Técnicas de

Inmunohistoquímicas

Introducción

¿Que es la Inmunohistoquímica?

• Topología

• Inmunología

• Bioquímica

Introducción

¿Cual es su historia y su relación con la

inmunofluorescencia?

• 1871 Baeyer. Demostración de la unión del Rin y el Danubio (Fluoresceina)

• 1941 Coons Inmunofluorescencia (isocianatos: -N=C=O)

• 1949 Struggers. Utilización del Naranja de acridina en Microscopía de

Fluorescencia

• 1958 Riggs. Inmunofluorescencia (isotiocianatos –N=C=S)

• 1966 Nakane, 1969 Avrameas. Marcado por Peroxidasa de Rábano picante.

Desventajas de la IF

Requiere de Microscopio de luz UV

Material fresco o especialmente procesado

Conservación corta de la muestra

Cito morfología poco definida

Decaimiento de la fluorescencia con el tiempo

Fundamentos de la IHQ

Para comprender mejor el potencial de los métodos de coloración de IHQ,

así como los problemas latentes que pueden estar asociados con los mismos

es necesario tener un conocimiento básico sobre:

Fundamentos de la IHQ

IgM y la inmunización

IgG y la Hiperinmunización

Vida media de las Ig

Fundamentos de la IHQ

Anticuerpos Policlonales

• Especies: conejo, cabra, cerdo, equino

• Facilidad del mantenimineto

• ATC humanos contra proteínas de conejo

son menos frecuentes que para otras

especies

• Los ATC de conejo precipitan mejor

proteínas humanas

• Pools de varios conejos no generan

variaciones en las partidas

• Vías y dósis de inoculación

• Purificación: antisueros o fracción de Ig

Fundamentos de la IHQ

Anticuerpos Monoclonales

• Características

• Producción de monoclonales

• Ventajas: homogeneidad, auscencia de

inespecificidad, ausencia de variabilidad

entre partidas, facilidad en la caracterización

• La especificidad: el epitope debe ser único en

el ATG

Fundamentos de la IHQ

Afinidad entre Anticuerpos

• Afinidad intrínseca: Fuerzas iónicas, de van der Waals, enlaces de H+

• Afinidad funcional: Concentraciones iónicas, T °C, agitación, tiempo

de incubación

Reactividad cruzada entre Anticuerpos

• Entre ATC y dos o mas ATGs

• Entre un ATg y varios ATCs diferentes

• Reactividad cruzada interespecifica y su aplicación científica

Fundamentos de la IHQ

Estabilidad de los Anticuerpos

• Métodos de Purificación: PH, concentraciones salinas,

ATC conjugados con glutaraldehido

• Métodos de Almacenaje.

Manejo de los Anticuerpos

• Envases adecuados

• Temperatura de almacenaje

Fundamentos de la IHQ

Título de los Anticuerpos

• El concepto de la dilución máxima

Dilución de los Anticuerpos

Estreptoavidina-

HRP

Diluciones del ATC Primario

1:50 1:50 1:100 1:200

1:100 1:50 1:100 1:200

1:200 1:50 1:100 1:200

• Tiempo de incubación

• Temperatura de incubación

Fundamentos de la IHQ

Enzimología: Concepto

E +S E.S P + E

Px + H2O2 Px.H2O2 + DAB (cromógeno)

Molécula coloreada + Px + H2O

Fundamentos de la IHQ

Peroxidasa (HRP)

• Tiene un grupo hematina

• Se inhibe por exceso de sustrato

• Cuando se combina con H2O2 libera O2 molecular

Fosfatasa alcalina (AP)

• Transfiere grupos fofato

• No es interferida por la actividad endógena de la perxidasa

• La actividad de fosfatasa alcalina endógena se bloquea con

Levamisol

Fundamentos de la IHQ

Sustratos de la Peroxidasa

• 3, 3´diaminobenzidina DAB)

•3-amino-9-etilcarbazol (AEC)

• 4-chloro-1-naftol (CN)

• P-fenilendiamina dihidroclorhidrico

Sustratos de la Fosfatasa alcalina

• naftol AS- fosfato

• la fuccina nueva

• AS-Bi fosfato

• 5 bromo-4-cloro 3-indoxil fosfato (BCIP)

• Fast red

• Nitro Blue

La Fijación

La fijación como modificación de la

estructura antigénica

• Coagulación de proteínas

• Formación de puentes metileno entre aminoácidos básicos

Tipos de fijadores

• Extendidos de sangre

• Extendidos citológicos

• Cortes de críos tato

• Cortes de Parafina

• Microondas

La Fijación

La Recuperación Antigénica

• El uso de enzimas digestivas

• El uso de soluciones de metales o de citrato alternando con calor

• El uso del calor y presión

• Usos combinados

• La AR en la hibridación in situ

Metodos de Coloración

El Método Directo

El Método Indirecto

Métodos de Coloración

Método indirecto de tres pasos

Técnicas de Complejos

Inmune Solubles de Enzima

Métodos de Coloración

Técnica de (Estrept) Avidina - Biotina

Técnica de LSAB

Métodos de Coloración

Técnica ABC utilizando la amplificación

catalizada de señal (ACS)

Métodos de Coloración

Tecnología de Polímeros Conjugados

Metodo EPOS

• Polímero de Dextrán

• 70 moléculas de Enzima

• 10 moléculas de ATC 1rio

Metodo EnVision

• ATC 2rio unido al polímero de Dextrán

• No usan (estrept)avidina biotina

• Se reduce el tiempo de incubación

• Mayores diluciones de ATC

Métodos de Coloración

Sistema EnVision para la marcación simultánea de varios ATG tisulares

Métodos de Coloración

Los Controles

Para determinar la especificidad de un policlonal es mejor reemplazarlo

con un antisuero preabsorbido o una fracción de Inmunoglobulina.

• Concentración de proteína de la fracción IgG

4.8 g/l, Dil. 1:200. Concentración final: 4.8/200= 0.024g/l

• Fracción de IgG no inmune de conejo

20g/l, Dil. 20 g/l / 0.024 = 833

• Dilución de control negativo de Reactivo:

1:833

Los controles de Reactivo

Métodos de Coloración

Los Controles de Tejido

• Controles de tejido Negativos

• Controles de tejido Positivos

• Controles de Tejido Internos

Los Controles de Técnica

• Controles negativo de ATC 1rio

• Controles negativo de ATC 2rio

El Fondo Interacciones Hidrofóbicas

El Fondo

La actividad de enzimas endógenas

Interacciones por difusión de ATG

El Fondo

• Difusión de Antígeno

• Difusión de proteínas de plasma

Interacciones Misceláneas

El Fondo

• Por fijación inadecuada • Células aplastadas