CROMATOGRAFA Determinacin Separacin Historia M. Tswett (1903) Martin y Synge (1941) Lacromatografaesunmtodofsicodeseparacinenel que los componentes de la muestra se distribuyen entre dos fases,unadelascualesesfijaoestacionariaylaotra mvil. La velocidad de desplazamiento es funcin del coeficiente de distribucin de cada componente entre las dos fases. ] [A] [A= DFMFEFE slido lquido gel FM gas lquido fluido sc Fundamento del proceso cromatogrfico Forma de realizar dicho proceso tipos de cromatografas tcnicas cromatogrficas lanaturalezadelasfasesmvily estacionariaylaclasedeequilibrios implicadosenlatransferenciadelos solutosentrelasfases,esdecir,el mecanismo de interaccin dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase mvil y la estacionaria Proceso por el cual la FM atraviesa la columna Eluyentecolumnaeluato Velocidad de flujo (mL/min) volumen de disolvente que atraviesa la columna por minuto Velocidad de flujo lineal (cm/min) longitud de columna atravesada por el disolvente en un minuto V0 Representafsicamentelosespaciosintersticiales entre las partculas empaquetadas en la columna que sonaccesiblesalaFM,eincluyeademslos volmenes internos del sistema Representacingrficadelarespuesta deldetectorenfuncindeltiempo, volumendeeluyenteodistanciaenel lecho cromatogrfico funcionamiento del sistema cromatogrficoInformacin analtica relativa a la muestra el tiempo que tarda el mximo de un pico en ser eluido despus de la inyeccin intervalo de tiempo que transcurre desde que el trazador es insertado al principio del lecho cromatogrfico hasta que sale del mismo t'R = tR - to t0 tR tR diferencia entre el tiempo de retencin del analito y el volumen muerto de la columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna comparado con un compuesto no retenido k' = ( tR - to ) / to Es la relacin entre el tiempo que las molculas del analito estn en la fase estacionaria y el que estn en la fase mvil. tR = t0 (1 + K') K'= KD K'= D m mS SV CV CFM la enpasa soluto el que tiempoFE la enpasa soluto el que tiempoK = =PesyPm,probabilidadesquetieneunanalitodeestarenlaFEoFM, respectivamente, coinciden con las fracciones del mismo en cada una de estas fases: Pes = K'/ 1+K' Pm = 1/ 1+K' Pmesequivalentealdenominadofactorde retraso, R, R = velocidad de desplazamiento del analito/velocidad de FM = 1 / 1+K' V= tF K' = V'R/V'0 VR = V'R + V0

volumen que ocupa en la columna la FM V0 = t0F volumen de FM necesario para que se produzca la elucin de un soluto VR = tRF V'R = t'RF VR = V0 (1 + K') La longitud de una columna en la que el soluto experimenta un equilibrio completo entre las dos fases La eficacia de la columna aumenta cuanto mayor es el nmero de platos tericos y menor la altura del mismo. Eficacia de una separacin cromatogrfica nmero de platos tericos (N) altura del plato terico (H) N = L/H Una columna cromatogrfica es ms eficaz cuando menores son los ensanchamientos de banda que origina N = tR2/ot2 N = 16 tR2 / Wb2 N = 4 tR2 / Wi2

= 5,54 tR2 / Wh2 |.|

\|+1,25BA1)W/t( 41,7 = N20, R velocidad finita a la cual el soluto alcanza el equilibrio entre ambas fases la forma resultante de la banda depende velocidad de elucin difusin del soluto a lo largo de la columna existenciadediferentescaminosquelasdiversas molculas de soluto pueden seguir cuando se mueven entre partculas de la fase estacionaria.estos efectos dependen de la velocidad con que la fase mvil atraviesa la columna, y constituyen un mecanismo diferente de ensanchamiento de banda cromatogrfica. Ecuacin de van Deemter para la AEPT H = A + B/u + Cu A, B y C son ctes caractersticas de un sistema dado: coeficiente de difusin aparente coeficiente de difusin longitudinal coeficiente de transferencia de masa Existeunavelocidadptima paraoperarconcualquier columna,alacuallaAEPT alcanza un valor mnimo H = B/u + CS u + CM u H : cm u: velocidad lineal de FM (cm/s) B, CS, CM: ctes relacionadas con las propiedades de la columna y del analito Mecanismo diferente de ensanchamiento de la banda Definelacapacidaddeunsistemacromatogrficoparadistinguirentre dos componentes. Es una funcin termodinmica que depende de las distribuciones relativas entre las fases mvil y estacionaria. Se expresa mediante el factor de selectividad o retencin relativa: o2,1 = t'R,2 / t'R,1 = k'2 / k'1 Para que una separacin sea posible, es necesario que los valores de Kde los componentes de la mezcla sean diferentes. Cuanto ms elevado es el valor de o , mayor es la selctividad de la FE, y ms fciles las separaciones Esunfactorqueserefierealacapacidaddeunsistema cromatogrficoparaseparardossustancias,teniendoencuentano slo la separacin entre picos, sino tambin los anchos de la bandaRs = 2(tR,2 - tR,1) / (wb,1 + wb,2)4Nk+ 1k1 -=R22sooSelectividad(o),serelacionaconlosvalores deretencinrelativaymideelpoder discriminatorio del sistema cromatogrfico. Retencin(k'),midelafraccindeeluito presenteenlaFEyexpresaelpoderde retencin del sistema cromatogrfico. Eficacia (N), mide la estrechez relativa de los picos mediante el nmero de platos tericos con que funciona la columna modificar o y K: variando la temperatura o la composicin de las fases cambiar N modificando la longitud de la columna, y H variando el caudal de fase mvil, el tamao de partcula del relleno, la viscosidad de la fase mvily el grosor de la pelcula de lquido adsorbido que constituye la fase estacionaria. Objetivo conseguir picos bien definidos y separados en el menor tiempo posible de anlisis variando las condiciones experimentales: velocidad de flujo, tamao de partculas de soporte, temperatura de la columna, seleccin de fase mvil y estacionaria ms adecuada, aumentando la longitud de la columna, etc La ecuacin de la resolucin sirve de gua para elegir las condiciones que permitan unabuenaseparacin:o,K'yNpuedenajustarsemsomenos independientemente. Aumento del nmero de platos de la columna mejora la resolucin: longituddelacolumna,temperatura,tipodeanalito, caudal,tamaodelamuestra,tcnicadeinyeccin, etc.El resultado es un estrechamiento de las bandas con el consiguiente aumento de la altura de las mismas; el tiempo de retencin prcticamente no se modifica. disminuireltamaodepartculadel relleno reducirlaviscosidaddelafasemvil lquida UnaumentodeK'generalmenteaumentala resolucin pero tambin el tiempo de elucin. Intervalo ptimo de valores de K: 1 a 5. Confasesmvilesgaseosas,K'puede mejorarse aumentando la temperatura Confasesmvileslquidas,cambiandola composicin del disolvente. Un aumento en el factor de selectividad produce un desplazamiento relativo de los mximos de las bandas, con un rpido aumento de la resolucin. Losprocedimientosparaaumentarosin modificarsignificativamenteK'son,pororden decreciente de conveniencia: 1. cambiar la composicin de la fase mvil incluyendo cambios en el pH (en separaciones de cidos o bases ionizables) 2. cambiar la temperatura de la columna, muy til sobre todo en cromatografa de cambio inico 3. cambiar la naturaleza de la fase estacionaria: disponer de varias columnas fcilmente intercambiables 4. utilizar efectos qumicos especiales; incorporar a la fase estacionaria una especia que forme complejos o interaccione de otra forma con uno o ms componentes de la muestra. Ejemplo: usar un adsorbente impregnado con una sal de plata mejora la separacin de olefinas debido a la formacin de complejos entre los iones plata y los compuestos orgnicos insaturados. CromatogramaDato de informacin cualitativa tR Sustanciadesconocidapodemos identificarla comparando su tRcon el de un patrn dependen de una variedad de condiciones experimentalesdividirlamuestraendosalcuotas:unade ellasdecromatografadirectamente, mientrasquealaotraseleadicionauna cantidaddadadeunasustanciapatrnque se sospecha existe en la muestra, y tambin se cromatografa.seobtieneconectandolalneadebasede cadaladodelpicopormediodeunalnea rectaymidiendoladistanciaperpendicular entre esta lnea y el pico precisin razonablemente grandeslopuedeusarsecuandolospicosson agudos, estrechos y estn bien separados. mayor precisin: independientes de los efectos de ensanchamiento debido a las variablesexperimentales integradores electrnicos digitalesestimacin manual: triangulacin, planmetro, pesada Paraqueestemtodoseaexacto,debendarselas siguientes condiciones: 1. Todos los analitos deben ser eluidos 2. Todos los analitos deben ser detectados 3.Todoslosanalitosdebentenerlamisma sensibilidad %A = rea del pico A/Ereas x 100 fx = fs (As/Ax) (wx/ws) %X = (Ax fx)/E(Ai fi) 100 requiere un mtodo muy reproducible de introduccin de la muestra1.Debeeluirprximoalospicosdeinters, pero 2. Debe estar bien resuelto de ellos. 3.Debeserqumicamentesimilaralos analitosynoreaccionarconningn componente de la muestra. 4.Comocualquierestndardebeestar disponible en forma pura.