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1. Introducción

LLos microorganismos fila-mentosos son miembros jun-to con protozoos y metazoos

de la microfauna de las plantas detratamiento de aguas residuales porfangos activos, desempeñando unpapel esencial en la formación delflóculo (Madoni et al., 2000). Co-múnmente, la proliferación excesivade bacterias filamentosas generaproblemas de explotación y causa se-rios problemas de separación en elclarificador. Estos problemas pue-den ser clasificados en dos grandesgrupos, que pueden aparecer de for-ma separada o conjunta: esponja-miento o bulking y espumación o fo-aming. En este último caso, los agre-gados de bacterias filamentosas seunen con burbujas de gas y partículasdel flóculo, formando espumas en la

superficie del tanque (Madoni et al.,2000). Este efecto genera la separa-ción de la masa de fango hacia la su-perficie, dando lugar a un ecosistemaque tiende a evolucionar de forma di-ferente al resto, con característicasfisicoquímicas distintas.

Estas espumas son generadas pordeterminadas bacterias filamento-sas, usualmente Gram positivas conalto contenido en Guanina/Citosina(Seviour, 1999) que, por las caracte-rísticas de su pared celular, puedenabsorber compuestos de baja solu-bilidad (Martins et al., 2004) y fuer-temente hidrofóbicos. Dentro de lasbacterias filamentosas con mayorcapacidad para formar espumas es-tán: Microthrix parvicella, GALO,PTLO, T 0092, T 0675, T 0041 ybacterias cocales (Jenkins et al.,2003).

Episodios periódicos de espumación con implicación de filamentos Gram negativos. El morfotipo 0581: un desconocidoPor: Andrés Zornoza(*); Eva Rodríguez(**); Laura Isac(**); José Luis Alonso(***);

Natividad Fernández(**); Francisco Zorrilla(****); Vicente Fajardo(****)

(*) EDAR Quart-Benager (Valencia)Entidad Pública de Saneamiento de la Generalidad Valenciana (Epsar)E-mail: azetazeta@hotmail.comWeb: es.geocities.com/mndmicroscopico

(**) Asociación Científica Grupo Bioindicación Sevilla (GBS)E-mail: g.b.s@lycos.esWeb: www.grupobioindicacionsevilla.com

(***) Universidad Politécnica de ValenciaCiudad Politécnica de la InnovaciónInstituto del Agua y Medio Ambiente (I.I.M.A.A.)Grupo de Química y MicrobiologíaE-mail: jalonso@ihdr.upv.es

(****) General Valenciana del Agua, S.A. (Egevasa)Edificio Torres del TuriaC/ Santa Amalia, 2 , 2º Entresuelo, Pta. K - 46009 ValenciaE-mail: egevasa@egevasa.es - Web: www.egevasa.es

Las bacterias filamentosas Actinomice-tos Gram positivos (GALO) y Microth-rix parvicella son responsables de la es-pumación en los fangos activos de lasEDAR. La clasificación de estos micro-organismos se realiza según Eikelboom(2000) y Jenkins et al. (2003) por mor-fotipos, los cuales muestran, a veces,una alta diversidad de especies usandosondas específicas.Un proceso periódico de espumaciónen la EDAR del municipio de Torres-Torres (Valencia) con dominancia delmorfotipo 0581, ha permitido compro-bar la identidad, tanto óptica como filo-genética, de dicho morfotipo. Al con-trario de lo que pueda parecer debido asu similitud morfológica con Microth-rix parvicella, el morfotipo 0581 se en-cuentra filogenéticamente relacionadocon el phyllum Chloroflexi y no con elphyllum Actinobacteria, al que perte-nece Microthrix parvicella.

Palabras clave:

Resumen

Periodical episodes of foaming involving gram-negative filaments.Morphotype 0581: an unknown.The gram-positive filamentous bacteriaActinomycetes (GALO) and Microth-rix parvicella are responsible for foa-ming in active sludge in waste watertreatment plants. According to Eikel-boom (2000) and Jenkins et al. (2003),these micro-organisms are classified bymorphotypes, which sometimes show alarge diversity of species when specificprobes are used.A study of the periodical foaming pro-cess in the waste water treatment plantin the municipality of Torres-Torres, inthe province of Valencia, Spain, with apredominance of morphotype 0581,has made it possible to ascertain boththe optical and phylogenetic identity ofthis morphotype. Contrary to whatmight have been expected in view of itsmorphological similarity to Microthrixparvicella, morphotype 0581 is phylo-genetically related to the phyllum Chloroflexi and not to the phyllum Ac-tinobacteria, to which Microthrix par-vicella belongs.

Abstract

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2. Identificación debacterias filamentosas

Evidentemente, la identificacióncorrecta del filamento generador dela alteración es primordial en el pro-ceso de explotación de la EDAR. Elsistema de identificación/denomi-nación para las bacterias filamento-sas más frecuentes en fangos acti-vos fue publicado por Eikelboom en1975. Posteriormente Eikelboom yvan Buijsen (1983) y Jenkins et al.(1996), desarrollaron unas claves deidentificación dicotómicas en fun-ción de una serie de característicasmorfológicas y una reactiva a lastinciones clásicas, quedando la no-menclatura, pues, en forma de uncódigo de cuatro cifras precedidopor la denominación ‘tipo’ y en al-gunos casos el género.

La versión mas actualizada de es-ta clave de identificación, Jenkins etal. (2003), es una modificación de laaportada por Eikelboom y van Buij-sen (1983), en la que se recogen las23 bacterias filamentosas que conmayor frecuencia se encuentran enlos fangos activos. De hecho, la ma-yoría de los estudios se realiza conlas técnicas convencionales de ca-racterización por fenotipos (Se-viour, 1999). No obstante, el uso deestas claves de identificación no es-tá exento de riesgo, ya que la morfo-logía así como las respuestas a lasdiferentes tinciones de estas bacte-rias pueden cambiar en virtud de va-riaciones en factores ambientales.En sistemas industriales de fangosactivos, incluso, pueden encontrar-se morfotipos de bacterias filamen-tosas distintos a los habituales (Se-viour, 1999).

La identificación y el papelbioindicador de los microorganis-mos filamentosos han sido temas deestudio durante décadas. Sin embar-go, debido a la complejidad de lascomunidades microbianas, las téc-nicas de identificación y, en conse-cuencia, la bioindicación, se en-cuentran limitadas por los métodosclásicos. El empleo en los últimosaños de técnicas moleculares queestudian la composición de lípidos

de la pared, secuencias e hibrida-ción de ácidos nucleicos (Seviour yBlackall, 1999, Lacko et al., 1999),aplicados al estudio de las bacteriasfilamentosas, están determinando laverdadera relación evolutiva entreestas bacterias. Dichos estudios per-miten situarlas en el árbol filogené-tico y conocer su fisiología graciasal aislamiento de cultivos puros. Sinembargo, en la actualidad, sólo unaminoría de filamentos se ha identifi-cado usando estudios filogenéticos.

La hibridación in situ con sondasde ARN ribosómico marcadas confluorocromos (FISH) permite iden-tificar, mediante microscopía defluorescencia, los microorganismosen muestras en su medio natural(Bjornssom et al., 2002). Esta técni-ca se basa en la hibridación directade la bacteria a identificar con unasonda complementaria de una re-gión del 16S o 23S ARN ribosómi-co, que previamente se ha diseñadopara que sea específica de la bacte-ria que se va identificar.

En la relación de organismos fila-mentosos recogida en el manual deJenkins et al. (2003) se resumen dife-rentes estudios, detallando el ordende aparición y abundancia de los fila-mentos en distintas plantas de trata-miento del mundo. Tal y como se ob-serva en la Tabla 1, a excepción delos hongos, cuya presencia no esmuy común en fangos activos, los fi-lamentos que ocupan los 10 primerospuestos son: GALO, Tipo 1701, Tipo021N, Tipo 0041, Thiothrix sp., Sp-haerotilus natans, Microthrix parvi-cella, Tipo 0092, Haliscomenobac-ter hydrossis y Tipo 0675.

En la EDAR del municipio deTorres-Torres (Valencia) se produ-cen de forma periódica episodios defoaming. En el periodo de estudio(marzo, abril y mayo 2005) se pre-sentó como filamento dominante elmorfotipo 0581, el morfotipo 0092como secundario y Microthrix par-vicella de forma ocasional, tanto enlas espumas generadas como en ellicor mezcla. Esta situación nos hapermitido comprobar cómo este ti-po filamentoso, el Tipo 0581, uno

de los filamentos con menor gradode incidencia en los episodios debulking y foaming del estudio pre-sentado por Jenkins et al., 2003 (Ta-bla 1) y en la bibliografía, en gene-ral, puede generar procesos de espu-mación típicos de bacterias Grampositivas y ser, además, dominante.

Por su parte, Microthrix parvice-lla es uno de los organismos con ma-yor grado de ocurrencia en fangosactivos (Jenkins et al., 2003) y estáimplicado en severos problemas deseparación sólido/líquido y foaming(Rossetti et al., 2005), con la particu-laridad de presentar una gran simili-tud morfológica con el Tipo 0581. Anivel óptico, la diferencia entre am-bos filamentos se reduce a la res-puesta ofrecida a la tinción Gram,positiva para Microthrix parvicellay negativa para el morfotipo 0581.

Todas estas observaciones, uni-das al hecho de que algunos fila-mentos pueden cambiar morfológi-camente según las condiciones am-bientales (Martins et al., 2004), noshicieron plantear la posibilidad deque el filamento identificado comoTipo 0581 se tratase, en realidad, deMicrothrix parvicella. En concreto,muchos actinomicetos, entre ellosMicrothrix parvicella, se fragmen-tan en su ciclo vital, lo que hace queparezcan otros organismos bajocondiciones ambientales distintas(Seviour y Blackal, 1999).

La revisión taxonómica de ambasbacterias nos permite comprobarque el Tipo 0581 está actualmente enestudio, con ubicación desconocida(Seviour, 1999). Es decir, con la de-nominación Tipo 0581 nos encon-tramos ante un ‘puzzle’ todavía porresolver (Rossetti et al. 2005). Encuanto a Microthrix parvicella, gra-cias a los estudios con técnicas de se-cuenciación, se han aislado e identi-ficado varias cepas como posiblescandidatas y se han desarrollado lassiguientes sondas FISH para su de-tección e identificación directa enmuestras de espumas: MPA60,MPA223, MPA645, MPA650,CompMPA650.1, CompMPA650.2(Erhart et al., 1997).

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Por lo tanto, partimos de la baseque el nombre vernáculo de Mi-crothrix parvicella, probablemente,se pueda dividir taxonómicamentemediante el empleo de sondas espe-cíficas, las cuales permitirán discer-nir claramente si nos encontramoscon especies distintas o variedadesde la misma. De hecho, Seviour(1999) define este grupo como filo-genéticamente diverso.

En resumen, el objetivo de esteestudio es dilucidar la auténticaidentidad del filamento identificado

como Tipo 0581, para lo que se harealizado un análisis de la decanta-bilidad del fango, un estudio conmicroscopía óptica y la caracteriza-ción filogenética con FISH de dichabacteria dominante.

3. Material y métodosEl muestreo se ha realizado en la

EDAR situada en el municipio deTorres-Torres, titularidad de la En-tidad Pública de Saneamiento deAguas Residuales de la Generali-dad Valenciana (Epsar) y explotada

por la Empresa General Valencianadel Agua (Egevasa) desde el año1992.

Esta planta está diseñada paratratar 625 m3/día de caudal mediocon una carga de 300 mg/l de sóli-dos en suspensión totales y unaDBO5 de 300 mg O2/l. La línea deagua consta de un pretratamientoque comprende un desbaste y un ta-mizado, un reactor biológico circu-lar de mezcla completa (650 m3)con dos aireadores sumergidos y undecantador secundario. La línea de

Organismo Filamentoso USAa Países Alemaniac,e Sudáfricad Australiaf Dinamarcag Italiah República Bajosb,e Checai

Nocardioformes y actinomycetes 1 ? ? 6 3 - 2 6

Tipo 1701 2 5 8 8 12 - 9 13

Tipo 021N 3 2 1 - 1 3 6 7

Tipo 0041 4 6 3 6 2 2 3 5

Thiothrix spp. 5 19 - 9 13 - 7 8

Sphaerotilus natans 6 7 4 - 14 - - -

Microthrix parvicella 7 1 2 2 1 1 1 1

Tipo 0092 8 4 - 1 4 3 4 3

Haliscomenobacter hydrossis 9 3 6 9 5 - - 11

Tipo 0675 10 - - 4 2 - 3 11

Tipo 0803 11 9 10 7 9 - - 4

Nostocoida limicola I, II y III 12 11 7 8 5 - 5 2

Tipo 1851 13 12 - 3 8 6 - -

Tipo 0961 14 10 9 - 10 - 8 9

Tipo 0581 15 8 - 9 - - - -

Beggiatoa spp. 16 18 - - 15 - - -

Hongos 17 15 - - - - - -

Tipo 0914 18 - - 5 7 5 10 10

a Richard et al. (1982) y Strom y Jenkins (1984): 525 muestras de 270 plantas.b Eikelboom (1977): 1100 muestras de 200 plantas.c Wagner (1982): 3500 muestras de 315 plantas.d Blackbeard et al. (1986a y 1986b): 111 plantas que incluyen 26 plantas de eliminación biológica de nutrientes (BNR); licor mezcla con bulking y sin bulking.e No se incluyen las nocardioformes.f Seviour et al. (1994): 38 plantas de eliminación biológica de fósforo (EBPR).g Kristenesen et al. (1994): 40 plantas.h Rossetti et al. (1994): 40 plantas.i Wanner et al. (1998): 86 muestras de 86 plantas.

Tabla 1. Abundancia de organismos filamentosos. Fuente: Jenkins et al., 2003.

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fangos consta de un secado de fan-gos realizado en eras de secado.

Con el fin de determinar el inter-valo de carga másica a la cual operala planta depuradora, se establecióun periodo de muestreo comprendi-do entre los días 19-24 de abril2005, encontrándose la temperaturaambiental en torno a 25 °C. Para ellose habilitó un equipo tomamuestrasautomático después del pretrata-miento y justo antes de la entradadel influente al reactor biológico.La toma de agua se programó para larecogida de muestras cada 30 minu-tos con las que se confeccionó unamuestra compuesta a partes iguales.Los análisis físico-químicos se rea-lizaron según los Métodos Normali-zados (APHA, AWWA, WPCF).

Las muestras de licor mezcla setomaron justo a la salida del reactorbiológico y las de emulsión (nata) se

recogieron en la superficie del de-cantador secundario. Simultánea-mente se realizaron mediciones ho-rarias del oxígeno disuelto en distin-tas partes del reactor.

El tratamiento preliminar de lasmuestras del reactor para la obser-vación microscópica y su conserva-ción se realizaron según el protoco-lo establecido en Rodríguez et al.(2004). El estudio de las muestrasdel reactor y de las espumas se harealizado siguiendo el protocolo deGBS (Rodríguez et al., 2004). Laidentificación de bacterias filamen-tosas se hizo según a los manualesde Jenkins et al. (1996, 2003) y Se-viour y Blackall (1999).

La observación óptica se ha reali-zado con un microscopio Zeiss mo-delo Axiostar con objetivos de100x, 200x, 400x y 1.000x, dotadode equipo para microfotografía.

Debido a la abundancia de fila-mentos presentes en el reactor hu-bo que practicar una V30 diluida enla proporción 1:3 (Stöbbe et al.,1964; Jenkins et al., 2003). Es porello que el índice volumétrico defangos se expresa en su forma di-luida (IVFD).

Con la técnica FISH se han utili-zado sondas específicas marcadascon fluorocromos, para la detecciónde bacterias filamentosas en lasmuestras del reactor y de las espu-mas (Tabla 2). Esta técnica es másfiable para la identificación de bac-terias filamentosas que las técnicasconvencionales, al basarse en se-cuencias de nucleótidos específicasde las bacterias o grupos de bacte-rias que se quieren identificar. Lashibridaciones se han realizado a 46 °C durante 1,5-3 h según el pro-tocolo de Manz et al. (1992).

Sonda Secuencia (5´-3´) Especificidad % F1 Referencia

EUB 338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT Bacteria 20 Amann (1990)

EUB 338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT Planctomycetes 20 Daims et al. (1999)

EUB 338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT Verrucomicrobia 20 Daims et al. (1999)

ALF1b CGTTCG(C/T)TCTGAGCCAG α Proteobacteria 20 Manz et al. (1992)

BET42a GCCTTCCCACTTCGTTT β Proteobacteria 35 Manz et al. (1992)

GAM42a GCCTTCCCACATCGTTT γProteobacteria 35 Manz et al. (1992)

HGC69a TATAGTTACCACCGCCGT Actinobacteria 25 Roller et al. (1994)

LGC354A TGGAAGATTCCCTACTGC Firmicutes 35 Meier et al. (1999)

LGC354B CGGAAGATTCCCTACTGC Firmicutes 35 Meier et al. (1999)

LGC354C CCGAAGATTCCCTACTGC Firmicutes 35 Meier et al. (1999)

CF319 TGGTCCGTGTCTCAGTAC Bacteroidetes 35 Manz et al. (1992)

GNSB941 AAACCACACGCTCCGCT Chloroflexi 35 Gich et al. (2001)

CFX1223 CCATTGTAGCGTGTGTGTMG Chloroflexi 35 Björnsson et al. (2002)

TM7905 CCGTCAATTCCTTTATGTTTTA TM7 20 Hugenholz et al. (2000)

MPA645 CCGGACTCTAGTCAGAGC Microthrix parvicella2 20 Erhart et al. (1997)

MPA223 GCCGCGAGACCCTCCTAG Microthrix parvicella 20 Erhart et al. (1997)

MPA60 GGATGGCCGCGTTCGACT Microthrix parvicella 20 Erhart et al. (1997)

1 Concentración óptima de formamida.

2 Microthrix parvicella.

Tabla 2. Sondas utilizadas para identificar el Tipo 0581.

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3.1. Antecedentesbibliográficos: descripcióndel morfotipo 0581 a nivelóptico

Jenkins et al. (2003): Filamentocurvado y enrollado situado dentrodel flóculo o libre en el espacio in-terflocular. La longitud del tricomase encuentra típicamente entre 100y 200 µm de longitud y 0,5-0,8 µmde ancho. No se aprecian las célulasa lo largo del filamento. No presentani septos visibles, ni vaina, ni creci-miento adherido. No presenta ni ra-mificaciones ni movilidad.

Reactiva a tinciones: Gram nega-tivo y Neisser negativo.

Clave de identificación: Locali-zación dentro del flóculo y reacciónGram negativa. El filamento puedeser confundido con Microthrix par-vicella, pero la reacción fuertemen-te positiva de este otro filamento lodiferencia de la reacción Gram ne-gativa, propia del morfotipo 0581.

Eikelboom (2000): No modificasustancialmente las claves identifi-cativas de este filamento respecto asu primera edición (1983), salvo eldiámetro celular que lo sitúa entrelos rangos de 0,3-0,4 µm y la longi-tud del filamento, que presenta va-lores inferiores a 200 µm. Esta cir-cunstancia sugiere la posibilidad deque Microthrix parvicella y T 0581

pudieran tratarse de distintas formasde crecimiento de la misma especie.

Microthrix parvicella, descritapor primera vez por Pasveer en1969, se incluye en el phyllum Acti-nobacteria (Rossetti et al., 2005),con características especiales, sien-do uno de los filamentos más polé-micos de la lista de Eikelboom. Ladistinta morfología presentada poresta bacteria, según los sustratosutilizados, hace pensar que existenvariantes, definidas por Eikelboomcomo “distintos ecotipos” que en re-alidad se corresponden con la mis-ma especie. En muchos casos, estepolimorfismo guarda relación conla adaptabilidad de la especie (Mar-galef, 1998).

Por otra parte, algunos autoresencuentran codominancia entre Mi-crothrix parvicella y el Tipo 0092(Madoni et al., 2000), así como dis-tintos ecotipos de Microthrix parvi-cella en función de la temperatura.Esta última presenta un óptimo decrecimiento a 25 °C (Seviour yBlackal, 1999), con crecimiento enforma alargada (200-500 µm) que,durante el verano, se fragmenta yqueda en forma de filamentos cortos(20-200 µm) (Hawany y Tanakoo,1998; Rossetti et al., 2005). La fre-cuencia de las distintas formas fila-mentosas es función de las condi-

ciones ambientales, algunas de lascuales cambian en el curso del año(Margalef, 1998). Esta última cir-cunstancia nos hizo pensar que Mi-crothrix parvicella y T 0581 podrí-an pertenecer al mismo grupo filo-genético y que ambas podrían en-contrarse íntimamente ligadas al Ti-po 0092 en función de sus caracte-rísticas ecológicas.

4. Resultados y discusiónPara poder determinar las carac-

terísticas de las bacterias es necesa-rio establecer la decantabilidad delfango, conocer los parámetros ope-racionales de la EDAR, proceder alanálisis óptico del fango y realizarsu estudio filogenético.

4.1. Análisis dedecantabilidad

Debido a la longitud y forma decrecimiento similares en Microthrixparvicella y el Tipo 0581, es lógicopensar que el análisis macroscópicorealizado sobre el conocido ensayode la V30 sea también muy parecidoen cuanto a la velocidad de decanta-ción, aspecto algodonoso del licor,emulsión en superficie y elevaciónde la masa de fango. Ambas formasde crecimiento filamentoso produ-cen valores de IVF elevados y emul-siones (natas), por lo que podría con-

Figura 1. Ensayos correspondientes a la muestra de estudio. A: Ensayo de la V30 sin diluir y diluido (a la derecha). B: Levantamiento de la manta de fango, generandola típica “Probeta partida”. C: Capa emulsionada en superficie.

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siderarse un doble efecto bulking-foaming. En la Figura 1A se mues-tra en la probeta de la izquierda elensayo de la V30 sin diluir y en la dela derecha diluido (correspondiendoun IVFD 1:3) (Stobbe et al., 1964).

La forma curva del filamento,con gran tendencia a enrollarse,produce el entrelazado de los flócu-los y por tanto una velocidad de de-cantación lenta. Grandes porciones

de licor mezcla se elevan debido a laacumulación de microburbujas endicha “estructura”, aspecto que pue-de apreciarse visualmente en la su-perficie del clarificador secundarioy que en el lenguaje de la explota-ción de estaciones depuradoras sedenomina como “trozos de fangoelevado”, sin tratarse de la emulsiónpropiamente dicha. Este hecho sepuede apreciar en la Figura 1, sobre

todo cuando se practica una dilu-ción para realizar el ensayo de laV30 o cuando el nivel de sólidos ensuspensión del licor mezcla(SSLM) es bajo. Este aspecto es co-nocido como “probeta partida”. Noobstante, los efectos del foaming sedejan ver en la parte superior de laprobeta en forma de una capa emul-sionada con aspecto céreo que, asimple vista, aparece como unamultitud de burbujas de aire juntocon fango.

En la Figura 2A se muestra la si-tuación del clarificador en los mo-mentos en los que se están forman-do las primeras “natas”, las cualesinicialmente tienen forma de “esca-mas”, con multitud de burbujas, quesalen de la zona central del decanta-dor para ocupar toda la superficie.En este tipo de episodios, según elgrado de avance del foaming, puedellegarse a colapsar toda la superficiedel reactor biológico (Figura 2B)con el aspecto típico de “chocolateespeso”.

7Figura 3. Reacciones a las tinciones de los filamentos encontrados en las muestras estudiadas (1.000x). A. T 0581: 1. Muestra en vivo. 2. Neisser negativa. 3. Respuesta Gram negativa de T0581, junto con reactiva Gram positiva de Microthrix parvicella; B. Microthrix parvicella: 1. Muestra en vivo. 2. Reacción gránuloNeisser positiva. 3. Tinción Gram positiva; C. Tipo 0092: 1. Muestra en vivo. 2. Clásica tinción Neisser positiva, color púrpura. 3. Tinción Gram con reactiva negativa.

Figura 2. Aspecto del tratamiento secundario en la planta estudiada. A: Primeros estadios de formación denatas en el clarificador. B: Acumulación de natas en el reactor biológico.

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4.2. Análisis ópticoEn el análisis microbiológico re-

alizado a las muestras aparecen, en-tre otros, tres tipos bacterianos: Ti-po 0581 (dominante), Tipo 0092(secundario) y Microthrix parvice-lla (ocasional) (Figura 3).

El análisis detallado de las mues-tras indica que, tal como se puedeapreciar en la Figura 4, la presenciadel Tipo 0581 a niveles altos de po-blación puede producir una estruc-tura flocular abierta, de forma simi-lar a Microthrix parvicella.

La semejanza óptica de ambos fi-lamentos en el estudio de una mues-tra in vivo es notable, siendo impo-sible discernir entre ellos sin reali-zar tinciones. El análisis métrico noes, pues, una característica distinti-va, sino simplemente orientativa.La forma curva y enrollada típica yque estamos acostumbrados a ob-servar en Microthrix parvicella,aparece en ambos morfotipos (Fi-gura 5).

Con el fin de contrastar la morfo-logía de estas dos bacterias en la

misma muestra y resaltar las dife-rencias, se introdujo de manera arti-ficial Microthrix parvicella (Figura6).

El ancho celular de ambos mor-fotipos es distinto (Figura 6). Gene-ralmente, el Tipo 0581 es algo másfino que Microthrix parvicella, aun-que nos podemos encontrar con diá-metros similares, siendo Microthrixparvicella más fina que la mostradaen dicha figura. Por esta razón, eldiámetro celular no sería una carac-terística distintiva entre ambas.

En la Figura 7 se pueden obser-var espacios vacíos en el tricoma, tí-picos de Microthrix parvicella que,sin embargo, han podido observarsetambién en el Tipo 0581. Estos hue-cos parecen estar asociados a condi-ciones de estrés ambiental, ya queen cultivos puros no aparecen. A ba-ja concentración de oxígeno (0,4mg/L) presentan morfología irregu-lar y alargada sin células deforma-das o vacías (Rossetti et al., 2005).

La Figura 8 nos permite compa-rar la reactiva a Gram (métodoHücker modificado). Ambos mor-fotipos tienen reacciones clara-mente distintas, lo que haría supo-ner que esta tinción es clave para sudistinción. Sin embargo, de maneraocasional, se observan algunos fi-lamentos con una reacción clara-mente positiva a dicha tinción quelos convierten en “candidatos” aMicrothrix parvicella en la muestraestudiada, en la que el filamentodominante es el morfotipo 0581.En relación con esto último, existe

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Figura 4. Disgregación flocular por dos bacterias de características morfológicas similares (100x). A: Tipo0581 (muestra estudiada); B: Microthrix .parvicella.

Figura 5. Forma en bucles típica de Microthrix parvicella, presente en ambas bacterias (400x). A: Tipo 0581( muestra de estudio); B: Microthrix parvicella.

Figura 7. Presencia de huecos en los filamentos estudiados. A: Tipo 0581 (muestra de estudio); B: Microthrixparvicella (.1000x).

Figura 6. Diámetros celulares de Microthrixparvicella (introducida artificialmente) y el Tipo0581 (1.000x) en muestra in vivo.

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la hipótesis de que se pueden gene-rar cambios en la superficie celularde algunas bacterias filamentosasfrente a vertidos químicos (Rosset-ti et al, 2005), lo que se traduciríaen reacciones a tinciones anómalasy añadiría más dificultad a la iden-tificación de morfotipos visual-mente idénticos. En estas mues-tras, la determinación filogenéticaaporta la clave necesaria para com-probar si se tratan de distintos mor-fotipos, ecotipos o especies distin-

tas con capacidad de convivir en elmismo nicho ecológico.

En cuanto a la tinción Neisser, enfunción de la actividad de los gránu-los Neisser, hemos dividido los fila-mentos de morfologías similares entres grupos:– Filamentos del Tipo 0581, abun-

dantes, que no presentan reac-ción gránulo-Neisser positiva.

– Filamentos que presentan reac-ción gránulo-Neisser positiva,aunque no muy marcados, distri-

buidos desigualmente y de formaespaciada por todo el filamento,asignados a “variantes” del Tipo0581.

– Filamentos con gránulos fuerte-mente Neisser positivos, que sehan identificado como Microth-rix parvicella.En la Figura 9C se puede obser-

var un filamento con una reacciónNeisser clásica de Microthrix parvi-cella, mientras que la Figura 9Apermite observar una reacción va-riable del morfotipo 0581 a dichatinción que contrasta con la de Mi-crothrix parvicella. La bibliografía,sin embargo, indica que el Tipo0581 es gránulo-Neisser negativo(Figura 9B).

El resto de tinciones, tinción devainas y PHB, muestran resultadosnegativos en todas las ocasiones re-alizadas (Figura 10), si bien Ros-setti et al. (2005) indican que estasreacciones pueden presentar varia-bilidad según la riqueza del medioen nutrientes y lípidos. 9

Figura 8. Comparativa de la reacción Gram en los filamentos estudiados. A: Tipo 0581 (muestra de estudio);B: Microthrix parvicella y Tipo 0581 (1.000x).

Figura 10. Tinción de vainas y tinción PHB. A: Reacción negativa a la tinción de vainas del Tipo 0581. B: Reacción negativa a la tinción de PHB del Tipo 0581 (1.000x). Ambas procedentes de la muestra de estudio.

Figura 9. Reacción a la tinción de Neisser de los dos filamentos (1.000x). A: Microthrix parvicella con gránulos fuertemente positivos y Tipo 0581 con gránulos Neisserdébilmente positivos. B: Tipo 0581 con reacción gránulo-negativo. C: Muestra control de Microthrix parvicella procedente de otra muestra distinta a la de estudio en laque se observa la típica reacción gránulo-positiva.

Para identificarel Tipo 0581 se

realizan análisisde decantabilidad

del fango

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Es típico observar como despuésde un aumento brusco de la pobla-ción de Actinomicetos, los cualescontienen ácidos micólicos (Myco-lata), junto con una subida brusca delos niveles de oxígeno en el reactor,puede generarse en escaso tiempouna gruesa capa de emulsión pro-ducto del incremento de microbur-bujas (Figura 11).

En la Figura 11D se puede obser-var claramente como en el espaciointerflocular, en el frotis procedente

de la muestra de nata, aparece unagran población de bacterias fila-mentosas (Tipo 0581) siempre ma-yor que en el licor mezcla. Esta si-tuación ocurre de forma similar enMicrothrix parvicella, estando des-crita como LAO (acumuladora delípidos) (Rossetti et al., 2005).

La formación de foaming produ-cida por microorganismos filamen-tosos es un complejo proceso queengloba reacciones físico-químicasy biológicas. El proceso termina con

la estabilización del sistema en tresfases: aire-agua-células microbia-nas. La estabilización de la nata bio-lógica es el resultado de la produc-ción de materiales lipídicos, lipo-péptidos, proteínas y carbohidratos,los cuales tienen propiedades deagentes tensioactivos. Por añadidu-ra, las paredes celulares de los mi-croorganismos formadores de foa-ming son fuertemente hidrofóbicas.

El mecanismo de estabilizaciónde la nata podría explicarse aplican-do un modelo sencillo de “monoca-pa”. La mayoría de sustancias defuerte carácter hidrófobo antesmencionadas presentan, al menos,una parte compuesta por ácidos gra-sos (saturados o insaturados) queestán formados por un grupo polar(carboxilo) y una parte apolar (ca-dena hidrocarbonada) con un núme-ro elevado de átomos de carbono.De manera visual se observa que supresencia comienza apreciándoseen las zonas centrales de los flócu-los que se presentan bien compactos(Figura 11B), y con una microes-tructura rica en formas filamentosassusceptibles de albergar o sintetizarestos compuestos (Figura 11C).Una vez que los niveles aumentan,se llega a un contacto directo molé-culas-licor mezcla, produciéndoseun efecto similar al adicionar unagente tensioactivo a una disoluciónacuosa. Es decir, las moléculas tien-den a concentrarse en la superficie(interfase líquido-gas) formando

10

Figura 11. Aspecto típico de situaciones de foaming. A: Sustancias de carácter hidrófobo; sistema estableaire-agua-células. B: Presencia material hidrófobo cercano al núcleo del flóculo. C: Material hidrofóbico en las zonas de mayor densidad bacteriana. D: Población filamentosa en el espacio interflocular del frotisde la muestra de nata (100x).

DIA CAUDAL DBO5 SSLM SSVLM V30 IVFD CARGA ENTRADA ENTRADA REACTOR REACTOR (1:3) (1:3) MÁSICA

m3 mg O2/l mg/l mg/l ml/l ml/g kg DBO/kg SSVLM.d

19-04-05 400 300 2890 2250 200 551 0,082

20-04-05 480 240 2840 2190 220 620 0,081

21-04-05 440 200 2770 2130 180 520 0,064

22-04-05 405 380 2830 2210 170 480 0,12

23-04-05 450 420 2900 2290 160 441 0,13

24-04-05 450 500 2920 2300 150 411 0,15

Tabla 3. Valores de carga másica obtenidos en el periodo de muestreo.

Tabla 3

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C D

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una monocapa con los grupos pola-res interaccionando con las molécu-las de agua y los apolares dirigidoshacia la fase gas (disposición ener-gética favorable). En el reactor bio-

lógico tenemos que añadir ademásun factor muy importante, el siste-ma de aireación, con millones demicroburbujas de aire colisionandocontinuamente con los flóculos,

muchos de ellos en la situación an-tes descrita y a los que se les va a fa-cilitar una interfase líquido/gas don-de las moléculas se podrán disponeren monocapa. La situación final esque los flóculos con este tipo de ma-terial atrapan microburbujas (Figu-ra 11A), por lo que tienden a flotar yacumularse en la superficie. Cuandolas cantidades son importantes aca-ba formándose una nata espesa en lasuperficie del reactor y/o del clarifi-cador secundario.

4.3. Parámetrosoperacionales

Las cargas másicas (CM) obteni-das se mantienen bajas durante elperiodo de estudio (0,06-0,08 kg.DBO/kg. MLVSS d.) y se ven incre-mentadas a lo largo del fin de sema-na debido, fundamentalmente, alaumento de la carga orgánica en elinfluente por el desplazamiento po-blacional que sufre el municipio.

A continuación se presentan losrangos de carga másica en los quesuele ser frecuente encontrar losmorfotipos principales de la mues-tra de estudio (Jenkins et al., 2003):

Tipo 0581: 0,1-0,05 kg. DBO/kgSSVLM d.Tipo 0092: 0,15-0,05 kg DBO/kgSSVLM d.Microthrix parvicella: 0,2-0,05 kgDBO/kg SSVLM d.

En la Tabla 3 podemos compro-bar en que rango de carga másica haoperado la EDAR durante el perio-do de estudio y como coincide conlos rangos típicos que aparecen en labibliografía. No se detectó ningunavariación importante de los distin-tos microorganismos presentes enfunción de la CM.

Un parámetro que afecta de formaimportante a los distintos organis-mos filamentosos es el nivel de oxí-geno disuelto. El sistema de oxigena-ción ocasiona zonas y momentos conescasos niveles de oxígeno, como esel caso de las zonas desde donde losaireadores impulsan el aire (posición1) frente a otras zonas con niveles 11

Figura 12. Distribución de oxígeno en el reactor estudiado.

Esquema reactor biológico

0.00

1.30

3.00

4.30

6.00

7.30

9.00

10.30

12.00 13

.3015

.0016

.3018

.0019

.3021

.0022

.30

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mas elevados (posición 2), tal y co-mo puede apreciarse en la Figura 12.La posición 3 corresponde al puntode muestreo del licor mezcla.

Esta situación de intermitenciaen el oxígeno podría ser similar a laque se produce en el régimen depuestas en marcha y paradas en lossistemas de aireación por turbinas yen los que es muy común el creci-miento de las formas de Microthrixparvicella, más competitiva en es-tas situaciones de alternancia, y enlas cuales también podría serlo laforma Tipo 0581.

4.3. Estudio filogenéticoEl morfotipo 0581 se ha encon-

trado como dominante en el 10% dedepuradoras con problemas de es-pumas en Alemania (Lemmer et al.,2004). En las muestras analizadas

de la depuradora de Torres-Torrescon la técnica FISH se han utilizadosondas de diferentes phyllum parapoder ubicar filogenéticamente elmorfotipo 0581, dominante en estasmuestras. El morfotipo 0581 no hahibridado con las siguientes sondasque se utilizan para caracterizarbacterias a nivel de phyllum: Prote-obacteria, Actinobacteria, Firmicu-tes, Planctomycetes, Verrumicro-bia, Bacteroidetes y TM7. Björns-son et al. (2002) encuentran tambiénalgunos filamentos que hibridancon la sondas del phyllum Chloro-flexi y que no dan señal con las son-das EUB338 mix (I, II y III). En lasmuestras de Torres-Torres se handetectado morfotipos filamentososque no hibridan con las sondasEUB338 I, II y III (Figura 13A) yque, sin embargo, hibridan con las

sondas GNSB941 y CFX1223 (Fi-gura 13B). Se ha obtenido una señalpositiva en las células que constitu-yen este morfotipo con las sondasdel phyllum Chloroflexi (Figuras13B, C y D). Bacterias filamentosasdel phyllum Chloroflexi se han des-crito como abundantes en procesosde tratamiento de aguas residualescon eliminación de nutrientes(Björnsson et al., 2002).

Con la técnica FISH en las mues-tras de Torres-Torres se ha detecta-do señal de hibridación en algunascélulas/filamentos del morfotipoMicrothrix parvicella. Las célulashibridadas daban una señal débil(Figuras 14A y 14B). Este resulta-do correspondería a un bajo conte-nido en ribosomas en las células queconstituyen el filamento de Mi-crothrix parvicella.12

Figura 13. Hibridación con distintas sondas. A: Células de color rojo hibridadas con la sonda EUB338I marcada con TAMRA. B: Mismo campo que en A pero la hibridación se ha realizado con las sondas GNSB941 y CFX1223 (marcadas con FAM), utilizadas para identificar bacterias del phyllum Chloroflexi, la flecha de color blanco señala un filamento que ha hibridado con las dos sondas del phyllum Chloroflexi y no ha hibridado con la sonda EUB338I. C y D: representandiferentes campos en los que se pueden observar células de color verde del morfotipo 0581 (flechas de color rojo).

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5. ConclusionesEs evidente la necesidad de utili-

zar técnicas moleculares para avan-zar en la identificación de los distin-tos morfotipos descritos por Eikel-boom. El FISH se plantea como unaopción muy interesante al no nece-sitar cultivos puros, aunque sí domi-nancia del organismo en el fango ac-tivo. Tiene, además, la ventaja deutilizar la propia muestra y ser repe-titivo. Sin embargo, para poder apli-car esta técnica es necesario que lacélula esté activa, porque en situa-ciones de estrés el contenido en ri-bosomas de la célula podría situarsepor debajo del límite de detecciónde la señal de hibridación.

Los futuros estudios deben ir en-caminados, por una parte, a desen-trañar la filogenia de las distintasbacterias implicadas en las altera-ciones de fangos activos, ya que estedato es fundamental para conocer elporqué del fenómeno. Por otra parte,se necesita obtener sistemas de apli-cación FISH en planta, de forma quelos operadores puedan realizar iden-tificaciones certeras y por lo tantoobtener información de la ecologíade una determinada bacteria, así co-mo tomar las decisiones oportunas.

A pesar de las característicasmorfológicas de este organismo, si-milares a Microthrix parvicella, latécnica de FISH ha podido poner demanifiesto que el morfotipo 0581estaría incluido dentro del phyllumChloroflexi, no guardando relación

con los Actinomicetos, clásicos for-madores de natas, que se incluyenen el phyllum Actinobacteria.

Corroboramos que tanto la tin-ción de Neisser como PHB no sondiferenciadoras de ambas bacterias,aunque sí que se ha podido compro-bar que el Tipo 0581 puede presen-tar respuesta negativa y respuestadébilmente positiva a gránulosNeisser, distinta a la de Microthrixparvicella que es mucho más inten-sa. Algunas formas filamentosas deeste morfotipo pueden presentar re-acciones anómalas a ambas tincio-nes debido a deficiencias nutricio-nales o vertidos, que no permitiríantomar una decisión clara en su iden-tificación. Por el contrario, la tin-ción Gram sí permite diferenciar alTipo 0581.

Sería conveniente realizar un es-tudio a nivel nacional y un segui-miento de esta bacteria para compro-bar si su grado de influencia es real-mente tan bajo o si por el contrario hapasado desapercibida al ser confun-dida con Microthrix parvicella.

A pesar de las escasas citas bi-bliográficas, este filamento hemospodido comprobar que es capaz degenerar situaciones con doble efec-to bulking-foaming, por lo que debepresentar capacidades competitivasrespecto al resto de bacterias quecomparten el mismo ecosistema.

En este episodio, coincidiendocon la bibliografía, el trinomio Tipo0581, M.p y Tipo 0092 ha estado

asociado a bajas cargas másicas y aalternancia de oxígeno, lo que pare-ce indicar que comparten estas mis-mas necesidades y pueden competiren el mismo nicho. Fluctuaciones enlas condiciones ambientales, no de-tectables por el operador, permitiríael desarrollo aventajado de una deestas bacterias, sin que las otras lle-garan a desaparecer.

6. AgradecimientosQueremos dejar constancia de

nuestro agradecimiento a cada unade las empresas y centros a los quepertenecemos, especialmente aEgevasa, Epsar y Emasesa, por suapoyo y respaldo a nuestro trabajo.También agradecemos su colabora-ción a Rebeca Castresana de Mi-guel, durante la toma de muestras yen la obtención de parámetros fisi-coquímicos.

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Figura 14. Microthrix parvicella hibridado con sondas MPA645, MPA223 y MPA60, utilizadas para identificar este morfotipo. Las figuras A y B representan diferentescampos en los que se pueden observar células de Microthrix parvicella de color rojo (flechas de color blanco) (fluorocromo TAMRA utilizado para marcar las tres sondas).

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