4. Bao cao toan van

8/15/2019 4. Bao cao toan van

1/116

Hội ngh ị Khoa h ọc Công ngh ệ Tu ổi tr ẻ Khoa Y Dượ c l ần II

Hà Nội - 2015

1

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT PHENOLIC TỪ LÁ CÂY GỐI HẠC (L eea rubr a Blume ex Spreng.)

Ph m Giang Nam1, Ho ng Văn H ng

1

Giáo viên hướng dẫn: Vũ Đức Lợi 11 Khoa Y Dư c, Đ i h c Qu c gia H N i

TÓM TẮTTừ cắn chiết ethanol 96% lá cây g i h c ( Leea rubra Blume ex Spreng) thu hái t i

huyện L ng Giang, tỉnh Bắc Giang, năm h p chất (1-5) đã đư c phân lập bằng các phương pháp sắc ký. Các h p chất n y đư c xác định l acid gallic (1), acid protocatechuic ( 2), acid

4-hydroxybenzoic ( 3), arctiin ( 4), kaempferol-3-O- α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinofuranosid ( 5) dựa trên các dữ liệu phổ thực nghiệm v so sánh với dữ liệu phổ đã đư ccông b trước đây. Tất cả các h p chất trên đều lần đầu tiên đư c phân lập từ cây g i h c. h p chất2, 4, 5 lần đầu tiên phân lập đư c từ lo i Leea rubra . Trong đó, hai h p chất4, 5 lầnđầu tiên đư c tìm thấy trong m t lo i thu c chi Leea . Từ khóa: G i h c,acid gallic, acid protocatechuic, acid 4-hydroxybenzoic, arctiin,kaempferol-3-O- α-L- rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinofuranosid.

EXTRACT AND ISOLATED PHENOLIC COMPOUNDS FROM THE LEAF OF

LEE A RUBRA BLUME EX SPRENGSUMMARY

From the ethanol 96% extract of the leaf of Leea rubra Blume ex Spreng collected in

Lang Giang (Bac Giang, Vietnam), five compounds ( 1-5) were isolated by chromatographicmethods. These isolates were identified as gallic acid ( 1), protocatechuic acid ( 2), 4-hydroxybenzoic acid ( 3), arctiin ( 4), kaempferol-3-O- α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinofuranoside ( 5) by spectroscopic analyses and comparison with literature data. The

presence of compounds 2, 4, 5 in this species was firstly reported. Among them, compounds 4 and 5 were isolated the first time from genus of Leea .Key words: Leea rubra Blume ex Spreng, gallic acid, protocatechuic acid, 4-hydroxybenzoicacid, arctiin, kaempferol-3-O- α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinofuranoside.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây g i h c t a, có tên khoa h c Leea rubra Blume ex Spren g, l vị thu c đư c s d ngrất phổ biến đ điều trị các bệnh về đau nh c xương khớp, tê thấp, đau b ng, rong kinh, yế


2/116


Hà Nội - 2015

2

mệt m i sau khi đ [1]. M c d đư c s d ng r ng rãi trong y h c cổ truyền, dư c liệu gh c v n chưa đư c nghiên c u đầy đ về tác d ng dư c lý c ng như th nh phần hóa h c, dđến việc chưa có các tiêu chu n ki m nghiệm. Ch nh vì thế, việc nghiên c u phân lập hochất, ch ng minh ho t t nh sinh h c, đề xuất tiêu ch đánh giá chất lư ng dư c liệu, phát trsản ph m từ dư c liệu g i h c tr th nh m t yêu cầu hết s c cần thiết v cấp bách. Cho nay, mới chỉ có 2 báo cáo công b sự có m t c a các flavonoid v triterpenoid trong lá c alo i L.rubra [2], [3]. Nhằm cung cấp thêm thông tin hướng tới m c tiêu xác định đư c ho tchất ch nh v tiêu chu n hóa dư c liệu g i h c, phát tri n sản ph m từ cây g i h c, đề tchiết xuất phân lập v xác định cấu tr c c a 05 h p chất phenolic. Đây l nhóm h p chất qutr ng trong cây g i h c v có các tác d ng sinh h c ng d ng trong phòng v điều trị bệnh.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu Nguyên li ệu dùng trong nghiên c u là b phận lá c a cây g i h c đư c thu hái ti

huyện L ng Giang, t ỉnh B ắc Giang v o tháng 12 năm 2012. M u đư c xác định tên khoa h clà Leea rubra Blume ex Spreng b i TS. Đỗ Th ị Xuyến, B môn Th ực vật, Khoa Sinh h c,Trường Đi h c Khoa h c Tự nhiên – Đ i h c Qu c gia Hà N i. M u nghiên c u hiện đư c

lưu giữ t i Khoa Y Dư c, ĐHQGHN.2.2. Hóa chất, dung môi

Hóa chất: bản m ng tráng sẵn pha thường silica gel F254 (Merck), pha đảo RP18 F254s (Merck), chất hấp ph silica gel pha thường (cỡ h t 63-200 μm, Merck), pha đảo RP-18 (30-50 μm, Merck), acid sulfuric 10%/ethanol. Dung môi công nghiệpn-hexan, ethyl acetat, n-

butanol, dicloromethan (CH 2Cl2), methanol (MeOH), nước cất (H2O).

2.3. Thiết bị, dụng cụ - Các lo i c t sắc ký, đèn t ngo i t i Viện Dư c liệu - Máy đo phổ hồng ngo i (IR) FT-IR Spectrophotometer (Perkin Elmer, Mỹ) t i Viện

Hóa h c, Viện H n lâm Khoa h c v Công nghệ Việt Nam - Máy đo phổ kh i Agilent 1100 LC/MSD t i Viện Hóa h c, Viện H n lâm Khoa h c v

Công nghệ Việt Nam - Máy đo phổ c ng hư ng từ h t nhân ( 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT, HSQC, HMBC)

Bruker AM500 FT- NMR t i Viện Hóa h c, Viện H n lâm Khoa h c v Công nghệ

Việt Nam


3/116


Hà Nội - 2015

3

2.4. Phương pháp nghiên cứuChiết xuất, phân lập các hợp chất

Chiết xuất các h p chất từ dư c liệu bằng ethanol 96% theo phương pháp ngâm nhiệt đ phòng. Phân đo n dịch chiết bằng dung môi có đ phân cực tăng dầnn-hexan, ethylacetat và n- butanol. Phân lập các chất bằng sắc ký c t với các chất hấp ph silica gel phathường, pha đảo RP-18, Sephadex. Sắc ký lớp m ng d ng đ theo dõi vết các chất từ dịchchiết phân đo n v ki m tra đ tinh khiết các chất phân lập. Xác định cấu trúc các chất phân lập

Xác định cấu tr c c a các chất phân lập đư c dựa trên phân t ch kết quả phổ hồng ngo(IR), phổ kh i (MS), phổ c ng hư ng từ h t nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC,

HSQC) s d ng chất n i chu n l TMS (tetramethyl silan) v so sánh các dữ liệu thu đư c tthực nghiệm với các dữ liệu đã công b .

2.5. Chiết xuất, phân lậpLá g i h c đã phơi khô (3,0 kg) đư c cắt nh , ngâm chiết với ethanol 96% nhiệt đ

phòng (chiết 3 lần, mỗi lần 4 ng y). Dịch chiết đư c g p l i v cất lo i cồn nước dưới áp giảm thu đư c cắn chiết cồn đã cô khô (103 g). Cắn chiết đư c hòa tan v o nước cất (0,5 lth nh hỗn dịch rồi lắc, chiết phân đo n lần lư t với n -hexan (0,5 l t × 3 lần),ethyl acetat (0,5

l t × 3 lần),n- butanol (0,5 l t × 3 lần). Các dịch chiết n -hexan, ethyl acetat và n- butanol đư ctách riêng, cất lo i dung môi dưới áp suất giảm thu đư c các phần cắn tương ng: cắn phđo nn-hexan (20 g), cắn phân đo n ethyl acetat (35 g) v cắn phân đo nn-butanol (34 g).Cắn phân đo n EtOAc (35 g) đư c ch y qua c t sắc ký silica gel pha thường, r a giải bằng hdung môi CH 2Cl 2 - MeOH với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0 đến 100 % thu đư c 5 phân đo n: PĐ1 (4,4 g); PĐ2 (5,6 g); PĐ3 (7,1 g); PĐ4 (4,8 g) và PĐ5 (3,9 g). Phân đo nPĐ3 (7,1 g)tiếp t c đư c phân tách bằng c t silica gel pha thường với hệ dung môi r a giải CH2Cl 2 -

MeOH (10/1; 8:1; 5/1) thu đư c 4 phân đo n (PĐ3.1 đếnPĐ3.4). Phân đo nPĐ3.2 đư c đưalên c t silica gel pha đảo RP-18 r a giải gradient với hệ dung môi MeOH/H2O (0/1; 1/8; 1/6)lần lư t thu đư c chất s1 (34 mg) v chất s2 (8 mg). Phân đo nPĐ3.1 đư c phân tách trênc t silica gel pha đảo RP-18 r a giải đẳng dòng với hệ dung môi MeOH/H 2O (1/5) thu đư cchất s 3 (11 mg). Phân đo nPĐ3.4 đư c đưa lên c t Sephadex LH-20 s d ng dung môi r agiải l methanol. Ki m tra th nh phần dịch r a giải bằng sắc ký lớp m ng, thu đư c 4 phâđo nPĐ3.4.1 đếnPĐ3.4.4. Phân đo nPĐ3.4.3 đư c tinh chế trên c t silica gel pha đảo RP-

18 r a giải gradient với hệ dung môi methanol/H2O (1/2; 1/1) thu đư c chất s4 (15 mg) vàchất s 5 (18 mg) .


4/116


Hà Nội - 2015

4

3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Dữ liệu phổ của các hợp chất :

Chất số 1: B t m u trắng. Phổ IR (cm-1

): 3496; 1667; 1 318; 1610; 1541; 1425; 1218. PhổESI-MS ( m/z )=169 [M-H] -. Phổ 1H-NMR (C 5D5 N; 500 MHz) và 13C-NMR (C 5D5 N; 125MHz): xem bảng3.1.

Chất số 2: B t m u nâu. Phổ IR (cm-1): 3369; 2937; 2859; 1678; 1469; 1417; 1241; 1101.Phổ ESI-MS ( m/z ) =153 [M-H] -. Phổ1H-NMR (DMSO; 500MHz) và 13C-NMR (DMSO; 125MHz): xem bảng3.1.

Chất số 3: B t m u nâu. Phổ IR (cm-1): 3494; 1658; 1266; 1173. Phổ ESI-MS ( m/z )=137 [M-

H] -. Phổ1H-NMR (CD 3OD; 500MHz) và 13C-NMR (CD 3OD; 125 MHz): xem B ảng3.1.

Chất số 4: B t vô định hình m u trắng. Phổ IR (cm-1): 3409; 2924; 1760; 1598; 1457; 1266;1030. Phổ ESI-MS ( m/z ) = 557 [M+Na] +. Phổ1H-NMR (C 5D5 N; 500 MHz): 6,73 (1H, d,J=1,5 Hz, H-2), 6,88 (1H, d, J=8 Hz, H-5), 6,69 (1H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-6), 6,98 (1H, d, J=

2,0 Hz, H- 2’), 7,52 (1H, d,J= 8,5 Hz, H- 5’), 6,83 (1H, dd, J= 2,0; 8,0, H-6’), 5,61 (1H, d, J=7,0 Hz, H- 1’’), 4,15- 4,50 (5H, H- 2’’; H-3’’; H-4’’; H-5’’; H-6’’), 3,90 – 4,06 (2H, m, H-9),3,03 (2H, m, H- 7’), 2,69- 2,80 (2H, m, H-7), 2,57 (1H, m, H- 8’), 2,53 (1H, m, H-8). Phổ13C-

NMR (C 5D5 N; 125 MHz): 132,6 (C-1), 112,7 (C-2), 150,3 (C-3), 148,7 (C-4), 114,3 (C-5),

121,2 (C-6), 37,9 (C-7), 41,6 (C-8), 71,3 (C-9), 131,6 (C- 1’), 113,2 (C-2’), 150,1 (C-3’),146,9 (C- 4’), 116,4 (C-5’), 122,3 (C-6’), 34,6 (C-7’), 46,6 (C-8’), 178,9 (C-9’), 102,5 (C-1’’),74,8 (C- 2’’), 78,5 (C-3’’), 71,4 (C-4’’), 78,8 (C-5’’), 62,3 (C-6’’), 60,0 (3-OCH 3), 60,0 (3’-OCH 3), 55,9 (4’-OCH 3).

Chất số 5: B t vô định hình m u v ng. Phổ IR (cm-1): 3402; 2924; 1659; 1614; 1512; 1183;1090. Phổ ESI-MS ( m/z ) = 587 [M+Na] +. Phổ1H-NMR (CD 3OD; 500 MHz): 6,21 (1H, d, J=2Hz, H-6), 6,41 (1H, br s, H-8), 7,98 (2H, dd, J=2,0; 6,5 Hz, H- 2’; H-6’), 6,95 (2H, dd, J=2,0;7,0 Hz, H- 3’; H-5’), 5,70 (1H, br s, H-1’’), 4,44 (1H, dd, 1,0; 2,5 Hz, H-2’’), 3,61 (2H, m, H-5’’), 4,97 (1H, d, J=1,5 Hz, H-1’’’), 1,25 (3H, d, J=6,0 Hz, H-6’’’). Phổ13C-NMR (CD 3OD;125 MHz): 158,6 (C-2), 134,8 (C-3), 179,8 (C-4), 161,6 (C-5), 100,1 (C-6), 166,5 (C-7), 94,9

(C-8), 159,0 (C-9), 105,2 (C-10), 107,9 (C- 1’’), 88,4 (C-2’’), 77,2 (C-3’’), 87,9 (C-4’’), 62,5(C-5’’), 101,3 (C-1’’’), 72,3 (C-2’’’), 72,2 (C-3’’’), 73,9 (C-4’’’), 70,5 (C-5’’’), 17,9 (C-6’’’).


5/116


Hà Nội - 2015

5

Bảng 3.1. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (125 MHz) của các hợ p chất (1-3)

Vị trí1a 2b 3c

δH(s H, đ b i, J =Hz) ppm

δC (ppm)

δH( s H, đ b i, J =Hz) ppm

δC (ppm)

δH( s H, đ b i, J =Hz) ppm

δC (ppm)

1 122,8 121,9 122,7

2 8,07 (1H, s) 110,5 7,33 (1H, d, 2,0 ) 116,67,90 (1H, dd,

1,5; 7,0)133,0

3 147,5 144,9

6,84 (1H, dd,

1,5; 7,0) 116,0

4 140,4 150,0 163,3

5 147,5 6,78 (1H, d, 8,0) 115,96,84 (1H, dd,

1,5; 7,0)116,0

6 8,07 (1H, s) 110,57,28 (1H, dd, 2,0;

8,0)121,7

7,90 (1H, dd,

1,5; 7,0)133,0

COOH 169,6 167,4 170,1

Các ký hiệu đ b i: s (singlet), d (doublet), dd (double of doublet).a: Đo trong C5D5 N; b: Đo trong DMSO;c: Đo trong CD3OD Xác định cấu trúc của các hợp chất: Chất s 1 thu đư c dưới d ng b t m u trắng. Phổ IR cho biết trong phân t 1 có các nhóm

ch c: nhóm OH (dải hấp th có đỉnh 3496 cm-1), nhóm cacbonyl; C=O (1667 cm -1), liên kếtC=C nhân thơm (1610; 1541; 1425 cm -1), liên kết C-O (1218; 1014 cm -1). Phổ kh i ESI-MScó đỉnh ion t i m/z: 169 [M-H] (negative) cho biết kh i lư ng phân t c a1 là M=170. P hổ1H- NMR có t n hiệu c a 02 proton nhân thơm xuất hiện dưới d ng pic đơn đ chuy n dịδH=8,07 ppm. Phổ13C- NMR xuất hiện t n hiệu c a 05 cacbon trong đó 04 cacbon có đchuy n dịch nằm trong đ chuy n dịch c a cacbon nhân thơm ho c liên kết đôi C=C, mcacbon c a nhóm cacbonyl. Các t n hiệu c a phổ c ng hư ng từ h t nhân v phổ kh i ch biết, chất s1 l h p chất phenolic đơn giản có m t vòng benzen với b n nhóm thế trong cấutr c [5]. Hai proton c a nhân thơm nằm hai vị tr đ i x ng. Nhóm thế th nhất đư c xáđịnh l nhóm thế cacboxyl (C=O; δH=169,6 ppm), ba nhóm thế còn l i đư c xác định l nhóm

thế hydroxy thông qua phổ kh i. Dựa v o tất cả các dữ liệu phổ, tham khảo t i liệu [4], [


6/116


Hà Nội - 2015

6

nhận danh h p chất1 là acid 3,4,5- trihydroxybenzoic, tên thường g i l acid gallic. Chất s 2 thu đư c dưới d ng b t m u nâu. Các phổ1H-NMR; 13C- NMR v phổ kh i cho biếtchất s 2 c ng l m t acid phenolic đơn giản. Tuy nhiên, khác với h p chất1, chất s 2 có banhóm thế trong vòng benzen trong đó có m t nhóm cac boxyl và hai nhóm hydroxy. Ba tínhiệu proton c a2 xuất hiện dưới d ng ABX các đ chuy n dịch 7,33 (1H, d, 2,0 Hz; H-2);6,78 (1H, d, 8,0 Hz; H-5); 7,28 (1H, dd, 2,0; 8,0 Hz; H- 6). Tham khảo t i liệu [5], xác địnhchất s 2 l h p chất acid 3,4-dihydrox ybenzoic, tên thường g i acid protocatechuic.Gi ng như chất s1 v chất s2, chất s 3 c ng l d n xuất c a acid benzoic. Chất s3 cóhai nhóm t n hiệu proton c a nhân thơm (mỗi nhóm có 2 proton đ i x ng). Hai nhóm protonn y đư c xác định l các proton H-2; H-6 và H-3; H- 5 c a vòng benzen. Dựa v o các phổ

NMR, phổ kh i cho biết công th c phân t c a3 là C 7H6O3 (phổ kh i ESI-MS có đỉnh ion t im/z: 137 [M- H]). H p chất3 đư c xác định l acid 4-hydroxybenzoic sau khi phân t ch dữkiện phổ nghiệm v tham khảo các t i liệu đã công b [5]. Chất s 4 thu đư c dưới d ng chất rắn m u trắng. Phổ IR cho biết trong phân t4 có cácnhóm ch c sau: nhóm OH (dải hấp th có đỉnh 3409 cm-1); nhóm C=O (đỉnh 1760 cm-1); liênkết đôi C=C (đỉnh 1598; 1457 cm-1); liên kết C- O (đỉnh 1266, 1030 cm-1). Phổ1H- NMR xuấthiện t n hiệu c a 6 proton vòng thơm có đ chuy n dịch từ δH 6,69 đến 7,52 ppm, 3 t n hiệu

singlet c a c a nhóm methoxy đ nh v o vòng thơm đ chuy n dịch lần lư t δH=3,78 ppm,δH=3,75 ppm v δH=3,73, 4 proton methylen đ chuy n dịch từ 2,69 ppm đến 3,03 ppm.Phổ13C- NMR c a4 có 12 t n hiệu cacbon nằm trong v ng liên kết đôi hay vòng thơm có đdịch chuy n từ 112,7 ppm đến 150,1 ppm khẳng định chất s 4 có 2 vòng thơm trong phân t .M t t n hiệu cacbon c a nhóm cacbonyl xuất hiện t i δc=178,9 ppm, t n hiệu n y kết h p vdữ liệu phổ hồng ngo i có đỉnh hấp th t i 1760 cm-1 cho phép xác định4 có vòng lacton. Cácdữ liệu đã phân t ch trên rất gi ng với những dữ liệu phổ c a h p chất arctigenin [6], [7]

đoán cấu tr c4 có phần aglycon l arctigenin. Phần đường c a 4 đư c xác định l đườngglucose, cấu hình β với các t n hiệu đ c trưng proton anomer δH= 5,61 (d, J=7,0 Hz), t n hiệuCH 2 với δH= 4,35-4,49 ppm, δc=62,3 ppm. Phổ kh i có pic ion (m/z ) = 557 [M+Na] + cho biếtchất s 4 có kh i lư ng phân t M=534. Kết h p t nh chất vật lý, dữ kiện phổ v tham khảt i liệu [6], [7], [8] nhận danh chất s4 là arctiin.


7/116


Hà Nội - 2015

7

Hình 1.Công thức cấu t o của các hợp chất (1-5) phân lập được từ lá gối h c Chất s 5 thu đư c dưới d ng b t m u v ng. Phổ IR cho biết trong phân t c a h p chấ

5 có các nhóm OH (3402 cm -1), nhóm C=O (1659 cm -1), nhóm C=C nhân thơm (1614; 1512cm -1), nhóm C-O (1183, 1090 cm -1). Phổ1H- NMR c a5 xuất hiện t n hiệu c a 6 proton vòngthơm đ chuy n dịch δH 6,21-7,98 ppm. Trong s 6 proton n y có 2 proton ghép c p meta δH 6,21 (1H, d, J=2 Hz); 6,41 (1H, br s), 2 t n hiệu c p doublet kép c a 4 proton thơm: δH 6,95(2H, dd, J=2,0; 7,0 Hz ) v δH 7,98 (2H, dd, J=2,0; 6, 5 Hz). Quan sát về v ng trường cao thấyt n hiệu c a hai nhóm CH với δH 5,70 (1H, br s) v 4,97 (1H, d, J=1,5) c ng m t nhóm các t nhiệu đ chuy n dịch từ δH 1,25 đến 4,41 ppm đư c nhận định l t n hiệu c a phần đường.Khảo sát phổ13C- NMR chỉ ra sự có m t c a 26 nguyên t cac bon, trong đó t n hiệu ca nhómC=O xuất hiện δC 179, 8 ppm. Tất cả các dữ liệu trên cho biết chất s5 l m t flavonoiddiglycosid, ph h p với phổ ESI-MS pic ion m/z 587 [M+Na] + cho biết công th c phân tC26H28O14 (M=564) [2], [9]. Xét riêng phần aglycon, việc chỉ có các t n hiệu proton và carbonthơm (ho c thu c liên kết đôi) ch ng t h p chất5 là flavono id với phần aglycon chỉ có nhómthế hydroxy. Các t n hiệu proton thu c vị trmeta cho biết ch ng thu c vị tr 6 v 8 c a vòngA, 2 t n hiệu c p doublet kép c a 4 proton thơm đư c xác định hai c p proton vị trortho đ i x ng c a vòng B. Do đó phần aglycon đư c xác định l kaempferol[2] . Hai phần đườngtrong phân t c a5 đều l đường có cấu hìnhα do 2 proton anomer xuất hiện δH 5,70 (1H, br s) v 4,97 (1H, d, J=1,5). Hai phần đường lần lư t đư c xác định l arabinofuranose vrhamnopyranose (m t đường có 5 cacbon v m t đường có 6 cacbon). Đường arabinose đ nhv o phần aglycon vị tr C-3 do xuất hiện tương tác c a H-1’’ (δH 5,70, br s) và C-3 ( δC


8/116


Hà Nội - 2015

8

134,8 ppm) khi quan sát trên phổ HMBC. Các t n hiệu cacbon còn l i c a đườngarabinofuranose đư c xác định l88,4 (C- 2’’), 77,2 (C-3’’), 87,9 (C-4’’), 62,5 (C-5’’) sau khi phân t ch các phổ HSQC, HMBC c ng như tham khảo t i liệu đã công b [2], [9]. Đườngrhamnopyranose đư c xác định l đ nh v o vị tr C-2 c a đường arabinose do xuất hiện tươngtác c a H-1’’’ (δH 4,97, d) và C- 2’’’ (δC 88,4 ppm) c ng như tương tác c a H-2’’ (δH 4,44, dd)và C- 1’’’ (δC 101,3 ppm) trên phổ HMBC. Tổng h p các dữ kiện phổ đã phân t ch, tham khảot i liệu [2], [9], [10] xác định chất s5 l h p chấtkaempferol-3-O- α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinofuranosid. H p chất n y lần đầu tiên đư c phân lập từ lác a lo i Artabotrys hexapetalus thu hái Trung Qu c [10]. Cho đến nay, chưa có bất cnghiên c u n o công b về sự có m t c a h p chất kaempferol-3-O- α-L-

rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinofuranosid trong các lo i thu c chi Leea .

4. KẾT LUẬN Từ cắn chiết ethanol b phận lá c a cây g i h c ( Leea rubra Blume ex Spreng) thu hái

Bắc Giang (Việt Nam), bằng các phương pháp sắc ký, nhóm nghiên c u đã phân lập v xácđịnh cấu tr c c a 05 h p chất phenolic. Phân t ch các dữ kiện phổ v so sánh với những tliệu đã công b , các h p chất n y đư c xác định lacid gallic ( 1), acid protocatechuic ( 2),acid 4-hydroxybenzoic ( 3), arctiin ( 4), kaempferol-3-O- α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinofuranosid ( 5). Ba h p chất2, 4, 5 lần đầu tiên phân lập đư c từ lo i g i h c L. rubra ,trong đó hai h p chất (4-5) lần đầu tiên đư c tìm thấy trong m t lo i thu c chi Leea . Đây lđóng góp mới c a nghiên c u nhằm l m phong ph thêm tri th c về hóa thực vật h c c a chLeea nói chung và loài L. rubra nói riêng.

Các kết quả trên c ng m ra những hướng nghiên c u sâu hơn nhắm tới m c tiêu tìm rho t chất ch nh có khả năng ng d ng l m chất chu n trong ki m nghiệm. Cần tiếp t c thhiện các nghiên c u bổ sung về h m lư ng v tác d ng sinh h c c a các h p chất phân lậđư c, nhằm minh ch ng cho công d ng v góp phần xây dựng hệ th ng tiêu ch , phương phđịnh t nh, định lư ng ph c v cho công tác quản lý chất lư ng dư c liệu g i h c.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Viện Dư c liệu (2004),Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam , Nh xuất bản Khoah c v Kỹ thuật, tập 1, 874-875.2. Nguyễn Thị Phương v c ng sự (2014), Flavonoid phân lập từ lá c a cây g i h c,Tạp chí

Dược liệu, 19(2), 110-115.


9/116


Hà Nội - 2015

9

3. Phuong NT. et al (2014), Triterpenes from the leaves of Leea rubra Blume ex Spreng,

Vietnam Journal of Medicinal Materials , 19(5), 307-310.

4. Gangadhar M. et al (2011), Isolation and characterisation of gallic acid from Terminalia

bellerica and its effect on carbohydrate regulatory system in vitro, International Journal of

Research in Ayurveda and Pharmacy , 2(2), 559-562.

5. Yu Y, Gao H, Tang Z. et al. (2006), Several phenolic acids from the fruit of Capparis

spinosa , Asian Journal of Traditional Medicines , 1, 1-4.

6. Xie L.H. et al. (2003), Transformation of arctiin to estrogenic and antiestrogenic substances

by human intestinal bacteria, Chem. Pharm. Bull. , 51(4) 378 — 384. 7. Saknali A. et al. (2011), Sausurea heteromalla (D. Don) Hand.-Mazz.: A new source of

arctiin, arctigenin, and chlorojanerin, Indian Journal of Chemistry , 50, 624-626.

8. Chaturvedula VSP. et al. (2012), Chemical constituents from the polar fraction of Rubus

suavissimus, Organic Chem Current Res, 1(1), 1-6.

9. Zhong J, Yang Y, Xiao Z (2009), Separation and purification of three flavonoids from the

petal of Rosa Rugosa Thunb. by HSCCC, Asian Journal of Traditional Medicines , 4(6), 220-

227

10. Li T, Yu J (1998), Studies on the chemical constituents of the leaves from Artabotrys

hexapetalus , Yao Xue Xue Bao , 33(8), 591-596.


10/116


Hà Nội - 2015

10

KHẢO SÁT SỰ GIẢI PHÓNG KÉO DÀI CỦA VIÊNĐA LỚ PTRÊN HỆ CỐT TRƠ

Nguyễn Văn Mnh1, Phan K ế Sơn

1, Nguyễn Thu Hương

1,

Giáo viên hướ ng dẫn: Nguyễn Thanh Hải 11 Khoa Y Dư c, Đi h c Qu c gia Hà N i

TÓM TẮT

M ục tiêu : Xây d ựng mô hình đng h c giải phóng kéo dài c a viên đa lớ p dựa trên đng h cHiguchi. Thi ết k ế các mô hình th ực nghi ệm đ đánh giátính phù h p c a mô hình đ ng h cđã xây dựng đư c. Phương pháp nghiên cứ u : Xây d ựng và ch ng minh mô hình lý thuy ết

đ ng h c giải phóng kéo dài c a viên đa lớp theo phương pháp giải t ch đi s . Thiết k ế và bào ch ế các viên nén h ệ c t trơ 1 lớ p, 2 l ớ p vớ i chất mô hình là sunset yellow. S d ng máyđo đ hòa tan đ đánh giá đng h c giải phóng sunset yellow t ừ các m u viên bào ch ế đư c.

K ế t qu ả: Xây d ựng đư c m t mô hình lý thuy ết đ ng h c Higuchi m r ng cho h ệ c t trơnhiều lớ p, ch ng minh đư c sự giải phóng dư c chất từ hệ c t nhiều lớ p trên th ực tế tuân theomô hình đã xây dựng vớ i hệ s tương quan lớ n. K ế t lu ận: Mô hình đng h c Higuchi m r ng giúp ti ết kiệm thờ i gian và các thí nghi ệm khi đánh giá và t i ưu hóa sự giải phóng dư c

chất từ viên c t nhiều lớ p. Bằng cách điều ch ỉnh đ d y c ng như nồng đ dư c chất giữa cáclớ p trong viên có th bào ch ế đư c m u viên có đng h c giải phóng g ần với đ ng h c bậckhông – tuyến tính theo th ờ i gian.

T ừ khóa : Higuchi, c t nhiều lớ p, ki m soát gi ải phóng thu c, giải phóng kéo dài.

SUSSTAINED RELEASE KINETIC OF DRUG FROM MULTI-LAYER MATRIXTABLETS

SUMMARYObjects : Building the kinetic model for sustained release of drug from multi-layer tablets

based on Higuchi model. Designing experiments to assess the rate of drug release from multi -

layer c t tablets. M ethod: Building and demonstrating the logical model of multi-layer c t

tablets by mathematical analysis. Designing and manufacturing one-layer and two-layer c t

tablets with sunset yellow as a drug model. Assessing kinetic models of tablets by solubility

machine. Results: Designed a logical Higuchi model for multi-layer c t tablets. Demonstrated

the relationship between drug delivery from c t tablets and Higuchi model. Conclusion: Higuchi model is a sharp tool to save time and experiments in assessing and optimizing the


11/116


Hà Nội - 2015

11

drug delivery of multi-layer tablets. The release of drug from multi-layer c t tablets is nearly

liner with time.

Key words : Higuchi, multi-layer c t, controlled drug delivery, sustained release.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ Khoa h c bào ch ế thu c đã có những bướ t phát tri n m nh trong th ờ i gian qua. T ừ

những d ng thu c qui ước trước đây, đến nay đã phát trin thành công nhi ều d ng thu c giải phóng có ki m soát đư c thiết k ế m t cách tinh vi. Các d ng thu c đó đãkhắc ph c đư cnhững như c đim v n có c a d ng thu c qui ướ c (nồng đ thu c trong máu tăng đ t ng t;

phải dùng nhi ều lần trong ng y …) v mang li nhiều l i ch cho ngườ i bệnh (an to n hơn;

dùng thu c ít lần hơn trong ng y …).M t trong s các d ng bào ch ế giải phóng kéo dài là viên c t trơ (hình 1.1 (a)), có cấu

t o là m t viên nén ch a dư c chất và các thành ph ần t o c t không tan. Khi s d ng dư cchất sẽ giải phóng kh i c t theo con đườ ng khu ếch tán. Đ ng h c giải phóng dư c chất từ viên c t trơ đã đư c Higuchi mô t ả bằng m t phương trình toán hc vào kho ảng năm 1960(M=k.t 1/2; trong đó M l lư ng dư c chất giải phóng; k là h ệ s tỷ lệ; t là th ờ i gian – Hình1.1(b)). Mô hình toán h c (đ ng h c Higuchi) cho th ấy dư c chất đư c giải phóng t ừ c t trơ

tỷ lệ với căn bậc hai c a thời gian. Đng h c này có th giải thích là do trong quá trình gi ải phóng, quãng đườ ng khu ếch tán ngày càng dài trong khi chênh l ệch nồng đ không thay đổi.

Đ khắc ph c như c đim t c đ giải phóng dư c chất giảm theo th ờ i gian, nhómnghiên c u đ t vấn đề thiết k ế viên đa lớp có h m lư ng dư c chất tăng dần từ ngoài vàotrong đ tăng dần chênh l ệch h m lư ng giữa bề m t giải phóng v môi trường đ bù l i tácđ ng tăng quãng đư c khu ếch tán trong quá trình. Như vậy t c đ giải phóng s ẽ đư c giữ ổnđịnh v đng h c giải phóng s ẽ gần với đ ng h c bậc không hơn [1,2][3,4].

Đề tài nghiên c u đư c tiến hành nh ằm kh ẳng định gi ả thiết khoa h c trên v ớ i các n idung nghiên c u ch nh như:

- Xây d ựng mô hình đng h c lý thuy ết quá trình gi ải phóng dư c chất từ viên đa lớ p.- Thực nghi ệm đ ch ng minh mô hình lý thuy ết đã xây dựng.- Đề xuất viên gi ải phóng kéo d i theo cơ chế c t trơ đa lớp có đng h c giải phóng x ấ p

xỉ bậc không.


12/116


Hà Nội - 2015

12

(a) Mô hình viên c t trơ(b) Mô hình Higuchi d ng đ xây d ựng mô

hình đ ng h c giải phóng

Hình 1.1. Viên d ng cốt trơ v động học Higuchi

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.1 Nguyên li ệu, thi ế t b ị Viên d ng c t trơ, c t trơ đa lớp v đng h c giải phóng t ừ viên.Canxi dihydrophosphat; lactose; ethyl cellulose (EC); ethanol đt tiêu chu n dư c d ng.Máy d ậ p viên m t chày.

Máy đo đ hòa tan Valken; máy đo phổ UV – Vis

2.2 Phương pháp nghiên cứ u- S d ng các phương pháp giải t ch đi s đ xây d ựng các mô hinh lý thuy ết.- Phương pháp b o chế viên c t, c t đa lớ pCác m u viên đư c bào ch ế bằng phương pháp ướ t vớ i dung d ịch EC trong ethanol là tá

dư c dính. Công th c bào ch ế trình bày trong b ảng 2. 1 dưới đây STT Thành phần Số lượ ng cho 100 gam ht (g)

1 Canxi dihydrophosphat 70

2 Lactose 24 ho c 20

3 Ethyl cellulose 3

4 Cồn 96% 25

5 Sunset yellow Thay đổi 2 (lớ p ngoài) ho c 6 (lớ p trong)6 Magnesi stearat 1

- Phương pháp dậ p viên

+ Dậ p viên m t lớ p: bằng chày 7 mm, kh i lư ng viên 180 mg


13/116


Hà Nội - 2015

13

+ Dậ p viên hai l p: D ậ p viên th nhất bằng chày c i 7 mm, d ậ p viên l ần hai b ằng chày11 mm, trong lõi có viên nhân đường k nh 7 mm đã dậ p.

- Đánh giá đ hòa tan sunset yellow t ừ viên: th bằng thi ết b ị cánh khu ấy, dùng 900 mlnước l m môi trường hòa tan, định k ỳ định lư ng sunset yellow hòa tan b ằng phương pháp đoquang.

- Các phương pháp đánh giá sự tương quan mô hình Higuchi Dựa v o hệ s tương quan R 2, v dựa v o hệ s AIC đư c t nh dựa trên phần mềm MathCAD.

- So sánh đồ thị giải phóng dư c chất Có rất nhiều phương pháp đư c s d ng đ đánh giá xem hai đồ thị giải phóng dư c

chất c a hai chế ph m l gi ng nhau hay khác nhau b i chỉ s f2 đư c quy định b i cơ quaquản lý dư c ph m v thực ph m Mỹ FDA.

Trong đó: n: số điểm lấy mẫu; : phần trăm dược chất hòa tan tại thời điểm t của mẫu đối chiếu;: phần trăm dược chất hòa tan tại thời điểm t của mẫu thử

Tiêu chuẩn đặt ra: hai đồ thị được coi tương tự nhau nếu nằm trong khoảng từ 50-100, giátrị càng lớn thì hai đồ thị càng giống nhau.

3. K ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. X ây d ựng mô hình động h ọc lý thuy ế t quá tr ình gi ải phóng dượ c ch ấ t t ừ viên m ột l ớ p.S d ng mô hình Higuchi, thu c đư c coi như giải phóng theo t ừng lớ p, khi l ớ p này h ết

tớ i lớp kia. Như vậy ta có th phân ra các vùng gi ả định như sau (như hình 1(b)).Dòng ch ất l ng thấm v o hòa tan dư c chất, với đ tan c a thu c trong kho ảng 0 < x <

(trong kho ảng này thu c đã hòa tan ho n to n) l C =. Theo s ự chênh l ệch gradient n ồngđ , nồng đ chất tan s ẽ giảm cho t ới khi đt C = 0 t i liên b ề m t giữa viên và môi trườ ng hòatan. Trong kho ảng th tích < x < L, lư ng nướ c thấm v o chưa đ khả năng hòa tan ho ntoàn ch ất tan, v n còn t ồn t i các h t chất r ắn chưa bị phân rã hoàn toàn. Trong kho ảng này,dung d ịch tr ng thái quá bão hòa. Trong kho ảng th t ch x > L, chưa có nướ c thấm vào,chưa có sự hòa tan ch ất tan. B ằng cách này b ề m t chung gi ữa vùng thu c b ị phân tán hoàntoàn và vùng ch a các phân t thu c b ị hòa tan m t phần (m t hệ d ị th ) di chuy n vào phía

trong c t theo th ờ i gian.


14/116


Hà Nội - 2015

14

Phân tích hình v ẽ, sự biến thiên n ồng đ trên m t đơn vị th tích, dM, cùng v ớ i sự biếnthiên đ dày vùng d ị th các phân t thu c chưa bị hòa tan ho n to n, dh, đư c cho b i :

Theo định luật Fick I cho s ự khuếch tán các ch ất tan ta l i có

(1)

Hay (2)

Vớ i là hệ s khuêch tán c a chất tan đang đư c xét.Khi cân b ằng phương trình (2) v (3) sau đó lấy tích phân và gi ải ra h ta thu đư c

Lấy t ch phân phươ ng trình (1) và thay giá tr ị c a h theo phương trình (4) thu đư c:

Đây ch nh l phương trình Higuchi. Đ thiết lập đư c các phương trình trên ta phải chấ pnhận m t s điều kiện gần đ ng sau – các điều kiện giả ổn định c a Higuchi:

- Nồng đ thu c trong m ỗi đơn vị th tích c a c t phải lớn hơn đáng k so vớ i nồng đ thu c bão hòa.

- Môi trườ ng l ng mà thu c khuêch tán v o đư c coi như t i đó nồng đ thu c khôngđáng k .

- Các h t thu c đươc coi như l nh hơn nhiều so v ớ i khoảng cách khuêch tán- Hằng s khuêch tán c a chất tan đư c coi như hằng định.

- Không có tương tác đáng k nào gi ữa thu c và c t.3.2. Xây d ựng mô hình động h ọc lý thuy ế t quá tr ình gi ải phóng dượ c ch ấ t t ừ viên đa l ớ p.

Như vậy viên d ng c t m t lớp lư ng dư c chất giải phóng gi ảm dần theo th ờ i gian. Đ đ ng h c c a viên d ng c t tuân theo đng h c bậc không đề t i đt vấn đề bào ch ế viên c tnhiều lớ p, m ỗi lớ p có n ồng đ thu c khác nhau như trong hình, c ng hướ ng v ề tâm thì n ồngđ c ng cao đ bù tr ừ sự giảm t c đ giải phóng theo th ờ i gian do tăng quãng đườ ng khu ếchtán . Đ làm rõ, hãy xét m t tính toán minh h a cho h ệ c t hai l ớp, sau đó sẽ m r ng ra

trườ ng h p tổng quát v ớ i n lớ p.


15/116


Hà Nội - 2015

15

(a) Hệ c t hai l ớ p vớ inồng đ thu c ban đầu

mỗi lớ p là khácnhau

(b) Các giai đon giải phóng dư c chất từ hệ c t hai l ớ p vớ inồng đ tương ng lớ p th nhất và lớ p th hai là A 1, A 2 cùng

bề d y tương ng là 2l 1 và 2l

Hình 3.1. Viên d ng cốt hai lớ p Trướ c hết chúng ta cùng quay tr l i vớ i mô hình Higuchi c ổ đi n khi s ự phân b chất tan làđồng nh ất, khi đó sự phân b chất tan tuân theo 3 phương trình sau:

Vớ i M t : lư ng ch ất tan đư c giải phóng qua m t đơn vị diện tích b ề m t trong th ờ i gian t.

: t c đ giải phóng ch ất tan.

Đ tiện dễ d ng hơn trong việc th hiên m i tương quan giữa lư ng thu c giải phóng theo th ờ igian, t ừ đó ch ng minh đư c t nh ưu việt c a mô hình m r ng so v ớ i mô hình c ổ đi n, chúngta s d ng các đ i lư ng không th nguyên.

Đ t: l đ i lư ng thờ i gian không th nguyên

Khi đó là t c đ giải phóng không th nguyên

( vớ i : bề dày c a lớ p chất ban đầu theo mô hình)Từ (4) và (5) ta có:


16/116


Hà Nội - 2015

16

(6)

Vớ i là thời gian đ giải phóng hoàn toàn h ết chất tan mà t i đó các điều kiện giả định c aHiguchi v n còn t ồn t i.

Từ phương trình Higuchi đã chng minh:

Từ các m i tương quan trên ca mô hình c ổ đi n chúng ta m r ng vớ i hệ c t hai l ớp. Trườ ngh p đư c minh h a hình 2(a); (b) là mô hình c t gồm 2 lớp đ i x ng có b ề dày l ần lư t là

và , m ỗi n a ch a h m lư ng ch ất tan là A 1 và A 2 tương ng.

Với điều kiện vật liệu polymer c a c t c a mỗi lớ p là gi ng nhau, các thông s và làkhông đổi trong su t quá trình; lư ng ch ất tan lớ p bên ngoài A 1 t hơn so vớ i lớ p bên trong.Ta có th chia quá trình gi ải phóng th nh 4 giai đonTừ (4) và (5) ta có:

Từ đó ta lập đư c m i quan h ệ giữa hai đ i lư ng không th nguyên l ần lư t c a t c đ giải phóng và th ời gian.Tương tự như vậy ta tìm m i liên h ệ giữa hai đi lư ng này trongcác kì th ờ i gian khác nhau.

Trong kho ảng thờ i gian t 1 < t < t 2 tương ng vớ i < < :Phương trình (9) vớ i A = A 2, ta có :


17/116


Hà Nội - 2015

17

Lấy tích phân v ới điều kiện = t i t = t 1

Ở thời đi m t > t 2 khi đó to n b lư ng chất tan còn l i đư c giải phóng, và hi n nhiên, lúc

này t c đ giải phóng s ẽ l đồng nh ất và không ph thu c vào phân b chất tan ban đầu.Điều n y đã đư c tính tính toán m t cách c th qua các k ết quả trung gian c a J. Crank(The Mathematics of Diffusion, Oxford University Press, London, 1956, p. 45.). Lúc này

t c đ giải phóng đư c cho b i

Khi m r ng vớ i 3 lớ p và n l ớ p tiế p t c ta sẽ thu đư c: Trong kho ảng thờ i gian tương ng vớ i

Từ phương trình (9) vớ i A = A 3, lấy tích phân 2 v ế s d ng điều kiện t i t = t 2.

Vớ i sự biến đổi tương tự, dễ d ng thu đư c bi u th c c a t c đ giải phóng không th nguyêntrong


18/116


Hà Nội - 2015

18

Như vậy theo cách ch ng minh h ồi quy ta có th dễ d ng t nh toán v tìm đư c m i quan h ệ giữa thờ i gian và t c đ giải phóng thu c bất kì giai đo n n o khi m các điều kiện giả ổnđịnh v n đư c duy trì.

M r ng cho trườ ng h p n lớ p:

3. Các thí nghiệm chứ ng minh mô hình lý thuyết đã xây dự ng.Dậ p các m u viên 1 l ớ p và viên 2 l ớp theo phương pháp đã mô tả, đánh giá đ hòa tan c asunset yellow t ừ viên. K ết quả trình bày trên hình 3.2, 3.3

(a) tính theo th ờ i gian (b) t nh theo căn bậc hai th ờ i gian

Hình 3.2.Lượng dượ c chất giải phóng theo thờ i gian của viên cốt cốt trơ 1 lớ p. Vớ i sự giải phóng tuy ến t nh theo căn bậc hai c a thờ i gian( R 2= 0.9838) và ch ỉ s AIC th ấ pnên viên s ự giải phóng dư c chất từ viên c t c t trơ 1 lớ p phù h p với mô hình đng h cHiguchi.


19/116


Hà Nội - 2015

19

Hình 3.3. Dượ c chất giải phóng theo thờ i gian của viên cốt cốt trơ 1 lớ p và 2 lớ p. Khác v ớ i viên c t c t trơ 1 lớ p, b ị giảm dần t c đ giải phóng theo th ờ i gian, s ự giải phóngdư c chất viên 2 l ớ p gần như tuyến tính theo th ờ i gian v ớ i R 2 = 0.972, điều này phù h p vớ icác tính toán lý thuy ết đã chng minh phần trướ c.Các thí nghi ệm đư c thực hiện l p l i. Khi so sánh các đồ thị, giá tr ị tương đồng đồ thị f2 =89.

4. BÀN LUẬN VÀ K ẾT LUẬNCác tính toán nói trên cho th ấy biến đổi không gian phân b trong c t ban đầu m t cách

h p lý có th làm gi ảm nhẹ đi sự biến thiên c a t c đ giải phóng theo th ờ i gian, K từ khi t cđ giải phóng c a chất tan ph thu c vào kho ảng cách t ớ i bề m t thoáng c a c t, thì đ tránhsự giảm t c đ giải phóng theo th ờ i gian, ta c ần nâng cao n ồng đ c a các l ớ p bên trong – nhưlà m t phương pháp b trừ. Sự gia tăng nồng đ thu c các l ớ p lõi còn ph thu c vào hàmlư ng thu c thực tế. Khi x lý khéo léo các tham s liên quan, ta có th l m cho đồ th ị c a t cđ giải phóng thu c theo th ờ i gian g ần với đ ng h c bậc không. Tuy v ề m t kĩ thuật, phương

pháp c t nhiều lớ p là hoàn toàn kh ả thi ( kĩ thuật co-extrusion), nhưngcần phải làm ch khá

nhiều điều kiện thực nghi ệm đ từ đó phương trình Higuchi không bị sai s quá nhi ều.Mô hình đng h c Higuchi m r ng giúp ti ết kiệm thờ i gian và các thí nghi ệm khi đánh

giá và t i ưu hóa sự giải phóng t ừ viên c t c t nhiều lớ p. B ằng cách điều ch ỉnh đ d y c ngnhư nồng đ dư c chất giữa các l ớ p trong viên c t ta thu đư c sự giải phóng g ần với đ ngh c bậc không – tuyến tính theo th ờ i gian.

LỜ I CẢM ƠN Xin cảm ơn B môn Bào ch ế và Công ngh ệ Dư c ph m, B môn Hóa dư c và Ki m

nghiệm thu c, Khoa Y Dư c, ĐHQGHN đã gi p đỡ ch ng tôi ho n th nh đề tài này.


20/116


Hà Nội - 2015

20

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Arbabi, S., Sahimi, M., 1991. Computer-simulations of catalyst deactivation. I. Model

formulation and validation. Chem. Eng. Sci. 46, 1739 – 1747.2. Bonny, J.D., Leuenberger, H., 1991. C t type controlled release systems. I. Effect of

percolation on drug dissolution kinetics. Pharm. Acta Helv. 66, 160 – 164.3. Borgquist, P., Zackrisson, G., Nilsson, B., Axelsson, A., 2002. Simulation and parametric

study of a film-coated controlled-release pharmaceutical. J. Control. Release 80, 229 – 245.4. Bunde, A., Havlin, S., Nossal, R., Stanley, H.E., Weiss, G.H., 1985. On controlled

diffusion-limited drug release from a leaky c t. J. Chem. Phys. 83, 5909 – 5913.5. Carslaw, H.S., Jaeger, J.C., 1948. Operational methods in applied mathematics. Oxford

Univ. Press, London. 2 edition

6. Crank, J., 1984. Free and moving boundary problems. Clarendon Press, Oxford.

7. Frenning, G., 2003. Theoretical investigation of drug release from planar c t systems:

effects of a finite dissolution rate. J. Control. Release 92, 331 – 3398. Frenning, G., 2004. Theoretical analysis of the release of slowly dissolving drugs from

spherical c t systems. J. Control. Release 95, 109 – 117.9. Higuchi, T., 1961. Rate of release of medicaments from ointment bases containing drugs in

suspension. J. Pharm. Sci. 50, 874 – 875.10. Higuchi, T., 1963. Mechanisms of sustained action medication: Theoretical analysis of the

rate of release of solid drugs dispersed in solid matrices. J. Pharm. Sci. 52, 1145 – 1149.


21/116


Hà Nội - 2015

21

NGHIÊN CỨ U CHIẾT XUẤT CURCUMIN VÀ BÀO CHẾ PHYTOSOMECURCUMIN NHẰM TĂNG SINH KHẢ DỤNG TỪ CỦ NGHỆ

Phan K ế Sơn 1, Nguyễn Bích H nh 1

Giáo viên hướ ng dẫn: Bùi Thanh Tùng1, Nguyễn Thanh Hải 1 1 Khoa Y Dư c, Đi h c Qu c gia Hà N i

TÓM TẮTMục tiêu: Nghiên c u phương pháp chiết xuất curcumin và bào ch ế phytosome

curcumin nh ằm tăng sinh khả d ng từ c Nghệ. Phương pháp nghiên cứ u: Tiến hành chi ếtxuất curcumin t ừ c Nghệ, s d ng các phương pháp sắc ký c t và k ết tinh. S d ng phương

pháp bào ch ế phytosome đ tổng h p phytosome curcumin t ừ curcumin đư c chiết từ c Nghệ và phospholipid v ớ i các t ỷ lệ khác nhau. Đánh giá các đc tính c a ph c h p phytosomecurcumin t ổng h p đư c dựa v o các phương pháp phân t ch quang phổ: đo phổ hồng ngo iIR và phân tích quét nhi ệt vi sai DSC. K ết quả: Đã chiết xuất và k ết tinh đư c curcumin cóđ tinh khi ết cao. Phytosome curcumin đư c tổng h p từ curcumin và phospholipid, sau khiđánh giá các đc tính c a ph c h p t o thành theo t ỷ lệ 1:1 có h m lư ng curcumin cao nh ất(6 %). Trên ph ổ IR c a ph c h p phytosome curcumin quan sát th ấy đỉnh (peak) t i 3745.76cm -1 ch ng t có hình thành liên li ết hydro gi ữa curcumin và phospholipid. Ph ổ DSC cho th ấy

m t đỉnh cực ti u 84.84 oC và m t đỉnh khác 397.38 oC. Đỉnh thu nhi ệt 84.84 oC do chuy nđ ng nhi ệt c a đầu phân c ực phospholipid gây ra, đỉnh 397.38 oC do thay đổi từ tr ng thái gelsang l ng c a phytosome curcumin v đầu hydrocarbon không phân c ực c a phospholipid b ị nóng ch ảy. K ết luận: Đã xây dựng đư c quy trình chi ết xuất curcumin có đ tinh khi ết cao.Tổng h p th nh công v đánh giá đư c ph c h p phytosome curcumin đã b o chế.Từ khóa: Curcumin, Ngh ệ, phytosome, phytosome curcumin.

EXTRACTION CURCUMIN AND PREPARING PHYTOSOME CURCUMIN FORIMPROVE BIOAVAILABILITY OF CURCUMIN FROM TURMERIC

SUMMARY

Objectives: This research aimed to study the extraction method and prepare phytosomecurcumin to increase bioavailability of curcumin from turmeric. Method: Extractingcurcumin from turmeric using column chromatography and crystallization. Synthesize

phytosome curcumin from tumeric-extracted curcumin and phospholipid with different ratios.

Evaluating the characteristics of the compound phytosome curcumin based on spectralanalysis method: IR spectrometry and Differential scanning calorimetry. Results: We


22/116


Hà Nội - 2015

22

successfully extracted and crystallized curcumin with high purity. Phytosome curcumin was

synthesized from curcumin and phospholipid. The evaluating process showed that the

characteristics of the compound formed at the ratio of 1: 1 had the highest concentration of

curcumin (6%). The peak at 3745.76 cm -1 was observed on the IR spectrum of phytosome

curcumin , demonstrating a hydrogen bond formation between curcumin and phospholipid.

DSC spectrum showed a minimum peak in 84.84 oC and another peak in 397.38 oC.

Endothermic peak in 84.84 oC due to thermal motion of the first polarization phospholipids

induced, peak in 397.38 oC by change from gel to a liquid state of Phytosome curcumin and

head nonpolar hydrocarbon of phospholipid melted. Conclusion: We have extractedcurcumin with high purity. We also synthesized and evaluated prepared phytosome curcumin

complex.

Keywords: Curcumin, phospholipid, phytosome, phytosome curcumin.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ Curcumin là m t d n xuất từ cây ngh ệ, lo i thảo dư c có ngu ồn g c Đông Nam Á đư c

s d ng r ng rãi như l mt gia v ị trong các món ăn bản địa và các ch ế ph m dư c liệu [1].Curcumin đư c s d ng trong điều tr ị các b ệnh khác nhau bao g ồm đ c th y tinh th , vếtthương, si mật, d ị ng, viêm t y, viêm loét d dày, viêm ru t, s t, h i ch ng suy gi ảm mi ễndịch mắc phải, bệnh v y nến, bệnh Alzheimer, suy giáp, xơ nang, xơ vữa đng m ch, nh ồimáu cơ tim, loãng xương, bệnh ph ổi, s t rét, viêm kh ớ p, bệnh Leishmania, đái tháo đườ ng,

bệnh đa xơ cng, bệnh đng kinh, b ệnh Parkinson và b ệnh ung thư [2]. Về m t hóa h c,curcumin là diferuloylmethane, nó có hai vòng aryl v ớ i m t nhóm methoxy và m t nhómhydroxyl trên m ỗi vòng. Tuy nhiên, curcumin mang nh ững đ c đi m dư c đng h c kém như:kém h ấ p thu, chuy n hoá nhanh và th ải tr ừ kh i cơ th nhanh nên sinh kh ả d ng r ất thấ p.Phytosome là m t trong nh ững công th c mới đã đư c ch ng minh có tác d ng l m tăng hiệu

quả điều tr ị c a m t s phân t có sinh kh ả d ng thấ p và kh ả năng hấ p th kém [3]. Ở Việt Nam, phytosome là m t k ỹ thuật khá m ới trong khi nó đã bắt đầu đư c nghiên c u trên th ế giớ i k từ năm 1980. Vì vậy, chúng tôi ti ến hành nghiên c u này nh ằm m c đ ch đ chiết xuấtcurcumin và t ổng h p ph c h p v đánh giá phytosome curcumin t ừ Nghệ.

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U2.1 Chiết curcumin từ Nghệ

Cân 500g ngh ệ vàng, tán nh sau đó chiết bằng 5L methanol (× 3 l ần). Thu toàn b dịch

chiết r ồi đem cô quay. Cao đ c thu đư c có kh i lư ng 68g. Ph ần cao đc đư c chiết phân


23/116


Hà Nội - 2015

23

đo n lần lư t vớ i n- hexene, EtOAc v BuOH. Phân đoan EtOAc thu đư c (25 g) ch y sắc kýc t silicagel, v ớ i dung môi n-Hexane- EtOAc (10:1 đến 0:1), thu đư c 10 phân đon, từ F1đến F10. Phân đon F5 ch ấm TLC th ấy 1 vết, đem kết tinh, thu đư c 3 g. Sau đó d ng HPLCki m tra có th ấy 3 h p chất là curcumin, demethoxycurcumin và bis-demethoxycurcumin.

Hình 2.1. Sắc ký đồ của phân đo n k ết tinh.

2.2. Tiến hành tổng hợ p phứ c hợ p curucmin – phospholipidPh c h p phytosome curcumin (curucmin – phospholipid) đư c tổng h p nhờ phản ng

giữa curcumin và PEG - phospholipid các t ỉ lệ mol khác nhau: 1: 1, 1: 2, 1: 4, m ỗi tỷ lệ đãđư c l p đi l p l i hai l ần. M t lư ng b t curcumin v phospholipid đư c cân và cho vào c ccó m dung tích 100 ml, sau đó thêm 30 ml dichloromethane. Hỗn h p n y đư c đun hồi lưu

nhiệt đ không vư t quá 40oC trong 2 gi ờ. L m bay hơi dung dịch thu đư c đ lo i b dichloromethane và thêm vào dung d ịch 50 ml n – hexan. Ph c h p curucmin – phospholipidđư c k ết t a r ồi đem l c v l m khô trong chân không đ thu đư c phytosome curcumin thô.Đ lo i b các d ấu vết c a chất curcumin t ự do và phospholipid, kho ảng 500 mg b t thô đư c

hòa tan trong acetone trong 2 gi ờ v sau đó đư c l c đ thu đư c ph c h p tinh khi ết. 2.3. Xác định h m lượ ng của curcumin trong phứ c hợ p

Đườ ng chu ẩ n của nồng độ curcumin . Kho ảng 100 mg b t curcuminoid đư c hòa tantrong methanol trong bình định m c 25 ml. Dung d ịch n y đã đư c pha loãng 500 - 1000 l ầnđ xác định sự hấ p thu bướ c sóng 425 nm trong quang ph ổ UV VIS.

Xác định hàm lượ ng curcumin trong ph ứ c hợ p. Khoảng 30 mg ph c h p curcumin – phospholipid đư c hòa tan trong methanol trong bình định m c 25 ml. Dung d ịch n y đãđư c pha loãng 10 l ần v đo đ hấ p th c a dung d ịch t i 425 nm đư c quan sát b ằng quang

phổ UV VIS.


24/116


Hà Nội - 2015

24

2.4. Đo quang phổ hồng ngo i IRTrong nghiên c u này, ph ổ hồng ngo i biến đổi Fourier (FITR) đư c s d ng đ thu

thậ p ph ổ hồng ngo i c a curcumin, phospholipid và phytosome curcumin tinh khi ết tỷ lệ 1:1.

2.5. Phân tích quét nhiệt vi sai DSCS d ng DSC cho ph c h p curcumin – phospholipid (1:1) thô và tinh khi ết. Các m u

đư c đậy k n trong đĩa nhôm v đun nóng vớ i t c đ 10 oC/phút t ừ 0oC đến 800 oC trong khínitơ (60 ml/ph t). Nhiệt đ kh i đầu chuy n tiếp đỉnh c a ph c h p thu đư c đã đư c xácđịnh và so sánh v ớ i sự gi p đỡ c a Mettler DSC 30S (Mettler Toledo, M ỹ).2.6. Đánh giá độ hòa tan

Xác định đ hòa tan c a curcumin, ph c h p phytosome curcumin, h ỗn h p vật lý c acurcumin và phospholipid b ằng cách thêm m t lư ng dư ca mỗi m u v o 20 ml nướ c trong

bình th y tinh kín nhiệt đ phòng. Các m u đư c lắc trong 24 h và ly tâm 5000 rpm trong10 ph t. Đem dịch thu đư c đo đ hấ p th c a dung d ịch t i 425 nm và quan sát b ằng quang

phổ UV VIS.

3. K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U VÀ BÀN LUẬN3.1. Đặc tính vật lý của phứ c hợ p curcumin – phospholipid

Các ph c h p thu đư c sau khi s ấy khô dưới chân không đư c giữ trong đĩa petri (Hình3.1) và quan sát tính ch ất vật lý. M u 1.1 và 1.2 là ph c h p c a curcumin và phospholipd v ớ itỷ lệ 1: 1, m u 2.1 và 2.2 là t ỷ lệ 1: 2 và m u 3.1 và 3.2 là 1: 4. T ất cả các ph c h p có màuvàng cam, tuy nhiên m u 1.1 và 1.2 m ềm v mư t trong khi b n m u khác dính và d o hơn.Điều này do trong m u 1.1 và 1.2 có nhi ều phospholipid hơn.

Hình 3.1. Các đặc tính vật lý của phứ c hợ p curcumin – phospholipid


25/116


Hà Nội - 2015

25

ở các tỷ lệ khác nhau.

3.2. Hiệu suất của quá trình tổng hợ p phytosome curcuminHiệu suất c a tất cả các quá trình t ổng h p phytosome curcumin đư c tính d ựa trên

công th c sau đây v kết quả đư c trình bày bảng 1.

Bảng 3.1. Hiệu suất tổng của quá trình tổng hợ p phứ c hợ p phytosome curcumin

Khi lư ng phospholipid trong ph c h p càng cao thì hi ệu suất tổng h p càng l ớ n, ph ch p curcumin – phospholipd v ớ i tỷ lệ 1:2 v 1:4 cao hơn tỷ lệ 1:1. Do lư ng phospholipid l ớ nnên kh ả năng tương tác giữa curcumin và phospholipd cao, nên d ễ hình thành ph c h p hơn.C ng có th l do chưa loi b đư c hết các phospholipid t ừ m u curcumin – phospholipd thô.3.3. Xác định h m lượ ng của curcumin trong phứ c hợ pTiến hành xây d ựng đườ ng chu n nồng đ curcumin

Hình 3.2Đườ ng chuẩn nồng độ curcumin

MẫuKhốilượ ng

curcumin(C)(g)

Khốilượ ng

phospho-lipid (P)

(g)

Tỷ lệ mol

Khốilượ ngphứ c

hợ p thô(g)

Tinh chế phứ c hợ p

Hiệu suấttổng

(w/w,%)

Khối lượ ngphứ c hợ p

thô (g)

Khối lượ ngphứ c hợ ptinh khiết

(g)

1.1 0.404 2.804 1:1 2.808 0.500 0.468 81.931.2 0.421 2.802 1:1 3.044 0.507 0.471 87.742.1 0.411 5.650 1:2 5.730 0,517 0.591 91.612.2 0.404 5.568 1:2 5.771 0.510 0.496 93.98

3.1 0.204 5.736 1:4 5.815 0.512 0.495 94.643.2 0.208 5.619 1:4 5.806 0.508 0.491 96.30


26/116


Hà Nội - 2015

26

H m lư ng curcumin trong ph c h p phytosome curcumin đư c tính theo công th c:

%curcumin: hàm lượng curcumin trong phức hợp A: độ hấp thụ của dung dịch curcumin, f: hệ số pha loãng

Bảng3.2. H m lượng curcumin trong phức hợp curcumin – phospholipidMẫu 1.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.2H m lượng Curcumin (%) 5.52 6.46 3.38 4.24 2.99 3.00

Tỷ lệ phần trăm ca curcumin trong phytosome trong m u 1.1 và 1.2 (theo t ỷ lệ 1: 1) là caohơn (h m lư ng curcumin đt 5.5 – 6.5 %) so v ớ i các m u còn l i (h m lư ng curcumin đt 3 – 4 %).3.4. Đo quang phổ hồng ngo i IR

Phổ IR c a curcumin, phospholipid v ph c h p tinh chế đư c trình b y trong hình3.3.Ở v ng 1500- 1800 cm -1, đ c trung cho liên kết C=C v C=O, hai đỉnh c a phổ IR c acurcumin 1625.99 cm -1 và 1600.92 cm -1 biến mất trong quang phổ c a phytosome, trong khi

m t đỉnh cao 1734.01 cm-1

c a phospholipid v n xuất hiện. Hơn nữa, xuất hiện tương tự m tđỉnh 3506.59 cm-1 c a curcumin (O- H c a nhóm phenol) v hai đỉnh 2916.37 và 2848.86cm -1 c a phospholipid (chuỗi hydrocacbon c a axit béo). Ở v ng 3200- 4000 cm -1 c a quang phổ phytosome, có m t đỉnh t i 3745.76 cm-1 v m t s dao đ ng ch ng t sự hình th nh c aliên kết hydro giữa curcumin v phospholipid. Vì vậy, trong ph c h p curcumin liên kết vớiđầu phân cực c a phospholipid trong khi đuôi không phân cực c a phospholipid v n quay tựdo v bao b c lấy m t phần cực ch a các phân t curcumin.

Curcumin Phospholipid


27/116


Hà Nội - 2015

27

Phytosome tinh khiết

Hình 3.3. Phổ IR của curcumin, phospholipid v phytosome tinh khiết

3.5. Phân tích quét nhiệt vi sai DSCHình 3. 4 trình b y nhiệt ký DSC c a ph c h p phytosome curcumin thô v tinh khiết.

Nhiệt ký c a ph c h p cho thấy 2 đỉnh:m t đỉnh cực ti u 84.84 oC và m t đỉnh khác 397.38 oC. Đỉnh thu nhi ệt 84.84 oC do chuy n đ ng nhi ệt c a đầu phân c ực phospholipid gâyra, đỉnh 397.38 oC do thay đổi từ tr ng thái gel sang l ng c a phytosome curcumin v đầuhydrocarbon không phân c ực c a phospholipid b ị nóng ch ảy.

Phytosome thô Phytosome tinh khiết

Hình 3.4. Nhiệt ký DSC của phức hợp phytosme thô v phytosome tinh khiết

3.6. Đánh giá độ hòa tan Đ hòa tan trong nước c a curcumin, hỗn h p vật lý c a phospholipid v curcumin v phh p phytosome curcumin đư c th hiện trong bảng3.3.

Bảng3.3. Độ hòa tan trong nước của curcumin, hỗn hợp vật lý của phospholipid vcurcumin v phức hợp phytosome curcumin Mẫu Độ hòa tan trong nước (mg/ml)

Curcumin 0.008

Ph c h p phytosome curcumin 0.087Hỗn h p vật lý c a phospholipid v curcumin 0.017


28/116


Hà Nội - 2015

28

4. BÀN LUẬNCurcumin có tính k ỵ nướ c cao, tính th ấm v đ hoà tan kém nên sinh kh ả d ng r ất thấ p,

nên vi ệc s d ng curcumin đ điều tr ị bệnh trong lâm sàng còn h n ch ế. Ứ ng d ng k ỹ thuật phytosome trong vi ệc cải thiện sinh kh ả d ng c a curcumin đã mang li hiệu quả đáng kế,tổng h p ph c h p phtosome curcumin đư c thực hiện các t ỷ lệ khác nhau 1:1, 1:2, 1:4. K ếtquả cho th ấy vớ i tỷ lệ curcumin : phospholipid = 1:1 có h m lư ng curcumin trong ph c h pcao nh ất. Ph c h p phytosome curcumin làm c ải thiện đáng k đ hòa tan trong nướ c c acurcumin, tăng gấ p kho ảng 10 l ần, l m tăng khả năng hấ p thu c a curcumin trong đườ ng tiêuhóa, có ti ềm năng mang li hiệu quả cao trong điều tr ị lâm sàng [3, 4].

5. K ẾT LUẬNĐã chiết xuất và k ết tinh đư c curcumin có đ tinh khi ết cao. Phytosome curcumin

đư c tổng h p từ curcumin và phospholipid v ớ i tỷ lệ 1:1 có h m lư ng curcumin cao nh ất(6 %) v đánh giá đư c sự t o thành ph c h p phytosome curcumin d ựa theo k ết quả c a phổ IR và ph ổ DSC

LỜ I CẢM ƠN

Xin chân thành c ảm ơn sự gi p đỡ c a Khoa Y Dư c đ tiến hành th ực hiện nghiên c u này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Chattopadhyay, I. Biswas, K. Bandyopadhyay, U. & Banerjee, R. K. 2004. Turmeric and

curcumin: biological actions and medicinal applications. Curr. Sci., 87, 44 – 53.2. Moorthi C, Kiran K, Manavalan R, Kathiresan K. Preparation and characterization of

curcumin – piperine dual drug loaded nanoparticles. Asian Pac J Trop Biomed 2012;2:841 – 8.3. Chutima Jantarat , Bioavailability enhancement techniques of herbal medicine: a case

example of curcumin, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 2012

4. Kuntal Maiti, Kakali Mukherjee, Arunava Gantait, Bishnu Pada Saha, Pulok K. Mukherjee.

Curcumin – phospholipid complex: Preparation, therapeuticevaluation and pharmacokineticstudy in rats. International Journal of Pharmaceutics 330 (2007) 155 – 163.


29/116


Hà Nội - 2015

29

ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA ACETAMINOPHEN LÊN SỰ PHÁT TRIỂN

PHÔI CÁ NGỰ A VẰN (DANI O RERI O )

Dương Th y Linh 1

, Hoàng Thị Mỹ H nh1

Giáo viên hướ ng dẫn: Nguyễn Lai Thành 11 Khoa Sinh h ọc, Trườ ng Đại học Khoa h ọc T ự Nhiên, Đại học Quố c Gia Hà N ội

TÓM TẮT Trong nhi ều thậ p k ỷ, Acetaminophen là ch ất thu c nhóm thu c h nhiệt - giảm đau

đư c s d ng r ng rãi nhiều đ i tư ng k cả tr sơ sinh v ph nữ mang thai. Tuy nhiên, đãcó m t s những phát hi ện tác d ng ph lên c ấu trúc và phát tri n m ch máu ho c sắc t . Bên

c nh đó, việc đánh giá ảnh hư ng c a Acetaminophen lên s ự phát tri n c a phôi thai c ngchưa có những nghiên c u k ỹ với các phương pháp hiện đ i đảm bảo đ tin cậy c ng như hiệuquả cao so v ớ i yêu c ầu an to n dư c ph m hiện nay. Nghiên c u này s d ng phôi cá ng ựavằn đ đánh giá ảnh hư ng c a Acetaminophen lên s ự phát tri n từ giai đo n r ất sớ m tớ i khiấu th k ết th c giai đon t o hình và hoàn thi ện về m t hình thái. Phôi cá đư c phơi nhiễmliên t c vớ i Acetaminophen t ừ 2 giờ cho t ớ i 96 gi ờ sau khi th tinh. Các giá tr ị LC50, EC50và TI (ch ỉ s d ị d ng) c a Acetaminophen v quan sát đánh giá kết quả sau 24, 48, 72 và sau96 gi ờ . Các giá tr ị sau 96 gi ờ phơi nhiễm tương ng là: 700, 300 mg/l và 2,33. Các b ất thườ ngvề hình thái như ph m ng noãn ho ng, ph não, dị d ng đuôi, hoi t , t máu và gi ảm sắc t c a ấu th c ng đư c ghi nh ận. K ết quả thu đư c trong nghiên c u này cho th ấyAcetaminophen có ảnh hư ng không nh tớ i quá trình phát tri n phôi cá ng ựa vằn đc biệt làkhả năng gây dị d ng.Từ khóa: Acetaminophen; đc tính; cá ng ựa vằn; danio rerio ; d ị d ng

EFFECTS OF ACETAMINOPHEN IN THE EMBRYONIC DEVELOPMENT

OF ZEBRAFISH (DANI O RERI O)SUMMARY

Acetaminophen is an over-the-counter analgesic used by all groups of people, including

infant and pregnant women. The side-effects on structure and development of blood vessels or

pigmentation were reported. However, the researches on the effect of Acetaminophen on

embryonic development are limited. On this study, we evaluated the zeabrafish embryo

development at early stage and lava stage under Acetminophen treatment. The zebrafish

embryos were exposed with Acetaminophen after 2 hours after fertilization until 96 hours as

larval stage. The LC50, EC50 and TI (index malformation) of Acetaminophen were


30/116


Hà Nội - 2015

30

calculated and morphology observation after 24, 48, 72 and 96 hours. After 96 hours, the

LC50, EC50 and TI are 700, 300 mg/L and 2.33, respectively. The malformation morphology

such as yolk sac edema, heart edema, head edema, curved tail, necrosis as well as

hypopigmentation were observed. Based on these evidences, we concluded that

Acetaminophen affected to the development of zebrafish embryos.

Keywords: Acetaminophen, toxicity, zebrafish, Danio rerio, malformation

1. ĐẶT VẤN ĐỀ Acetaminophen là thành ph ần chính c a đa s lo i thu c giảm đau- h s t thương mi

đang đư c s d ng. Theo s liệu năm 2008 ca tổ ch c FDA, M ỹ, khoảng 24,6 t ỉ liều

Acetaminophen đư c s d ng mỗi năm v có xu hướng tăng[3] . Lo i thu c n y đư c s d ng ph ổ biến, k cả cho tr sơ sinh v ph nữ mang thai. Tuy nhiên, ảnh hư ng c aAcetaminophen lên s ự phát tri n c a phôi thai chưa có những k ết quả nghiên c u thực sự rõràng do h n ch ế c a phương pháp v đ i tư ng nghiên c u trước đây. Mô hình th đ c tínhtrên đ ng vật có vú b ậc cao (như: chut, th , g …) l giải pháp hi ệu quả nhưng b ị h n chế b icác vấn đề về đ o đ c nghiên c u, ngân sách và th ờ i gian. Trong nh ững thậ p niên g ần đây,mô hình th đ c trên phôi cá ng ựa vằn ( Danio rerio ) khắc ph c đư c những khó khăn trên.Vớ i những đ c đim sinh s ản nhanh, d ễ nuôi trong phòng thí nghi ệm, 85% h ệ gen tương đồngvớ i hệ gen ngườ i [2] v đc biệt là quá trình phát tri n phôi tương tự như đ ng vật bậc caođã đưa phôi cá ngựa vằn tr th nh mô hình lý tư ng cho th đ c t nh trên đng vật có xươngs ng.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U2.1. Đối tượ ng nghiên cứ u

Cá ngựa vằn ( Daino rerio ) tr ư ng th nh đư c cung c ấ p b i phòng thí nghi ệm Công

nghệ Tế b o Đng vật, B môn Sinh h c Tế bào, khoa Sinh h c, trường Đi h c Khoa h c Tự nhiên, Đ i h c Qu c gia Hà N i. Cá đư c nuôi trong điều kiện 27 ± 1 °C, 14 gi ờ sáng/ 10 gi ờ t i, pH 7,0 –7,2. Đầu chu kì sáng, c p cá ng ựa vằn đư c giao ph i trong 30 ph t. Phôi đư cthu và r a trong nước RO đư c ch n dướ i kính hi n vi đ lo i b phôi ch ết, không th tinh và

bất thườ ng giai đo n từ 4-256 t ế b o tương ng 1-3 gi ờ sau th tinh.Acetaminophen (>99%, Sigma ) đư c pha trong nướ c RO v ớ i 9 nồng đ tương ng: 150,

200, 250, 300, 400, 550, 700, 900, 1200 (mg/l). Phôi cá ng ựa vằn đư c phơi nhiễm mỗi nồng

đ acetaminophen trên đĩa 24 giếng, đi ch ng âm đư c thay th ế bằng nướ c RO.2.2. Phương pháp nghiên cứ u


31/116


Hà Nội - 2015

31

Trong nghiên c u n y, các tiêu ch đánh giá th đ c tính d ựa theo tiêu chu n OECD(Organisation for Economic Co-operation and Development) [5] . Phôi đ t yêu c ầu đư c phơinhiễm vớ i dải nông đ Acetaminophen khác nhau, quan sát trong 4 ngày và ghi l i các k ết quả về tỉ lệ s ng ch ết c ng như các dị d ng hình thái quan sát đư c. T ỉ lệ dị d ng đư c tính theo t ỉ lệ phôi b ất thườ ng / ấu th s ng sót. Hình thái đư c so sánh v ớ i các mô t ả trước đây caKimmel và cs [4] . Các ch ỉ tiêu đ xác định phôi ch ết gồm phôi đông t , không tách đuôi,không hình thành th tiết (24gi ờ ), thiếu nh ị p tim (t ừ 48 gi ờ đến 96 gi ờ ). Từ các k ết quả th nghiệm, chúng tôi ti ến hành tính n ồng đ gây ch ết 50% (LC50), n ồng đ gây d ị d ng 50%(EC50), ch ỉ s TI (ch ỉ s đánh giám c đ c h i c a hóa ch ất).

Các phân tích th ng kê g ồm hồi quy, bi u đồ, đ tin cây đư c thực hiện vớ i phần mềm

Graphpad Prism v.5.04.

3. K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U Ảnh hưở ng c ủa Acetaminophen lên s ứ c s ố ng phôi cá ng ự a v ằn

Đ xác định đ đ c c a Acetaminophen, các đường cong đáp ng liều t i 24 gi ờ , 48 gi ờ ,72 giờ , 96 gi ờ đư c xây d ựng dựa trên t ỉ lệ phôi s ng và t ỉ lệ phôi d ị d ng. K ết quả đư c th hiện hình 3.1.

Hình 3.1. Đường cong đáp ứ ng liều với Acetaminophen sau khi phơi nhiễm t i (A) 24 giờ ,(B) 48 giờ , (C) 72 giờ , (D) 96 giờ .


32/116


Hà Nội - 2015

32

Sau 24 gi ờ phơi nhiễm, Acetaminophen ảnh hư ng tớ i khả năng s ng sót c ng như hìnhthái c a phôi v tăng dần theo n ồng đ . T i nồng đ 700 mg/l đã xuất hiện phôi ch ết, trongkhi đó, ảnh hư ng gây d ị d ng đư c quan sát nồng đ thấp hơn l 400 mg/l (Hình 1A). Sau48 giờ phơi nhiễm, ảnh hư ng c a Acetaminophen tăng đáng k so vớ i thời đi m 24 gi ờ , th hiện s lư ng phôi ch ết tăng lên (nồng đ 1200 mg/l s lư ng phôi ch ết đ t 74,3%) và n ồngđ 250 mg/l đã xuất hiện d ị d ng hình thái (Hình 1B). T i thời đi m đánh giá sau 72 giờ phơinhiễm, phôi ch ết ch ỉ bắt đầu đư c phát hi ện thấy nồng đ Acetaminophen 550 mg/l nhưngtất cả các phôi còn s ng đều xu ất hiện d ị d ng. K ết thúc thí nghi ệm t i thời đi m phơi nhiễm96 giờ , nồng đ 400 mg /l Acetaminophen đã bắt đầu làm m t s phôi ch ết và t ỷ lệ phôi ch ếttăng theo chiều tăng nồng đ (hình 1D). Trong các n ồng đ phơi nhiễm, ngoài n ồng đ 150

mg/l không xu ất hiện d ị d ng, tất cả các n ồng đ còn l i đều có các phôi d ị d ng và m c đ c ng nhưtỷ lệ phôi d ị d ng tỷ lệ thuận vớ i nồng đ .

Từ những k ết quả theo dõi, tính toán t ỷ lệ chết, tỷ lệ d ị d ng các n ồng đ và th ờ i gian phơi nhiễm khác nhau, ch ng tôi xác định đư c giá tr ị LC50, EC50 th hiện trong B ảng 3.1.Giá tr ị TI đư c tính d ựa vào t ỉ s giữa LC50/EC50. K ết quả t i bảng 3.1 cho th ấy giá tr ị TI các kho ảng thời gian phơi nhiễm khác nhau đều lớn hơn 1. Như vậy, Acetaminophen có th đư c xem là m t chất có kh ả năng gây dị d ng phôi thai.

Bảng 3.1. Các chỉ số LC50, EC50 và TI của Acetaminophen đối vớ i phôi cá ngự a vằntrong các khoảng thời gian phơi nhiễm khác nhau

24 giờ 48 gi ờ 72 gi ờ 96 gi ờ LC50 (mg/l) - 935 800 700

EC50 (mg/l) 830 394 340 300

TI - 2,56 2,34 2,33

Ảnh hưởng của Acetaminophen tới sự phát triển hình thái của phôi cá ngựa vằn Bên c nh tác đng tớ i khả năng s ng sót c a phôi, Acetminophen còn ảnh hư ng tớ i sự

phát tri n hình thái c a ấu th . Ch ng tôi quan sát đư c nhiều d ị d ng hình thái trong quátrình phát tri n c a phôi các th ời gian phơi nhiễm khác nhau. K ết quả đư c th hiện hình3.2.

Phân tích các d ị d ng hình thái phôi, chúng tôi quan sát th ấy m t s dị d ng xu ất hiện

trong su t quá trình phát tri n và hoàn thi ện c a cơ quan như: ph m ng noãn ho n, ph m ng

bao tim, m ất sắc t . Trong khi đó, mt s d ị d ng xu ất hiện sau khi hoàn thi ện cơ quan như: phù não, phù m ắt, ho i t mắt.


33/116


Hà Nội - 2015

33

Hình 3.2. Các dị d ng khi phơi nhiễm AcetaminophenA: Đ i ch ng; B: Phù màng noãn hoàng (24 gi ờ ); C: Ho i t (48 gi ờ ); D: Phù màng bao tim(72 gi ờ ); E: Phù não (96 gi ờ ); F: Phù m ắt (96 gi ờ ); G: M ất sắc t (96 gi ờ ); H: D ị d ng hìnhthái đuôi (96 giờ ); I: Ho i t não (96 gi ờ ). Mũi tên: Điể m bất thườ ng

4. BÀN LUẬNTác đ ng c a Acetaminophen ph thu c vào li ều và th ời gian phơi nhiễm th hiện t ỉ

lệ phôi ch ết c ng như m c đ nghiêm tr ng và ph c t p c a những bất thườ ng hình thái.Ch ng tôi c ng quan sát đư c m c đ nghiêm tr ng c a d ị d ng c ng gia tăng như ph nề lớ nhơn, tăng dị d ng hình thái đuôi v hoi t …Từ bảng 1cho th ấy, ch ỉ s TI >1 t i tất cả cácgiai đo n đánh giá v kết quả nà y c ng tương đồng v ớ i k ết quả c a Ingrid và cs [8] . Từ đóch ng tôi đưa ra kết luận Acetaminophen là ch ất có ảnh hư ng đến quá trình phát tri n hìnhthái phôi. Ch ỉ s TI t i thời đi m 48 gi ờ (TI = 2,56) có giá tr ị lớ n nhất trong các th ời đi mđánh giá. Kết h p vớ i sự giảm m nh c a giá tr ị EC50 trong giai đo n phơi nhiễm 24 - 48 gi ờ ,

ta có th nhận thấy Acetaminophen tác đng lớ n nhất vào hình thái giai đo n hình thành và phát tri n cơ quan m không phải giai đo n sau hoàn thi ện. Bên c nh đó, mt s công b k ết


34/116


Hà Nội - 2015

34

quả nghiên c u c ng ch ng minh t nh đc c a Acetaminophen lên s ự phát tri n cơ quan nhưthận, khuy ết tật ng tiền thận v gây đc gan [1, 7] .

Dựa trên k ết quả phơi nhiễm với Acetaminophen, ch ng tôi đã xác định r ằng vi ệc tiế pxúc v ớ i Acetaminophen trong 24 gi ờ đầu tiên c a phôi, đ đ gây ảnh hư ng lên s ự phát tri nhình thái th hiện phù màng noãn hoàng (hình 2B). Trong các d ị d ng thu đư c d ị d ng phùmàng bao tim là d ị d ng ph ổ biến nh ất, xuất hiện nhiều nồng đ c ng như trong sut thờ igian phơi nhiễm. Ngoài ra, chúng tôi ghi nh ận những ảnh hư ng c a Acetaminophen lên h ệ tim m ch và h ệ thần kinh như ph m ng bao tim, t máu, phù não, ho i t não (Hình 2D, 2E,2I).

M t s nghiên c u đã công b tác đ ng c a Acetaminophen lên s ự phát tri n c a phôi

cá ngựa vằn thông qua ch ỉ s đánh giá TI, nhưng chưa có những đánh giá về dị d ng hình tháitrong quá trình phát tri n c a phôi [8] . Tuy nhiên nghiên c u c a ch ng tôi đã đưa ra các chỉ tiêu d ị d ng chi ti ết như: ph m ng bao tim, t máu, m ất sắc t … Trong nghiên cu c aChuenlei Parng v cs c ng đưa ra kết luận Acetaminophen có ảnh hư ng lên phôi cá giaiđo n 24 – 144 gi ờ sau th tinh [6] . Như vậy, trong nghiên c u n y, ch ng tôi đã xác địnhđư c chính xác các d ị d ng c ng như m c đ ảnh hư ng c a Acetaminophen lên giai đon

phát tri n sớ m c a phôi cá ng ựa vằn.

5. K ẾT LUẬNTrong nghiên c u này, chúng tôi ti ến hành các thí nghi ệm nghiên c u nhằm xác định

m i liên h ệ đáp ng liều giữa t ỉ lệ s ng ch ết và t ỉ lệ d ị d ng c ng như xác định ch ỉ s TI. T ừ k ết quả thu đư c, chúng tôi k ết luận Acetaminophen là ch ất có kh ả năng gây quái thai mnhvà ảnh hư ng đến sự phát tri n c a phôi cá ng ựa vằn th hiện các d ị d ng quan sát đư c.

LỜ I CẢM ƠN

Kinh phí th ực hiện nghiên c u n y đư c tài tr b i đề tài TN.15.13. và QG13.11TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Driessen, M., Kienhuis A.S., et al. (2013), “Exploring the zebrafish embryo as analternative model for the evaluation of liver toxicity by histopathology and expression

profiling”, Archives of toxicology , 87 (5), pp. 807-823.2. Howe, K., Clark M.D., et al. (2013), “The zebrafish reference genome sequence and itsrelationship to the human genome”, Nature , 496 (7446), pp. 498-503.

3. Http://Www.Fda.Gov/Drugs/Drugsafety/Informationbydrugclass/Ucm165107.Htm .

http://www.fda.gov/Drugs/Drugsafety/Informationbydrugclass/Ucm165107.Htmhttp://www.fda.gov/Drugs/Drugsafety/Informationbydrugclass/Ucm165107.Htmhttp://www.fda.gov/Drugs/Drugsafety/Informationbydrugclass/Ucm165107.Htm


35/116


Hà Nội - 2015

35

4. Kimmel, C.B., Ballard W.W., Kimmel S.R., Ullmann B., and Schilling T.F. (1995),

“Stages of embryonic development of the zebrafish”, Developmental dynamics , 203 (3), pp.253-310.

5. Oecd (2013), T.N.F.E.a.T.F.T., Oecd and Guidelines for the Testing of Chemicals S., Oecd

Publishing.

6. Parng, C., Seng W.L., Semino C., and M cgrath P. (2002), “Zebrafish: a preclinical modelfor drug screening”, Assay and drug development technologies , 1 (1), pp. 41-48.7. Peng, H.-C., Wang Y.-H., Wen C.-C., Wang W.-H., Cheng C.-C., and Chen Y.-H. (2010),

“Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis”,Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology , 151 (4), pp.

480-486.

8. Selderslaghs, I.W., Blust R., and Witters H.E. (2012), “Feasibility study of the zebrafishassay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using

a training set of 27 compounds”, Reproductive Toxicology , 33 (2), pp. 142-154.


36/116


Hà Nội - 2015

36

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG Ứ C CHẾ TĂNG TRƯỞ NG CỦA MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀOUNG THƯ PHỔ BIẾN BỞ I CÁC DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM

Bùi Thị Thùy Dung 1, Hà Hữu Cườ ng 1, Trịnh Thị Loan 1,Hoàng Thị Mỹ Nhung 1, Ph m Thị Lương Hằng 1

1 Trườ ng Đ i h c Khoa h c tự nhiên, Đ i h c Qu c gia Hà N iTÓM TẮT

Vi khu n lam là ngu ồn giàu các h p chất có ho t tính sinh h c vớ i tiềm năng dư c ph m có ý nghĩa quan trng. Trên th ế giớ i, m t s h p chất và ch ất d n xuất từ vi khu n lamđã cho kết quả khả quan trong các th nghiệm lâm sà ng điều tr ị ung thư pha I v II như

Dolastatin 10, Curacin A, Cryptophycin- 52… Từ tiềm năng dư c liệu c a vi khu n lam,chúng tôi ti ến h nh đánh giá khả năng c chế c a d ịch chi ết từ 10 ch ng vi khu n lam lên s ự tăng trư ng c a ba dòng t ế b o ung thư (MCF7, HepG2, và HCT116) b ằng mô hình th nghiệm đơn lớ p vớ i thu c nhu m sulforhodamine B. Sinh kh i khô c a mỗi ch ng vi khu nlam đư c chiết lần lư t với ethyl acetate v methanol đ thu đư c các d ịch chi ết ethyl acetatev methanol tương ng. K ết quả cho th ấy, trong 20 d ịch chi ết từ 10 ch ng vi khu n lam ch ỉ có các d ịch chi ết từ ba ch ng APA4, APD4 và APA5 có tác d ng đ i c chế sự tăng trư ng

c a dòng t ế b o ung thư v MCF7, đồng thờ i các d ịch chi ết từ hai ch ng APA4, APD4 cùngvà DL12 có tác d ng c chế sự s ng c a dòng t ế b o ung thư đi tr ực tràng HCT116. T ất cả các d ịch chi ết từ 10 ch ng n y đều không có tác d ng c chế đ i vớ i dòng t ế b o ung thưgan HepG2. Điều này cho th ấy d ịch chi ết từ các ch ng vi khu n lam có kh ả năng c chế ch n l c đ i vớ i các dòng t ế b o ung thư khác nhau. Đây l kết quả khả quan đ chúng tôitiến hành s ắc ký đ phân l ập các đơn chất có tác d ng kháng ung thư từ dịch chi ết c a 4ch ng vi khu n lam APA4, APD4, APA5 và DL12.

Từ khóa: Vi khu n lam, phương pháp sulforhodamine B, môhình th nghi ệm đơn lớ p,APA4, APD4, CDL12

EVALUATION OF CYTOTOXICITY OF SEVERAL CYANOBACTERIAEXTRACTS TO COMMON CANCER CELL LINES

SUMMARYCyanobacteria produces various types of bioactive compounds with anticancer,

antiviral, antibacterial, and antifungal activities… In the world, many compounds from

cyanobacteria and their analogues are found to be effective for cancer treatment at phase


37/116


Hà Nội - 2015

37

I&II of clinical trial such as Dolastatin 10, Curacin A, Cryptophycin- 52…Basing on this pharmaceutical potential, we evaluated inhibitory activities of extracts from 10

cyanobacteria strains on 3 cancer cell lines (breast cancer MCF7, liver cancer HepG2,

colorectal cancer HCT116) by using the sulforhodamine B assay. Dried biomass of each

strain was extracted in ethyl acetate and methanol in order to gain ethyl acetates and

methanol extracts, respectively. The extracts from three cyanobacteria strains including

APA4, APD4, and APA5 could inhibit proliferation of MCF7 cells; moreover, the extracts

from two strains (APA4 and APD4) with CDL12 strain had cytotoxicity against HCT116

cells. None of extracts from 10 strains could affect viability of HepG2 cells. These results

indicate that the cyanobacteria extracts have selective activities to different cancer cell lines.

Therefore, the extracts from APA4, APD4, APA5 and CDL12 strains will be used for

isolation of cytotoxic compounds by chromatographic methods.

Key words: Cyanobacteria, Sulforhodamine B assay, 2D culture method, APA4, APD4,DL12.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư l căn bệnh nguy hi m h ng đầu trên thế giới với tỷ lệ mắc phải ng y c ng tăng

Theo s liệu báo cáo c a Viện nghiên c u qu c tế về ung thư, trong năm 2012, trên to n thế giới có hơn 14 triệu ngườ i b ị chết vì các lo i bệnh ung t hư khác nhau. Các chuyên gia cảnh

báo n ếu con ngườ i không s ớm tìm đư c biện pháp h ữu hiệu đ ngăn chn t c đ phát tri nnhư hiện nay c a căn bệnh n y, thì sau 20 năm nữa, mỗi năm ung thư sẽ cướp đi sự s ng c aít nhất 22 tri ệu người.Hóa tr ị và x tr ị từ lâu đư c xem l các phương pháp đc tr ị ung thư,tuy nhiên hai phương pháp n y kéo theo những tác d ng ph , ảnh hư ng xấu tớ i s c kh engườ i bệnh, ngườ i bệnh có th t vong trướ c khi tiêu di ệt đư c tận g c các t ế b o ung thư.

B i vậy, việc tìm ra m t lo i thu c đ c hiệu điều trị ung thư v an to n với ngườ i bệnh lm t vấn đề vô c ng cấp bách v đư c quan tâm h ng đầu hiện nay. Trong công cuc tìmkiếm đó, các h p ch ất từ thiên nhiên đư c quan tâm nhi ều hơn cả b i chúng lành tính và t ừ xa xưa đã đư c xuất hiện trong nh ững bài thu c tr ị bệnh dân gian.

C ng với xu hướng thế giới, tận d ng thế m nh c a m t nước m nhiệt đới với hệ ththực vật đa d ng phong ph , Việt Nam đang tìm kiếm v đã phát hiện ra nhiều lo i thảo mcó tiềm năng tr th nh thu c điều trị ung thư. V , việc tìm ra m t lo i thu c có nguồn g c tthiên nhiên an to n cho người s d ng, thân thiện với môi trường đang l m t hướng đi t ccực.


38/116


Hà Nội - 2015

38

Vi khu n lam là ngu ồn giàu các h p chất có ho t tính sinh h c vớ i tiềm năng dư c ph m có ý nghĩa quan trng. Chúng cho th ấy khả năng ch ng l i các kh i u, kháng virus,kháng khu n, kháng n ấm[2,4,5,6,7]. Các h p chất đư c phân l ậ p và tinh s ch từ vi khu nlam đã cho kết quả, bước đầu thành công trong trong các th nghi ệm khám v điều tr ị bệnh.Các h p ch ất n y đư c xem là h p ch ất tiên phong cho s ự phát tri n, tổng h p các h p ch ấttương tự vớ i ho t tính sinh h c t t hơn. Từ các tính ch ất tiềm năng ca vi khu n lam, chúngtôi tiến h nh đánh giá khả năng c chế sự s ng các dòng t ế b o ung thư ca 10 ch ng vikhu n lam lên ba dòng t ế b o ung thư: ung thư v người MCF7, ung thư gan HepG2, ungthư đ i tr ực tràng HCT116 b ằng mô hình th nghi ệm đơn lớ p s d ng thu c nhu mSulforhodamine B (SRB) nh ằm tìm ra ch ất mớ i có kh ả năng kháng l i ung thư.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U2.1. Đối tượ ng2.1.1. Dòng tế bào

- Dòng t ế b o ung thư v MCF7 - Dòng t ế b o ung thư gan HepG2 - Dòng t ế b o ung thư đi tr ực tràng HCT116

Cả ba dòng t ế b o trên đư c cung c ấ p b i trung tâm lưu trữ gi ng nuôi c ấy Hoa K ỳ (ATCC) v đư c bảo quản t i Nhóm nghiên c u Ung thư hc Thực nghi ệm, b môn Sinhh c Tế bào, khoa Sinh h c, trường Đi h c Khoa h c Tự nhiên, Đ i h c Qu c Gia Hà N i2.1.2. Vật liệuBảng 2.1. Các chủng Vi khuẩn lam đượ c dùng trong thí nghiệm thử đánh giá độc tínhSTT Chất thử STT Chất thử

1 APA4- Met 11 APA5- Met

2 APA4- EtAc 12 APA5- EtAc

3 APD4- EtAc 13 APD3- Met

4 APD4- Met 14 APD3- EtAc

5 DL12- Met 15 TVN9- Met

6 DL12- EtAc 16 TVN9- EtAc

7 AHK7- Met 17 T202- Met

8 AHK7- EtAc 18 T202- EtAc

9 CN4- Met 19 APD3*- EtAc

10 CN4- EtAc


39/116


Hà Nội - 2015

39

Dịch chi ết tổng s các ch ng vi khu n lam đư c cung c ấ p b i Phòng thí nghi ệm nuôicấy mô th ực vật và vi t ảo, b môn Sinh lí Th ực vật và Hóa sinh, khoa Sinh h c trường Đih c Khoa h c tự nhiên Hà N i. Mườ i chín d ịch chi ết tổng s đư c th ng kê trong b ảng trên.

Các m u th đư c cung c ấp dướ i d ng cao khô.2.2. Phương pháp nghiên cứ u

2.2.1. Phương pháp hoạt hóa t ế bào- Rã đông tế bào từ -196 oC trong

Documents

4. Bao cao toan van