Universidade Tecnolgica Federal do Paran Campus Campo Mouro

Coordenao de Alimentos Disciplina de Microbiologia

Profa. Mrcia R. F. G. Perdoncini AULA PRTICA 9 e 10: Tcnicas de semeaduras de microrganismos INTRODUO Ao se inocular um microrganismo em um meio de cultura adequado para seu crescimento in vitro, esse microrganismo inicia o seu desenvolvimento nesse meio. A inoculao correta da amostra um dos passos mais importantes na identificao de um patgeno e pode ser feita por meio de swabs, ou de outras fontes, com uso de alas de inoculao devidamente esterilizadas. Os meios devem ser sempre examinados antes da inoculao a fim de que se verifique a presena de contaminantes j existentes na placa. Bactrias so semeadas em meios lquidos ou em meios slidos. Aps a inoculao, a placa ou o tubo, devidamente rotulado, colocado em uma incubadora a 37C por 24 a 48 horas. Quando ocorre o crescimento bacteriano em um meio slido, as bactrias so representadas em padres caractersticos, denominados colnias, grandes grupos de clulas bacterianas. Em meios lquidos, o crescimento mostra-se evidente pela existncia de turvao do lquido. As estrias da semeadura so feitas a fim de que se consiga o isolamento dos organismos. Como cada espcie possui um tipo morfolgico colonial diferente, deve ser feita a anlise quanto elevao, forma, ao tamanho, s bordas e pigmentao. Em um meio de cultura, um nico tipo de colnia observado denominado cultura pura. Se forem observados vrios tipos, denomina-se cultura mista. H vrias tcnicas de inoculao de microrganismos. Algumas so utilizadas para exames qualitativos e outras, para estudos quantitativos. OBJETIVOS - Realizar inoculao em meios de cultura lquidos, slidos em placa e inclinados (semi-slidos), verificando a presena ou ausncia de crescimento bacteriano; - Realizar semeadura em profundidade; - Realizar semeadura em superfcie. MATERIAIS

Tubos de soluo salina estril (9,9mL) ;

Suspenses bacterianas (Escherichia coli) Staphylococcus aureus e mista);

Tubos de meio lquido tioglicolato; Tubos com Agar nutriente inclinado; Tubos com Agar semi-slido (SIM); Placas de EMB ou McConkey.

PROCEDIMENTO Prtica

A) Tcnica de semeadura em meio lquido- tubos de meio lquido tioglicolato;

Flambar a ala de inoculao ao rubro e, a seguir, deix-la esfriar perto da chama do bico de Bunsen;

Tomar o tubo a ser inoculado e identific-lo;

Tomar o tubo com a cultura bacteriana com a mo esquerda e agit-lo levemente;

Retirar o tampo de algodo com o dedo mnimo da mo direita e flambar a boca do tubo;

Introduzir a ala at tocar o meio e retir-la aps coletar uma gota da suspenso;

Flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo;

Tomar o tubo com o meio esterilizado com a mo esquerda, retirar o tampo de algodo com o dedo mnimo da mo direita e flambar a boca do tubo;

Introduzir a ala carregada de microrganismo no interior do tubo, levando-a, delicadamente, ao interior do meio lquido;

Retirar a ala, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo;

Colocar o tubo na estante, flambar a ala e recoloc-la na estante.

B) Tcnica de semeadura em meio slido inclinado (esgotamento): tubos com gar nutriente inclinado

Flambar a agulha de platina ao rubro e a seguir, deix-la esfriar perto da chama do bico de Bunsen;

Tomar o tubo a ser inoculado e identific-lo;

Tomar o tubo com a cultura bacteriana com a mo esquerda e agit-lo levemente;

Retirar o tampo de algodo com o dedo mnimo da mo direita e flambar a boca do tubo;

Introduzir a agulha at tocar o meio e retir-la aps coletar uma gota da suspenso;

Flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo;

Tomar o tubo com o meio esterilizado com

a mo esquerda, retirar o tampo de algodo com o dedo mnimo da mo direita e flambar a boca do tubo;

Introduzir a agulha carregada de microrganismo no interior do tubo, levando-a, delicadamente, ao interior do meio inclinado, fazendo estrias na superfcie do Agar com a agulha;

Retirar a agulha, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo;

Colocar o tubo na estante, flambar a ala e recoloc-la na estante.

C) Tcnica de semeadura em meio semi-slido em tubo (repicagem profunda)- MEIO SIM

Flambar a agulha de platina ao rubro e, a seguir, deix-la esfriar perto da chama do bico de Bunsen;

Tomar o tubo com a cultura bacteriana com a mo esquerda e agit-lo levemente;

Retirar o tampo de algodo com o dedo mnimo da mo direita e flambar a boca do tubo;

Introduzir a agulha at tocar o meio e retir-la, aps coletar uma gota da suspenso;

Flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo;

Tomar o tubo com o meio esterilizado com a mo esquerda, retirar o tampo de algodo com o dedo mnimo da mo direita e flambar a boca do tubo;

Introduzir a agulha carregada de microrganismo no interior do tubo, levando-a, delicadamente, ao interior do meio semi-slido;

Inocular a cultura de bactrias em meio semi-slido, utilizando a agulha de platina. A inoculao dever ter a profundidade de dois teros do meio semi-slido ao qual se aplicar uma, e apenas uma picada;

Retirar a agulha, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de algodo;

Colocar o tubo na estante, flambar a ala e recoloc-la na estante.

D) Tcnica de semeadura em meio slido em placa (esgotamento) usar cultura mista em McConkey A tcnica de esgotamento em placa

consiste em depositar sobre um ponto da superfcie do meio uma parte do material e, depois, espalh-la de maneira a se obter quantidades progressivamente menores do material. O objetivo obter colnias isoladas.

O sucesso da semeadura est em:

- No haver um grande nmero de estrias; - No perfurar o meio; - Pegar uma pequena quantidade de

material para semear.

Prtica

E) Tcnica de semeadura em placa Pour Plate

A tcnica Pour Plate pode ser realizada com o objetivo de se obter colnias isoladas (estudo qualitativo), ou de se fazer a contagem de colnias em placa (estudo quantitativo). A seguir, ser visto o procedimento para a realizao do estudo quantitativo, determinando o nmero de UFC (unidades formadoras de colnia) por mililitro.

Agitar a cultura da bactria e transferir 0,1mL para 9,9mL de lquido de diluio (1:100);

Agitar esse tubo e transferir 0,1mL para outro tubo com 9,9mL (1:10.000);

A seguir, realizar nova diluio, transferindo 0,1mL do ltimo tubo para outro com 9,9mL de lquido de diluio (1:1.000.000);

Aps realizar as diluies, fazer o plaqueamento ao se agitar e retirar 1mL de cada diluio, transferindo-os para placas estreis;

Em seguida, colocar de 15 a 20mL de Agar fundido em cada uma delas;

Submeter as placas a suaves movimentos

rotatrios (em forma de oito), visando perfeita mistura da cultura com o Agar;

Esperar solidificar; Inverter as placas e incubar a 37C por

48horas.

F) Tcnica de semeadura em placa Spread Plate

Aproveitar a mesma diluio da semeadura em placa Pour Plate;

Fazer o plaqueamento ao agitar, e retirar 0,1mL de cada diluio, transferindo-os para a placa com o Agar j solidificado;

Com a ala de Drigalski esterilizada, espalhar os inculos para as superfcies dos meios de cultura, comeando do mais diludo para o menos diludo;

Incubar a 37C por 48horas.

EXERCCIOS DE FIXAO

1. Quais so as formas de crescimento bacteriano? Explique-as.

2. O que se entende por colnia de microrganismo?

3. Como pode ser obtida uma cultura pura de bactria?

4. Explique a diferena entre as tcnicas de semeadura em Pour Plate e em Spread Plate.

5. Como se calcula o nmero de UFC/ml de microrganismos inoculados na tcnica de Pour Plate?

6. Como se calcula o nmero de UFC/ml de microrganismos inoculados na tcnica em Spread Plate?

REFERNCIAS OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologia- roteiros de aulas prticas. So Paulo: Tecmedd, 2008.