植物组织培养最新技术　植物组织培养最新技术

植物脱毒技术植物快繁技术植物种质保存技术

第一节 植物脱毒技术第一节 植物脱毒技术

一、植物病毒对生产的影响一、植物病毒对生产的影响

引起多种植物病害，大多数植物都不同程度地受到病毒的危害。

茄科和十字花科植物上，有 50% 的病害为病毒病。 在烟草 , 马铃薯上成为重要的病害。 在花卉上，病毒病使品质和产量降低，甚至影响

进出口。

大麦黄矮病毒，在使美国小麦损失 6000万美元，加拿大损失 1700 万美元。

草莓感染 62 种病毒、类菌质体，每年都必须更新母株。

以特定的无毒植株取代有毒植株后，产量最多可增加 300% （平均为 30% ）

大部分病毒都不通过种子传播无性繁殖传播率极高

无性繁殖材料和嫁接传播无性繁殖材料和嫁接传播以球茎、块根、接穗芽为繁殖的作物，如马

铃薯、大蒜、郁金香、苹果树等，如母株受侵染则无一幸免。这些无性繁殖材料都可以带毒，故成为重要的检疫对象。

嫁接可以传播任何种类的病毒、植物菌原体和类病毒病害。

二、研究历史二、研究历史White 在 1943 年首先在感染烟草花叶病毒

植株生长点发现病毒浓度很低，甚至没有。Holmes （ 1948 ）通过茎尖扦插由受感染

的大丽花中获得了无病毒植株。Morel,Martin(1952) 将 100μm 长的大丽花

茎尖切下，在培养基中进行培养，长成无根苗，后嫁接到健康大丽菊砧木上，获得无病毒植株。

三、目前研究较热的植物三、目前研究较热的植物草莓、马铃薯、生姜、大蒜、苹果、葡

萄、中药、香蕉

11 　脱毒种蒜大量繁殖（东北农大）　脱毒种蒜大量繁殖（东北农大）大蒜是营养繁殖作物，在长期栽培过程中，

病毒感染严重，致使蒜头变小，产量降低。利用植物茎尖组织培养技术，培养脱毒种蒜，可提高大蒜蒜头的直径和产量。目前，国内外市场对优质大蒜的需求大量增加，每年美国、日本、韩国、东南亚等国家和地区都从我国进口大蒜，但由于我国目前生产大蒜未能全面达到出口标准，造成外贸出口量逐年下降。外汇收入降低。

脱毒种蒜大量繁殖（东北农大）脱毒种蒜大量繁殖（东北农大）

利用优质种蒜的茎尖外植体、应用组织栽培技术，培养脱毒菌与微麟茎，提高培养效率，缩短培养周期，扩大繁殖系数，同时根据大蒜的生物特性，开辟了脱毒种蒜大量繁殖的新途径，为实现产业化生产奠定了基础。

生产工艺简介生产工艺简介蒜瓣→ 茎尖培养→ 增殖培养 →形成微麟

茎↓生根培养→ 驯化成苗→ 原原种→ 原种→ 良种

主要设备投资主要设备投资培养架、蒸馏设备、超净平台、温室、灭菌锅、网棚、化验室仪器试剂设备投资 180 万元

22 　 果树脱毒课题组　 果树脱毒课题组（河南）（河南）     本课题组主要从事落叶果树病毒脱除、组

织培养、病毒检测、苗木快繁及无病毒栽培技术研究，同时开展果树生理及设施栽培技术研究。先后承担多项国家、农业部、河南省科技攻关课题，其中“苹果无病毒生产体系的建立”获河南省科技进步三等奖。现承担河南省重大科技攻关项目“苹果、葡萄、草莓脱毒快繁及产业化开发应用”，获得了苹果、葡萄、草莓共计 60余个品种的无病毒苗，部分优良品种正在向生产推广应用。

经济效益分析经济效益分析

按 40 万株 / 年脱毒苗的生产规模每亩地增收 500 元

33 　脱毒种薯生产新方法研制成功　脱毒种薯生产新方法研制成功黑龙江省农科院研制出一种工厂化快速

生产马铃薯脱毒原种新方法——无基质定时气雾栽培法，最近通过了专家鉴定。

　　无基质定时气雾栽培法就是将马铃薯脱毒苗直接固定在空气中，定时、定量向其根部喷施营养液，促使植株生长，达到结薯目的。　

马铃薯靠块茎无性繁殖来繁衍后代，在种植过程中极易感染和积累病毒，造成减产。利用生物技术离体培养带有一二个叶原基的茎尖生长点，脱除或减少病毒粒子的含量，培养和快速繁殖脱毒试管苗和脱毒原原种供生产应用，是目前解决马铃薯病毒性退化的唯一途径。传统的原原种生产方法生产周期长、效率低，并由于栽培基质不能年年更换，潜在传毒的可能性，产品质量不能保证。

工厂化生产马铃薯脱毒原原种新技术科技含量高、方式新颖，同原有生产技术相比产量提高30％以上，单个小薯的体积增长 5 到 7倍、 2克以上微型薯达到 70％，出芽率达到 95％。每平方米结薯 800粒以上，单株结薯最高可达120粒，每年可生产 2 至 4茬。

据悉，这项技术已获国家发明专利，深受脱毒种薯生产者的欢迎，并已在省内外多家单位转让和推广

44 　烟台市农业科学研究院　烟台市农业科学研究院 我院投资 100 万元组建了烟台市最大的生物组培研

究及苗木脱毒中心，开展对草莓、甘薯、马铃薯、葡萄、花卉等作物苗木的脱毒技术研究，年生产能力可达 500 多万株，生产的苗木在生产上供不应求。与烟台“百年张裕”公司联合进行葡萄脱毒苗的研究、开发，每年为其提供 100 万株以上的酿酒专用苗。

多年实践证明：脱毒苗木生产健壮，整齐度高，耐寒、抗病性强，果实成熟早，上市早，能明显改善果品品质，产量增长显著，一般在 30-50%之间，高者可达 80% 以上，经济效益十分显著。

烟台市农业科学研究院烟台市农业科学研究院 脱毒草莓：丰香、宝交早生、明宝。最有发展

前途的是丰香，个大、优质、耐贮运、休眠浅，适宜于促成或半促成栽培。

脱毒葡萄：酿酒品种：赤霞珠、梅鹿特、神索、黑佳美、黑比诺、歌海娜、赛比尔、霞多丽、丽珠。

鲜食品种：红提、黑提、紫珍香、京亚、京秀、氏普罗莎等。

脱毒甘薯：鲁薯 6 、烟薯 16 等脱毒马铃薯：鲁引 1号、津引 8号、美国 1号。

脱毒草莓个大、新鲜、口感好

55 　重庆市薯类脱毒快繁中心　重庆市薯类脱毒快繁中心

        2003 年 2 月 24 日重庆市薯类脱毒快繁中心正式启动，该中心位于重庆市现代农业园区，占地面积 25亩，组培大楼总建筑面积 2900 平方米，目前已在3360 平方米的大棚中栽种 10 苗脱毒马铃薯试管苗，品种 8个，长势良好。在中心的 5亩展示地中栽种早熟菜用型、炸片、高淀粉加工型等 8个品种，本中心可年产 200 万粒脱毒微型马铃薯，我们正致力于加工型（薯条、薯片）马铃薯品种的选育和生产，促进我市马铃薯产业化的快速发展。其次我中心还进行花卉、药材、经 济作物等组培方面的探索和研究，

                                                                                  

                                                                                                            

三年时间内，共扦插脱毒组培苗 80万株，生产原原种薯 150万粒。　

优选品种－－费乌瑞特

66 　中药脱毒种苗试验繁育中心　中药脱毒种苗试验繁育中心  

目前开发成功的品种已达 8个，如桔梗、玄参、紫丹参、薄荷、白芍、草莓等。近年可以再开发 20个以上品种的无毒苗，以后每年可开发 2-3个脱毒品种，每年将可推广 2 万亩以上的脱毒种苗。　　

中国农业科学院科技与经济发展咨询中心

四、植物无毒区四、植物无毒区植物旺盛生长的分生组织很少含有

病毒，如茎尖、根尖，这也是通过分生组织培养获得无毒植株的依据。

为什么分生组织一般不易感染病毒？

病毒通过维管束输导组织系统的转移称作长距离转移，转移速度较快。

病毒在植物叶肉细胞间的移动称作细胞间转移，速度很慢。病毒靠产生运动蛋白去修饰胞间联丝，进而使其孔径扩大几倍甚至几十倍，以便侵染性病毒结构的通过。

茎尖无维管束，病毒不能进行长距离转移，只能通过胞间连丝传递，速度很慢，赶不上细胞分裂速度，故生长点病毒非常少，几乎检测不到。

五、植物脱毒一般步骤五、植物脱毒一般步骤高温处理（低温处理、化学处理）取材（取茎尖）消毒茎尖培养鉴定脱毒苗的隔离保存

热处理热处理热水浸渍法：适于切下的材料， 500C ，

数分钟到数小时，极易致材料受伤热风处理法： 35-400C ，几十分钟到数月，如草莓 360C6周；变温最好，每日400C处理 4 小时， 16-200C处理 20 小时，最初几天温度应逐步上升。应保持适当的湿度和光照，且植株应有丰富的碳水化合物贮备（事前对植物进行缩剪）

冷处理冷处理如菊花植株在 5 度条件下分别 4处理或

7.5个月，无菊花矮化病毒的无毒苗分别是 67% 和 73% 。

化学处理化学处理

　许多化学药品 (包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等 ) 对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有： 8—氮鸟嘌呤、 2—

硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素 D 、庆大霉素等。

　例如，将 100μg　2—硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的 PVY( 马铃薯病毒 ) 。

但也有人认为但也有人认为嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素处理，可在某种程度上抑制植物体内或离体叶片病毒的合成，但仍不能使病毒失活。

三氮唑核苷可有效地使病毒失活。

茎尖培养　由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需用带有适当光源的简单解剖镜 (8—40 倍 ) 。

　剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。

　在切取外植体之前一般须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须在 75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，则要用 0.1%次氯酸钠表面消毒 10min 。

　将接处好的茎尖置于 22℃ 左右的温度下。

　每天以 16h　2000—30001x 的光照条件下培养。

　由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。

　微茎尖需数月培养才能成功。　　　　

脱毒苗鉴定脱毒苗鉴定

直接观察法指示植物法抗血清法酶联免疫吸附法电镜检查法免疫吸附电镜法

1 　指示植物 (indmatingplant)法

利用病毒在其他植物上产生枯斑，作为鉴别种类的标准，即枯斑和空斑的测定法。

这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。

它只能鉴定靠汁液传染的病毒。常用的指示植物有：千日红、各种烟草、苋色藜、昆诺阿藜

　　　　

指示植 物法最早是 美 国 的 病 毒学家Holmes　1929 年发现的。

由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。

指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环状病斑构成。

2 　抗血清 (antisemm)鉴定法

植物病毒为抗原，注射到动物体内产生抗体，存在着这种抗体的血清称为抗血清。

　用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。高度专一，特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。

　抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。

3 　电子显微镜 (elecmc　microscope) 检查法

　采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。

这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。

4 酶 联 免 疫 鉴 定 法 (Enzyme　 linked　immunity　absorption　assay　ELISA)

　　采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶 ( 过氧化物酶或碱性磷酸酶 )标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。

　现在灵敏度较高和常使用的方法。

六　其它植物脱毒方法六　其它植物脱毒方法

愈伤组织脱毒茎尖微体嫁接脱毒

           通过植物的器官和组织的培养去分分诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。

愈伤组织培养脱毒愈伤组织培养脱毒

茎尖微体嫁接茎尖微体嫁接

木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取 0.4—1.0mm 茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。

　　　　　　　

七　马铃薯脱毒七　马铃薯脱毒

马铃薯病毒病马铃薯病毒病马铃薯卷叶病毒、马铃薯 A 病毒、马铃

薯 Y 病毒、奥古巴花叶病毒、马铃薯 M病毒、马铃薯 X 病毒、马铃薯 S 病毒、纺锤块茎病毒

其中前三种不进行高温处理，只进行茎尖培养也可获得较多的无病毒植株（ 80% ）。其它病毒在进行高温处理后可大大提高其脱毒效果。

马铃薯病毒病症状马铃薯病毒病症状（（ P99P99 ））

茎尖长度 叶原基数 发育的小植株数

去除病毒的植株数

0.12 1 50 24

0.27 2 42 18

0.6 4 64 0

离体茎尖的大小对病毒去除的影响

马铃薯脱毒程序马铃薯脱毒程序1　在正常的湿度和光照条件下，在土中

种一块单芽眼块茎，当第一个芽长到约15cm 高时，将顶端切下 6-8cm 长，去掉下面的 2个叶片，在切口处涂上生根激素后，把切条植入一个口径为 10cm 内装消毒土壤的花盆中，然后用玻璃烧杯罩上，保持 10天。

2 　植入花盆 3-4周后，将其移入生长箱中，其中光照强度为 3000-4000lux ，光照时间每天 16 小时，气温白天约为 36度，夜间为 33 度

3 　 2周后打掉幼株的茎尖，以促使腋芽的生长

4　经过 6周的热处理后，折下 1个腋生枝以从其上取芽，在植株上至少留下 2个叶片以促其进一步生长。由折下的腋生枝上剪去叶片，但要把小段基部叶柄留在枝上。把这个腋生枝包在湿纸内以防枯萎。

5　在双筒解剖镜下将茎尖解剖出来（枝条不必消毒）

6 　当只剩下 2个最幼小的叶原基时，用装在一根合适刀把上的一小片碎刀片切下茎尖（ 300-600μ ），放在培养基上。

7 　在 23 度，每天 16 小时光照条件下培养。

8　当茎长到 3cm并已生根时，即可移入土壤，起初要把植株保持在高湿度环境中，若有些品种茎不生根，可把它们嫁接到无病砧木上。

9 　移入土壤后，立即对植株进行第一次带病情况的检查，数周后再进行一次。　　　　　　

成分 数量（ mg/L)

成分 数量（ mg/L)

NH4NO3 1650 Na2MoO4.2H2O 0.25

KNO3 1900 KI 0.83

CaCl2.2H2O 440 H3BO3 6.2

MgSO4.7H2O 370 肌醇 100

KH2PO4 170 烟酸 0.5

FeSO4.7H2O 27.85 盐酸吡哆醇 0.5

Na2.EDTA 37.25 盐酸硫胺素 0.1

MnSO4.4H2O 22.3 甘氨酸 2

ZnSO4.7H2O 8.6 激动素 0.04

CoCl2.6H2O 0.025 IAA 0.5

CuSO4.5H2O 0.025 GA3 0.1

活性炭（可有可无）

2857