Upload
elias
View
53
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
A szabályozó fehérjék szabályozása. A Rac kis G fehérje szabályozása. GAP Rac· GTP Rac· GDP GEF RhoGDI·Rac·GDP. GAP = GTPáz aktiváló protein GEF = Guanin nukleotid kicserélő faktor GDI = Guanin nukleotid disszociáció inhibitor. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
A szabályozó fehérjék szabályozása
GAP Rac·GTP Rac·GDP
GEF
RhoGDI·Rac·GDP
A Rac kis G fehérje szabályozása
GAP = GTPáz aktiváló protein
GEF = Guanin nukleotid kicserélő faktor
GDI = Guanin nukleotid disszociáció inhibitor
A kis GTPázok alcsaládjai és szabályozó fehérjéi
RAS RHO RAB ARF RAN
H-Ras Rho-A Rab1- ARF1- RanK-Ras Rho-B Rab32 ARF7N-Ras Rho-C
Rap1 Rac1Rap2 Rac2
Ral Cdc42
GAPok 25 70 52 27 1
GEFek 50-60
Rho-GDI Rab-GDI
Mi újság a GEF-ek körül?
(Zheng, 2001)
A DH-GEFek domén szerkezete
GEF-ek
GTPázok
Target fehérjék
GEF-ek
GTPázok
Target fehérjék
GEF-ek
GTPázok
Target fehérjék
GEF-ek
GTPázok
Target fehérjék
GEF-ek
GTPázok
Target fehérjék
PROBLÉMA: Hol a specificitás?
Specificitás pedig van:
Patel et al. 2002, MBC, 13., 1215-1226
GEF-ek
GTPázok
Target fehérjék
MEGOLDÁS: fehérje komplexek
PH/DHRGSp115RhoGEF
1. példa
PH/DHRGSp115RhoGEF
Rho
PH/DHRGSp115RhoGEF
Rho
CNK1 target/scaffold fehérje
Jaffe A.B. et al. MCB 24. 1736. 2004; Cur. Biol. 15. 405. 2005;
PH/DHRGSp115RhoGEF
Rho
CNK1 target/scaffold fehérje
MLK2 kináz
PH/DHRGSp115RhoGEF
Rho
CNK1 target/scaffold fehérje
MLK2 kináz
Jun → Jun-P
PH/DHRGSp115RhoGEF
Rho
CNK1 target/scaffold fehérje
MLK2 kináz
Jun → Jun-P
MKK7
PH/DHRGSp115RhoGEF
Rho
CNK1 target/scaffold fehérje
MLK2 kináz
Jun → Jun-P
MKK7
Gα12
PH/DHRGSp115RhoGEF
Rho
CNK1 target/scaffold fehérje
MLK2 kináz
Jun → Jun-P
MKK7
Gα12
LPA-RPlazmamembrán
PH/DHRGSp115RhoGEF
Rho
CNK1 target/scaffold fehérje
MLK2 kináz
Jun → Jun-P
MKK7
Gα12
LPA-RPlazmamembrán
PH/DHRGSp115RhoGEF
Rho
CNK1 target/scaffold fehérje
MLK2 kináz
Jun → Jun-P
MKK7
Gα12
LPA-RPlazmamembrán
Kísérleti tény:
CNK1 hiány: LPA-indukált jun-P hiányzik, de stressz-rost képzés változatlan
CNK1 túltermelés: (GEF/Rho63 indukált) jun-P ↑
stressz-rost képzés ↓ (Rho megkötése)
2. példa
Tiam-1
Rac
Conolly BA et al., MCB 25. 4602. 2005.
2. példa
Tiam-1
Rac
IBS/JIP2
siderophilinIRSp53
2. példa
Tiam-1
Rac
IBS/JIP2
siderophilinIRSp53
p38 MAP kináz
p70 S6 kináz
WAVE 2
Aktin citoszkeleton
2. példa
Tiam-1
Rac
IBS/JIP2
siderophilinIRSp53
p38 MAP kináz
p70 S6 kináz
WAVE2
Aktin citoszkeleton
IRSp53
Cdc42
Mena
filopódium képzés
IRSp53
Tiam-1
RacCdc42
DH/PH
IRSp53
Tiam-1
RacCdc42
DH/PH
IRSp53
Tiam-1
Rac
WAVE2
lamellipodium képzés
DH/PH
IRSp53
Tiam-1
Rac
WAVE2
lamellipodium képzés
DH/PHRasPDGF-R
IRSp53
Tiam-1
Rac
WAVE2
lamellipodium képzés
DH/PHRasPDGF-R
Kísérleti tény:
IRSp53 hiányban
PDGF-R indukált lamellipódium képzés ↓
3. példa
Cool-2/α-Pix
(Cloned out of library 2) (PAK-interactive exchange factor)
Feng et al., EMBO J. 23. 3492. 2004; Baird et al., Curr. Biol. 15. 1. 2005
Cool-2/α-Pix dimér mint Rac-GEF
Cdc42 → Rac aktiválás mechanizmusa
Cool-2/α-Pix monomer mint Cdc42-GEF
Gβγ + PAK kötődés
Cool-2/α-Pix monomer mint Cdc42-GEF
Gβγ + PAK kötődés
GEF-smg-target komplex
Gondolatok:
1. G-fehérje kaszkádok
Gα12 → p115RhoGEF → Rho
Ras → Tiam-1 → Rac
Cdc42 → Cool-2/α-Pix → Rac
2. smg kezd „beágyazódni”
(up-stream, down-stream kapcsolatok)
GAPok
Rho/Rac GAPok doménszerkezete
TiCB 13. 13-22. 2001
Lipidek részvétele GAP-ok szabályozásában
Chimaerin Rac PMA, DAG, stb. ↑ / ↓
ASAP1 ARF1, ARF5 PIP2 ↑
GIT ARF6 PIP3 ↑
ARAP1 ARF1, ARF5 PIP3 ↑
Rho =
ARAP3 ARF6 PIP3 ↑
Brown et al. MCB 18. 7038. 1998; Vitale et al. JBC 275. 13910. 2000; Miura et al. Mol. Cell 9. 109. 2002; Krugmann et al. Mol. Cell 9. 95. 2002
Antonny B. et al. JBC 1997. 272. 30848.
A PL szerkezet hatása az ARF-GAP1 aktivitására
Bigay J. et al. Nature 2003. 426. 563.
A vezikulaméret hatása az ArfGAP1 aktivitására
Bigay et al. Nature 2003. 426. 563
Az ARF-GAP1 szabályozásának modellje
ARF1.
Antonny B. et al. JBC 1997. 272. 30848-51
Az ARFGAP és ARFGEF lipid érzékenysége
Antonny B. et al. JBC 1997. 272. 30848-51
GTPáz 4 x FF GAP
A p190RhoGAP domén szerkezete
PKCSrc
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 min 15 min 15 min + PS
32P
-GT
P (
%)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 min 5 min 5 min + PS
32P
-GT
P (
%)
PS hatása az endogén GTPáz aktivitásra
Rho Rac
Ligeti et al. JBC 2004.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
1 10 100 1000
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
1 10 100
p190GAP relatív menyisége
Bou
nd 32
P-G
TP
(%
)
Bou
nd 32
P-G
TP
(%
)
PS hatása p190 Rho-GAP és Rac-GAP aktivitására
Rho Rac
+ PS
Ligeti et al. JBC 2004.
Rho
0
20
40
60
80
100
1 3 10 30 100
Relative amount of p190
Pro
tein
bo
un
d
[32
P]G
TP
(%
)
Rac
0102030405060708090
100
1 3 10 30 100
Relative amount of p190
Pro
tein
bo
un
d
[32
P]G
TP
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 3 10 30 100
Relative amount of p190
Hy
dro
lys
ed
[3
2P
]
(cp
m x
10
3 )
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 3 10 30 100
Relative amount of p190
Hy
dro
lys
ed
[3
2P
]
(cp
m x
10
3 )
[32P]GTP fogyás
alapján
[32P]foszfát keletkezés alapján
A kísérletek kontrollja
Ligeti et al. JBC 2004.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rho Rac
Pro
tein
bo
un
d [
32P
]GT
P (
%)
no SDS
+ SDS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Rho Rac
Pro
tein
bo
un
d [
32P
]GT
P (
%)
no PS
+ PS
PS és SDS hatása a p190 Rho- és RacGAP activitására
Ligeti et al. JBC 2004.
0102030405060708090
100
noPL
PC PE PS PI PIP2 PA
Prot
ein
boun
d [3
2P]-G
TP (%
)
0102030405060708090
100
no PL PC PE PS PI PIP2 PA
Prot
ein
boun
d [3
2P]-G
TP (%
)
Különböző PL-k hatása a p190 GAP activitására
Rho Rac
Ligeti et al. JBC 2004.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rho Rac
Pro
tein
-bou
nd [3
2P]G
TP (%
)
no PS, no PKC + PS +PS, +PKC
01020
3040506070
8090
100
Rho Rac
Prot
ein-
boun
d [3
2P]G
TP (%
)
A PKC hatása a p190 Rho- and RacGAP activitására
ATP jelen ATP nélkül
P190 kísérletek újdonsága:
GAP fehérje módosítása változtatja a
szubsztrát specificitást
Hasonló helyzet: MgcRacGAP
→ nem-foszforilált állapotban Rac/Cdc42-GAP
foszforiláció után: Rho-GAP is
Minoshima et al. Dev. Cell 4. 549. 2003.
Autoinhibició:
p50GAP – nyitja: smg prenil csoportja
RA-RhoGAP – nyitja: RapGTP kapcsolódás
funkció: neurit növekedésben
További példák GAP-szabályozásra
GAP hatástól független funkciók:
p190GAP
FF-domén TFII-I köt, citoszolba lokalizálja azt
FF-domén Tyr-foszforiláció → TFII-I elengedés → magba vándorol
Tumbleweed (RacGAP50C) (Droso)
axon növekedés – GAP hatás függő
citokinesis – GAP hatástól független
p50GAP
Sec14 domén lokalizálja,
Sec14 mutáció – de nem GAP domén mutáció – biológiai hatása
p50GAP eloszlása és biológiai hatása a Sec14 doménhoz kötött
Sirokmány et al. 2006 JBC. 281. 6096.
Rho-GDI
RhoGDIRacGDP
RhoGDP
P - RhoGDI
RacGDP → RacGTP
RhoGDP
PAK
X
P - RhoGDI
RhoGDP
PAK
X
Cdc42 / Rac
RacGDP → RacGTP
DerMardirossian C. et al. Mol. Cell 15. 117. 2004.
Gondolatok:
1. G-fehérje kaszkádok
Gα12 → p115RhoGEF → Rho
Ras → Tiam-1 → Rac
Cdc42 → Cool-2/α-Pix → Rac
Cdc42→ PAK → RhoGDI→ Rac
Rap → RA-RhoGAP → Rho↓
2. smg kezd „beágyazódni”
(up-stream, down-stream kapcsolatok)
IRODALOM
Bernards A.
GAPs galore! A survey of putative Ras superfamily GTPase activating proteins in man and Drosophila
BBA 1603. 47-82. 2003.
Bernards A. and Settleman J.
GAP control: regulating the regulators of small GTPases
Trends Cell Biol. 14. 377. 2004.