Professora Cludia Sampaio de Andrade Lima

Recife - 2009

INTRODUO

Cromatografia um processo fsico de separao, no qual os componentes a

serem separados distribuem-se em duas fases: fase estacionria e fase mvel.

Em sua expresso mais simples, podemos definir a cromatografia como um

processo de anlise imediata por migrao diferencial dos componentes de uma mistura,

dentro do sistema cromatogrfico.

As origens da Cromatografia esto muito relacionadas com o estudo de produtos

naturais e as dificuldades em relao purificao desses compostos levaram melhoria

na performance dos processos de extrao e isolamento.

Para resolver problemas de anlise, indispensvel a escolha da tcnica

cromatogrfica mais apropriada, em funo da natureza das substncias a separar.

Uma grande parte dos problemas de separao de compostos orgnicos so

resolvidos com o conhecimento dos fenmenos de adsoro e partio, porm a

cromatografia, nas suas vrias verses, um mtodo de escolha na separao de

biomolculas. Somente na rea de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)

encontram-se aplicaes na indstria farmacutica, biotecnologia, investigao

biomdica e bioqumica, energia, alimentao, cosmticos, meio ambiente e vitaminas.

Com o crescente interesse no descobrimento de novos metablitos de vrias fontes

(vegetal, de microrganismos e organismos superiores marinhos e terrestres) existe a

necessidade de separao de misturas em pequenas quantidades, de maneira rpida,

eficaz e econmica.

HISTRICO

Em 1906, um botnico russo, chamado TSWETT, estudava os pigmentos dos

vegetais. Ele queria filtrar uma soluo de pigmento de folhas verdes em ter de

petrleo, com a ajuda de um tubo de vidro cheio com carbonato de clcio. Ele observou

a formao de uma srie de bandas horizontais coloridas, amarelas e verdes,

correspondentes aos diferentes constituintes da mistura, que se encontravam assim

fracionados. Desta forma foi lanada a base da tcnica cromatogrfica.

Vinte e cinco anos passaram-se at que, em 1931, KUHN e LEDERER mostram

a importncia da tcnica de TSWETT, na separao de a e -carotenos.

Em 1941, MARTIN e SYNGE, estudando a solubilidade de aminocidos

acetilados em diferentes solventes, descobriu a cromatografia de partio, cromatografia

lquido-lquido (contra-corrente).

CONDSEN e CORDON foram os precursores da cromatografia de partio

sobre papel, utilizando uma coluna de vidro cheia de rodelas de papel de filtro

superpostas, para a separao de amino-cidos no acetilados.

Em 1938, IZMAILOW e SCHRAIBER, descreveram um mtodo onde utilizava-

se camadas finas de alumina sobre placas de vidro. Onze anos depois, MEINHARD e

HALL introduziram a utilizao do amido, como ligante do adsorvente (alumina)

distribudo sobre as placas de vidro. Mas, foi STAHL, a partir de 1958, que

padronizando o mtodo da cromatografia em camada fina, mostrou sua utilidade geral e

fez com que ela adquirisse considervel importncia na maioria dos laboratrios.

A cromatografia em fase gasosa, utilizada na prtica por JAMES e MARTIN em

1952, uma aplicao da cromatografia de adsoro e da cromatografia de partio.

destinada a separar compostos gasosos. Esta tcnica foi idealizada desde o incio por

MARTIN e SYNGE.

Um dos ltimos princpios utilizados foi o da cromatografia por troca inica. Um

trocador de ons um composto que porta ons relativamente mveis, que podem, em

presena de uma soluo, serem trocados pelos ons livres da soluo. Em 1856,

THOMPSON colocou este fenmeno em evidncia. Depois, em 1907, GANS preparou

trocadores de ons artificiais.

Em 1976, foi introduzido o conceito de cromatografia a mdia presso para a

separao de diastereoismeros de oxazolidinas.

PRINCPIOS

Sistema cromatogrfico o conjunto formado pela mistura a ser analisada, pela

fase fixa e pela fase mvel. A fase fixa, tambm chamada fase estacionria, o meio

constitudo ou suportado por um slido poroso, cuja funo reter os solutos. A fase

mvel o solvente, neste caso chamado de eluente, que flui atravs da fase fixa, e tem

como funo deslocar os solutos. Neste sistema, a mistura de solutos levada a migrar

atravs da fase fixa, por meio de fluxo constante da fase mvel, sendo a diferena de

velocidade de migrao (migrao diferencial) provocada por processo de competio

pelo soluto, entre as duas fases.

Tipo de cromatografia

Natureza da fase estacionria

Natureza dos compostos a separar

Adsoro Slica gel A maior parte dos compostos orgnicos simples; os ismeros geomtricos. As molculas contendo vrios grupos polares, as substncias com carater eletroflico, as substncias com alto peso molecular. Os pesticidas.

xido de alumnio As vitaminas solveis, os alcalides, os corantes alimentares, os plastificantes, etc. As substncias com carter nuclefilo.

Partio Lquido imiscvel com a fase mvel (normalmente de alta polaridade)a

Aucares e compostos anfotros (aminocidos)

Troca de ons Resinas trocadoras de ons: Ex.: Amberlite, Dowex

Compostos cuja carga eltrica depende do pH (nucleotdeos, cidos carboxlicos, etc)

Excluso Gel com propriedades elsticas, que permitem a passagem de substncias at um determinado tamanho molecular

Grupos de substncias com similaridade fsico-qumica e pequenas diferenas no tamanho molecular.

Bioafinidade Matriz de ancoragem, ligada a um suporte neutro

Tcnica exclusiva de purificao de substncias que contm especificidade molecular, a exemplo de antgenos, hormnios, vacinas, enzimas, etc.

CROMATOGRAFIA POR ADSORO

Adsoro um fenmeno fsico-qumico atravs do qual um slido

(adsorvente) fixa em sua superfcie um lquido ou um gs, por meio de interaes

semelhantes s foras de Van Der Waals. Chama-se coeficiente de adsoro relao

kN

Na

a

n

=

onde Na e Nn so respectivamente o nmero de moles adsorvidos e no adsorvidos de

uma determinada substncia. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka,

estes variando com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de

vrios componentes forada a passar atravs de um tubo contendo um adsorvente

(coluna cromatogrfica), cada componente necessitar de um intervalo de tempo

diferente para transpor a coluna. Esse intervalo de tempo denominado tempo de

reteno (Tr). A Figura 2.1a ilustra um processo de Cromatografia por Adsoro. A

substncia mais fortemente adsorvida mais dificilmente arrastada pela Fase Mvel.

Figura 1: Diferena entre Cromatografia de Adsoro e Cromatografia de Partio

CROMATOGRAFIA POR PARTIO

Se uma substncia adicionada a um recipiente contendo dois lquidos no

miscveis, ela se dissolver parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a

relao C1 / C2, onde C1 e C2 so as concentraes da substncia em cada um dos dois

lquidos. Denomina-se coeficiente de partio relao

kC

Cp =

1

2

A separao de substncias contidas em uma amostra atravs do mtodo da

Cromatografia por partio se d atravs dos coeficientes de partio de cada

substncia.

Coeficiente de partio : a razo das concentraes de um soluto em presena de dois

solventes no miscveis, em equilbrio. O conhecimento do coeficiente de partio nos

permite estudar o fenmeno que ocorre na cromatografia de coluna.

SUPORTES PARA CROMATOGRAFIA DE PARTIO:

Terras de diatomcea - A fase estacionria tambm constituda por gotculas

microscpicas, retidas nas carapaas da diatomita. O fenmeno de adsoro neste caso

bastante reduzido e trata-se de uma partio lquido-lquido tpica.

Amido de batata - O amido pode reter at 35% de gua e constitui um bom suporte

para uma fase estacionria. Entretanto, no possui uma grande capacidade de separao,

mas o emprego de colunas grandes, permite a preparao de quantidades relativamente

grandes. Os fenmenos de adsoro so de certa forma, intensos, quando as colunas so

utilizadas para separar diferentes substncias (por exemplo, misturas simples de

aminocidos), observa-se que a adsoro praticamente o nico fenmeno envolvido.

Celulose - Nas colunas por partio a celulose bastante utilizada, sobretudo sob a

forma de ps. A celulose um suporte hidroflico, porm , existe a possibilidade de

preparao de celuloses hidrofbicas para a cromatografia de fase inversa.

CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL

A cromatografia em papel (CP) uma das tcnicas mais simples e que requer

menos instrumentos para sua realizao, porm a que apresenta as maiores restries

para sua utilizao em termos analticos.

Este um mtodo de extenso da cromatografia de partio sobre colunas de

celulose, idealizado por CONSDEN, GORDON e MARTIN. Podemos considerar que o

papel constitui um suporte inerte, que retm uma fase estacionria aquosa. A partio

efetuada entre a fase aquosa fixa e a fase orgnica mvel

A apario de novas tcnicas utilizando papis como trocadores de ons,

de celuloses hidrofbicas, de celuloses adsorventes, transformou este mtodo em uma

tcnica universal de micro-anlise.

Na cromatografia de papel, empregam-se quantidades de amostra na

ordem de microgramas ou miligramas. A resoluo depende da concentrao e do

dimetro da mancha aplicada. As substncias hidroflicas so separadas com facilidade,

enquanto as hidrofbicas requerem tratamento especial do papel. As fases mveis

devem estar saturadas com gua. Utilizam-se cubas vedadas e de preferncia com

saturao do solvente antes do incio da separao cromatogrfica. O desenvolvimento

pode ser ascendente, descendente, circular ou horizontal.

Fase mvel - A fase mvel em cromatografia sobre papel varivel e possui maior

efeito nas separaes dos componentes de uma mistura. Considerando um par de

lquidos, o menos polar funciona como fase mvel e o mais polar, como fase

estacionria.

CROMATOGRAFIA CIRCULAR

O papel recortado em forma de um crculo. No centro deste feito um pequeno

orifcio. As substncias so colocadas sobre uma circunferncia em torno do centro. O

crculo de papel ento colocado em uma cuba circular, o solvente derramado a partir

da parte inferior da cuba e conduzido por capilaridade at a poro central do papel. As

substncias se apresentam ao final da migrao como arcos em torno do centro.

OS PAPIS PARA CROMATOGRAFIA.

Papis simples - Os primeiros ensaios foram conduzidos sobre papis de filtro comuns.

Porm a sua qualidade era inadequada, levando necessidade de preparao de papis

especiais, que conduzissem a resultados reproduzveis, sendo necessrio uma certa

regularizao na sua fabricao e os papis deviam apresentar um certo grau de pureza.

Atualmente, os diferentes papis se destacam pela sua eficincia, sua durabilidade e

pelo seu grau de pureza.

Papis especiais - So papis com propriedades adsorventes. Eles foram criados para

adaptar as vantagens da cromatografia de papel cromatografia de adsoro. Para tal,

fixa-se sobre o papel (entre as fibras de celulose) uma substncia dotada de

propriedades adsorventes, principalmente a alumina e a slica.

REVELAO

Quando est terminada a migrao do solvente, conveniente que o

cromatograma seja submetido a um tratamento, de forma a colocar em evidncia as

substncias separadas. A revelao no apenas torna visveis as substncias incolores,

mas tambm facilita a identificao destas substncias. Isto possvel pela pulverizao

de reativos especficos ou de procedimentos fsicos convenientes.

CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA OU CROMATOGRAFIA EM

CAMADA DELGADA (CCD)

Podemos subdividir a CCD em trs gupos:

a)Anlise qualitativa, que permite determinar o nmero dos constituintes de

uma mistura desconhecida e qual a fase mvel e estacionria, ideais para a separao

cromatogrfica.

b) Anlise preparativa, que permite, aps separao de pequenas quantidades

de substncias para estudos qumicos ou fsico-qumicos, purificao de pequenas

quantidades dos constituintes.

c) Anlise quantitativa, que consiste em determinar as propores exatas de

cada um dos constituintes da mistura.

TCNICA:

Um adsorvente, selecionado de acordo com as caractersticas da amostra,

disposto sob a forma de uma camada fina sobre uma placa de vidro. Aps ativao pelo

calor, seguida do depsito das substncias a analisar. A placa colocada em uma cuba

fechada contendo o solvente. Terminada a migrao, os resultados sero observados

utilizando diferentes mtodos de revelao. A Figura 2. ilustra o processo.

O lquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os componentes

de uma mistura binria (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicao). Quando o solvente

se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta removida da cuba que contm o

solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posio vertical e a um nvel

abaixo do ponto de aplicao. As razes de frente, RfA = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 so

caractersticas de cada substncia, dependendo da natureza da fase mvel e da fase

estacionria. A Cromatografia em Camada Delgada a mais empregada em Anlise

qualitativa ou semi-quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra

utilizada, menos indicada para fins preparativos. quando necessrio se obter uma

quantidade maior das substncias puras, emprega-se a cromatografia em coluna.

Fig. 2 - Cromatografia em Camada Delgada.

Neste exemplo, a amostra contm dois componentes, A e B, que so identificados pelos respectivos valores de Rf

CLCULO DO Rf:

Se a amostra uma mistura, cada constituinte possuindo um coeficiente de

adsoro prprio e uma afinidade prpria, quando arrastado pelo solvente, progride com

uma velocidade que lhe caracterstica, sendo simbolizada por seu Rf. Este expresso

pela relao :

distncia percorrida por uma molcula Rf = ----------------------------------------------------

distncia percorrida pelo front do solvente

Substitumos tambm esta expresso, pela expresso mais reprodutvel :

distncia percorrida por uma molcula de referncia Rf = ---------------------------------------------------------------

distncia percorrida por uma molcula X

VANTAGENS DESVANTAGEM

- Optimizao fcil e rpida - Difcil reprodutibilidade do Rf

- Durao curta de desenvolvimento da placa

- O adsorvente pode suportar a ao enrgica

do revelador

- Separaes mais claras

- Utilizao de quantidades muito pequenas

- Vasto domnio de aplicao

CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA CENTRFUGA

A tcnica de cromatografia em camada fina centrfuga foi desenvolvida para

resolver alguns problemas da cromatografia preparativa em camada fina, nas quais o

tempo de migrao e a remoo das bandas das substncias no fcil ou eficiente. Esta

tcnica baseia-se na ao da fora centrfuga para acelerar o fluxo da fase mvel atravs

de uma placa circular.

Caronna (1955) introduziu a cromatografia centrfuga, que um mtodo em

que um rotor formado por duas placas circulares sustentavam uma folha de papel

cromatogrfico, tambm circular.

Aps varias tentativas de optimizao do mtodo, Heftmann et al. (1972)

conseguiram separaes mais eficientes. Eles utilizaram uma mistura de purinas,

cafena, teobromina, teofilina e xantina que puderam ser rapidamente em slica gel, em

quantidades de 5 mg.

Mesmo com o desenvolvimento de outros prottipos de cromatografia

centrfuga (Hostettmann, 1988), esta tcnica no alcanou grande sucesso, at o

lanamento de aparelhos chamados cromatotrons.

O cromatotron (figura 5) possui um rotor inclinado, ao contrrio, ao contrrio

dos seus antecessores que possuam um rotor plano. O corao do aparelho uma placa

de cristal circular de 24cm de dimetro, que coberta com o adsorvente adequado, a fim

de proporcionar uma camada delgada para as separaes preparativas.

A placa preparativa colocada no centro de um motor eltrico e colocada para

girar a 800 rpm. O eluente introduzido no centro da placa (que no contm

adsorvente), por uma bomba a pisto capaz de proporcionar um fluxo de 1 10

mL/min, que vai atravessar a camada delgada por fora centrfuga. A amostra ento

inserida e adiciona-se o eluente, mantendo-se um fluxo isocrtico ou introduzindo um

gradiente de concentrao at a purificao dos constituintes da amostra, a um fluxo de

3 6 mL/min. Observa-se a formao de bandas concntricas e as substncias so ento

separadas e coletadas na periferia, atravs de um tubo de sada. As fraes obtidas

podem ser analisadas atravs de CCD.

OS REVELADORES

So substncias capazes de complexar alguns compostos incolores em placas

cromatogrficas. Esta complexao pode ocorrer de forma inespecfica ou especfica.

importante que as placas sejam borrifadas uniformemente para que haja uma perfeita

visualizao dos compostos a serem revelados.

A visualizao pode ser efetuada inclusive atravs de mtodos fsicos, o que

permite a revelao de alguns compostos sem alterar a sua estrutura qumica. o caso

da exposio das placas luz ultravioleta ou a vapores de iodo.

Muitos so os agentes cromognicos empregados tanto na cromatografia

de papel como na cromatografia em camada fina, sendo que em geral so bem mais

sensveis na segunda. Uma das vantagens da CCD sobre o papel permitir a utilizao

de reveladores enrgicos ou que necessitem aquecimento posterior borrifao. Em

geral os mtodos qumicos de revelao so destrutivos e utilizados apenas em

separaes analticas. A seguir apresentamos um quadro com alguns exemplos de

reveladores utilizados na cromatografia em camada fina analtica.

Exemplos de Reveladores Qumicos:

Classes de compostos Reveladores

Aminocidos Ninhidrina

Fenis em geral FeCl3

Taninos FeCl3

Alcalides Reativo de Dragendorff

Reativo de Mayer

Reativo de Hagen

Esterides H2SO4

Triterpenides H2SO4

Flavonides Reativo de Neu

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

A cromatografia em coluna aberta convencional, universalmente etuilizada

pela sua simplicidade de operao.

Neste tipo de processo, a fase estacionria colocada em um tubo de vidro

(coluna cromatogrfica) colocado na posio vertical. A coluna dotada de uma

torneira na extremidade inferior (Fig. 3), que utilizada para controlar a vazo da fase

mvel, que desce por gravidade.

Figura 3- Cromatografia em coluna

O ponto A indica o nvel da fase estacionria e o ponto A indica o nvel

da fase mvel. A diferena A - A deve ser o menor possvel, para evitar a diluio

do material a ser cromatografado, o que resultaria em zonas (na Fig. 2.3, as faixas

1, 2 e 3) mais largas.

CROMATOGRAFIA LQUIDA SOB PRESSO (FLASH)

A expresso cromatografia lquida sob presso refere-se a qualquer tipo

mtodo que envolva aplicao de presso em uma coluna cromatogrfica, como forma

de se distinguir das separaes cromatogrficas por gravidade. Como resultado, podem-

se incluir todas as categorias desde cromatografia lquida flash (2 bar) at a CLAE

preparativa (100 bar), e as quantidades de amostras de g at Kg.

A diferena entre a cromatografia preparativa e a analtica que, enquanto a

ltima (empregada para separao, identificao e determinao) no se preocupa com a

recuperao da amostra, a cromatografia preparativa uma processo de purificao e

permite o isolamento de substncias puras contidas em uma mistura.

O termo preparativa refere-se a qualquer tipo de separao que no seja para

fins analticos. A quantidade de material puro requerido depende da finalidade para o

qual ser empregado:

Quantidades entre g a mg para identificao espectroscpica, como o

isolamento de produtos naturais;

Quantidades em mg para identificao posterior, reaes qumicas e

ensaios biolgicos;

Quantidades em g para ensaios biolgicos posteriores, trabalhos de sntese

e semi-sntese e isolamento de produtos de referncia.

A figura 4 representa os limites de aplicao aproximados dos diferentes

mtodos.

CLAE analtica

CLAE preparativa

CL baixa presso

CL flash

CL mdia presso

+ + + +

g 1 mg 10 mg 100mg 1 g

Quantidades de material a separar

Figura 4 Diviso aproximada dos mtodos de cromatografia lquida sob

presso, de acordo com a escala preparativa requerida.

OUTROS EXEMPLOS DE MTODOS CROMATOGRFICOS:

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSO

A cromatografia por excluso, tambm conhecida como filtrao gel, permeao

em gel e peneira molecular, um mtodo que promove uma seletiva e dinmica

distribuio das molculas do soluto entre duas fases lquidas separadas, e dependentes

de uma estrutura estacionria, contendo poros de tamanho controlado.

Fase estacionria

O termo gel, refere-se a um material elstico que contm gua. Este possui uma

estrutura tridimensional, cuja estabilidade mecnica dada pelo material contendo

espaos (poros) que contm lquido. Partculas pequenas do melhor resoluo e

eficincia. O aumento do tamanho das partculas resulta em espalhamento da zona nos

interior dos poros. O gel quimicamente definido, deve permitir variaes para o

fracionamento em diferentes intervalos de massa molecular.

TIPOS DE GIS

Gis de dextrano (SEPHADEX) - um tipo de polissacardeo com unidades de

glicose, obtido por fermentao de sacarose. Os diferentes tipos so caracterizados por

ligaes cruzadas entre as cadeias polissacardicas que quando entram em contato com a

gua, incham e produzem um gel com estrutura tridimensional..

Gis de poliacrilamida (BIO-GEL) - O polmero de poliacrilamida constitudo a

partir de ligaes cruzadas entre as cadeias de molculas de acrilamida (H2C=CH-CO-

NH2). As matrizes do bio-gel se assemelham quelas do sephadex, como os intervalos

de fracionamento e as propriedades de resistncia presso, para os gis que

apresentam o mesmo grau de absoro de gua.

Gis de gar e agarose - As propriedades cromatogrficas do gar fazem com que estes

gis sejam compmplementares aos gis de sephadex e poliacrilamida. O gar obtido

de algas e se constitui de polissacardeos lineares de lactose e dioxi-L-galactose.

Considera-se que o tamanho dos poros e a estabilidade dos gis de gar sejam

conseqncia da formao de microcristais.

Tamanho da amostra

Para uma boa resoluo, a zona em que est a amostra deve ser pequena em

relao ao comprimento da coluna (1 a 5% do tamanho da coluna) e possuir uma baixa

viscosidade, para no ocasionar uma vazo irregular entre as zonas do gel.

FASE MVEL

O sucesso do processo cromatogrfico, depende, entre outras coisas, do

comportamento dos solutos e das caractersticas destes e da fase mvel dentro da

coluna. Durante uma separao cromatogrfica, a concentrao das substncias

separadas, pode ser determinada no lquido por diferentes mtodos. Pela reteno do

soluto na fase estacionria, cada zona se movimenta com uma velocidadde caracterstica

. O eluente deve apresentar uma relao de viscosidades em relao ao soluto de at

duas vezes. As solues tampo so normalmente os eluentes de escolha pra

cromatografia por excluso.

APLICAES DA CROMATOGRAFIA DE FILTRAO GEL

Este mtodo permite estudar particularmente, os pesos moleculares de

protenas, em condies variadas de pH, temperatura e fora inica.

Outros usos compreendem a determinao da massa molecular de polmeros

naturais e sintticos, possibilidade esta que atualmente primordial para o controle de

qualidade destes compostos.

CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA

A cromatografia de troca inica, que geralmente chamada de cromatografia

inica, refere-se a mtodos modernos e eficientes de separao e determinao de ons

com base em resinas trocadoras de ons. A cromatografia inica foi desenvolvida em

meados dos anos 1970, quando foi mostrado que misturas de ction e nion podem ser

facilmente resolvidas em colunas cromatogrficas.

A cromatografia inica foi conseqncia de troca inica, desenvolvida durante

o projeto Manhattan para a separao de ctions de terras raras de propriedades

semelhantes entre si, com resinas trocadoras de ctions. Esse trabalho monumental, que

forneceu a base terica das separaes de troca inica, aps a Segunda guerra Mundial,

foi estendido para muitos outros tipos de materiais. Em ultima analise, levou aos

mtodos automticos para separao e deteco de aminocidos e outras espcies

inicas em misturas complexas.

APLICAES DA CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA:

Purificao de protenas

Purificao de antibiticos (caldos . de fermentao)

CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE

um tipo de cromatografia que baseia-se nas propriedades biolgicas das

macromolculas biolgicas e permite o isolamento seletivo destas, atravs da utilizao

das propriedades dessas substncias de unirem-se reversivelmente a ligantes especficos

que se encontram imobilizados covalentemente matriz ou suporte. A eluio das

molculas ligadas pode ser feita por al;terao do pH e/ou fora inica do meio, que

tornam o complexo molcula-ligante menos estvel, levando dissociao do mesmo, o

que conduz sua purificao. O mtodo da cromatografia de bioafinidade assemelha-se

ao tipo de ligaes que ocorrem entre os antgenos e os anticorpos.

Fase Estacionria- de extrema importncia a escolha das matrizes de ancoragem,

utilizadas na cromatografia de bioafinidade. Estas matrizes devem apresentar

estabilidades mecnica e qumica nas condies de acoplamento. Devem ser uniformes,

esfricas, rgidas e porosas, e que permitam boas condies de vazo, mesmo aps o

acoplamento. As substncias comumente usadas como matrizes so a agarose, o

dextrano, a poliacrilamida e outros polmeros, partculas porosas de alumina, vidro de

porosidade controlada e algumas associaes destes.

Acoplamento do ligante matriz - O acoplamento de ligantes especficos pode ser

realizado diretamente na matriz ativada ou em grupos funcionais disponveis. A

eficincia do processo de acoplamento, geralmente aumenta com a concentrao do

ligante. Estas reaes ocorrem normalmente em meio levemente alcalino (pH 8 - 9),

utilizando-se tampes borato ou bicarbonato.

MTODOS DE ELUICO

A eluio do material ligado fese estacionria realizada tanto com agentes

especficos como com agentes no especficos.

A utilizao de agentes de eluio especficos baseada na ligao preferencial

dessa substncia com o agente especfico ao invs da fase estacionria. Geralmente os

agentes de eluio especficos possuem estrutura qumica semelhante ao ligante da fase

estacionria.

Na utilizao de agentes de eluio no especficos h a formao de

complexos entre a substncia alvo com o ligante especfico, o que envolve ligaes

fracas como interaes eletrostticas e hidrofbicas, ou pontes de hidrognio isoladas ou

em conjunto, onde a variao do pH e/ou fora inica do tampo so os recursos

utilizados para provocar alteraes no complexo formado ou modificam e estrutura

qumica deste.

APLICAES

A cromatografia de bioafinidade aplicada para a purificao de enzimas como

a catalase e a celulase, antibiticos, antigenos, cidos nuclicos, drogas ou receptores

hormonais, e pequenas molculas como peptdeos sintticos e naturais.