e giù.

- Per ultimo scongelare i calibratori, controllare che tutto il liquido sia sul fondo della provetta

- Posizionare le provette nel Rotor Gene, aprire il programma e selezionare “Edit Samples” per impostare la posizione delle provette e la concentrazione dei calibratori (come riportato sull’etichetta interna alla scatola).

e aggiungervi direttamente la mix per evitare cross contaminazioni.

- Selezionare “Setting” ed indicare il volume di reazione (25 µl) ed il tipo di rotore utilizzato (36 pozzetti).

- Selezionare “Profile” ed impostare il profilo di RT-PCR come segue:


Cycle Cycle Point Hold @ 42°C, 30 min 0 secs Hold 2 @ 95°C, 10 min 0 secs Cycling (45 repeats) Step 1 @ 95°C, hold 15 secs Step 2 @ 60° C, hold 60 secs, acquiring to

Cycling A(FAM,JOE) o (GREEN,YELLOW) - Selezionare “View → gain calibration” ed impostare l’autocalibrazione a 60°C per i

canali FAM/GREEN e JOE/YELLOW (Min reading 5 FI; Max reading 10 FI); selezionare “Perform calibration before first acquisition”.

- Premere “Start”. ANALISI DEI DATI Canale FAM - GREEN (HCV) - Selezionare “Analysis”, “Quantitation”, “Cycling A.FAM”, “Show”. - Quando compare la finestra di analisi con il grafico, selezionare “Dynamic Tube” e

“Slope Correct”. - Inserire nella finestra “Threshold” il valore 0,01: l’intersezione tra la linea di soglia e la

curva del campione rappresenta il valore di CT. - Nella finestra “Results” compare il valore di CT per i campioni positivi ad HCV e la

rispettiva concentrazione calcolata mediante la curva di calibrazione. Esempio:

No. Name Type Ct Given Conc (IU/ml)

Calc. Conc. (IU/ml)

% Var.

1 Cal A Standard 23,73 1,00E+06 1,12E+06 12,0% 2 Cal B Standard 27,08 1,00E+05 8,65E+04 13,5% 3 Cal C Standard 29,97 1,00E+04 9,51E+03 4,9% 4 Cal D Standard 32,81 1,00E+03 1,09E+03 8,5% 5 Sample 1 Unknown 33,57 6,07E+02 6 Sample 2 Unknown 27,79 5,04E+04 7 Sample 3 Unknown 22,98 1,99E+06

Canale JOE - YELLOW (IC) - Selezionare “Analysis”, “Quantitation”, “Cycling A.JOE”, “Show”. - Quando compare la finestra di analisi con il grafico, selezionare “Dynamic Tube” e

“Slope Correct”. - Selezionare “More setting” e impostare come valore percentuale 10%. Se necessario

selezionere anche “Ignore first 10 cycles”


- Inserire nella finestra “Threshold” il valore 0,01: l’intersezione tra la linea di soglia e la curva del campione rappresenta il valore di CT.

- Nella finestra “Results” compare il valore di CT dei campioni; i calibratori non hanno CT (a causa dell’assenza del C.I.).

Esempio:

No. Name Type Ct Given Conc

(IU/ml) Calc. Conc.

(IU/ml) % Var.

1 Cal A Standard 1,00E+06 2 Cal B Standard 1,00E+05 3 Cal C Standard 1,00E+04 4 Cal D Standard 1,00E+03 5 Sample 1 Unknown 29,76 6 Sample 2 Unknown 30,56 7 Sample 3 Unknown 30,18

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI • Considerare il segnale di FAM per i calibratori: deve essere interpolato da una retta per

poter quantificare HCV RNA.

Considerare validi i valori dei CT dei 4 calibratori solo se compresi nei corrispondenti range riportati sull’etichetta all’interno della scatola.

Esempio:

No. Name Type Ct Given Conc

(IU/ml) Calc. Conc.

(IU/ml) % Var.

1 Cal A Standard 23,56 1,00E+06 1,25E+06 24,8% 2 Cal B Standard 27,49 1,00E+05 7,30E+04 27,0% 3 Cal C Standard 30,28 1,00E+04 9,78E+03 2,2% 4 Cal D Standard 33,68 7,50E+02 8,41E+02 12,2%


Se la retta di interpolazione non si adatta bene ad uno dei quattro calibratori (ad es. in presenza di un CT al di fuori del corrispondente RANGE di accettabilità riportato all’interno della confezione)

, quel calibratore può essere deselezionato in modo da ottenere una migliore approssimazione della retta stessa ai punti rimanenti (Esempio: a) e b)); questo permette una quantificazione più precisa dei campioni, senza alterare il significato clinico del risultato.

Esempio: a) Il Calibratore C si discosta molto dalla retta di interpolazione (CT al di fuori del

corrispondente range di accettabilità nell’esempio 28-29.5

)

No. Name Type Ct Given

Conc (IU/ml)

Calc. Conc. (IU/ml)

% Var.

1 Cal A Standard 22,74 2,50E+06 2,08E+06 16,8% 2 Cal B Standard 25,58 2,50E+05 2,15E+05 14,2% 3 Cal C Standard 27,08 1,50E+04 8,78E+04 101,3% 4 Cal D Standard 32,25 1,00E+03 9,81E+02 34,1% 5 Sample 1 Unknown 23,26 1,37E+06 6 Sample 2 Unknown 24,35 5,71E+05 7 Sample 3 Unknown 27,37 5,13E+04 8 Sample 4 Unknown 31,30 2,21E+03 9 Sample 5 Unknown 33,43 4,01E+02

b) Il calibratore C è stato deselezionato e si è ottenuta una nuova retta di

interpolazione utilizzando i calibratori rimasti


No. Name Type Ct Given Conc (IU/ml)

Calc. Conc. (IU/ml)

% Var.

1 Cal A Standard 22,74 2,50E+06 2,41E+06 3,7% 2 Cal B Standard 25,58 2,50E+05 2,64E+05 5,5% 4 Cal D Standard 32,25 1,00E+03 9,97E+02 1,6% 5 Sample 1 Unknown 23,26 1,60E+06 6 Sample 2 Unknown 24,35 6,84E+05 7 Sample 3 Unknown 27,37 6,54E+04 8 Sample 4 Unknown 31,30 3,06E+03 9 Sample 5 Unknown 33,43 5,82E+02

c) Se la retta di interpolazione non si adatta bene a più di un calibratore, la curva

standard non può essere ottenuta e la seduta va ripetuta. • Considerare il Ct di JOE per i campioni ed interpretare il risultato come segue:

JOE Ct Interpretazione

Campione Presente Valido Assente Invalido*

(*) In assenza del segnale del C.I. nei campioni il risultato non può essere confermato, quindi la seduta deve essere ripetuta. Tuttavia in presenza di HCV RNA ad alto titolo (>105

IU/ml) la possibile assenza di segnale del C.I. potrebbe essere dovuta alla competizione tra il target specifico di HCV ed il C.I.; in questo caso il risultato positivo per HCV può essere ritenuto valido.

• Considerare il risultato di FAM per i campioni validi: la concentrazione (IU/ml) calcolata per ogni campione viene riportata nella tabella dei risultati.

1. Se la concentrazione calcolata è inferiore al limite di rilevazione, riportare il risultato come HCV RNA < 290 IU/ml.

2. I valori di concentrazione che ricadono all’esterno dell’intervallo lineare del saggio non possono essere considerati accurati, pertanto devono essere interpretati con cautela.

3. Se la concentrazione calcolata è al di sopra del limite superiore di rilevazione, riportare il risultato come HCV RNA >5,00E+07 IU/ml. Se si vuole ottenere un risultato più accurato, il test va ripetuto utilizzando il campione di siero di partenza diluito con siero negativo. La concentrazione calcolata dovrà essere moltiplicata per il fattore di diluizione per ottenere la concentrazione iniziale di quel campione.

• Se nella seduta vengono analizzati anche il controllo negativo ed il controllo positivo,

interpretare i risultati come segue:

FAM Ct JOE Ct Interpretazione

Controllo Negativo

Assente Presente Valido Assente Assente Invalido* Presente Presente Invalido**

Controllo Positivo

Presente Assente Valido Assente Assente Invalido*

(*) Ipotesi di inibizione della RT-PCR o degradazione dell’RNA in qualche passaggio della procedura. (**) Possibile contaminazione.


AVVERTENZE - In caso di assenza del segnale atteso di JOE è consigliabile ripetere la seduta. - I calibratori non hanno il C.I., quindi non ci si deve attendere il segnale di JOE. - In caso di contaminazione è importante risalire all’origine (fase di estrazione e/o RT-

PCR). L’utilizzo dei controlli forniti può essere d’aiuto per assicurare le corrette prestazioni del test e per l’identificazione dell’origine di tale problema.

CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI Specificità La specificità del kit HCV RNA QUANTITATIVO REAL TIME è stata determinata analizzando 128 campioni di siero negativo per HCV provenienti da donatori di sangue. Non sono stati ottenuti risultati falsi positivi. In accordo con tali dati la specificità del kit è pari al 100%. Sensibilità analitica La sensibilità è stata determinata analizzando sei diluizioni scalari di un campione HCV positivo (genotipo 1b) calibrato con il Secondo Standard Internazionale HCV WHO (NIBSC codice 96/798). Per le diluizioni è stato utilizzato un siero negativo per HCV RNA ed anticorpi anti-HCV. L’analisi è stata condotta in accordo col manuale d’uso, estrazione compresa. Come indicato nella tabella sottostante, il limite di rilevazione per HCV RNA QUANTITATIVO REAL TIME è 290 UI/ml (95% Probit analysis).

Diluizioni Numero di repliche Numero di positivi % Positivi 1000 IU/ml 28 28 100 % 750 IU/ml 28 28 100 % 500 IU/ml 28 28 100 % 350 IU/ml 28 27 96,43 % 250 IU/ml 28 26 92,86 % 150 IU/ml 28 17 60,71 %

Probit 95%* 290 IU/ml *L’analisi Probit è stata eseguita con il programma SPSS for Windows Release 7.0

Intervallo di linearità Per valutare l’intervallo di linearità di quantificazione del dispositivo sono stati preparati 14 punti di diluizioni seriali utilizzando un campione HCV RNA positivo (dal punto E al punto P)* ed un templato di HCV RNA sintetico (dal punto A al punto D)* diluiti in siero umano HCV negativo. L’utilizzo di un templato sintetico è dovuto alla mancanza di campioni clinici con elevata carica virale. L’analisi è stata condotta in accordo col manuale d’uso, estrazione inclusa, utilizzando due differenti lotti di reagenti. Per ciascun punto di diluizione sono state testate 15-25 repliche.


Punto di diluizione Concentrazione (IU/ml) A 5,00E+07 B 2,50E+07 C 1,00E+07 D 5,00E+06 E 1,00E+06 F 5,00E+05 G 1,00E+05 H 5,00E+04 I 1,00E+04 L 5,00E+03 M 1,00E+03 N 7,50E+02 O 5,00E+02 P 3,50E+02

Come mostrato nella figura sottostante, il kit HCV RNA QUANTITATIVO REAL TIME ha fornito una risposta lineare da 3,50E+02 UI/ml fino ad almeno 5,00E+07 UI/ml, utilizzando come criterio di accettazione il valore ± 0,3 log 10.

Precisione

La precisione intra-saggio è stata valutata utilizzando sei punti di diluizione (1,00E+07 UI/ml; 1,00E+06 UI/ml; 1,00E+05 UI/ml; 1,00E+04 UI/ml; 1,00E+03 UI/ml; 5,00E+02 UI/ml) preparati come descritto per la linearità.

Precisione intra-saggio

Due differenti operatori hanno testato tre replicati per ogni punto di diluizione utilizzando lo stesso lotto di reagenti. I risultati sono riportati nella tabella sottostante.

Titolo (IU/ml) 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 5,00E+02 CV % Operatore 1 3 27 6 16 32 39 CV % Operatore 2 22 19 14 18 19 23

y = 1,0168x - 0,07 R2 = 0,9956

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Log

10 C

alcu

late

d Ti

ter (

IU/m

l)

Log10 Extimated Titer (IU/ml)

Linearity


La precisione inter-saggio è stata valutata utilizzando gli stessi campioni usati per la precisione intra-saggio.

Precisione inter-saggio

Due differenti operatori hanno testato varie repliche per ogni punto di diluizione in differenti sedute eseguite in diversi giorni (13 in totale), utilizzando due differenti lotti di reagenti. L’analisi è stata condotta in accordo col manuale d’uso, estrazione inclusa; in questo modo la precisione è stata valutata per tutti i passaggi della procedura. I risultati sono riportati nella tabella sottostante.

Titolo (IU/ml) 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 5,00E+02 CV % Totale 37 29 30 26 24 27

Genotipi Le prestazioni del kit HCV RNA QUANTITATIVO REAL TIME rispetto ai diversi genotipi di HCV sono state valutate analizzando quattro punti di diluizioni di campioni clinici HCV positivi aventi differente genotipo (come indicato di seguito). La carica virale dei campioni clinici è stata determinata utilizzando come riferimento il Secondo Standard Internazionale HCV WHO (NIBSC codice 96/798). Genotipi testati: 1a, 1b, 2a, 2b, 2a/2c, 3a, 4c/4d (determinati col dispositivo VERSANT HCV Genotype Assay, Bayer). Punti di diluizione analizzati:

a: 1x105

b: 1x10 IU/ml

4

c: 1x10 IU/ml

3

d: 5x10 IU/ml

2

IU/ml

Come mostrato nella figura sottostante la quantificazione dei diversi genotipi è confrontabile. L’efficienza di rilevazione del dispositivo HCV RNA QUANTITATIVO REAL TIME è pertanto indipendente dai genotipi analizzati.

0

1

2

3

4

5

6

log

UI/m

l

1a 1b(rif) 2a 2b 2a/2c 3a 4c/4d

Genotypes


Marcatori potenzialmente cross reattivi Per valutare la potenziale cross reattività del test HCV RNA QUANTITATIVO REAL TIME con altri patogeni sono stati analizzati i seguenti campioni (provenienti da pazienti infetti):

Altri patogeni N di campioni analizzati HGV 14

HCMV 2 HIV 3 HBV 2 HTLV 2 HPV 1

Chlamydia trachomatis 2 Tutti i campioni HCV negativi testati hanno dato un risultato negativo. Pertanto il test HCV RNA QUANTITATIVO REAL TIME non ha evidenziato una cross reattività con altri patogeni. Sostanze potenzialmente interferenti Dati non disponibili Confronto con il sistema COBAS AMPLICOR HCV MONITOR (ROCHE) Le prestazioni del dispositivo HCV RNA QUANTITATIVO REAL TIME sono state confrontate con quelle del sistema Cobas Amplicor Monitor Test (Roche) mediante l’analisi di 69 campioni positivi e 30 negativi per HCV RNA. L’analisi è stata condotta in accordo col manuale d’uso, estrazione inclusa.

I risultati ottenuti mostrano una buona correlazione tra i due dispositivi. Nella seguente tabella sono riportati i genotipi dei campioni utilizzati in questo confronto.

Genotipo N di campioni 1a 2 1b 39 2a 3 2b 4

2a/2c 5 3a 8

4c/4d 6 5a 2

y = 1,0731x - 0,3895 R² = 0,9732

1 2 3 4 5 6 7 8

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

log 1

0 (N

LM v

alue

s)

log10 (Roche values)


Valutazione del dispositivo con campioni positivi che rispecchiano le condizioni di routine degli utilizzatori Per valutare le prestazioni di REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST con campioni che rispecchiano le condizioni di routine degli utilizzatori, sono stati testati 108 campioni di siero positivi ad HCV, con esito conforme all’atteso. I campioni provenivano da pazienti con prima diagnosi di positività al virus o in follow up prima, durante o al termine della terapia farmacologica. Gli stessi sieri sono stati analizzati con Abbott RealTime HCV assay come sistema di riferimento.


0459

TOTAL PAGES 36

MOLECULAR BIOLOGY

EXTRACTION: AA077/C NOT INCLUDED

HCV RNA Real Time

Quantitative

NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l. HEAD OFFICE: Viale delle Industrie, 3 – 20090 SETTALA MI (Italy) Tel (+39) 02/95. 24. 51 - Fax (+39) 02/95. 24. 52. 37 WEB: www.nlm.it – E-MAIL: [email protected]

NLM 6228 VER 120911

AA910 50 TEST

MQE013-3


INTENDED USE REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST provides reagents for the determination of HCV viral load in human serum samples by quantitative Real Time RT-PCR of the 5’-untranlsated viral RNA (5’-UTR). A four calibrators panel is included for titre quantification and an Internal Control is provided to monitor all the procedure. This device must be used in association with RNA extraction kit NLM code AA077/C “Qiamp Viral RNA Mini Kit” (to be ordered separately). Viral RNA is retrotranscribed and amplified in one step RT-PCR of about 140 minutes, using Rotor Gene (Corbett Research). REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST is intended for use in conjunction with clinical presentation and other laboratory markers of HCV infection for the clinical management of patients. The test can be used to assess viral response to antiviral treatment as measured by changes in serum HCV RNA levels. The device is not intended for use as a screening test for the presence of HCV RNA in blood products or as a diagnostic test to confirm the presence of HCV infection.

INTRODUCTION Hepatitis C virus is the main etiologic agent of acute viral hepatitis that can lead, in most patients, to liver cirrhosis and then to hepatocellular carcinoma1. HCV can also cause extrahepatic diseases2-4

HCV genome is a linear single strand RNA with one ORF (Open Reading Frame); in 5’ position there is an untranslated highly conserved region (5’-UTR) that represents the target for viral molecular biology detection. The 5’-UTR genetic heterogeneity among different HCV strains determines the classification into different genotypes

.

5. HCV has a parenteral transmission through exposure to infected blood. This exposure can occur in the context of blood transfusion before 1992, injection drug use, solid organ transplantation from infected donors, birth to an infected mother, occupational exposure to infected blood, high-risk sexual practice6

After initial exposure, HCV RNA can be detected in patients blood within one to three weeks; acute infection can be severe but rarely is fulminant

.

6

Although generally asymptomatic, about 85% of the acute infections become chronic: persistence of HCV infection is diagnosed by the detection of HCV RNA in the blood for at least six months

.

6

Determination of HCV RNA concentration in serum samples is an important parameter for management of chronic hepatitis C. While no correlation was observed between HCV RNA absolute viral load and the severity or the progression of liver disease, variation of HCV RNA concentration provides important information about response to treatment in patients undergoing antiviral therapy

.

6

REFERENCES

.

1. Sarrazin C. Diagnosis of hepatitis C: update 2004. Journal of Gastroenterology and Hepatology (2004) 19, S88-S93

2. Johnson RJ, Gretch DR, Yamabe H et al. Membranoproliferative glomerulonephritis associated with hepatitis C virus infection. N Engl J med 1993; 328: 465-470.

3. Agnello V, Chung RT, Kaplan RM. A role for hepatitis C virus infection in Type II cryoglobulinemia. N Engl J Med 1992; 327: 1490-1495.


4. Andreone P, Zignego AL, Cursaro C et al. Prevalence of monoclonal gammopathies with hepatitis C virus infection . Ann Intern Med 1998; 129: 294-298

5. Zein NN. Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes. Clinical Microbiology Reviews, Apr. 2000, p. 223-235.

6. National Institutes of Health, Consensus Conference Statement. Management of hepatitis C: 2002.

PRINCIPLES OF THE PROCEDURE REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST is based on two processes:

1. Viral RNA extraction 2. Reverse transcription, amplification and detection of target sequence using Real

Time RT-PCR REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST provides an Internal Control that must be added to each sample in the extraction phase in order to monitor all the procedure. A four calibrators panel is also included in order to quantify the initial amount of HCV RNA in clinical specimens.

1. Viral RNA extraction HCV and IC RNA extraction from human serum samples must be done using “Qiamp Viral RNA Mini Kit” (Qiagen) as described in the Instructions for use.

2. RT-PCR and Detection

The HCV RNA 5’-UTR region has been chosen as target to detect the HCV presence in human serum samples because it is highly conserved among HCV genotypes.

Amplification target

The internal control is a synthetic RNA transcript with primer binding regions identical to those of HCV target sequence, an internal sequence of similar length and base composition as the HCV target sequence and a unique probe binding region that differentiates the IC amplicon from the target amplicon. Calibrators are obtained by serial dilutions of a synthetic RNA transcript of cloned HCV 5’-UTR region, therefore they need the same primers and probe as HCV RNA target for Real Time RT-PCR.

Following extraction step, RNA is retrotranscribed and amplified in one-step RT-PCR, using appropriate enzymes and buffer conditions (amplification enzyme assigned: violet cap).

Reverse transcription and Amplification

Real Time PCR allows target sequences detection during amplification itself, using suitable probes labeled with fluorescent dyes. In the amplification mix there are two specific probes, respectively for the Internal Control and for HCV 5’-UTR region, labeled with a reporter dye and a quencher dye. The fluorescent reporter dye is different for the two probes: FAM for HCV and JOE for IC. In presence of a light source, when the probes are close to each other, the fluorescence emitted by the reporter dye is absorbed by the proximal quencher. During the amplification each probe matches to its specific target, then the reporter and the quencher dyes appear to be distant. When they are separated the fluorescence of the reporter can be detected at its specific wavelength: in this way the amplification of viral RNA and IC can be monitored as the reaction proceeds.

Detection


Rotor Gene comprises in a single instrument a thermal cycler for target amplification and a fluorometer for the detection of fluorescence during the cycling process. A computer connected with the Real Time machine collects fluorescent data that is displayed in a graph through a specific software (Fig.1).

Figure 1: raw data is plotted on a graph of fluorescence versus cycle number.

Following raw data collection, analysis is carried out. Raw data is normalized to correct the background signal, then a threshold level can be set: this is the level at which fluorescence data is analyzed (Fig.2).

Figure 2: the normalized data is plotted on a log scale graph of fluorescence versus cycle number.

The number of cycles it takes for a sample to reach the threshold level is named CT-value (threshold cycle) and it is related to the initial amount of target RNA: the higher target titre the earlier the fluorescent signal comes out. If standards with corresponding concentrations are run, a linear regression analysis produces a standard curve from which the concentration of unknown samples can be determined. The standard curve is generated automatically by plotting the threshold cycle versus standard initial concentration (IU/ml) and calculating the best-fit line; the HCV RNA titre of each sample is determined by locating its Ct on the standard curve (Fig.3).


Figure 3: standard curve obtained by linear regression analysis of calibrators Ct plotted versus the respective initial concentration.

REAGENTS COMPOSITION (Store at –20°C) Mix 1 5 x 145 µl Tris-HCl KCl 0,01 % gelatin MgClPEG

2

dNTPs Mix 2 5 x 80 µl Primers HCV probe IC probe Reverse transcriptase (200 U/µl) 1 x 22 µl Tris HCl NaCl EDTA DTT Nonidet Glycerol Ribonuclease Inhibitor (40 U/µl) 1 x 22 µl HEPES-KOH KCl DTT Glycerol Negative Control 1 x 1000 µl Negative Control is human serum non reactive for HIV-Ab and RNA, HCV-Ab and RNA, HBs-Ag and DNA. Negative Control must be extracted.


Positive Control 5 x 14 µl Ribonuclease Inhibitor Synthetic RNA Positive Control is ready-to-use for RT-PCR step. Internal Control 5 x 70 µl Ribonuclease Inhibitor Synthetic RNA Internal control must be added to each sample and to the negative control before extraction step. Calibrators A, B, C, D 5 X 14 µl HCV Template Calibrators are provided in ready-to-use PCR tubes. Calibrators concentration can vary in different device lots, therefore it’s important to assign to each calibrator the titre reported on the internal label of the package.

Before using calibrators be sure that all the solution is on the bottom of the tube.

On the same label are shown CT ranges of the 4 calibrators; CT values must fall in these ranges in order to be accepted. These ranges may vary from batch to batch, so it is important for the analysis to refer to the correct interval of CT.

MODULARITY Reagents are provided for five distinct runs; 10 samples + 4 calibrators + 1 Negative Control can be analysed in each run. Reagents for Positive Control are not included. If modularity isn’t respected reagents could not be enough for the number of tests declared.

STABILITY AND STORAGE - All the reagents are stable up to the expiry date indicated on the label when stored at -

20°C. - Thaw all the reagents on ice or at +4°C. - Once used, Mix 1 and Mix 2 are stable for up to one day if stored at +4°C or until

expiration date if stored at -20°C. These reagents can be refrozen and thawed only once.

- Mix 2 contains FAM and JOE fluorophores that are photosensitive: avoid prolonged exposure to light.

- Master Mix must be used immediately after preparation; once dispensed in PCR tubes, the remaining reagent must be discarded. Avoid prolonged exposure to light.

- Each IC tube contains reagent for 10 tests; once used, the remaining IC must be discarded.

- Positive Control and Calibrators are RT-PCR ready-to-use: it is recommended to thaw them just before use to preserve their integrity and to add Master Mix after samples RNA dispensing in PCR tubes to avoid cross contamination.

SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING Viral RNA is isolated and purified from human serum specimens prepared within 6 hours from blood collection. - Collect blood observing universal precautions for venipuncture


- Collect blood in sterile tubes with no anticoagulants or in serum separator tubes. Allow blood to clot at room temperature and centrifuge (1000-1500g) within 10-15 minutes to separate serum.

- Aliquot 140 μl of serum for RNA extraction using vertical down-flow airbox and operating to avoid RNA degradation.

- Store samples at 4°C until extraction step. If they are not processed immediately store them in sterile tubes at -20°C for up to 72 hours prior to freezing at -80°C.

- Avoid repeated freeze-thaw cycles of serum samples - Perform the procedure using universal precautions and handle samples as if capable of

transmitting infection.

PRECAUTIONS - Handle this product according to established good laboratory practices and universal

precautions; wear personal protective apparel, including disposable gloves, throughout the assay procedure. Dispose gloves as bio hazardous waste.

- All disposable items (tips and tubes) must be sterile. Use aerosol-resistant pipette tips to avoid pipettes contamination. Use a new tip every time a volume is dispensed.

- Discard all used material as bio hazardous waste. - The negative control is a human serum sample non reactive for HIV-Ab and RNA,

HCV-Ab and RNA, HBV HBsAg and DNA. However it should be handled as potentially infectious and should be treated with the necessary safety precautions.

- Do no eat, drink, smoke or apply cosmetics in areas where reagents or specimens are handled.

- In case of contact with reagents rinse immediately with water and seek medical advice. - Do not use device after its expiration date. - Do not mix reagents from different lots. - Pay attention to device modularity (10 samples + 1 Negative Control + 4 Calibrators for

5 runs): if modularity is not respected the reagents could be insufficient for all the 50 tests.

- It’s recommended to perform the assay in three different areas: o Area 1: pre-PCR (samples handling and extraction) o Area 2: RT-PCR Mix preparation. o Area 3: post-PCR (Real Time PCR)

- It is advisable to have constant and uniform laboratory temperature, avoid to place the instruments near heating/cooling sources that may compromise the right working.

MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED AREA 1 Vertical downflow airbox Precision pipettes set Sterile aerosol barrier tips and tubes Microcentrifuge AREA 2 Vertical downflow airbox Precision pipettes set Sterile aerosol barrier tips 0,2 ml flat cap sterile PCR tubes DNA polymerase Hot start (enzyme assigned: violet cap)


AREA 3 RotorGene (Corbett Research) Rotor Gene software

ASSAY PROCEDURE EXTRACTION (Recommended Extraction method: NLM cod. AA077 “Qiamp Viral RNA Mini kit”, Qiagen) Refer to Qiagen instructions for use for preparation, handling and disposal of reagents.

1. Prepare the necessary amount of 1,5 ml microcentrifuge tubes (samples and negative control).

2. Pipet 560 µl of AVL Buffer containing RNA Carrier into each 1,5 ml microcentrifuge tube.

3. Add 140 µl of sample and 5 µl of Internal Control to the AVL Buffer / RNA Carrier and mix by pulse-vortexing for 15 seconds. To ensure efficient lysis, it is essential that the sample is mixed thoroughly with Buffer AVL. Avoid the direct contact between serum and IC (IC RNA could be degraded by samples enzymes not yet inactivated)

4. Incubate at room temperature (15-20°C) for 10 minutes. Viral particles lysis is complete after 10 min incubation at room temperature. Prolonged times have no effect on yield or quality of the purified RNA. Potentially infectious agents and RNases are inactivated by AVL buffer.

5. Briefly centrifuge tubes to remove drops from the inside of the lid. 6. Add 560 µl of ethanol (96-100%, not provided) and mix again by pulse-vortexing for

15 sec. After mixing, briefly centrifuge tubes to remove drops from the inside of the lid. Prepare enough columns (with 2 ml collection tube) to process all lysed samples. Only ethanol should be used since other alcohols may reduce RNA yield and purity.

7. Carefully apply 630 µl of the solution from step 6 to each spin column (in a 2 ml collection tube, provided) without wetting the rim, close the cap and centrifuge at 6000 x g for 1 min. Place the spin column in a clean 2 ml collection tube (provided) and discard the tube containing the filtrate. If the solution has not completely passed through the membrane, centrifuge again until all of the solution has passed through.

8. Repeat step 7 9. Carefully open the spin column and add 500 µl of AW1 Buffer. Close the cap and

centrifuge at 6000 x g for 1 min. Place the spin column in a clean 2 ml collection tube (provided) and discard the collection tube containing the filtrate.

10. Carefully open the spin column and add 500 µl of AW2 Buffer. Close the cap and centrifuge at full speed (20000 x g ) for 3-4 min.

11. Place the spin column in a clean 2 ml collection tube (not provided) and discard the collection tube with the filtrate. Centrifuge at full speed for 2 min to eliminate residual ethanol that may inhibit amplification reaction.

12. Place the spin column in a clean 1,5 ml microcentrifuge tube (not provided). Discard the collection tube containing the filtrate. Carefully open the spin column and add 60 µl of sterile RNase-free water. Incubate at room temperature for 1-2 min. Be sure that sterile RNase-free water is deposited in the centre of the column membrane.

13. Centrifuge at 6000 x g for 1 min. 14. Discard the column and use RNA eluted to further steps.


RNA can be stored at 4°C if used immediately, otherwise must be frozen at -20°C for up to 72 hours or at -80°Cfor up to 7 days. It is recommended to thaw RNA at +4°C.

REAL TIME RT-PCR Reagents Volume per sample

Mix 1 6,7 µl Mix 2 3,5 µl

Ribonuclease Inhibitor 0,2 µl Reverse Transcriptase 0,2 µl Taq 5 U/µl (violet cap) 0,4 µl

- - Prepare the Master Mix for the number of RNA extracted (samples and negative

control) + 4 calibrators + 2 volumes (to have enough mix for all the samples).

Carefully resuspend the mix before use.

- Mix gently and dispense 11 µl in the flat cap test tubes previously marked. - Add 14µl of extracted RNA to each tube and mix pipetting up and down. - At last thaw calibrators verify that all the liquid is on the bottom of the tube

- Place test tubes in the RotorGene rotor, click on “Edit Samples” window and set up tube position and calibrators concentration (as reported on BOX internal label).

and add directly the mix to avoid cross contamination.

- Click on “Setting” window and indicate the PCR reaction volume(25 µl) and the rotor used (36 wells)

- Click on “Profile” window and set up the RT-PCR profile as follows: - Click on “View → gain calibration” and set up autocalibration at 60°C for FAM/GREEN

and JOE/YELLOW channels (Min reading 5 FI; Max reading 10 FI); select “Perform calibration before first acquisition”.

- Click on “Start”. RAW DATA ANALYSIS FAM - GREEN Channel (HCV) - Click on “Analysis” window and select “Quantitation”, “Cycling A.FAM”, “Show”. - When the analysis graph appears select “Dynamic Tube” and “Slope Correct”. - Put in the “Threshold” window 0,01 value: the intersection between threshold line and

the samples curve is the Ct-value. - In the “Results” window the CT values for the positive samples and their concentration

calculated on the Calibration Curve are shown.

Cycle Cycle Point Hold @ 42°C, 30 min 0 secs Hold 2 @ 95°C, 10 min 0 secs Cycling (45 repeats) Step 1 @ 95°C, hold 15 secs Step 2 @ 60°C, hold 60 secs, acquiring to

Cycling A(FAM,JOE) OR (GREEN,YELLOW)


Example:

No Name Type Ct Given Conc (IU/ml)

Calc. Conc. (IU/ml)

% Var.

1 Cal A Standard 23,73 1,00E+06 1,12E+06 12,0% 2 Cal B Standard 27,08 1,00E+05 8,65E+04 13,5% 3 Cal C Standard 29,97 1,00E+04 9,51E+03 4,9% 4 Cal D Standard 32,81 1,00E+03 1,09E+03 8,5% 5 Sample 1 Unknown 33,57 6,07E+02 6 Sample 2 Unknown 27,79 5,04E+04 7 Sample 3 Unknown 22,98 1,99E+06

JOE - YELLOW Channel (IC) - Click on “Analysis” window and select “Quantitation”, “Cycling A.JOE”, “Show”. - When the analysis graph appears select “Dynamic Tube” and “Slope Correct”. - Select “More setting” and choose 10%. If necessary, select also “Ignore first 10 cycles” - Put in the “Threshold” window 0,01 value: the intersection between threshold line and

the samples curve is the Ct-value. - In the “Results” window the samples CT values are shown; calibrators have no CT

(because of the absence of IC) Example:


Calc. Conc. (IU/ml)

% Var.

1 Cal A Standard 1,00E+06 2 Cal B Standard 1,00E+05 3 Cal C Standard 1,00E+04 4 Cal D Standard 1,00E+03 5 Sample 1 Unknown 29,76 6 Sample 2 Unknown 30,56 7 Sample 3 Unknown 30,18


RESULTS INTERPRETATION • Check calibrators FAM signal: it must fit a linear curve in order to quantify HCV RNA.

Example

CT values of 4 calibrators must be considerated valid if are included in the corresponding range show on the label in the box.

No Name Type Ct Given Conc

(IU/ml) Calc. Conc.

(IU/ml) % Var.

1 Cal A Standard 23,56 1,00E+06 1,25E+06 24,8%

2 Cal B Standard 27,49 1,00E+05 7,30E+04 27,0%

3 Cal C Standard 30,28 1,00E+04 9,78E+03 2,2%

4 Cal D Standard 33,68 7,50E+02 8,41E+02 12,2%

1. If one of the four calibrators doesn’t match with the linear fitting (i.e. in the presence

of a CT value outside the corresponding acceptability RANGE reported in the box)

Example:

, it can be deselected and a more precise standard curve is plotted (Example: a and b); this allows a more precise sample quantification without altering the clinical significance of the results.

a) Calibrator C doesn’t fit well (CT outside the corresponding range of acceptability, i.e. 28-29.5)


Calc. Conc. (IU/ml)

%Var.

1 Cal A Standard 22,74 2,50E+06 2,08E+06 16,8% 2 Cal B Standard 25,58 2,50E+05 2,15E+05 14,2% 3 Cal C Standard 27,08 1,50E+04 8,78E+04 101,3% 4 Cal D Standard 32,25 1,00E+03 9,81E+02 34,1% 5 Sample 1 Unknown 23,26 1,37E+06 6 Sample 2 Unknown 24,35 5,71E+05 7 Sample 3 Unknown 27,37 5,13E+04 8 Sample 4 Unknown 31,30 2,21E+03 9 Sample 5 Unknown 33,43 4,01E+02


b) Calibrator C is deselected and a new fitting is plotted using the other calibrators

No Name Type Ct Given Conc

(IU/ml) Calc. Conc.

(IU/ml) % Var.

1 Cal A Standard 22,74 2,50E+06 2,41E+06 3,7% 2 Cal B Standard 25,58 2,50E+05 2,64E+05 5,5% 4 Cal D Standard 32,25 1,00E+03 9,97E+02 1,6% 5 Sample 1 Unknown 23,26 1,60E+06 6 Sample 2 Unknown 24,35 6,84E+05 7 Sample 3 Unknown 27,37 6,54E+04 8 Sample 4 Unknown 31,30 3,06E+03 9 Sample 5 Unknown 33,43 5,82E+02

2. If more than one calibrator doesn’t match with the linear fitting, Standard Curve

cannot be plotted and the run must be repeated. • Check samples JOE Ct and interpret results as follows:

JOE Ct Interpretation

Sample Present Valid Absent Invalid*

(*) In absence of IC signal sample result can’t be confirmed, therefore sample run should be repeated. Nevertheless in presence of HCV RNA high titre ( > 105

IU/ml) the possible absence of IC signal could be due to the competition between HCV specific target and Internal Control target; in this case sample positive result can be considered as valid.

• Check FAM results for valid samples: a value of concentration (IU/ml) is given in the result table.

1. If given concentration is lower than Detection Limit, report result as HCV RNA < 290 IU/ml.

2. Results that are not within the linear range of the assay cannot be considerate accurate, therefore they should be interpreted with caution.

3. If given concentration is above the upper quantification limit, report result as HCV RNA > 5,00E+07 IU/ml. If a more accurate value is desired, dilute the original serum sample with HCV negative serum and repeat the assay. Calculated titre must be multiplied by the dilution factor to obtain the concentration of the original sample.


• If negative and positive controls are run, interpret results as follows:

FAM Ct JOE Ct Interpretation

Negative Control

Absent Present Valid Absent Absent Invalid* Present Present Invalid**

Positive Control

Present Absent Valid Absent Absent Invalid*

(*) Hypothesis of RT-PCR inhibition or RNA degradation in one of the procedure steps (**) Possible contamination

WARNING - In case of absence of expected JOE signal it is advisable to repeat the assay. - Calibrators haven’t Internal Control, therefore JOE signal is not expected. - When contamination events occur it’s important to find out the source (extraction

and/or RT-PCR steps). Controls provided can be very useful to ensure the correct test performance and to find out contamination origin.

PERFORMANCE CHARACTERISTICS Specificity The specificity of the REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST was determined by analysing 128 HCV negative serum samples from blood donors. No false positive results were obtained. According to the results the specificity of the assay is 100%. Analytical sensitivity Sensitivity was determined by analysing six dilution levels of an HCV positive clinical specimen (genotype 1b) calibrated with the HCV WHO Second International Standard (NIBSC code 96/798). For the dilutions a serum negative for HCV RNA and antibodies was used. The test was performed according to the instructions for use, starting from RNA extraction. As shown in the table below, the detection limit of REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST is 290 IU/ml (95 % Probit analysis).

Diluition Number of replicates

Number of positives

% Positives Rate

1000 IU/ml 28 28 100 % 750 IU/ml 28 28 100 % 500 IU/ml 28 28 100 % 350 IU/ml 28 27 96,43 % 250 IU/ml 28 26 92,86 % 150 IU/ml 28 17 60,71 %

Probit 95%* 290 IU/ml *Probit analysys done with SPSS for Windows Release 7.0

Linear Range To evaluate the linear range of the device 14 dilution levels were prepared using either an HCV RNA high positive specimen (from E to P level)* or a synthetic HCV RNA (from A to D level)* diluted in negative human serum. The use of a synthetic HCV RNA is due to the unavailability of a clinical sample with a very high viral load.


The test was performed according to the instructions for use, starting from the RNA extraction and using two different lots of reagents. Each dilution level has been tested in 15-25 replicates.

Dilution level Concentration (IU/ml) A 5,00E+07 B 2,50E+07 C 1,00E+07 D 5,00E+06 E 1,00E+06 F 5,00E+05 G 1,00E+05 H 5,00E+04 I 1,00E+04 L 5,00E+03 M 1,00E+03 N 7,50E+02 O 5,00E+02 P 3,50E+02

As shown in figure below, REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST showed a linear response from 3,50E+02 IU/ml to at least 5,00E+07 IU/ml, using the accuracy acceptance criterion of : ± 0,3 log 10

Precision

Intra-assay precision was evaluated by using six dilution levels (1,00E+07 IU/ml; 1,00E+06 IU/ml; 1,00E+05 IU/ml; 1,00E+04 IU/ml; 1,00E+03 IU/ml; 5,00E+02 IU/ml) prepared as described for Linear Range determination.

Intra-assay precision

Two different operators tested 3 replicates per dilution level using the same batch lot. Results are showed in the table below.

Titer (IU/ml) 1,00E+07 1,00E+ 06 1,00E+ 05 1,00E+ 04 1,00E+ 03 5,00E+ 02 % CV Operator 1 3 27 6 16 32 39 % CV Operator 2 22 19 14 18 19 23

Inter-assay precision was evaluated by using the same samples as the intra-assay precision.

Inter-assay precision

y = 1,0168x - 0,07 R2 = 0,9956

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Log

10 C

alcu

late

d Ti

ter (

IU/m

l)

Log10 Extimated Titer (IU/ml)

Linearity


Two different operators tested several replicates per dilution level in different runs and days (13 in total), using two different lots of reagents. The test was performed according to the instructions for use, starting from the RNA extraction; in this way the precision was evaluated for all the steps of the procedure. Results are showed in the table below.

Titer (IU/ml) 1,00E+ 07 1,00E+ 06 1,00E+ 05 1,00E+ 04 1,00E+ 03 5,00E+ 02 Total % CV 37 29 30 26 24 27

HCV Genotypes The performance of REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST on different HCV genotypes was determined by analysing four dilution levels of different HCV positive clinical specimens genotypes (as listed below). The viral load of the samples used was determined by comparing the signal of the original samples with the signal of the HCV WHO Second International Standard (NIBSC code 96/798). Genotypes tested: 1a, 1b, 2a, 2b, 2a/2c, 3a, 4c/4d (determined with VERSANT HCV Genotype Assay, Bayer). Dilutions tested:

a: 1x105

b: 1x10 IU/ml

4

c: 1x10 IU/ml

3

d: 5x10 IU/ml

2

IU/ml

As showed in the graphic below quantification is comparable for the different genotypes analysed. The detection efficiency of REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST is therefore independent of the genotype.

0

1

2

3

4

5

6

log

UI/m

l

1a 1b(rif) 2a 2b 2a/2c 3a 4c/4d

Genotypes


Potential cross reactive markers To evaluate the potential cross reactivity of REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST with other pathogens the following samples (from infected patients) were analysed:

Other pathogens Nr of samples tested HGV 14

HCMV 2 HIV 3 HBV 2 HTLV 2 HPV 1

Chlamydia trachomatis 2 All the Non-HCV samples tested gave a negative result. Therefore REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST showed no cross reaction with other pathogens. Potentially interfering substances Data not available. Comparsion with COBAS AMPLICOR HCV MONITOR TEST (ROCHE) The performance of the REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST was compared to Cobas Amplicor Monitor Test (Roche) analysing 69 HCV positive and 30 negative clinical samples. The test was performed according to the instructions for use, including the extraction phase.

Results obtained show a good correlation between these two assays. In the following table genotypes of samples used for comparison are summarized.

Genotype Nr of samples 1a 2 1b 39 2a 3 2b 4

2a/2c 5 3a 8

4c/4d 6 5a 2

y = 1,0731x - 0,3895 R² = 0,9732

1 2 3 4 5 6 7 8

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

log 1

0 (N

LM v

alue

s)

log10 (Roche values)


Device performances with positive samples reflecting routine conditions of users To evaluate device performances with samples reflecting routine conditions of users, 108 serum specimens positive for HCV were tested with REAL TIME HCV RNA QUANTITATIVE TEST and gave a result as expected. The samples were from patients with a first diagnosis of HCV or in follow up before, during or at the end of pharmacological therapy. The same samples were quantified with Abbott RealTime HCV assay as reference system.


Catalogue number Temperature

limitation

Consult instructions

for use

European Conformity

In vitro diagnostic

device

Internal Control

IC INTERNAL CONTROL

Negative Control

Use by

Positive control

Site of manufacturing

Lot number

Documents

AA910 NLM 6228 IT EN ver 120911 #910-17-DI-11