Funkcije proteinov• Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen ...)

• Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb)

• Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini)

• Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Imunoglobulini)

• Lipoproteini, potrebni za transport lipidov po telesu

• Kontraktilni proteini

• Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko membrane

• Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze ...)

• Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

Membranski proteini in transport

- Sestava in struktura membrane

- Dinamika membrane

- Transport čez membrano

http://en.wikibooks.org/wiki/File:Membrantransport.png

Vsako kraljestvo, vrsta, tkivo, tip celic in organel ima značilen set lipidov in proteinov

Plazemska membrana proteini fosfolipidi steroli vrsta sterolaČlov. mielin.ovojnica 30 30 19 holesterol

Mišja jetra 45 27 25 holesterolList koruze 47 26 7 stigmasterolKvasovka 52 7 4 Ergosterol

Paramecij (protist) 56 40 4 SitosterolE. Coli 75 25 0 /

Večja variabilnost v sestavi proteinov – so lahko tudi glikozilirani (glikoforin v eritrocitu)

Lipidna sestava različnih membran hepatocita-funkcijska specializacija

Biološke membrane imajo skupne lastnosti

Model tekočega mozaika, asimetričnost, omogočeno lateralno gibanje lipidov in proteinov , oligosahardine verige lipidov in proteinov na zunanji strani

V membranah so lipidi in proteini razporejeni asimetrično

Membranski proteini

-Integralni (lahko jih odstranimo le z detergenti)-Periferni (pridruženi membrani preko elektrostatksih interakcij)-Amfitropični (so lahko v membrani ali pa v citosolu)

zunaj

znotraj

lipidni dvosloj

glikolipid

oligosaharidnaveriga glikoproteina

polarne glave fosfolipidov

periferni protein

integralniprotein

sterol

Integralni membranski protein

periferniprotein, kovalentno vezan na lipid

Omogočajo komunikacije med celicami:- skozi celično membrano prenašajo organske molekule in ione- receptorji na celični površini zaznajo signale in sprožijo specifične poti v celici - skrbijo za stik med celicami

Integralni transmembranski proteini – primer glikoforina v membrani eritrocita

Tetrasaharid:-2 Sialični kislini-Galaktoza-N-acetil galaktozamin

Medcelično prepoznavanje

Polarne AK

Nepolarne AK

Polarne AK

Integralni transmembranski proteini – primer bakteriorodopsina

Bakteriorodopsin izhaja iz bakterije H. Salinarum; soroden človeškemu rodopsinu

7 zelo hidrofobnih alfa-vijačnic; Polipeptidna veriga 7-krat prečka membrano (7 transmembranskih domen)

Vrste integralnih membranski proteinovTransmembranske regije so alfa vijačnica ali beta sodček; hidrofobne interakcije z

membranskimi lipidi

Lehninger Principles of Biochemistry

Ena regija čez membrano (glikoforin, tip I)

Več regij čez membrano, 1 polipeptid (bakteriorodopsin, transportni proteini)

Več regij čez membrano, več polipiptidov , kanalček (transportni protieni)

Zasidrani v membrano kovalentna vez z lipidom

Transmembranske domene in lipidno sidro

Važna je orientacija!

Bakteriorodopsin.

Topolgijo membranskega proteina lahko razberemo iz zaporedja AK

- Eksperimentalno so bile določene spremembe prostih entalpij pri premikanju stranskihverig AK iz nepolarnega topila v vodo – relativna polarnost AK; G pri prehodu se izrazi kotindeks hidrofobnosti

- Določanje število predvidenih transmembranskih regij z in silico z diagramom hidrofobnosti.

G < 0 – polarne AK

G > 0 – nepolarne AK

glikoforin

Na stiku med lipidi in vodo sta v membranskih proteinih Trp in Tyr

- Stranske verige Trp in Tyr vstopajo v interakcije tako z lipidi centralnega dela membrane, kot tudi z vodno fazo na obeh straneh membrane.

- Pravilo “pozitivne notranjosti” - na notanji (citoplazemski) strani prevladujejo bazične aminokisline Arg, His, Lys.

znotraj

zunaj

Porini – bakterijski transmembranski proteini s strukturo “ sodčka”

sodčki - 20 ali več transmembranskih segmentov z verigami v obliki cilindra –vzpostavljeno je maksimalno število vodikovih vezi med CO in NH peptidnih ostankov, prostora za vodikove vezi z vodo ni – podobna stabilnost kot vijačnica.

Planarnih ploskev NE najdemo v notranjosti membran, saj je še prostor za H-vezi med CO in NH peptidnih vezi ter vodo.

Membranski proteini tipa V, VI so preko lipidov zasidrani v membrano

Palmitinska kislinana notranje Cys, Ser,

Miristinska k. na N-term. GlyIzoprenoidi na C-term. Cys

Glikozilirani derivati fofatidil inozitola (GPI) na C-term.

tioestrska vez

Amidna vez

zunajznotraj

tioeterska vez

Povezave med lipidi in proteini

Membrane so lahko v obliki gela ali tekočega mozaika

Premik lipidov z ene strani memebrane na drugo je počasen

P.F. Devaux et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1778 (2008) 1591–1600

Flipaza, flopaza in skramblaza omogočajo prehod lipidov z ene strani membrane na drugo

ATP ADP + Pi

Lipidni rafti (splavi) so s proteini bogate mikrodomene membran

Kaveole so lipidni rafti s proteinom kaveolinom

Membrane organizmov, tkiv, celic, organel, imajo različno sestavolipidov in proteinov

Periferni membranski proteini so z elektrostatskimi silami in H-vezmišibko povezani z membrano

Integralni proteini so močno povezani z membrano prek hidrofobnihinterakcij

• Lipidi v membrani so lahko v tekočem urejenem ali neurejenemstanju (tekoči mozaik)

• Lipidi in proteini se v membrani lahko premikajo lateralno.• Flip-flop difuzija prek membrane je redka in počasna. Pospešijo jo

flipaze, flopaze (ob hidrolizi ATP) in skramblaze (brez kemičneenergije)

• Lipidni rafti so domene membran, bogate s sfingolipidi, holesterolomin proteini.

Sestava in dinamika membran – povzetek

Snovi morajo preko različnih membran, da pridejo na vsa mesta, kjer so potrebne.

Mnoge snovi same ne morejo preko membran, zato potrebujejo prenašalce. Da se snovi lahko koncentrirajo, je potrebna energija.

Transport preko bioloških membran

kotransport

Vrste transporta po smeri in številu prenešenih molekul

Vrste transporta po smeri in energiji

Pasivni transport: v smeri koncentracijskega gradienta (od večje k manjši koncentraciji) in brez uporabe energije. Lahko je s prenašalci ali brez.

Aktivni transport: proti smeri koncentracijskega gradienta (od manjše k večji koncentraciji) in z uporabo energije - vedno s prenašalci!

Pasivni transport

1. Preprosta difuzija

2. Olajšana difuzija

3. Ionski kanali

4. Ionofori

Aktivni transport

5. Primarni aktivni transport

6. Sekundarni aktivni transport

1

2

3

4

6

5

Vrste transporta

Snovi, ki ne morejo čez membrano, potrebujejo prenašalce.

Pasivni transport - prenašalci le vežejo molekule, jim olajšajo prenos (povečajo hitrost prenosa, ker zmanjšajo aktivacijsko energijo) in jih izpustijo na drugi strani.

To ne voliva na ravnotežje!

Podobnost s katalizatorji!

Snovi, ki se pretaknejo čez membrano se morajo pri prehodu znebiti hidratacijskega plašča.To je glavni vir velike aktivacijske energije.

Energijske zakonitosti prehoda čez membrano

Vrste prenašalcev čez membrano

Prenašalec ima določeno kapaciteto in se nasiči s prenašano molekulo.

Ko so vsi prenašalci nasičeni, je dosežena maksimalna hitrost prenosa in povečanje koncentracijske razlike ve vpliva več (ničti red)!

ničti red

prvi red

Transportni proteini

Prenašalci Kanali

Sekundarni aktivni

prenašalci

Pasivni prenašalci

Primarni aktivni

prenašalci

c ali Δc

Lastnosti transportnih proteinov: kanalčki in prenašalci

Prenašalci• Stereospecifična vezava

substrata• Visoka hitrost transporta• Pride do nasičenja• Monomerni proteini

Kanalčki• Niso stereospecifični• Visoka hitrost transporta (108 ionov/s) • Ne pride do nasičenja• Multimerni proteini (pogosto iz ene

vrste podenot)• Odpiranje kanalčkov je uravnavano

- z ligandom- z napetostjo

Ena of klasifikacij transportnih proteinov

1 a) Kanalčki s strukturo -vijačnice (K+ kanalček, akvaporini, acetilholinski receptorski kanalček, kanalček, odvisen od napetosti...)

b) Porini s strukturo β-sodčka (bakterijski porini)c) Toksini, ki tvorijo pore (toksin difterije)

-------------------------------------------------------------------------------------2 a) Porterji: uniporterji, simporterji, antiporterji (GLUT1 transporter glukoze

v eritrocitih, HCO3-Cl- antiporter)

b) Neribosomsko sintetizirani porterji (valinomicin)

3 a) Transporterji, ki dobijo energijo s hidrolizo ATP (CFTR Cl- kanalček, F1,F0 ATPazna protonska črpalka, ABC (ATP binding cassette) transporterji

GLUT1

• Stereospecifična vezava substrata

• Visoka hitrost transporta• Pride do nasičenja• Monomerni proteini

Transportni proteini

Prenašalci Kanali

Pasivni prenašalci

Primarni aktivni

prenašalciSekundarni aktivni

prenašalci

Prenašalci čez membrano

Snov se premika spontano (Gt < 0) iz predela z višjo koncentracijo na predel z nižjo koncentracijo.

Ravnotežje G = 0 je doseženo , ko je C1 = C2

Termodinamske zakonitosti transporta čez membrano

Prosta entalpija snovi, ki se prenaša čez membrano, je odvisna od koncentacijskega gradienta

Premikanje vzdolž koncentracijskega gradienta je manifestacija 2. zakona termodinamike –molekule se spontano razporedijo čimbolj naključno, entropija se poveča.

Prenos glukoze v eritrocitu – olajšana difuzija čez GLUT1

• Transporterji glukoze so prisotni v različnih tkivih (GLUT1, GLUT2, etc.)

• Pospešijo prenos glukoze (olajšana difzuzija) vzdolž c gradienta do 50 000 x

• Eritrociti so odvisni od stalne dobave glukoze iz krvne plazme

Erythrocytes depend on constant supply of glucose from blood, kjer je [Glc]

= ~4.5-5 mM; glukozo uporabljajo kot vir energije za glikolizo.

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/LIPIDS/transport.html

Predvidena struktura prenašalca GLUT1

.

Shulman G I Physiology 2004;19:183-190

©2004 by American Physiological Society

Insulinski in glukozni receptor

www.betacell.org/content/articles/articlepane

Z insulinom posredovani privzem glukoze: insulin se veže na insulinski receptor. To sproži kaskado prenosa signala, ki poveča število GLUT4 receptorjev na membranah in omogoči hiter prenos glukoze v celico.

Mladostni diabetes tipa I – ni sprožanja insulina, zato ni prenosa glukoze v celico.

Prenašalec klorida in bikarbonata- anionski izmenjevalni protein,pasivni transport

Elektro-nevtralni prenos.

Kotransporter – antiport.

Milijonkrat poveča hitrost prenosa bikarbonatnih ionov, poveča kapaciteto eritrocita za prenašanje CO2

Aktivni transport topljencev proti koncentracijskemu gradientu

Primarni: prenos topljenca je direktno vezan na hidrolizo ATP.

Sekundarni: zaradi primarnega aktivnega prenosa je že vzpostavljen gradient X (pogosto natrijevi ioni). X lahko spontano potujejo v smeri elektrokemijskega gradienta.

Gibanje X vzdolž gradienta daje dovolj energije, da se skupaj z njimi PROTI elektrokemijskemu gradientu premikajo ioni S.

Če je razlika v koncentraciji 10-kratna, za prenos 1 mola snovi potrebujemo 5,7 kJ

-70 pri človeku

- imajo Asp ostanek, ki se fosforilira

-Imajo 8 – 10 transmembranskih domen

-Vse inhibira vanadat, analog fosfata

-Ca črpalka je uniporter

-K /Na ATP-aza je antiporter

-Črpalka protonov in K v želodcu

P-vrsta ATPaz – skupina aktivnih prenašalcev

+2

+ +

+

Črpalka kalcijevih ionov sarkoplazemskega retikuluma: SERCA- Vzdržuje nizko koncentracijo kalcija v citoplazmi vseh celic.-Vzdržuje visoko koncentracijo kalcija v lumnu ER – v miocitu lumen SER-Sproščanje SER kalcija vzpodbudi krčenje mišic-Velika konformacijska sprememba ob hidrolizi ATP, kar prenese 2 Ca iona

Na /K ATP-aza+ +

-Simport obeh kationov proti elektrokemijskemu gradientu

-Vzdržuje znotrajcelično koncentracijo Na in K ionov, vzdržuje membranski potencial

-Potencial vzdolž plazemske membrane je nujen za prenos živčnih impulzov

-Gradient Na ionov pomaga pri sekundarnem aktivnem transportu številnih snovi

FoF1 ATPaza/ATP sintaza-Je reverzibilna, z ATP povezana črpalka

-Črpa protone proti koncentracijskemu gradientu

-Protonski gradient daje dovolj energije da obrne reakcijo – sintetizira se ATP – od tod ime ATP sintaza!

-Sinteza ATP je osnova oksidativne fosforilacije v notrnaji mitohondrijski membrani. Prenos elektronov v dihalni verigi je sklopljen z oksidativno fosforilacijo – izvor kemično vezane energije ATP po presnovi (katabolizmu)

ABC prenašalci

•ABC transporterji (ATP Binding Cassette transporters) –velika družina črpalk, črpajo iz celic: aminokisline, peptide, proteine, kovinske ione, lipide, žolčne kisline, sterole, hidrofobne spojine (polutante, droge, zdravila)

•Znane mutacije v genu za ABC transporterje pri človeku –dedne bolezni (anemije, odpoved ledvic, cistična fibroza)

•Pri človeku najbolj znan MDR1 (multi drug transporter) odgovoren za rezistenco nekaterih tumotjev na kemoterapevtska zdravila (adriamicin...)

•ABC transporterji v bakterijah (Streptococcus aureus...) odgovorni za rezistenco bakterij – ciljano iščejo zdravila za inhbicijo bakterijskih ABC transporterjev

faculty.smu.edu/jwise/mdr1.html www.pnas.org/

Ionofori preprečijo aktivni transport, ker porušijo elektrokemijski gradient vzdolž membrane

Ionofor valinomicin je antibiotik. Prenaša kalijeve ione čez bakterijsko

membrano in poruši gradient.

K+

Ena of klasifikacij transportnih proteinov

1 a) Kanalčki s strukturo -vijačnice (akvaporini, K+ kanalček, acetilholinski receptorski kanalček, kanalček, odvisen od napetosti...)

- Za ione selektivni kanalčki: (a) kanalčki, odvisni od ligandov; (b) kanalčki, odvisni od napetosti

b) Porini s strukturo β-sodčka (bakterijski porini)c) Toksini, ki tvorijo pore (toksin difterije)

-------------------------------------------------------------------------------------2 a) Porterji: uniporterji, simporterji, antiporterji (GLUT1 transporter glukoze

v eritrocitih, HCO3-Cl- antiporter)

b) Neribosomsko sintetizirani porterji (valinomicin)

3 a) Transporterji, ki dobijo energijo s hidrolizo ATP (CFTR Cl- kanalček, F1,F0 ATPazna protonska črpalka, ABC (ATP binding cassette) transporterji

GLUT1

www.biolcell.org/

Toksini, ki tovrijo pore – gram pozitivna bakterija Dypthteria

Proteoliza po okužbi s toksinom te bakterije

Toksin Dyphterie inhibira translacijo

Prenos vode z akvaporinom

Hitrost prenosa do 10 s kar je več kot hitrost encimsko kataliziranih reakcij. -19

Akvaporini pri sesalcih

K+ kanalček

Radij K+ - 1,33ARadij Na+ - 0,95 APrehod K+ skozi poro 108 ionov/s(10.000x hitrejši kot Na+)

“filter selektivnosti”

“filter selektivnosti”

Na+ kanalček nevrona je uravnavana s transmembransko napetostjo

Mehanizem odpiranja kanalčka kot odgovor na znižanje napetosti

Nikotinski/acetilholinski receptor – ionski kanalček, ki deluje pod vplivom liganda

• Bistvena komponenta električnega signala od motoričnega nevrona do mišičnega vlakna (v živčno-mišični sinapsi)

• Ligand – acetiholin (ACh) in nikotin• Vezava ACh na receptor povzroči konformacijsko spremembo receptorja →

odpre se ionski kanalček• Kationi prehajajo v notranjost celice → depolarizacija membrane• Ionski kanalček je prepusten za Na+, Ca2+ in K+

• Na+ prehaja v smeri nižje konc. (2 x 10-7 ionov/s)

Acetilholinski receptor

Bolezni zaradi napak v kanalčkih

Cistična fibroza – okvarjen kanalček CFTR za prenos Cl-

•Cistična fibroza – okvarjen kanalček za Cl- ; avtosomna recesivna, 5% belcev je prenašalcev

•Odkrita 1989 - mutacija v genu za protein CFRT (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)

•Homozigoti dočakajo največ 30 let. Prizadeta predvesm gastrointestinalni in respiratornitrakta;

•Znanih že 1720 različnih mutacij tega gena!!

Kanalček odprt, ko sta vezani molekuli ATP; zaprt, ko 1 ATP hidrolizira v ADP in Pi

Zaradi sluzi pogoste bakterijske okužbe

dihalnega trakta

Naravni strupi, ki delujejo na ionske kanalčke, vplivajo na prenos živčnega impulza

• Tetrodotoksin (riba), veže se na Na+ kanalčke

• Saksitoksin (dinoflagelati v južnih morjih), veže se na Na+ kanalčke

• Dendrotoksin (mamba – afriška kača) inhibira K+ kanalčke

• Tubokurarin, (aktivni strup kurare-ja, s katerim so ob Amazonki zastrupljevali

puščice), veže se na ACh receptor

• Kobratoksin in bungarotoksin (kačja strupa), vežeta se na ACh-receptor z visoko

afiniteto (Kd = 10-15 M) in inhibirata prenos impulza

tetrodotoksin

Transport čez membrano - povzetek

• Prenos polarnih molekul in ionov čez membrano potrebuje prenašalne proteine

• Molekule in ioni se lahko prenašajo vzdolž konc. gradienta ali proti gradientu

• GLUT prenašalci glukoze so uniporterji, ki prenašajo glukozo vzdolž gradienta

• Simporterji omogočajo simultani prenos dveh snovi v isto smer (prenos glukoze skupaj z

Na+ v prebavnem traktu)

• Antiporterji prenašajo dve snovi v nasprotno smer (prenos Cl-/HCO3-; Na+K+ATPaza)

• Na+K+ATPaza plazemske membrane in Ca2+ prenašalci sarkoplazemskega retikuluma

(SERCA) so primeri ATPaz tipa P– (reverzibilna fosforilacija med katalitičnim ciklom)

• ATPaze tipa F so protonske črpalke (ATP sintaze), ki so ključne za ohranjanje energije

mitohondrijev in kloroplastov.

• ABC transporterji odnašajo iz celic različne snovi, vključno z zdravili

• Ionofori so lipidotopne molekule, ki vežejo ione, jih pasivno prenesejo čez membrano in

tako porušijo elektrokemijski gradient

• Voda čez membrane prehaja prek akvaporinov (nekateri prenašajo tudi gliceorl in ureo)

Transport čez membrano - povzetek

• Ionski kanalčki tvorijo hidrofilne pore skozi katere lahko difuncirajo ioni vzdolž električnega

ali kemijskega gradienta

• Ionski kanalčki se večinoma ne morejo nasititi (saturirati), so večinoma specifični za eno

vrsto ionov

• Večina ionskih kanalčkov je uravnavana z napetostjo (Na+ kanalček živčnih celic) ali z

ligandom (acetilholinski receptor)