Proteomicadisciplina che studia

l’espressione delle proteine

le interazioni tra proteine

la struttura delle proteine

Espressione delle proteine

METODI DI ANALISI

Elettroforesi su gel

Tecniche immunologiche

Western blot

Analisi in situ

ELISA

Elettroforesi su gelSDS PAGE

Elettroforesi su gelbidimensionale

Focalizzazione isoelettrica

2D SDS PAGE

Fonti di errore del 2D SDS PAGEnella quantizzazione delle proteine:

• Estrazione non stechiometrica delle proteine dai vari costituenti cellulari

• Mancata migrazione delle proteine nel gel di focalizzazione

• Risposta non lineare del colorante di rivelazione

Sono poco rappresentate le proteine con alta carica e bassa concentrazione oppure quelle sequestrate in organelli o membrane

Le proteine molto grandi migrano male in SDS, quelle molto piccole possono uscire dal gel

Strategie per evidenziare anche le proteine meno abbondanti:

• “tagging”delle proteine meno abbondanti con biotina-avidina (es. proteine di membrana)

• eliminazione delle proteine più abbondanti mediante cromatografia per affinità

Database di gel 2D

DI GEdiff erential in gel electrophoresis

http://ca.expasy.org/melanie

MALDI-TOF-MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight-Mass Spectrometer)

Identificazione delle proteineSpettrometria di massa

HP

AG

CC V A D

LF

FE

K

H P A G C C

V A D

L FF

EK

tripsina

Tecniche immunologichestruttura e produzione di anticorpi

Anticorpi policlonali

Tecniche immunologicheProduzione di anticorpi monoclonali

Tecniche immunologiche

Gel di poliacrilamide colorato con coomassie

Filtro dopo reazione antigene-anticorpo e successiva rivelazione

WESTERN BLOT

ELISA con antigene adsorbito sulla piastra

Immunoistochimica

Marcatura immunitaria con oro(microscopia elettronica)

MI CROARRAY DI PROTEI NE

Network delle interazioni tra proteine nel lievito

- PHAGE DI SPLAY

- DOPPI O I BRI DO:

ESI STONO DIVERSE METODICHE PER SELEZI ONARE LI GANDI DI UNA PROTEI NA DI I NTERESSE: ?

“TRAPPI NG” -> MASS SPEC. ?

- FRET

Doppio ibrido

MODI FI CAZI ONE DEL CAPSI DE FAGI CO

BATTERI OFAGOBATTERI OFAGORI COMBI NANTE

LI BRERIE DI cDNA SU FAGO ( PHAGE DI SPLAY)

GENE PROTEINA CAPSIDICA

c DNA

CLONAGGIO

PRODOTTI DI c DNA

- PHAGE DI SPLAY:

?

LIBRERIA

?

LIBRERIA DI FAGIRICOMBINANTI( 108-109 PLACCHE)

SEQUENZA GENERICOMBINANTE

IDENTI TA’ DEL PEPTIDE ESPOSTO

?bait

SELEZIONE PER AFFINITA’

POTENZIALI LIGANDI DELLA PROTEINABERSAGLI O DELLA SELEZI ONE

FRET(Fluorescent Risonance Energy

Transfer)