はじめに

げっ歯類を用いた脳血管閉塞による脳梗塞モデルにおいては虚血誘導から少なくとも 24 時間以上の経過で脳梗塞巣は拡大し続けることが報告されている1）．虚血辺縁部では種々の組織傷害性因子による血管内皮障害が進行し，接着因子の発現増加，白血球の微小血管内皮集積などを介した微小循環障害が進展する．その結果虚血領域は拡大し，脳梗塞巣拡大につながっていくと考えられている．このことから急性期の虚血辺縁部における血管内皮障害を抑制することができれば脳梗塞巣拡大を阻止できる可能性があると考えられる．近年，脳虚血急性期の治療薬としてRho-kinase 阻

害薬が注目されている．Rho-kinase は低分子量G蛋白質のRho によりその活性が制御されるキナーゼと

して発見された2,3）．Rho-kinase はその基質蛋白の活性を制御することで種々の細胞において重要な働きを担っていると考えられる（Fig. 1）．血管内皮における作用としては，低酸素血症時の血管内皮細胞において内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）の発現が低下することが知られているが，この現象にRho-kinase が関与していることが報告されている4）．Rho-kinase 阻害薬は血管内皮における eNOSのmRNAを安定化させることで eNOSの発現量を増加させることも明らかになり，各種病態においてRho-kinase 阻害薬の血管内皮障害改善を介した治療効果が期待されるようになった．最近，局所脳虚血モデルにおいてRho-kinase阻害薬を 2日前からあらかじめ前投薬しておくと脳血流量増加により梗塞体積の縮小効果が認められたという報告がなされた5）．そしてこの効果は血管内皮機能改善を介するものであることも同時に示された．しかしながら実際の臨床では脳梗塞発症前から治療薬をあらかじめ投与できるケースは極めて少ないと考えられる．この点を考えると，脳虚血発症後に投薬を開始しても，ペナンブラにおける血管内皮障害を抑制しうるかということが重要な問題となってくる．これまで脳虚血病態におけるRho-kinase 活性化の詳細は分かっ

● シンポジウム 2 脳循環代謝制御に関連する物質―update―

3．脳虚血病態における微小循環障害に対するRho-kinase 活性化の関与八木田佳樹，北川 一夫

要 旨我々は脳虚血発症早期の血管内皮障害および微小循環障害にRho-kinase 活性化が関与している可能性があると考え，虚血脳におけるRho-kinase 活性化の動態を経時的に観察した．さらに血管内皮と微小循環の変化を評価し，これらに対するRho-kinase 阻害薬の効果について検討を行った．ラット中大脳動脈永久閉塞モデルを用い，Rho-kinase の活性化を基質である adducin のリン酸化で評価した．脳内微小血管におけるRho-kinase 活性は，脳虚血により虚血辺縁部において早期より活性化されており，同部位では vWFの染色性増強を認めた．蛍光ラベルした血清を静注することにより微小循環を評価すると，この部位では既に微小循環障害が認められた．Rho-kinase 阻害薬であるファスジル（10 mg�kgBW）を虚血開始 5分後に腹腔内投与した群では，虚血辺縁部における微小循環障害は抑制され，脳梗塞体積縮小および神経学的スコアの改善を認めた．以上の結果よりRho-kinase 活性化が脳虚血後の血管内皮細胞障害，微小循環障害に関与することが示唆された．

（脳循環代謝 19：69～74，2007）キーワード：脳虚血，微小循環障害，血管内皮，Rho-kinase

大阪大学大学院医学系研究科神経内科学（脳卒中センター）〒565―0871 大阪府吹田市山田丘 2―2TEL 06―6879―3634FAX 06―6878―6574Mail yagita@medone.med.osaka-u.ac.jp

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Fig. 1. Rho/Rho-kinase system.Rho-kinase regulates cell motility and contraction via alteration of substrate function. In the endo-thelial cell, Rho-kinase activation decreases eNOS function.

ておらず，虚血領域におけるRho-kinase 阻害薬の作用についても不明な点が存在する．これらの点を明らかにするため，本研究では脳虚血後のRho-kinase 活性化のプロフィール，および血管内皮障害，微小循環障害進展との関連を検討した．

対象と方法

雄性Wister ラット（体重 270 g～320 g）を用い，血管内栓糸法にて中大脳動脈永久閉塞モデルを作成した．Rho-kinase 活性は Rho-kianse の基質である α-adducin のリン酸化状態を免疫組織化学染色で検出することで評価した．リン酸化抗体はRho-kinase によりリン酸化されるThr 4456）のリン酸化状態を特異的に認識するものを用いた．血管内皮障害は von Wille-brand 因子（vWF）の染色性増強により，微小循環障害は蛍光ラベル（dichlorotriazinyl amino fluo-rescein : DTAF）した血清を静脈注射することで脳内の微小循環をラベルすることにより評価した．Rho-kinase 阻害薬のファスジル（10 mg�kg）は虚血誘導5分後に腹腔内投与し，6時間後の vWF染色性，微小循環に対する効果を，48 時間後の脳梗塞サイズ，神経スコアに対する効果を評価した．

結 果

リン酸化 adducin（p-adducin）は非虚血脳において広く発現していたが，特に神経細胞で高い発現が認

められた（Fig. 2）．虚血 6時間後には神経細胞での発現は低下しており，かわってグリア細胞と微小血管において p-adducin の発現上昇が認められた．24 時間後にはこれらの p-adducin シグナルはさらに強いものとなっていた．またRho-kinase 阻害薬であるファスジルを虚血誘導後に投与すると脳実質内のグリア細胞におけるRho-kinase 活性化は抑制できていないが血管内皮における活性化は抑制されていることが示された．脳虚血誘導早期の血管内皮におけるRho-kinase の

活性化が血管内皮障害および微小循環障害に関与しているのではないかと考え，まず脳虚血時の血管内皮障害および微小循環障害を評価した．脳虚血誘導後 6時間という早期の時点では虚血中心部は既に梗塞に陥っているものの虚血辺縁部では神経細胞は保たれている（Fig. 3）．しかしこの領域ではすでに vWFの染色性増強と微小血管のラベル効率の低下が認められ，血管内皮障害と微小循環障害が進行していることが観察された．この領域はその後梗塞に陥る危険性の高い領域であることから先行する微小循環障害の進展が梗塞巣拡大に関与しているものと考えられる．脳虚血誘導後にRho-kianse 阻害薬を投与すること

でこれらの障害が抑制されるかどうか検討を行った．まず vWF染色性に関してはファスジル投与により虚血の強い領域ではその効果を認められなかったものの，虚血辺縁部において染色性増加を抑制していた（Fig. 4）．また微小血管ラベル効率に関しても同様に虚血辺縁部でラベル効率低下の抑制効果が観察された

脳循環代謝 第 19 巻 第 3号

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Fig. 2.　Rho-kinase activation in the peripheral region of ischemic area.Immunohistochemistry of p-adducin indicates Rho-kinase activity. In the non-ischemic cortex, p-adducin staining was localized predominantly in neuronal cell bodies （A）. After ischemic insult, p-adducin staining was increased in brain vessels 6（B, arrowheads）and 24 hours（C）after induction of ischemia. In this phase, many glial cells also stained strongly for p-adducin. Six hours after ischemia, p-adducin signals were increased in the endothelium of vehicle-treated rat（D, arrows）. In the fasudil-treated group, p-adducin signals were suppressed in the endothelium 6 hours after ischemia（E, arrows）, whereas p-adducin signals in glial cells were not altered.Scale bars＝75 μm（A-C）, 50 μm（D, E）

（Fig. 5）．これらの結果より脳虚血後のファスジル投与が虚血後早期の虚血辺縁部における血管内皮障害と微小循環障害を軽減することが示されたといえる．さらに虚血 48 時間後の脳梗塞体積の縮小効果，神経症状軽減効果も認められ（Fig. 6），ファスジルは脳虚血後投与でも血管内皮障害と微小循環障害抑制効果を介して脳梗塞後遺症を軽減することが可能であると考えられる．

考 察

現在脳梗塞急性期の脳保護薬としてエダラボンが認可されているが，Rho-kinase 阻害薬が新たな脳保護薬として注目されている．本研究ではその機序解明の基礎データとして脳虚血後のRho-kinase 活性化のプロフィールを明らかにし，血管内皮障害，微小循環障害との関連を示した．また脳虚血誘導後のRho-kinase阻害薬投与により脳梗塞巣縮小，神経後遺症軽減とい

う効果が認められることも示した．Rho-kinase 阻害薬のファスジルはその平滑筋弛緩作用によりくも膜下出血後の脳血管攣縮に対する治療薬としてすでに臨床の場で広く用いられ，安全性も確立している．このため脳梗塞治療薬として用いるための研究も進んでおり，実際の脳梗塞急性期患者に対する臨床試験において有効性が認められたことがすでに報告されている7）．最終的に臨床の場に登場するまでにはまだいくつかの検証が必要であるが新たな脳保護薬として期待できる．現在脳虚血急性期の治療の中心は抗血栓療法であ

る．病型や病態により抗血小板剤や抗凝固薬を用いて虚血巣の拡大を防ぐ治療法がとられるが，その有効性の反面，出血性梗塞への移行という危険性を潜在的にはらんでいる．組織傷害により脳血管は透過性が増し，脆弱になっているため元々出血性変化をきたしやすいところにこれらの薬剤が作用し出血を増悪させることになる．血栓は血小板や凝固因子だけで生じるの

3．脳虚血病態における微小循環障害に対するRho-kinase 活性化の関与

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Fig. 3. Microcirculatory disturbances in the peripheral ischemic area near the MCA.Panels show double-staining with DTAF（A, D）and MAP2（C, F）, and vWF staining（B, E）in the same regions of（A, C）and（D, F）in adjacent sections. Away from the ischemic area, MAP2 and vWF staining were detected at normal levels（A-C）. In the ischemic area, microcirculation was disturbed 6 hours after ischemia（D）, and vWF staining was increased（E）, whereas MAP2 staining was unchanged（F）.

Fig. 4.　Effect of fasudil on endothelial cell dysfunction in the early phase of ischemic injury.vWF signal was increased in the ischemic area 6 hours after induction of ischemia （A） and fasu-dil treatment attenuated vWF staining（B）. Quantitative analysis showed a significant difference in the peripheral ischemic area between the 2 groups（C）. Scale bar＝50 μmValues are expressed as mean±SD; n＝5 for each group. ＊P＜0.05 vs. the vehicle-treated group.

ではなく，血栓形成の場である血管内皮の状態がその形成に大きく影響する．したがって血管内皮障害を抑制することで内皮上の接着因子発現や血管透過性をコントロールできれば出血性副作用の少ない抗血栓療法を開発することにつながる可能性がある．この点から

も脳虚血急性期の治療として血管内皮は重要な標的となりうると考えられる．Rho-kinase 阻害薬の血管内皮保護作用はNOを介

するものであると考えられている．脳虚血モデルにおいても虚血誘導 2日前からの投与により脳血流量が増

脳循環代謝 第 19 巻 第 3号

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Fig. 5. Fasudil treatment improved microcirculation in the peripheral ischemic area.Microcirculation was assessed with the use of DTAF-labeled serum 6 hours after induction of ischemia. In the peripheral ischemic area, microcirculation was markedly disturbed in the vehicle treated group （A）, whereas fasudil treatment improved capillary patency（B）. Quantitative analy-sis is shown in（C）.Scale bar=50 μmValues are expressed as mean±SD; n=5 for each group. ＊P＜0.05 vs. the vehicle-treated group.

Fig. 6. Effect of fasudil on infarct volume and on neuro-logical deficits after ischemia.　Lesion area was evaluated by TTC staining of 2-mm brain slices 2 days after induction of ischemia. Signifi-cant differences were found in infarct volume（left graph）. Neurological scores were also improved by fasu-dil treatment（right graph）.　Values are expressed as mean±SD; n=12 for each group. ＊P＜0.05 vs. the vehicle-treated group.

加し，その効果で梗塞サイズが縮小すると報告されている5）．低酸素負荷により血管内皮の eNOS発現量が低下することが知られており，Rho-kinase 活性化により eNOS mRNAが不安定化するという機序が提唱されている4）．このため脳血管内皮における eNOS発現を増加させるためには慢性投与が必要と考えられている．しかしRho-kinase は Akt の活性抑制を介してeNOSの活性をその発現量によらず低下させるという系も報告されている8）．虚血脳では eNOS発現量自体はむしろ増加するという報告9）もあり，Rho-kianse 阻害薬の効果が eNOS発現量増加によるという説明は

必ずしも十分ではないと考えられる．発現量とともにeNOSの活性化がRho-kinase 阻害薬の脳保護効果に関与している可能性を考えるべきであろう．しかしながら脳虚血病態においてRho-kinase―PI3K�Akt―eNOSの系がどのように作用しているかについては今後のさらなる検討が必要である．NOは脳血流増加作用を有することが知られている

がそれ以外にも血管内皮上の接着因子発現や vWFのexocytosis を制御することで抗血栓作用をも有している10）．vWFは血管内皮細胞で産生され，細胞質のWeibel-Palade 小体に貯蔵される．通常は一定量が細胞膜表面に exocytosis，酵素的に切断され血中に放出されるが，血管内皮障害があると exocytosis が亢進し内皮上に切断されない vWFが増加することになる．微小血管内で血栓形成傾向に傾くと微小循環障害を惹起することになる．本研究ではファスジルの投与により微小血管における脳虚血後の vWF染色性増強は抑制されることが示された．これは血管内皮障害時に亢進する vWFの exocytosis に Rho-kinase が関与している可能性を示している．intercellular adhesionmolecule-1 などの接着因子とともに vWFの exocyto-sis を制御するということも血管内皮を標的とした脳梗塞急性期治療法を考える上で重要であると考えられる．本研究により脳虚血急性期にRho-kinase が血管内

皮細胞において活性化され，血管内皮障害，微小循環障害に関与することが示された．また虚血後のRho-kinase 阻害薬投与によりこれらの障害を軽減し，梗塞体積縮小，神経後遺症の軽減効果を発揮しうることも示され，Rho-kinase 阻害薬は新規の脳保護薬として期待できるものと考えられる．ただしその作用機序

3．脳虚血病態における微小循環障害に対するRho-kinase 活性化の関与

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Key words :

は血管内皮における eNOS活性化を介することが示唆されているが，いまだ不明な点も多く今後の検討が必要である．

文 献1）Mabuchi T, Kitagawa K, Ohtsuki T, Kuwabara K,Yagita Y, Yanagihara T, Hori M, Matsumoto M : Con-tribution of microglia�macrophages to expansion ofinfarction and response of oligodendrocytes after fo-cal cerebral ischemia in rats. Stroke 31 : 1735―1743,1996

2）Ishizaki T, Maekawa M, Fujisawa K, Okawa K,Iwamatsu A, Fujita A, Watanabe N, Saito Y, Kaki-zuka A, Morii N, Narumiya S : The small GTP-bindingprotein Rho binds to and activates a 160 kDa Ser/Thr protein kinase homologous to myotonic dystro-phy kinase. EMBO J 15 : 1885―1893, 1996

3）Matsui T, Amano M, Yamamoto T, Chihara K, Naka-fuku M, Ito M, Nakano T, Okawa K, Iwamatsu A,Kaibuchi K : Rho-associated kinase, a novel serine/threonine kinase, as a putative target for small GTPbinding protein Rho. EMBO J 15 : 2208―2216, 1996

4）Takemoto M, Sun J, Hiroki J, Shimokawa H, Liao JK :Rho-kinase mediates hypoxia-induced downregulationof endothelial nitric oxide synthase. Circulation 106 :57―62, 2002

5）Rikitake Y, Kim HH, Huang Z, Seto M, Yano K,

Asano T, Moskowitz MA, Liao JK : Inhibition of Rhokinase（ROCK）leads to increased cerebral blood flowand stroke protection. Stroke 36 : 2251―2257, 2005

6）Kimura K, Fukata Y, Matsuoka Y, Bennett V,Matsuura Y, Okawa K, Iwamatsu A, Kaibuchi K :Regulation of the association of adducin with actinfilaments by Rho-associated kinase（Rho-kinase）andmyosin phosphatase. J Biol Chem 273 : 5542―5548,1998

7）Shibuya M, Hirai S, Seto M, Satoh S, Ohtomo E ;Fasudil Ischemic Stroke Study Group : Effects offasudil in acute ischemic stroke : results of a prospec-tive placebo-controlled double-blind trial. J Neurol Sci238 : 31―39, 2005

8）Ming XF, Viswambharan H, Barandier C, Ruffieux J,Kaibuchi K, Rusconi S, Yang Z : Rho GTPase�Rhokinase negatively regulates endothelial nitric oxidesynthase phosphorylation through the inhibition ofprotein kinase B�Akt in human endothelial cells. MolCell Biol 22 : 8467―8477, 2002

9）Veltkamp R, Rajapakse N, Robins G, Puskar M,Shimizu K, Busija D : Transient focal ischemia in-creases endothelial nitric oxide synthase in cerebralblood vessels. Stroke 33 : 2704―2710, 2002

10）Lowenstein CJ, Morrell CN, Yamakuchi M : Regula-tion of Weibel-Palade body exocytosis. Trends Cardio-vasc Med 15 : 302―308, 2005

AbstractThe role of Rho-kinase activation in microcirculatory disturbance induced by cerebral ischemia

Yoshiki Yagita and Kazuo KitagawaStroke Division, Department of Cardiovascular Medicine, Osaka University Graduate School of Medicine

Abnormal activation of Rho-kinase may contribute to endothelial dysfunction and subsequent microcircula-tory disturbances after cerebral ischemia. However, it is not clear whether endothelial Rho-kinase is activated invivo or Rho-kinase activation contributes to microcirculatory disturbances after cerebral ischemia. In this study,we evaluated the temporal and spatial profiles of Rho-kianse activity and the effect of the Rho-kinase inhibitorfasudil on endothelial dysfunction and microcirculatory disturbances in the focal brain ischemia. Rho-kinase acti-vation was evaluated by analyzing the phosphorylation of adducin, a substrate of Rho-kinase by immunohisto-chemistry. Staining for p-adducin was found in endothelia in the ischemic area 6 hours after induction of ische-mia. Microcirculatory disturbances and increased endothelial cell staining for von Willebrand factor（vWF）wereobserved in the same area. Post-ischemic treatment with fasudil suppressed endothelial Rho-kinase activation,inhibited endothelial cell vWF staining and preserved microcirculation. These effects resulted in inhibition of in-farct expansion and improvement of neurologic deficits. These findings indicate that Rho-kinase is activated inthe endothelial cells and contributes to microcirculatory disturbances in cerebral ischemia.

cerebral ischemia, microcirculatory disturbance, endothelium, Rho-kinase

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