of 36/36
Biologi Molekuler 2010 1 Modul Biologi Molekuler Sumatif II – SiePend 2009 BISA! - FARMAKODINAMIK - Jumpa lagi.. hahaha.. Nah berhubung materi ini ada yang penting dan ngga (keluar ujian ato ngga kan dikasih tau tuh..), yang katanya keluar itu yang ada bintang-bintang yak.. tapi materi yang lain dibaca juga, ntar ga sesuai perkiran berbahaya.. keh.. lanjuuut.. Baiklah, sekarang kita belajar mengenai farmakodinamik. Apa seh **bedanya** antara farmakodinamik dan farmakokinetik?? Farmakokinetik mempelajari akan nasib obat di dalam tubuh jadi tubuh ngerjain si obat, nah kalo farmakodinamik mempelajari akan nasib tubuh karena obat jadi obat ngerjain tubuh, hehehe.. Kalo diliat, farmakokinetik mempelajari berapa dosis yang harus diberikan, obatnya berapa banyak? Apa bentuknya? Seberapa sering? Dimasukan ke tubuh mau lewat mana? Ya begitulah.. Kalo farmakodinamik mempelajari akan respon tubuh atau dampaknya dari kerja obat tersebut. Ada yang bikin seneng, ada yang bikin tenang, dan lain-lain. Kedua sub-materi dari farmakologi ini dihubungkan lewat keadaan obat di dalam plasma darah dan resptornya di sel. Ini neh yang jadi jembatan keduanya. Secara ilmiah, **definisi dari farmakodinamik** itu adalah. Ilmu biokimia yang mempelajari kerja obat secara fisiologik dalam tubuh dan mekanisme kerjanya, yang merupakan dasar dari terapi pemberian obat dan pembuatan obat baru. Hal ini dilihat dari interaksi antara obat dengan reseptor yang akan memberikan efek bagi tubuh. Mekanisme dari kerja obat itu tergantung reseptor neh kawandz.. Reseptor akan memodulasi tingkat fungsi kerja dari tubuh dan fungsi fisiologis nya. Jadi rumusnya, obat + reseptor = fungsi (inget materi apa gtu.. hehehe ) Contohnya : hormon, growth factor, neurotransmiter, enzymes (Ach [asetilkolin] transferase, dihodrofolat reduktase, dan transpor elektron kayak Na/K- ATPase) Reseptor fisiologis itu memiliki 3 bentuk kerja : Agonis, kerjanya menyerupai kerja senyawa yang berasaal dari dalam sel individu Antagonis, obat yang memiliki aktivitas intrinsik sehingga menimbulkan efek yang menghambat kerja agonis Inverse Agonis (Agonis negatif), obat tersebut menimbulkan efek yang berlawanan dengan efek agonis Mekanisme ini tergantung dari ikatan antara obat dan reseptor, yaitu ikatan ion, hidrogen, hydrofobik, van der Waals hingga kovalen. (umumnya reversible) Mekanisme kerja reseptor ini bisa diliat dari pompa Na/K-ATPase yang bisa meningkatkan kadar Ca 2+ dalam sel dan membuat terjadinya kontraktilitas (kontraksi). Struktur dan hubungan antara reseptor dan molekul obat tergantung pada struktur kimia dari obat tersebut terhadap reseptor (affinitas dan aktivitas intrinsik) serta modifikasi diantara keduanya. Contohnya Rasio Efek terapi/efek racun yang jika makin tinggi makin baik adanya, selektivitas obat dan profil dari farmakokinetiknya. (Kalo di slide contohnya ada senyawa thiazolidinedione yang beda struktur dari Troglitazone, Pioglitazone dan Rosiglitazone [nice to know aja, ga keluar.. hehehe]) **Sifat reseptor** ini tergantung dari hal-hal berikut. Daerah fungsional, yaitu tempat berikatan dengan ligan (ekstrasel) dan yang tidak berikatan dengan ligan (intrasel) Reseptor occupancy, ada yang langsung ke target selulernya (protein efektor), pake protein efektor lalu kirim second messenger, atau transducer yang memediasi molekul sinyal seluler Reseptor protein efektor/transducer/second messenger target nya merupakan sebuah sistem efektor atau jalur transduksi sinyal. Merupakan amplifier dari sinyal biokimia

2. Biologi Molekuler Sumatif 2

  • View
    380

  • Download
    12

Embed Size (px)

DESCRIPTION

a

Text of 2. Biologi Molekuler Sumatif 2

  • Biologi Molekuler 2010

    1 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    - FARMAKODINAMIK - Jumpa lagi.. hahaha.. Nah berhubung materi ini ada yang penting dan ngga (keluar ujian ato ngga kan dikasih tau tuh..), yang katanya keluar itu yang ada bintang-bintang yak.. tapi materi yang lain dibaca juga, ntar ga sesuai perkiran berbahaya.. keh.. lanjuuut.. Baiklah, sekarang kita belajar mengenai farmakodinamik. Apa seh **bedanya** antara farmakodinamik dan farmakokinetik?? Farmakokinetik mempelajari akan nasib obat di dalam tubuh jadi tubuh ngerjain si obat, nah kalo farmakodinamik mempelajari akan nasib tubuh karena obat jadi obat ngerjain tubuh, hehehe.. Kalo diliat, farmakokinetik mempelajari berapa dosis yang harus diberikan, obatnya berapa banyak? Apa bentuknya? Seberapa sering? Dimasukan ke tubuh mau lewat mana? Ya begitulah.. Kalo farmakodinamik mempelajari akan respon tubuh atau dampaknya dari kerja obat tersebut. Ada yang bikin seneng, ada yang bikin tenang, dan lain-lain. Kedua sub-materi dari farmakologi ini dihubungkan lewat keadaan obat di dalam plasma darah dan resptornya di sel. Ini neh yang jadi jembatan keduanya. Secara ilmiah, **definisi dari farmakodinamik** itu adalah. Ilmu biokimia yang mempelajari kerja obat secara fisiologik dalam tubuh dan mekanisme kerjanya, yang merupakan dasar dari terapi pemberian obat dan pembuatan obat baru. Hal ini dilihat dari interaksi antara obat dengan reseptor yang akan memberikan efek bagi tubuh. Mekanisme dari kerja obat itu tergantung reseptor neh kawandz.. Reseptor akan memodulasi tingkat fungsi kerja dari tubuh dan fungsi fisiologis nya. Jadi rumusnya, obat + reseptor = fungsi (inget materi apa gtu.. hehehe ) Contohnya : hormon, growth factor, neurotransmiter, enzymes (Ach [asetilkolin]

    transferase, dihodrofolat reduktase, dan transpor elektron kayak Na/K-ATPase)

    Reseptor fisiologis itu memiliki 3 bentuk kerja :

    Agonis, kerjanya menyerupai kerja senyawa yang berasaal dari dalam sel individu

    Antagonis, obat yang memiliki aktivitas intrinsik sehingga menimbulkan efek yang menghambat kerja agonis

    Inverse Agonis (Agonis negatif), obat tersebut menimbulkan efek yang berlawanan dengan efek agonis

    Mekanisme ini tergantung dari ikatan antara obat dan reseptor, yaitu ikatan ion, hidrogen, hydrofobik, van der Waals hingga kovalen. (umumnya reversible)

    Mekanisme kerja reseptor ini bisa diliat dari pompa Na/K-ATPase yang bisa meningkatkan kadar Ca

    2+ dalam sel dan

    membuat terjadinya kontraktilitas (kontraksi). Struktur dan hubungan antara reseptor dan molekul obat tergantung pada struktur kimia dari obat tersebut terhadap reseptor (affinitas dan aktivitas intrinsik) serta modifikasi diantara keduanya. Contohnya Rasio Efek terapi/efek racun yang jika makin tinggi makin baik adanya, selektivitas obat dan profil dari farmakokinetiknya. (Kalo di slide contohnya ada senyawa thiazolidinedione yang beda struktur dari Troglitazone, Pioglitazone dan Rosiglitazone [nice to know aja, ga keluar.. hehehe]) **Sifat reseptor** ini tergantung dari hal-hal berikut.

    Daerah fungsional, yaitu tempat berikatan dengan ligan (ekstrasel) dan yang tidak berikatan dengan ligan (intrasel)

    Reseptor occupancy, ada yang langsung ke target selulernya (protein efektor), pake protein efektor lalu kirim second messenger, atau transducer yang memediasi molekul sinyal seluler

    Reseptor protein efektor/transducer/second messenger target nya merupakan sebuah sistem efektor atau jalur transduksi sinyal.

    Merupakan amplifier dari sinyal biokimia

  • Biologi Molekuler 2010

    2 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Diagram ini menggambarkan interaksi antara reseptor inversagonis (Ri) dan Reseptor agonis nya (Ra) serta keadaan berikatan dengan obat (D-Ri dan D-Ra) **Grafik diatas** memperlihatkan mekanisme kerja obat dan kecenderungan rekasi terjadi. misalnya, untuk full agonis, maka reaksi akan cenderung bergerak ke Ra. Begitu seterusnya.

    Reseptor ini ada apa aja seh??? **Jenis reseptor fisiologik** yang ada yaitu

    Reseptor enzymes, kalo ada teks book yang bilang resptor sitokin, salah satunya contohnya.

    Kanal ion, udah tau lah ya.. gerbang perpindahan ion gtu..

    G protein, ini lagi mpe bosen.. hehe

    Faktor trankripsi, satu-satu nya reseptor di intrasel yang temenan nya sama sinyal yang berupa lipid.

    Ne die gambarnye.. udah ringkasan jadi pahamin ye (cara kerja, ligannya, protein efektornya, second messengernya).. hehhehe

    **Keterangan gambarnya**. (Afalin neh guyz..) 1. Enzim

    Tirosin Kinase, ligannya: insulin, EGF, PDGF, lymphokins

    Sherine/ threonine protein kinase : TGF beta

    Guanilil siklase : reseptor ANF, reseptor guanilin

    Tirosin fosfatase 2. Ligand-gate ion channel

    Reseptor asetilkolin nikotinik

    Reseptor GABAA

    Reseptor glutamat, aspartat and glysin 3. G protein-coupled receptor

    Reseptor amin biogenik

    Reseptor eikosanoid

    Resptor hormon peptida Untuk protein efektornya ada:

    Enzyme : adenyl siklase, PLA2, C, D.

    Kanal ion : Ca++

    , K+, Na

    +

    Protein transpor 4. Faktor transkripsi

    Reseptor hormon tiroid, steroid, retinoid, dan Vitamin D.

    ENZIM (PROTEIN KINASE) Jenisnya udah ada diatas, wat protein ini targetnya bisa enzim lain (kinase lainnya), protein regulator, atau protein struktural. Contohnya yang paling gampang ya insulin (santai aja ne Nice 2 Know) **RESEPTOR SITOKIN (JAK-STAT receptor)** Merupakan reseptor tirosin kinase, yaitu 2 protein tirosin kinase yang terpisah (Janus Kinase, JAK family) JAKs ini akan menfosforilasi protein STATs ato signal transducers and activator of transcription (udah pinter lah ya bhs.inggrisnya.. hehehe). Jadi fungsinya ntu, meregulasi transkripsi dari gen yang spesifik. Ligand nya ada growth hormones, erythropoeitin, interferon, etc dah.

  • Biologi Molekuler 2010

    3 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    KANAL ION Sesuai namanya, reseptor ini mengatur potensial membran dan komposisi ion di dalam sel. Untuk jenis ligannya kaya jenis yang dah disebutin diatas, ada asetilkolin nikotinik (nicotinic cholinergic receptor), Reseptor GABAA, glutamat, aspartat and glysin (merupakan **tranmitter sinapsis**) Contohnya reseptor asetilkolin nicotinik, merupakan pentamer (2, , , chains) dengan berat 43000-50000. Asetil kolin berikatan pada subunit sehingga Na

    + masuk.

    PROTEIN G **Ligannya** yaitu..

    Amin biogenik (norepinefrin, ACh, histamin, tiramin, dopamin, dll). Eikosanoid (LT [leukotrine], PG [prostaglandin], TX [thromboxan], dll) Hormon peptida (LH, FSH, ACTH, etc)

    **Protein efektornya** yaitu adenyl siklase, PLA2 (PhospoLipase A2) , C, D, Kanal ion (Ca

    ++, K

    +, Na

    +), protein transpor.

    Protein G ini memiliki 3 sub unit yaitu (, , ) yang akan mencari protein efektor. Lalu protein efektor akan berasosiasi dengan second messenger untuk meneruskan sinyal ke dalam sel. Kompleks protein ini memiliki 7 buah protein transmembran yang memiliki bentuk bermacam-macam. Gugus yang berikatan dengan ligan adalah gugus amina dan yang berikatan dnegan protein G adalah gugus karboksil. Jadi, ke 7 protein ini sebenarnya berbentuk melingkar dengan faktor

    agonis ada di tengah-tengahnya (abstrak seh, gw juga bingung.. pizzz). G alfa yang teraktivasi akan mencari protein efektor targetnya dan bagian ini spesifik untuk setiap protein efektor yang ada. Berikut tabel yang memperlihatkan spesifisitas dari efektor yang ada. (JANGAN PANIK!!! INI NICE TO KNOW AJA.. HEHEHE..)

    Waktu untuk interaksi nya berbeda-beda, yang paling lama itu pada saat protein G mencapai protein efektornya. Reseptor yang kemudian akan mengaktifkan efektor lalu sinyal yang ada di dalam sel akan berakumulasi dan menimbulkan efek.

    OIA, PROTEIN INI PALING FAMOUS DI KEBANYAKAN SEL. FAKTOR TRANSKRIPSI Reseptor spesial yang ada di dalam sel dan bisa mengakibatkan terjadinya trankripsi karena bisa berikatan dengan DNA. **Ligan nya**, yaitu steroid, tiroid, vitamin D dan retinoid. Bagian yang berada di dekat karboksil akan menjadi kontrol atau regulator dari transkripsi DNA yang kemudian akan berikatan dengan DNA untuk menghambat atau mengaktivasi transkripsi gen. ***SECOND MESENGEEEEEEER***

  • Biologi Molekuler 2010

    4 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Karakteristiknya, konsentrasinya sangat rendah, prosuksinya cepat dan mekanisme nya daur ulang. **Contohnya**, cAMP, cGMP, Inositol triphospate (IP3) dan diacylglycerol (DAG), Ca

    ++, serta NO

    (Signaling nya dan contoh nya apa aja di slide NICE TO KNOW AJA.. )

    **REGULASI DARI RESEPTOR** Reseptor yang ada di regulasi oleh fungsi fisiologi dan biokimia agar terciptanya homeostasis di dalam sel melalui proses sintesis dan degradasi. Baik reseptro, transducer maupun efektor itu diregulasi. Pemberian stimulasi yang sama secara berkelanjutan dari agonis akan memberikan efek negatif yaitu desensitisasi (kecanduan hingga faktor regulatornya menurun) Mekanisme feedback inhobition nya ada yang

    Homolog desensitisasi (dari reseptor yang terstimulasi)

    Heterolog desensitisasi (dari banyak reseptor yang sharing jalur sinyal yang sama) Untuk yang homolog, desensitisasi terjadinya hanya pada molekul reseptor itu saja. Bisa mengalami fosforilasi, proteolisis, hingga penurunan sintesis. Untuk yang heterolog, desensitisasi terjadi dengan adanya penghambatan atau hilangnya satu hingga lebih protein yang ikut berpartisipasi dalam jalannya sinyal dari

    reseptor yang lain. Jadi karena dia ikutan ngelanjutin sinyal dari resptor itu, dia juga ikut-ikutan mengalami desensitisasi. Ada lagi yang PARAAAH, hehe... namanya supersensitisasi yaitu pengurangan fungsi secara kronik dari stimulasi reseptor itu. Contohnya pada beta-blocker.

    Untuk grafik yang ada di atas, ceritanya begini. Kalo mengalami desensitisasi pasti responnya akan menurun. Kalo homolog, bila dikasih stimulasi agonis yang lain (b) dia akan kembali seperti respon semula. Tapi, kalo yang heterolog karena reseptor yang kena banyak, maka dikasih stimulasi agonis b,c,d juga ga akan balik ke respon semula. Hal ini dikarenakan reseptor yang satu mungkin bisa kembali, tapi kalo reseptor yang lain ngga ya sama juga boong. Lah kerjanya juga bareng-bareng. Hehehe.. Nah terakhir ne.. **PENYAKIT KARENA MALFUNGSI RESEPTOR**

    Sindrom feminisasi testis, karena kekurangan reseptor ANDROGEN

    Myasthenia gravis, yaitu deplesi autoimun gara-gara reseptor cholinergic nicotinic

    Insulin-resistant DM, yaitu deplesi autoimun karena reseptor insulin

    Multiple endocrine disorder, karena defisiensi dari Gs (heterogen)

    Malignancy, aberasi reseptor yang bersifat onkogen

  • Biologi Molekuler 2010

    5 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Retinitis pigmentosa, precocious puberty, dan malignant hipertiroidisme yaitu mutasi reseptor yang memicu aktivasi dari kompleks protein G

    (Hafalin ya temandz, yang sabar ngafalinnya biar apal.. hehehe.. semangaaaadz) Yang paling ujungz... **KERJA OBAT YANG TIDAK DI MEDIASI OLEH RESEPTOR**

    (Jadi langsung tancep gas ngasih efek ke tubuh.) Ada macem-macem yaitu.

    Kerjanya Berikatan dengan molekul lain atau ion, contohnya antasida (obat maag)

    Efek koligatif, contohnya mannitol (obat sembelit)

    Yang memiliki struktur analog dengan molekul kimia biologis, contohnya beberapa agen antiviral dan antikanker (jadi salah kenal gitu virus nya.. hhehe)

    Desinfektan, detergen, alkohol yang LANGSUNG merusak membran tanpa pamrih.. hehehe

    Baiklah, mungkin itu dulu.. sebenarnya ini ada di buku rujukan farmakologi bab yang depan-depan kayak: Farmakologi FKUI (yang hejo), Katzung, Goodman-Gilman, dan laen-laen.. Sory ya kalo mirip banget ma slide, hehehe.. Met belajar guyz.. GBU!!!

    - MUTASI GENETIK -

    PROLOG

    DNA merupakan informasi genetik yang berupa molekul asam nukleat.

    Gen merupakan DNA yang diekspresikan menjadi protein

    DNA yang tidak diekspresikan berfungsi hanya sebagai pembentuk struktur dan juga fragmen perantara antara satu gen dengan gen lainnya (disebut juga junk DNA). Namun, di dalam organisme prokariot, terutama bakteri, DNA yang terdapat di dalam bakteri hampir semuanya diekspresikan.

    Basa nitrogen selalu berpasangan pada rantai DNA double helix dengan komplemennya. Yakni Adenin dengan Timin, serta Citosin dengan Guanin.

    Mutasi adalah perubahan pada materi genetik (DNA) yang dapat diturunkan.

    Mutasi mengacu pada : 1. Perubahan materi genetik, 2. Proses perubahan materi genetik tersebut.

    TIdak semua mutasi itu negatif, contoh : evolusi tanpa adanya mutasi, evolusi tidak akan terjadi makhluk hidup tidak dapat beradaptasi dengan membentuk alel.

    Mutan Organisme yang mengalami mutasi akan membentuk fenotip dan genotip baru.

    Mutasi dapat terjadi pada sel apapun dan kapanpun ketika perkembangan dari organisme multiseluler. Mutasi dapat terjadi pada 2 jenis sel:

    1. Germinal mutation terjadi pada sel sperma dan sel telur, akibatnya akan diteruskan ke keturunan selanjutnya

    2. Somatic mutation terjadi pada seluruh sel tubuh kecuali sel sperma dan ovum, dan pada mutasi ini tidak akan diturunkan pada keturunan berikutnya

    Mutasi dapat terjadi dalam skala kecil hanya satu molekul DNA yang berubah (point mutation), hingga terjadi dalam skala besar hingga satu kromosom yang berubah.

    Jenis-jenis mutasi titik (point mutation):

    1. Substitusi satu nukleotida digantikan oleh nukleotida lain, contoh : tautomeri 2. Delesi hilangnya nukleotida, bisa satu pasang saja atau satu fragmen besar,

    misalnya disebabkan oleh radiasi sinar-sinar radioaktif 3. Insersi masuknya satu atau lebih nukleotida ke dalam sekuens DNA

    Delesi dan insersi dari satu atau dua pasang basa pada sebuah gen dapat

    menyebabkan perubahan pada pembacaan kodon pembacaan kodon menjadi bergeser, sehingga dapat terjadi perubahan asam amino yang dikode pada proses translasi. Mutasi semacam ini disebut frameshift mutation.

    (perhatikan pada pembacaan kodon ketiga dst pada gen yang wild-type (normal) dan pada gen yang mutant, terjadi perubahan pengkodean asam amino akibat insersi C-G)

  • Biologi Molekuler 2010

    6 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Mutasi yang terjadi pada gen normal sehingga menghasilkan fenotip yang mutan disebut forward mutation.

    Sementara itu, ketika terjadi mutasi kedua yang menyebabkan fenotip kembali menjadi normal (original), maka mutasi tersebut disebut reverse mutation. biasanya terjadi pada organisme yang mudah mengalami mutasi, ex. bakteri. Reverse mutation dapat terjadi melalui 2 cara :

    1. Back mutation mutasi kedua terjadi pada tempat yang sama dari mutasi yang pertama sehingga fenotip yang dihasilkan kembali normal

    2. Suppressor mutation mutasi kedua terjadi pada lokasi yang berbeda, tapi akibat dari mutasi kedua tersebut meniadakan (menekan = suppress) efek dari mutasi yang pertama.

    Mutasi titik yang menyebabkan perubahan pasangan nukleotida pada gen, yang

    pada akhirnya mengakibatkan perubahan pada asam amino yang dikode, disebut juga missense mutation.

    Sementara itu, apabila mutasi titik yang menyebabkan perubahan pasangan nukleotida pada gen, tetapi pada akhirnya tidak menyebabkan perubahan asam amino yang dikode (hal ini disebabkan karena terdapat asam amino yang dikode oleh beberapa kodon) disebut juga silent mutation.

    Jika point mutation yang terjadi menyebabkan terciptanya stop kodon (UAG, UGA, atau UAA), disebut juga nonsense mutation.

    Akan tetapi, ada mutasi yang terjadi tetapi tidak menimbulkan efek pada fenotip (jadi kayak mutasinya itu gak ngaruh), oleh karena itu disebut sebagai neutral mutation. Hal ini terjadi misalnya pada mutasi pada DNA yang bukan gen junk DNA.

    Namun, kebanyakan mutasi yang terjadi menyebabkan perubahan fenotip. Dan perubahan fenotip ini adalah akibat dari tidak adanya protein yang terbentuk atau aktivitas protein yang terbentuk itu berkurang akibat terjadinya mutasi.

    Alel resesif yang mutan seringkali menyebabkan gangguan metabolisme. Contoh :

    ada 5 gangguan/penyakit yang disebabkan oleh mutasi autosomal resesif sehingga tidak dihasilkan enzim yang berperan dalam metabolisme, akibatnya adalah adanya gangguan pada metabolisme phenylalanine-tyrosin, yakni :

    Phenylketonuria (tidak adanya enzim phenylalanine hydroxylase) Tyrosinosis (tidak adanya enzim tyrosine transaminase) Tyrosinemia (tidak adanya enzim p-hydroxyphenylpyruvic acid oxidase) Alkaptonuria (tidak adanya enzim homogentisic acid oxidase) Albinism (ada dua kemungkinan penyebab, defek pada enzim tyrosinase atau

    gangguan pada perubahan 3,4 dihydroxyphenylalanine menjadi pigmen melanin)

    *Untuk lebih mudah memahami, sebaiknya lihat bagan yang ada di slide*

    Berdasarkan penyebab terjadinya mutasi, ada 2 jenis mutasi: Mutasi spontan (spontaneous mutation)

    Terjadinya tanpa diketahui penyebabnya. Pada eukariot, mutasi ini dapat terjadi dengan perbandingan 1: 10juta hingga 1: 1 milyar. (artinya : dari setiap 10 juta hingga 1 milyar pasang nukleotida yang terdapat di DNA, dapat terjadi mutasi pada 1 pasang nukleotida). Sementara pada DNA yang merupakan gen, mutasinya terjadi dengan perbandingan 1: 10ribu hingga 1:10juta. kesimpulan : pada SELURUH DNA, perbandingan mutasi 1: 10 juta hingga

    1: 10 milyar, sementara pada DNA yang merupakan Gen, perbandingan 1: 10ribu hingga 1:10 juta). Jadi kemungkinan mutasi pada DNA yang merupakan Gen lebih tinggi daripada seluruh DNA. Contoh : Orangtuanya normal, tapi tiba-tiba ketika punya anak, anaknya mengidap sickle cell anemia.

    Induced mutation Dihasilkan karena tereksposenya organism ke agen fisik dan kimia (physical and chemical agent) disebut mutagen.

    Mutagenic Agent, ada 3: 1. Chemical Agents (note : struktur kimianya bisa dilihat di slide) :

    Alkylating agent mentransfer gugus alkil (CH3-, CH3CH2-, etc) ke basa DNA Contoh : Mustard Gas [Di-(2-chloroethyl) sulfide]

    EMS (Ethyl methane sulfonate)

    Basa Analog analog dari suatu basa nitrogen, memiliki struktur yang mirip dengan basa nitrogen normal dan masuk ke dalam DNA selama replikasi. Contoh : 5-Bromouracil (BU) 2-Aminopurin (2-AP)

    Deaminating Agent mendeaminasi (menghilangkan gugus amino) pada basa nitrogen. Contoh : Nitrous Acid (HNO2)

    Hydroxylating agent menghidrolasi gugus amino pada basa nitrogen. Akibatnya, dapat terjadi mutasi transisi (mutasi titik yang menyebabkan nukleotida purin menjadi purin lainnya (AG, vice versa) atau pirimidin menjadi pirimidin lainnya). Contoh : hydroxylamine.

    Acridine dyes menginterkalasi (masuk) pada celah DNA (groove), sehingga rigiditas dari DNA bertambah mengubah konformasi DNA yang double helix menjadi abnormal. Contoh : Prolavin, Acridine orange. *keduanya merupakan zat pewarna pakaian.

  • Biologi Molekuler 2010

    7 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    2. Physical Agent

    Ionizing radiation = sinar berenergi tinggi menyebabkan elektron lepas menyebabkan free radical ion. Sinar tersebut menyebabkan perubahan yang sangat besar pada kromosom. Contoh : X-rays, gamma rays, dan cosmic rays.

    Non-ionizing radiation energinya lebih rendah dibanding ionizing radiation penetrasinya hanya pada lapisan permukaan pada sel tidak menyebabkan ionisasi. Contoh : Sinar UV menyebabkan pyrimidine hydrate dan pyrimidine dimer.

    3. Transposable Genetic Material

    (transposons) Elemen dari gen itu sendiri yang dapat berpindah. Berasal dari kata (transposable = dapat berpindah). Pada sel eukariota, jarang ditemukan adanya transposons. Perpindahan akibat insersi dari transposon itu tentu saja akan menyebabkan gen tersebut menjadi tidak fungsional.

    Faktor utama mengapa mutasi dapat terjadi : 1. Tingkat keakuratan dari proses replikasi DNA 2. Efisiensi dari mekanisme yang dapat memperbaiki kerusakan DNA (DNA Repair) 3. Tingkat keterpajanan terhadap mutagenic agent Mekanisme dari mutasi : 1. Tautomerisasi pada proses Replikasi DNA

    Tautomerisasi adalah proses dimana terjadinya perpindahan atom hidrogen dari satu posisi ke posisi lain pada basa purin atau pirimidin. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya sinar yang menyebabkan atom hidrogen loncat. Mutasi yang disebabkan karena tautomerisasi :

    Mutasi transisi : penggantian purin menjadi purin lainnya (contoh : G menjadi A) atau pirimidin menjadi pirimidin lainnya.

    Mutasi transversi : penggantian purin menjadi pirimidin lainnya dan sebaliknya.

    Pada pirimidin, perpindahan atom hidrogen terjadi pada atom karbon nomer 3 ke atom karbon nomer 4. Sementara pada purin, perpindahan atom hidrogen terjadi pada atom karbon 1 dan 6. Perpindahan atom karbon ini menyebabkan potensi mereka untuk berikatan dengan basa nitrogen pasangannya berubah. Contoh : Seharusnya dalam keadaan normal, yang terjadi adalah ikatan antara Adenin dan Timin. Namun, karena terjadi tautomerisasi, yang terjadi adalah ikatan antara Adenin dan Citosin. Hal ini disebabkan karena perpindahan atom

    hidrogen tersebut merubah konformasi dari Citosin yang dalam keadaan normal adalah amino form, menjadi imino form. Citosin dengan bentuk amino form berpotensi untuk berikatan dengan Guanin, sementara Citosin dengan bentuk imino form berpotensi untuk berikatan dengan Adenin.

    * Untuk lebih mudah memahami, sebaiknya lihat gambar yang ada di slide*

    2. Kegagalan dalam proses repair DNA. Mekanisme dari DNA repair diklasifikasikan menjadi : 1. Excision (memotong) repair:

    Terdiri dari 3 tahap : a. DNA glycosilase enzyme mengenali bagian DNA yang mengalami

    mutasi kemudian memotongnya. b. DNA polymerase mengisi nukleotida yang hilang dengan nukleotida

    yang sesuai karena dipotong. c. DNA ligase menyambungkan potongan tadi sehingga untaian DNA

    menjadi seperti semula Apabila terjadi kegagalan dalam proses repair ini, maka dapat terjadi mutasi yang permanen.

    2. Light-dependent repair (photoreactivation)

  • Biologi Molekuler 2010

    8 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Proses repair yang dibantu oleh adanya sinar. Hanya terjadi di prokariota, pada organisme tingkat tinggi seperti manusia jarang atau hampir tidak pernah terjadi. Enzim yang berperan adalah DNA photolyase. Contoh : prokariota sangat sensitive terhadap sinar UV menyebabkan timin menjadi dimer DNA photolyase mengenali dan memisahkan timin dimer sehingga molekul timin-timin tersebut dapat berpisah kembali. Enzim ini aktif karena adanya sinar.

    Penyakit-penyakit heritable yang disebabkan karena adanya mutasi DNA :

    Sickle Cell Anemia Ditemukan pertama kali oleh Pauling et al. (1949). Penyakit ini merupakan pencetus istilah molecular disease. Pada penyakit ini terjadi substitusi nukleotida A menjadi C asam amino glutamat berubah menjadi valin Hb A (normal) berubah menjadi Hb S (defective, gak normal).

    Tay-Sachs disease Mutasi terjadi pada gen HEXA yang mengkode hexosamidase A untuk mengubah ganglioside GM2 into GM3 di dalam sel saraf. Jika tidak ada enzim tersebut, maka GM2 akan terakumulasi, padahal GM2 bersifat toksik pada sel saraf.

    Penyakit-penyakit heritable yang disebabkan oleh defek pada proses perbaikan DNA:

    Xeroderma Pigmentosum : penderita sangat sensitive terhadap sinar matahari. Disebabkan karena adanya defek pada proses perbaikan DNA akibat sinar UV.

    Cockayne syndrome : Defek pada excision dalam DNA repair.

    Mutasi adalah penyebab terjadinya polimorfisme. Polimorfisme itu sendiri adalah adanya dua atau lebih dari alternatif fenotip yang normal. Jadi misalnya, dalam golongan darah ABO, kita tau kan kalo golongan darah itu ada banyak. Namun, dari bermacam-macam golongan darah ABO tersebut,, semuanya normal.

    Menurut para ahli genetika, disebut genetic polymorphism apabila frekuensi dari adanya 2 atau lebih alel dalam satu lokus lebih dari 1% di dalam populasi. Misalnya golongan darah ABO dan MN. Sementara itu, alel dengan frekuensi kurang dari 1% (misalnya Golongan darah O Bombay) disebut varian yang jarang (rare variant) bukan disebut polimorfisme.

    Polimorfisme merupakan penyebab banyaknya perbedaan yang normal pada populasi manusia seperti warna mata, warna rambut, dan golongan darah.

    Meskipun polimorfisme tidak memiliki efek negatif pada kesehatan seseorang, beberapa variasi tersebut mungkin meningkatkan risiko terjadinya suatu penyakit atau kelainan.

    Bentuk-bentuk dari polimorfisme: 1. Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

    Polimorfisme pada DNA sequence yang berisi variasi dari basa nitrogen. Contoh missense mutation akibat substitusi nukleotida sickle cell anemia.

    2. Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) disebut juga macrosatellites Suatu tipe dari DNA polimorfisme yang dihasilkan oleh adanya pengaturan besar tandem (perulangan dari fragmen DNA yang pendek, misalnya masing-masing fragmen terdiri dari sekitar 10 untaian nukleotida, kemudian fragmen tersebut diulang-ulang). Contoh: ada orang yang VNTRnya 6, ada yang VNTRnya 5, etc.

    3. Microsatellites (Short Tandem Repeat Polymorphism (STRP))

    Mirip VNTR, bedanya pada STRP nukleotida yang berulang hanya terdiri dari 2-6 nukleotida tiap fragmen yang berulang, sementara pada VNTR bisa sekitar 10-20 nukleotida tiap fragmen yang diulang. Setiap jumlah fragmen STRP yang berbeda terdapat dalam alel yang berbeda. Misalnya : seorang anak memiliki 2 alel STRP, salah satunya berisi 14 fragmen yang berulang dan alel satunya lagi berisi 10 fragmen yang berulang. *Lihat gambar di slide untuk memudahkan pemahaman* Penurunan dari VNTR dan STRP mengikuti hukum Mendel.

    Sekitar 1 dari 1000 DNA dalam genom manusia termasuk polimorfisme genetik ada 3 juta SNP yang terdapat di dalam genom manusia. Dapat dilihat dari berbagai macam perbedaan dari produk-produk gen yaitu protein.

    Penggunaan Polimorfisme :

    Dalam forensik mengidentifikasi individu

    Dalam farmakogenetik respon tubuh terhadap obat berbeda-beda tiap individu

  • Biologi Molekuler 2010

    9 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Genetic relationship molecular evolution untuk melihat kekerabatan, apakah dekat atau tidak. Ex. suku batak ternyata dekat kekerabatannya dengan suku Toraja

    Mutasi genetik atau polimorfisme dapat diketahui dengan beberapa cara:

    RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

    PCR (Polymerase Chain Reaction)

    PCR DNA Sequencing

    Southern Blot

    - GENE REARRANGEMENT -

    1. DNA rearrangement = Perubahan struktur & komposisi gen pada khromosom

    yang mengakibatkan pengaturan ulang urutan gen dalam genom (berbeda dengan rekombinasi DNA pada saat meiosis yang hanya mengalami pertukaran gen tapi tidak merubah urutan gen pada genom).

    2. Rearrangement dapat terjadi pada virus, prokariota & eukariota untuk mengatur & mengontrol perubahan ekspresi gen pada tipe sel tertentu. Penemuan mengenai adanya gen yang mampu berpindah ke lokasi kromosom yang berbeda lalu mengubah ekspresi gen sekitarnya berasal dari ilmuwan yang tak asing bagi kita yaitu Barbara Mcclintock.

    3. Rekombinasi DNA pada gene rearrangement melibatkan site-specific recombination yang ada pada sekuens DNA dari segmen (gen) yang mengalami rekombinasi. Interaksi DNA yang terlibat rekombinasi dimediasi oleh protein (enzim) yang mengenal sikuens spesifik pada DNA target.

    4. Gene rearrangement pada prokariot

    Tujuan : menghasilkan varian protein yang diperlukan untuk beradaptasi pada perubahan lingkungan, seperti resisten terhadap antibiotik dan penghindaran dari intervensi sistem imun host.

    Rekombinasi DNA bakteriofag pada genom bakteri

    Apabila bakteriofag menginfeksi E.

    coli, DNA akan direplikasi untuk menghasilkan virion baru hingga sel lisis, atau terintegrasi ke genom bakteri

    membentuk profag. Pada siklus tsb (lisogenik), profag akan ikut direplikasi didistribusikan ke sel baru generasi berikutnya. Pada kondisi tertentu, profag dapat dieksisi & direplikasi kembali membentuk virion baru.

    Baik integrasi maupun eksisi DNA akan melibatkan site- specific recombination sequens pada virus dan sel host (bakteri). (gambar dapat dilihat di slide,,gak muat dimasukin di sini hehe).

    Rekombinasi (rearrangement) bakteriofag DNA dan genom bakteri

    dimediasi oleh protein bakteriofag disebut integrase (int). Protein integrase (enzim ini dikode oleh gen virus) mengenal site- specific recombination sequens pada virus (attP) dan sel host/bakteri (attB). Keduanya dipotong & diintegrasikan seperti gambar di samping.

    Mekanisme rekombinasi yang lebih detail : attP (merah) dan attB (biru) Int awalnya mengikat attP, membentuk sebuah kompleks di mana DNA attP dibungkus oleh sekitar beberapa protein Int. Kemudian kompleks Int-attP mengikat attB, dengan menyelaraskan dari situs att fag bakteri yang homolog (1). Baik attP maupun attB akan mengalami pemotongan oleh int pada site tertentu (2). attP dan attB yang sudah terpotong pada urutan yang homolog kemudian mengalami pertukaran dan direkatkan oleh enzim ligase (3). Int protein juga berperan pada

    eksisi profag yang prosesnya merupakan kebalikan dari proses integrasi. (materinya agak susah kalo ingin baca lebih lanjut

  • Biologi Molekuler 2010

    10 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    kunjungi http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi? book=cooper&part= A828)

    Transposisi gen / DNA Gen yang tidak akif (silent gene) diaktifkan dengan memindahkannya ke situs ekspresi yang akhirnya akan mengubah ekspresi gen sebelumnya. Gen yang mengalami transposisi disebut transposon. Transposisi melibatkan enzim transposase. Salah satu bentuk ekspresi gen yang dirubah oleh gene arrangement transposisi yaitu perubahan antigen permukaan (berupa komposisi protein pilin) oleh Neisseria gonorhoeae (bakteri penyebab kencing nanah) guna menghindar respon dari sIgA memori. Gambarnya ada di bawah tuuuh

    Inversi gen

    Segmen DNA dipotong & disambung kembali dengan orientasi berbeda (terbalik) dari sebelumnya. Contohnya pada Campylobacter fetus (bakteri gram positif dan patogen pada sapi peternakan dan manusia). C.fetus mengekspresikan SLP (S-layer protein) di permukaan selnya SLP dapat bereaksi dengan c3b yang berperan dalam opsonisasi. Ternyata C.fetus dapat mengalami rearrangement pada SLP-nya dengan membentuk 6,2 kb invertible element sehingga SLP berubah dan tidak bereaksi dengan c3b -> terhindar dari fagositosis. (gambarnya juga ada di samping tuuh).

    5. Gene arrangement pada eukariota

    a. Pathological Gene Rearrangement Contohnya : gene arrangement pada gen bcr/abl karena translokasi khromosom 9 dan 22. Simbolnya yaitu t (9;22)(q34;q11). Pada kasus ini gen bcr pada khromosom 22 berekombinasi dengan gen abl pada khromosom 9 menghasilkan rekombinan bcr/abl. Rekombinan ini menimbulkan penyakit

    chronic myeloblastic leukemia. Gambar nya tuuh

  • Biologi Molekuler 2010

    11 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    b. Natural gene rearrangement

    Terjadi pada reseptor antigen manusia : reseptor sel T (TCR) dan immunoglobulin. Mengapa? Karena bentuk gen Ig dan TCR itu ada dua :

    Bentuk germline = gen nonfungsional pada presel T dan presel B. Bentuk rearrangement = gen fungsional pada sel T dan sel B yang telah

    matur. Gen fungsional tsb berasal dari rekombinasi segmen gen somatik bentuk germline pada waktu diferensiasi sel T dan sel B.

    Kenapa siih si gen Ig dan TCR butuh di arrangement supaya fungsional?? Jadi ceritanya gini kan jumlah antigen ada milyaran. Berarti kan butuh milyaran sel T dan B juga agar spesifik untuk tiap antigen. Sayangnya, total DNA genom kita aja cuman ada sekitar 3 milyar itu juga banyak yang non pengkode. Nah. Ternyata memang Tuhan tahu segalanya yaah..Tuhan mensiasatinya dengan melakukan rekombinasi gen gen limfosit yang unik pada saat perkembangan sistem imun. Mau tahu gimana rekombinasinya?? Makanya jangan ngantuk dulu yaah..baru setengah jalan nhh semangat!!!..langsung ke nomor selanjutnya aja deeh..

    6. Gene rearrangement pada TCR

    TCR terdiri dari dua rantai polipeptida ( dan ) yang menembus membran plasma

    dan terikat oleh ikatan sulfide. Rantai dan tersusun atas variable region dan constant region. Bagian variable berfungsi untuk antigen binding sedangkan constant untuk aktifitas biologis.

    Gen yang mengkode dua polipeptida ini adalah rekombinasi antara V, J, C segments (rantai alfa) atau antara V, D, J, dan C segmen (rantai beta). (V= variable, D = diversity, J = joining, C = constant). Gen pengkode rantai alfa :

    Gen pengkode rantai beta :

  • Biologi Molekuler 2010

    12 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Bagaimana siiih gen2 ini menghasilkan bermilyar rantai polipeptida yang spesifik?? Mekanisme umumnya ditunjukkan oleh gambar di atas ini. Gambar ini adalah mekanisme umum pembentukan rantai TCR beta. Perbedaannya yang atas pake gen D2, J2, C2 sedangkan yang bawah pake gen D1, J1, C1. Jadi ngerti kan..tapiPertanyaannya kok bisa bermilyar2??pdhal di gambar ini ada dua aja variasinya. Sebentar..kan belum selesai ternyata V, D, J, C itu masing2 punya banyak ekson sehingga variasinya menjadi besar. Ingat prinsipnya hanya 1 ekson saja yang dipakai untuk DNA sel T yang matur . Lebih jelasnya ditunjukkan oleh table berikut.

    Domain (exon) TCRa TCRb

    Bentuk germline V 50 70 D -- 2 J 50 13 C 1 2

    Bentuk rearrangement Kombinasi 2,5 X 103 3,6 X 103 Tambahan N-sequence 2,5 X 105 3,6 X 105

    Diversitas TCR ab kombinasi

    7. Gene rearrangement pada Ig (Immunoglobulin) Immunoglobulin tersusun atas 2 heavy

    chains (H) dan 2 light chains (L dan L) yang terikat oleh ikatan disulfide. Keduanya terdiri atas region variable dan constant. Prinsip rekombinasi spesifik dalam pembentukan gen Ig pertama kali diungkapkan oleh Susumu Tonegawa. Gene rearrangement pada gen Ig dapat membentuk sekitar 10

    12 Ig yang spesifik

    untuk setiap antigen. Sama seperti TCR, gen yang menentukan kedua chain tsb adalah V,

    D, J, dan C. Untuk L dan L dikode oleh region gen V, J, dan C sedangkan H ditambah region gen D.

    Sekedar tambahan nihh saya kasih gambar mekanisme rearrangement light chain (1) dan heavy chain (2) :

  • Biologi Molekuler 2010

    13 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Lagi lagi seperti TCR,,alasan kenapa kombinasinya bentuk bisa banyak karena tiap region gen (V, D, J, C) punya hingga ratusan ekson (lebih hebat dari TCR hehe). Lebih jelasnya diuraikan oleh table di bawah ini.

    Domain (exon) Rantai Lk Rantai Ll Rantai H

    Bentuk Germline V 300 300 300 D -- -- 50 J 5 -- 8 C 1 5 9

    Bentuk Rearrangement Kombinasi 1,5 X 103 1,5 X 103 11 X 104 Tambahan N-sequence 1,5 X 105 1,5 X 105 11 X 106

    Diversitas Ig kombinasi

    8. Mekanisme rekombinasi VDJ

    Bagian ini beda dengan sebelumnya kalo tadi (TCR dan Ig) kan hanya mekanisme rearrangement secara umum untuk pembentukan gen fungsional keduanya sedangkan bagian ini akan menjelaskan bagaimana cara segmen VDJ itu saling join an yang nantinya akan membentuk gen fungsional. Pembahasan ini akan kembali ke prinsip awal kita dimana rearrangement melibatkan dua komponen

    penting yaitu site specific recombination dan protein (hayo hayo masih ingat gak).Tambah penasaran..ayuuk lanjut bacanya. Ternyata segmen coding dari Ig dan TCR (V, D, J, dan C) diapit oleh dua recombination signal sequence (RSS) yang terletak dihulu & dihilir exon. RSS dikenali dan di eksisi oleh 2 protein kompleks RAG1 & RAG2. Setelah eksisi noncoding sequence antara dua segmen (misal V dan D), maka akan terjadi rekombinasi (rearrangement) antara kedua segmen yang akhirnya menghasilkan gen fungsional (Ig & TCR) yang sangat bervariasi. Gambarnya sebagai berikut.

    9. Deteksi gene rearrangement TCR dan Ig

    Prinsip deteksi ini dimulai karena ditemukan bahwa rearrangement gen TCR dan Ig merupakan penanda galur dan distribusi klon sel T dan sel B. Penanda galur maksudnya adalah tiap galur TCR dan Ig memiliki pola rearrangement yang khas sedangkan distribusi klon berarti anggota dari satu klon pasti mempunyai gambaran rearrangement yang sama. Cara deteksi rearrangement gen TCR dan Ig :

    RFLP (determinasi fragmen restriksi pada blot Southern) Situs restriksi pada intron gen germline akan terinterupsi oleh rekombinasi segmen gen yang berpartisipasi/mengalami rearrangement sehingga komposisi fragmen restriksi akan berubah (berbeda dari bentuk germline). Akibatnya jika dilakukan Hibridisasi dengan DNA pelacak (probe) menyebabkan gambaran hibridisasi pada radioautogram blot Southern akan berubah dan berbeda dari gambaran germline.

    Amplifikasi gen dengan PCR Menggunakan primer yang komplementer dengan intron segmen gen pasangannya. Akibatnya, rearrangement akan menyebabkan segmen gen yang berkombinasi tidak teramplifikasi. Oleh karena itu, dengan amplifikasi ini kita bisa tahu segmen ekson mana yang berkombinasi berdasarkan intron yang hilang tsb.

    10. Rearrangement gen TCR dan Ig sebagai alat untuk memantau kelainan dan patologi limfoproliferasi

  • Biologi Molekuler 2010

    14 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Leukemia limfositik dan limfoma Sel leukemia dan neoplasma limfoblastik berasal dari satu sel ansestor yang berproliferasi lebih agresif dari pada sel normal, membentuk satu klon dominan dalam sirkulasi atau kelenjar limfa. Oleh karena itu jika dilakukan analisa rearrangement pada limfosit yang diisolasi dari darah tepi atau kelenjar limfe maka akan menunjukkan ekspansi klonsel neoplasia limfositik / limfoblastik

    Penyakit-penyakit autoimun Analisa limfosit yang diisolasi dari organ atau jaringan yang mengalami lesi karena reaksi autoimun, menunjukkan adanya proliferasi sel T monoclonal (stau jenis klon yang dominan) atau oligoklonal (beberapa jenis klon yang dominan) yang spesifik. - rhematoid arthritis (reaksi autoimun pd persendian) - autoimun chronic active hepatitis - psoriasis (lesi pada kulit, cth : dermatosis squamosa)

    Penyakit-penyakit infeksi virus dan bakteri intraseluler Respon imun thd antigen virus menyebabkan proliferasi sel T spesifik dalam sirkulasi dan jaringan/organ target. Jika dilakukan analisa rearrangement pada limfosit dari sirkulasi/organ memperlihatkan ekspansi monoklonal atau oligoklonal sel T tertentu. Cth : pada penderita hepatitis, sel hati yang terinfeksi akan mengekspresikan antigen hepatitis lalu dikenali oleh sel T CD 8 yang akan merusak sel2 hati yang terinfeksi.

    11. Sedikit data tambahan nhh teman2..btw kalo materi ini agak susah usahain jangan menghapal terus baca berulang2 ajah dan perhatikan gambarnya soalnya itu membantu sekali hehe,,sukses sumatif 2 yaaa Table lokus gen yang mengkode polipeptida TCR dan Ig

    Gen Lokus

    TCR 14 q 4

    7 q 32 35

    7 p 15

    14 q 4

    Ig L 2

    L 22

    H 14 q 9

    - DIAGNOSIS MOLEKULER DAN TERAPI GEN - Sebelum memasuki diagnosis molekuler dan terapi gen lebih jauh, teman-teman perlu mengetahui beberapa hal di bawah ini:

    Replikasi Transkripsi Translasi Kodon

    Sejarah Pada awal tahun 90an, implementasi dari biomol adalah sebagai alat diagnostik, baik untuk penyakit genetik maupun penyakit infeksi. Inilah yang kemudian mengarah ke suatu diagnosis yang dinamakan diagnosis molekular. Saat ini, diagnostik molekuler bisa diterapkan di berbagai kebutuhan medis, termasuk untuk mendeteksi malignansi, penyakit genetik, identity assignment, farmakogenetik, dan penyakit infeksi. Metode dan Spesimen Kelainan yang berhubungan dengan mutasi dapat dideteksi dengan metode:

    PCR PCR-RFLP Oligo spesifik probe ARMS Real time PCR for quantitaion

    Spesimen yang digunakan dapat berupa: Darah tepi/limfosit cord blood Vili choriales Cairan amnion Circulating Asam nukleat, etc.

    Deteksi mutasi terjadi di berbagai level DNA pada penyakit genetik. Mutasi dapat terjadi belakangan setelah proses differensiasi sel. Untuk mendeteksi mutasi gen paternal, kita tidak harus mengambil sel sperma ayah, cukup diambil limfositnya. Untuk mendeteksi ada tidaknya gen yang bermutasi, diambil DNA nya karena gen yang ada di inti sel sama urutannya di semua jaringan. Sedangkan, RNA sudah merupakan hasil ekspresi dari gen. RNA di sel otot berbeda dengan RNA di sel saraf. Meskipun ditemukan adanya mutasi di DNA, tidak semua gen akan digunakan. Misalnya, sel darah merah tidak mensistesis imunoglobulin. Gen imunoglobulin ada, tetapi RNA nya tidak ada. Imunoglobulin diproduksi sel limfosit B. Klo mau lihat RNA nya, lihat sel limfosit B. Kalau sel T? tidak ada juga karena tidak diekspresikan.

  • Biologi Molekuler 2010

    15 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Jadi, deteksi mutasi pada DNA menunjukkan bahwa mutasi itu ada. Tapi apakah akan diekspreskan? Lihat RNAnya! Circulating Asam Nukleat Merupakan asam nukleat DNA maupun RNA yang tidak berada di dalam sel (DNA radikal). Misalnya DNA dari sel kanker. Sel ini pertumbuhannya sangat cepat dan banyak pula yang mengalami kematian. Sel yang lisis akan mengeluarkan materi genetik ke bagian darah yang tidak mengandung sel. Darah terdiri dari sel dan cairan yang berupa plasma ataupun serum. Plasma masih mengandung faktor-faktor koagulasi. Ketika clotting, koagulasi memeras suatu cairan yang disebut serum. Dalam serum inilah terdapat circulating DNA. Beberapa hal yang dapat dideteksi: 1. Ca DNA bisa digunakan untuk mendeteksi:

    Apakah ada mutasi onkogen yang memicu terjadinya kanker. Keberadaan asam nukleat virus. Di mana, beberapa jenis kanker terkait

    dengan virus. Misalnya, HPV pada kanker serviks dan Absetrat(sp?) virus pada kanker nasofaring.

    2. DNA fetus ada yang lolos ke sirkulasi ibu, meskipun jumlahnya sedikit. Untuk menghindari diagnosis prenatal yang melibatkan pengambilan plasenta yang pake acara tusuk2 segala dan beresiko, DNA fetal dapat diperoleh pada sirkulasi maternal/ibu untuk mendeteksi kelainan maternal:

    Beta thalasemia Akondroplasia Hiperplasia adrenal congenital

    Sayangnya, kebanyakan dari DNA di plasma sirkulasi maternal merupakan DNA ibu, sehingga tidak dapat dipastikan bila DNA yang diambil bersasal dari DNA fetal. DNA dari dari bayi, jumlahnya sangat sedikit, sehingga akan terencerkan dikalahkan oleh DNA ibu. Di samping itu, materi genetik fetal setengahnya berasal dari ibu. Meskipun hasilnya positif, bagaimana ketahuan ini memang dari bayi atau malah ibunya. Oleh sebab itu, cairan amnion untuk PND tetap digunakan. Penggunaan circulating DNA ini juga dapat mendeteksi kerusakan jaringan pada emboli paru (kerusakan jaringan paru), infark miokard(kerusakan jaringan otot jantung), stroke (kerusakan jaringan otak), dan transplantasi organ (kerusakan jaringan transplantasi). Caranya, dengan mengambil circulating Asam Nukleat di sirkulasi. Tapi, yang diambil RNA nya, bukan DNA nya. Sebelumnya, kita harus mengetahui RNA spesifik hasil ekspresi gen-gen oleh organ-organ tersebut.

    Mt DNA DNA yang mengalami mutasi bisa berasal dari nukleus atau mitokondria. Karakteristik mtDNA:

    Diturunkan secara maternal. Saat pembuahan, sitoplasma sel sperma tidak ikut masuk, melainkan hanya materi genetiknya saja. Interaksi hanya terjadi antara membran ovum dan membran sperma. Namun, kemungkinan ada kebocoran cairan sitoplasma ayah yang akan direduksi, termasuk mtDNAnya.

    Jika satu pasang kromosom inti berasal satu dari ayah dan satu dari ibu, mt DNA memiliki banyak kopi dalam satu mitokondria, dan tidak sama satu dengan lainnya.

    mtDNA tidak memiliki sistem repair seperti DNA inti sel. DNA inti jika mengalami mutasi/tidak normal sel itu akan masuk ke aptosis. Kalo mitosis gagal akan menghadapi sistem imun selnya akan dihancurkan/difagositosis. Kalau sistem imun kewalahan kanker. mtDNA memiliki rate of mutation yang tinggi.

    mt DNA menggunakan istilah heteroplasmi dan homoplasmi. Homoplasmi terjadi bila dalam satu sel, mtDNA nya mengalami mutasi semua atau normal semua, sedangkan heteroplasmi berarti dalam 1 sel, mtDNA yang mengalami mutasi bisa ada beberapa, tetapi terdapat pula yang tidak. Dari 1 sel dengan komposisi tertentu, dapat berkembang menjadi sel dengan mtDNA bermutasi yang lebih banyak, dan sel dengan mutasi mtDNA yang justru sedikit.

    Pada pembuahan, hasilnya pun bervariasi derajat penyakit yang berbeda. Misalnya sel ovum matang dengan komposisi: 80% mutan dibuahi sel sperma severe disease 50% mutan dibuahi sel sperma mild disease 20% mutan dibuahi sel sperma no disease

    Kelainan pada mtDNA ada 2 macam, kelainan sel somatik dan sel germinal. Rate of mutation pada sel somatis dikaitkan dengan usia, proses menua, dan kejadian kanker. Kelainan yang berasal dari ovum/germline akan menimbulkan penyakit neurodegenartive dan myopati (kelainan otot dan saraf). Di Indonesia, sering ditemukan Lebers Hereditary Optic Neuropathy (LHON). Kelainan ini pernah ditemukan di keluarga-keluarga di suatu desa di Bali. Diduga karena pernikahan antar keluarga dekat. LHON diakhiri dengan kebutaan. Kebutaan tidak terjadi mendadak dan gejala tidak ditemukan sejak lahir, bersifat progressif. MELAS (Myopathy Encelopathy Lactis Acidosis Stroke like episode ini seperti stroke dan terkait dengan metabolisme. Karena DNA bertugas memproduksi energi, melalui produksi molekul ATP. Penderita lama kelamaan akan mengalami kelumpuhan.

    Aplikasi Diagnosis Molekuler Diagnosis molekuler dapat diaplikasikan untuk mendeteksi kelainan bawaan. Caranya bermacam-macam:

    1. Diagnosis differensial

  • Biologi Molekuler 2010

    16 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Contoh: Kelumpuhan terkait mutasi satu gen di kromosom X yang menyandi

    protein distrofin Tidak berkembangnya otot (distrofi otit). Gejala klinisnya lumpuh biasa, tetapi tidak lumpuh total. Namun lumpuh dapat disebabkan oleh banyak hal, sehingg diperlukan deteksi untuk membedakan.

    Retardasi mental terkait fragile X-syndrome. Kelainan kromosom X gampang patah. Manifestasinya dapat bergradasi dari ringan hingga severe.

    2. Deteksi karir/pembawa sifat dalam keluarga Contoh:

    Suatu penyakit Hiperplesia Adrenal Congenital yang disebabkan oleh defisiensi enzim hidroxylase 21. Produksi enzim tersebut berkurang sehingga menyebabkan gangguan berupa kehilangan garam pada awal kelahiran. Dapat dideteksi karier dalam keluarga.

    Pada pathway pembentukan, diketahui enzim hydroxylase 21 berperan merubah konformasi kolesterol menjadi kortisol. Kolesterol juga merupakan asal pembentukan testosteron. Enzim yang tidak ada kortisol berkurang pengaturan keseimbangan elektrolit terganggu nenatus kehilangan garam fatal. Bila diketahui sebelumnya bayi akan menderita salt lost, dokter dapat mepersiapkan obat-obatan untuk membypass konversi konversi dari kolestorol kortisol.

    Apabila jalur ini terhambat terbentuk jalur lain pada bayi wanita meningkatkan testosteron klitoris rusak ambigous genitalia/kebingungan terhadap jenis kelamin bayi diperlukan pemeriksaan kromosom.

    Intermezo: Sehari-hari dokter kita berjuang menghadapi kasus demam berdarah, di mana masalah yang utama sebenarnya bukan penurunan trombosit (tidak bermasalah selama tidak terjadi perdarahan), melainkan bagaimana menyeimbangkan elektrolit di dalam sirkulasi

    pasien makanya penggunaan infus sangat penting.

    3. Deteksi kelainan genetik yang disebabkan oleh autosomal resesif di

    populasi. Syaratnya, frekuensinya tinggi. Contoh: sistic fibrosis di populasi Kaukasia. Penyakit ini disebabkan mutasi gen yang menyandi Transmembrane Conductance Regulator yang

    mengatur saluran klorida dari dalam dan keluar sel. Mutasi fungsinya terganggu terbentuk mukosa/lendir yang dibentuk di saluran napas kental menghambat jalan napas gampang terkena infeksi disebut juga sebagai infeksi sekunder karena ada pemicunya.

    Di Indonesia Thallasemia frekuensinya sangat tinggi (14-15%). Kemungkinan 1 karier akan bertemu dengan karier lainnya sangat besar. Namun, mutasinya lebih dari 200an (sulit) deteksi di populasi tidak dilakukan, tapi deteksi carier di keluarga. Di populasi dapat dilakukan screening hematologi sel eritrosit yang ukurannya sangat kecil (tetapi dapat pula disebabkan defisiensi besi atau infeksi kronis). Jadi, untuk inherited disease harus dibuat dulu pedigree/riwayat family sebelum pemeriksaan untuk medeteksi apakah kelainan berupa maternal inherited (mtDNA atau X linked) atau nuclear inherited.

    4. Diagnosis prenatal (PND) sebelum kelahiran Tidak semua perlu didiagnosis prenatal, seperti PKU (kelainan metabolisme) karena dapat diobati. PND dapat dilakukan pada penyakit yang muncul gejalanya saat kanak-kanak, gejalanya berat dengan prognosis yang buruk dan tidak ada terapi yang efektif. Contoh:

    Thalasemia Thalasemia sintesis hemoglobin berkurang anemia. Meskipun dapat ditransfusi, tetapi membawa masalah karena memasukkan darah orang lain ke resipien komplikasi, seperti penyakit infeksi akibat donor tidak diseleksi. Terkadang donor mendonorkan hepatitis, serta menyebabkan kelebihan besi yang harus dikeluarkan dengan bantuan obat. Jika tidak, akan menumpuk di organ-organ.

    Thalasemia beta terkait globulin beta, gejalanya muncul saat 3 bulan. Thalasemia alfa terkait globulin alfa, gejala lansung muncul pada saat kelahiran. Globulin terdiri dari alfa dan beta. Hemoglobin orang dewasa terdiri dari 2 alfa dan 2 beta, serta delta dan gamma (HbA). Bayi yang baru lahir hanya terdiri dari 2 alfa dan 2 gamma (HbF). Perubahan dari gamma ke beta terjadi pada usia 3 bulan, tetapi beta dapat mengalami kerusakan. Kalau alfa hilang tidak terdapat hemoglobin mati sebelum kelahiran.

  • Biologi Molekuler 2010

    17 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Gradasinya bermacam-macam ada 4 gen yang menyandi. Satu mengalami kerusakan, masih ada 3 tidak masalah. Kalo 3, hilang parah! kerusakan terjadi saat pembentukan janin. Pada beta, ada 2 gen yang menyandi. Salah satu gen mengalami kerusakan tidak bermasalah, kalau 2 berat. Tiap bulan harus ditransfusi, kalau bagus transfusinya, besi dihilangkan, screening donor dilakukan baik dapat bertahan hidup sampai dewasa. PND harus disertai genetic counseling untuk memberitahukan apa yang dilakukan dan apa yang akan terjadi.

    Meskipun bayi meninggal dengan sendirinya dalam kandungan,

    tetap perlu PND karena kerusakan bayi dalam kandungan ibu mengalami resiko perdarahan, ecamplasia.

    5. Diagnosis presimptomatik. Misalnya kebutaan progressif yang dapat dideteksi sebelum mengalami kebutaan, seperti pada kelainan mtDNA. Syaratnya:

    Untuk kelainan genetik yang manifestasinya ketika dewasa dipersiapkan dan gejalanya ditunda kemunculannya.

    Mutasinya mutasi beta pada thalasemia bermacam-macam mutasi di tiap etnik 1-5 macam yang dominan klinisi tinggal menanyakan asal suku pasien.

    Koleksi data dikumpulkan 500 di tiap etnik untuk memperoleh peta

    jenis mutasi dapat dilihat yang dominan yang mana. Jika tidak ketemu, dilihat mutasi kedua terbanyak. Bila tidak ketemu

    mutasinya sama sekali dilakukan sekuensing dilihat semua urutan nukleotidanya yang mana yang mengalami mutasi 2-3 minggu. Masalahnya, seringkali orang berkonsultasi ketika usia

    kehamilan telah lanjut. Sebaiknya sedini mungkin terminasi lebih aman.

    PCR Teknik untuk mengamplifikasi/memperbanyak DNA Contoh:

    Kelainan dari rantai beta disebut sebagai Sickle cell disease karena eritrositnya seperti bulan sabit. Prevalensinya tinggi di populasi orang timur tengah.

    Terjadi akibat mutasi salah satu basa N, dari Adenin menjadi Timin, sehingga triplet GAG yang menyandi glutamin GTG yang menyandi valin.

    Bagaimana bisa diketahui seseorang memiliki gen HbS (Sickle) atau HbA (Normal)? Digunakan metode PCR RFLG.

    Enzim Mst II akan memotong di A pada GAG HbA akan terpotong. A yang diubah menjadi T pada GTG HbS tidak terpotong. Caranya, dilakukan amplifikasi basa DNA dengan panjang 1,3 kB diinkubasi dengan enzim Mst II HbA akan terpotong menjadi 1,1 dan 0,2, sedangkan HbS tidak akan terpotong (tetap 1,3 kB) dielektroforesis dan dilihat pita-pitanya ditentukan sampel homozigot normal (HbA HbA), heterozigot (HbA HbS), atau homozigot mutan (HbS HbS). Dapat pula dengan manggunakan probe/pelacak. Satu probe untuk normal sekuens, sedangkan yang lain untuk mutan sequence dimasukkan ke dalam tabung tabung satu untuk mutant dan yang lain untuk normal. Kalau positif untuk tabung mutan saja berarti HbS, tabung normal HbA, dan untuk kedua tabung positif berarti heterozigot. Screening Pasca Kelahiran PKU (inborn errors metabolism) Mutasi gen yang mengkode enzim phenylalanine hidroxylase yang mengubah phenylalanine menjadi tirosin penumpukan penilalanin kerusakan sel otak mental retardasi. Dikoreksi dengan newborn screening/screening pas baru lahir dengan mengukur level phenylalanine dalam darah. Dihilangkan phenylalanine dari makanannya. Kita perlu segera mengetahui apakah anak ini menderita. New Born screening, Apakah kadar penilalanine yang di dalam meningkat atau tidak. TREATMENT KELAINAN GENETIK Konvensional (diutamakan)

    Restriksi dietari/membatasi makanan Misalnya pada PKU dibatasi konsumsi makanan yang mengandung fenilanin.

    Penggantian hormon Congenital Adrenal Hyperplasia diberikan hormon cortison Congenital Hypothyroidism diberikan hormon tiroksin

    Penggantian protein Hemophilia A diberikan faktor VIII

    Thalasemia diberikan transfusi darah Terapi obat

    Hyperchlesterolemia diberikan antikolestelor. Menghindari obat tertentu

    Defisiensi enzim G6PD di eritrosit yang disebabkan faktor pencetus (obat-obatan, seperti sulphonamide eritrosit akan lisis.

  • Biologi Molekuler 2010

    18 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Terapi Gen Tujuannya untuk mengkoreksi defect genetik di DNA dan dipastikan harus diekspresikan. Terapi yang sukses baru cystic fibrosis.Caranya dengan memasukkan gen normal ke sel target yang tepat dan mempertahankan ekspresi optimal dari gen yang diperkenalkan memproduksi produk yang defisien pada pasien. Klasifikasi

    Germ line: gen disisipkan di sel germinasi karena sifat-sifatnya dilanjutkan ke generasi berikutnya dilarang dalam konsensus internasional karena merupakan satu langkah untuk menciptakan manusia super.

    Sel somatik: perubahan hanya pada sel somatis saja boleh dilakukan. Terapi Sel somatis Setelah dikoreksi, gen yang baru diperbanyak melalui kloning gen, kemudian dimasukkan ke sel target melalui dua cara, yaitu:

    In vivo: disuntikkan ke pasien. Ex vivo: dimanipulasi di luar, kemudian dimasukkan lagi dengan harapan gen

    akan memperbanyak diri di dalam tubuh. Namun, gen dapat hilang dalam 2-3 bulan karena tidak stabil. Untuk mendapatkan 1 gen terapi Memerlukan waktu yang lama untuk penemuan ini 20 -30 tahun. Aspek yang perlu diperhatikan:

    Karakter gen Harus dipikirkan bagaimana gen tersebut berekspresi dalam keadaan normal, daerah yang mengontrol ekspresinya, promotornya, faktor yang menswitch on dan off. Jika ditaruh sembarangan tidak ada pengaruhnya harus diperbanyak dengan kloning 1 paket, tidak hanya gen tertentu, tetapi juga daerah yang mengontrol ekspresi gen tersebut.

    Target Sel/pemicu atau gen organ harus diidentifikasi sel mana yang tepat dan mudah diakses oleh gen yang telah dibuat.

    Vektor/ kendaraan; dibutuhkan trial dan error dengan tujuan untuk mamasukkan gen secara efisien dan aman. Salah satunya dengan liposom, yaitu dengan menggabungkan materi genetik yang digabungkan dengan suatu plasmid (liposom) disuntikkan invitro ke dalam sel materi genetiknya akan bergabung dengan materi genetik sel. Pada kenyataanya? Tidak mudah.

    - REKAYASA GENETIKA - Defenisi Rekayasa genetik manipulasi DNA dengan menggunakan teknik DNA rekombinan. Teknik DNA rekombinan: DNA dipotong dipisahkan berdasarkan ukuran disekuensing untuk menentukan komposisi dan urutan nukleotidanya.

    Tujuan

    1. Isolasi gen tertentu, bagian dari gen atau daerah genomnya. 2. Menghasilkan RNA atau molekul protein yang diinginkan dalam jumlah

    banyak. 3. Meningkatkan efisiensi dalam pembuatan enzim dan obat-obatan secara

    komersil. 4. Memodifikasi organisme, sehingga dapat mengekspresikan suatu sifat baru

    yang sebelumnya tidak dikode oleh gen. 5. Koreksi kelainan genetik di organisme, termasuk manusia.

    Peralatan Peralatannya meliputi Polmerase Chain Reaction (PCR) memperbanyak DNA supaya dapat dianalisis, elektroforesis, etc. Teknik Rekayasa Genetik Struktur DNA (lihat tentir Asam Nukleat)

    DNA merupakan polimer dari nukleotida yang terdiri dari gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa Nitrogen. Gula deoksiribosa terbentuk karena atom C no.2 pada gula ribosa kehilangan oksigen.

    Basa N terdiri dari purin (adenin & guanin) dan pirimidin (cytosin & timin).

    Basa N membentuk ikatan hidrogen dengan komplementernya, A x T dan G x C membentuk untai nukleotida yang anti paralel. Untai pertama tersusun oleh nukleotida dari arah 3 ke 5, sedangkan pasangannya terususun dari arah 5 ke 3. Struktur inilah yang membentuk double helix pada DNA.

    Replikasi Semikonservatif (lihat tentir Replikasi-Transkripsi) Secara in vivo, terjadi replikasi dari arah 5 ke 3. Terbentuk dua untai yang disebut leading strand dan lagging strand. Lagging strand, untainya direplikasi terputus-putus, membentuk fragmen

    yang disebut fragment okazaki.

  • Biologi Molekuler 2010

    19 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    ssBP membant fiksasi untai DNA template yang telah terbuka mencegah kedua untai bersatu kembali.

    Oleh karena itu, prinsip replikasi selalu diawali dengan membuka dsDNA ssDNA.

    Prinsip ini dapat diterapkan dalam denaturasi DNA secara in vitro. Adonannya: ssDNA sbg template, topoisomerase, DNA polimerase III, etc. DNA terdenaturasi melalui pemanasan, memerlukan suhu yang sangat tinggi,

    90-950 C.

    Enzim Restriksi Endonuklease

    Enzim dapat memotong DNA pada untai tertentu, memotong ikatan fosfodiester kedua untai.

    Tempat pemotongannya (restriction site) dinamakan palindrom; prinsipnya seperti cermin, di mana untai 3 ke 5 menjadi cermin 5 ke 3. Ex: Pada untai 3 ke 5 terbentuk urutan G A A T T C, maka cerminnya adalah kebalikan dari urutan basa N tersebut, C T T A A G.

    DNA yang kepotong bisa jadi berekor(sticky end) atau berujung rata (blunt end).

    Untuk yang ujung rata kodenya CCCGGG yg berpasangan dengan GGGCCC. Kalo ekor, dipotong di urutan nukleotida G AATTC. Yang berekor ini lebih baik

    digunakan karena ia membentuk lock and key dengan tempat pemotongan pada vektor, misalnya plasmid bakteri.

    Potongan DNA ini disebut fragment restriksi. Bakteri memiliki kromosomal (mencapai Megabp) dan ekstrakromosomal

    (kbp) yang disebut plasmid. Plasmid biasa digunakan untuk kloning karena dapat bereplikasi secara mandiri, dan banyak mengandung restriction site.

    Bagaimana melakukan kloning DNA ke plasmid? diperlukan enzim ligase. Enzim Ligase

    Ligase adalah enzim yang menautkan 2 fragmen DNA dengan menyambung ikatan gula- fosfat yang terpotong endonuklease.

    Misalnya, insert (DNA yang akan diklon) memiliki situs potongan untuk Enzim EcoR1, vektor DNA (plasmid) juga harus punya samakan, kemudian dipotong membentuk sticky end. Dengan bantuan ligase, keduanya akan menyambung, dan terbentuk molekul rekombinan.

    Suatu plasmid memiliki situs pemotongan untuk enzim Alu I dan Hind III. Dipilih enzim yang memotong sesuai keinginan, jangan sampai motong di sembarang tempat.

    Tidak ketemu juga? Direkayasakan dengan PCR, daerah tersebut diamplifikasi, primernya disisipi dengan daerah yang bisa dikenali, sehingga amplifikasi bisa dilakukan dengan enzim yang tadinya tidak bisa digunakan.

    Tidak semua mikroorganisme memiliki DNA, ada virus yang materi genetiknya RNA. Dalam kloning, kita akan menggunakan materi genetik yang berupa DNA. Bagaimana dengan virus RNA? Enzim Reverse Transkriptase Digunakan reverse transkiptase. Enzim ini bertolakbelakang dengan dogma sentral: DNA RNA protein.

    Dahulu, orang berpikir, enzim tidak bisa balik. Tidak bisa menjadi RNA lagi karena mengalami processing, sehingga gen manusia jika diamplifikasi akan sukar karena memiliki ekson dan intron yang tidak mengkode gen. Klon DNA yang gennya dibatasi oleh intron, jika dimasukkan ke dalam PCR, daerah intronnya yang tidak dibutuhkan akan ikut teramplifikasi.

    RNA ternyata dapat diranskripsi balik menjadi DNA. Dengan reverse dari RNA yang hanya mengandung exon (intronnya telah dibuang melalui splicing) diperoleh DNA.

    Caranya? Template berupa RNA yang memiliki ekor yang kaya akan polinukleotida A (AAAA) di ujung 3. DNA primer berisi oligo dT (TTTT) akan berikatan dengan ekor RNA sebagai pasangan poli A, lalu dielongasi dari arah 5 ke 3 dengan reverse transkriptase. Terbentulah cDNA, komplementernya.

    Setelah selesai, cDNA akan menjadi template untuk replikasi pasangannya terbentuklah cDNA untai ganda diperbanyak dengan PCR, lalu dipotong dengan retriksi endonuklease diklon.

    Bagaimana kita mengetahui klon telah berhasil atau tidak? Genome dan Analisis Protein Untuk mengetahui keberhasilan kloning, digunakan jel elektroforesis dengan menggunakan jel agarosa atau poliakrimilamida.

  • Biologi Molekuler 2010

    20 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Diagar, lalu dibuat cetakannya, kemudian diberkukan cetakan sumur diberikan DNA hasil amplifikasi.

    DNA bermuatan negatif karena gugus fosfat DNA akan berjalan ke kutub positif.

    Hasilnya berupa separasi DNA berdasarkan berat molekulnya. DNA juga akan terpisah sesuai berat molekulnya.

    Misalnya 500 kb akan berbeda dengan 300 kb. Yang paling jauh adalah 300 karena lebih kecil, sehingga lebih mudah melewati pori-pori.

    Pengecekan dapat menggunakan marker. Jika 300 yang kita amplifikasi, garis visualisasi yang terbentuk pada agar akan berada di sekitar daerah 300 pada marker. Marker adalah DNA yang dipotong-potong pada daerah tertentu yang berfungsi seperti skala dengan ukuran tertentu.

    Ex: Hasil elektroforesis DNA Lambda yang dipotong pake EcoRI. DI sini bisa dilihat, ada berbagi macam ukuran dari potongan EcoRI. Setelah dielektroforesis, DNA yg terdiri dari 21.2 kb (paling gede) akan berada paling jauh dari kutub positif dan garisnya kelihatan tebal. Klo yg 3,6 kb paling dekat ke kutub positif. Menunjukkan semakin kecil BM semakin cepat migrasinya ke kutub yg berlawanan. Yg gede, yah harus jalan lambat karena kegedean. Meskipun kesannya the biggest loser, to be honest, big means beautiful! :D

    Hibridasi Asam Nukleat dan Pelacak (Probe) Produk yang diinginkan bisa dideteksi atau dilacak denga probe. DNA ketika didenaturasi akan menjadi ssDNA, jika didinginkan akan terjadi

    renaturasi menjadi dsDNA. Dua untai asam nukleat dengan urutan basa yang saling berkomplementer,

    dapat bergabung satu sama lain. Gabungan ini dapat berupa DNA-DNA, DNA-RNA, dan RNA-RNA. Sifat ini digunakan untuk merancang oligonukleotida yang mengenali fragmen/sekuens DNA tertentu yang ingin dicari dengan pelacak/probe. Supaya bisa dilihat, probenya dilabel dengan radioaktif atau enzim. Teknik mendeteksi asam nukleat tertentu dengan probe RNA atau DNA inilah yang disebut hibridisasi.

    Radioaktif maupun enzim memiliki manfaat dan mudarat (kerugian) masing-masing. Radioaktif memiliki sensitifitas yang tinggi, apalagi pada DNA yang berukuran kecil, tetapi dapat berpotensi memancarkan radiasi, seperti neutron yag dapat masuk ke dalam kulit dan mematahkan DNA yang menyandi sel epidermis. Akibatnya, kulit terbuka, sehingga harus dirawat di ruang steril.

    Enzim kurang sensitif, tetapi resikonya jauh lebih kecil dibanding radioaktif, sehingga tidak diperlukan peralatan mahal seperti antiradioaktif.

    Mekanisme blot: Sampel dilarikan pada elektroforesis jel agarosa blot ke membran hibridisasi dengan pelacak berlabel visualisasi. Terdapat Southern Blot untuk sampel DNA dan Northern blot untuk sampel RNA. Di samping itu, adapula hibridasisi balik tanpa label radioaktif. Hasilnya nanti dianalisis.

    Hasil analisis dapat dihasilkan gambar yang menyerupai titik2 hitam yang banyak, digunakan untuk mengetahui dan membedakan strain dari suatu mikroorganisme penyebab infeksi suatu penyakit.

    Ex: dalam suatu keluarga yang terkena TB, apakah penularan pada anak disebabkan oleh penularan dari ayah. Atau ketika seseorang menderita suatu penyakit enam bulan lalu. Ingin diketahui apa ia sembuh dan terapinya berhasil. Pada pemeriksaan awal, dicek dan hasilnya dijadikan sebagai database untuk dibandingkan dengan pemeriksaan 6 bulan kemudian. Jika sama, pasien masih terinfeksi bakteri yang sama dan disimpulkan bahwa terapinya belum berhasil.

    PCR PCR ibarat seperti pintu. Apakah mutasi ini dapat menyebabkan suatu penyakit itu hanya dapat dilakukan jika sampel diperbanyak hingga jutaan kopi.

    Dulu ditaruh dalam wadah berbeda-beda. 30 siklus, berarti 2 pangkat 30. Hasil akhirnya berupa miliaran kopi. Hehe...

    Memperbanyak DNA secara in vitro (di luar jaringan) Dibutuhkan primer, yaitu oligonukleotida sintetis yang dirancang untuk

    mengenali bagian DNA yang akan diamplifikasi memungkinkan terjadinya polimerasi/ pemanjangan untai DNA. Diperlukan suhu tinggi untuk denaturasi DNA. Dibandingkan dengan probe, primer pada PCR harus memiliki syarat-syarat tertentu, yaitu memiliki panjang antara 21-23bp dan bisa melakukan annealing di suhu tertentu. Walaupun kita sudah mendesign primer dengan bantuan komputer pada kenyataan, ketika pCR akan menghasilkan hasil yang negatif karena primer yang dipake tidak bisa nempel pada dna target.

    Digunakan enzim DNA polimerase yang tahan pada suhu 95oC (misal enzim

    taq polymerase dari Thermus aquaticus yang berasal dari kawah reaksi enzimatik dilakukan pada suhu ekstrem). Jadi, harus enzim yang tahan akan suhu yang panas karena enzim yang tidak tahan akan mengalami denaturasi.

    Proses 1. Denaturasi: pemisahan untai ganda menjadi tunggal, terjadi pada suhu

    90-950C

  • Biologi Molekuler 2010

    21 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    2. Annealing/Priming: perlekatan primer pada ssDNA target; pada suhu 50-65

    0C

    3. Elongasi: reaksi polimerasi/pemanjangan rantai DNA; pada suhu 68-720C

    Di sini juga dapat kita lihat betapa menguntungkannya PCR ini karena dengan 6 siklus saja, dapat dihasilkan 64 kopi DNA. 30 siklus milyaran kopi. Sekuensing DNA Dalam rekayasa genetik digunakan metode sekuensing untuk mengetahui urutan nukleotida pada Gen.

    Metode sanger; di mana dua utas dsDNA yang tidak diketahui urutan basa N nya, akan didenaturasi membentuk ssDNA. Salah satu untai akan dijadikan template untuk sintesis untai pasangannya. Intinya, dengan mengetahui satu untai DNA, dapat diketahui untai lainnya karena saling berkomplementer.

    ssDNA template kemudian ditambahkan banyak dNTP yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP, dan DTTP.

    Ditambahkan pula primer untuk memulai sintesis dan enzim DNA polimerase untuk sintesis pasangan ssDNA yang menjadi template.

    Adonan ini kemudian diramu dan dibagi ke dalam empat tabung. Dengan demikian, setiap tabung memiliki ssDNA, dNTP yang kaya, serta enzim DNA polimerase yang sama rata.

    Yang berbeda, tabung I diberi ddATP yang diberi label dengan warna merah, tabung II dengan dTTP (biru), tabung III dengan dCTP (hijau), serta tabung IV dengan dGTP (kuning). Molekul ddNTP ini berbeda dengan dNTP karena tidak memiliki molekul O pada karbon 3 dari ribosa, sehingga pemanjangan rantai DNA terhenti bila rantai mengikat ddNTP spesifik di masing-masing tabung tersebut (ddATP, ddGTP, ddCTP, atau ddTTP) atau diterminasi.

    Hasilnya, ketika terjadi elongasi primer, dNTP akan berkompetisi dengan ddNTP dalam berikatan dengan basa N pada ssDNA sebagai template.

    Ex: Di ssDNA (template), sekuens basa N (setelah basa yang diduduki oleh primer) adalah GATCA. Pada tabung I yang berisi dATP dari dNTP dan ddATP sintesis akan berlangsung hingga mencapai posisi T, di mana dATP akan berkompetisi dengan ddATP untuk berikatan. Bila diduduki oleh dATP, sintesis tetap berlanjut. Bila tidak, ddATP yang mengikat, akan terjadi terminasi, sehingga sintesis berhenti, terbentuk fragmen, dengan ujung yang berwarna merah bila dianalisis.

    Hasil akhirnya berupa fragmen-fragmen yang terpotong di daerah tertentu akibat terminasi dengan berat molekul yang berbeda-beda dielektroforesis, sehingga memberi warna yang berbeda. Hasilnya dapat dianalisis secara statistik. Komputer akan membaca urutan-urutan tersebut. Lihat yang mana yang paling atas.

    Dulu, orang melakukannya dengan cara diekspos ke suatu film dan dibaca satu per satu. Sekarang, cukup disinari dan akan ditangkap oleh sensor dibaca, lalu disusun menjadi suatu grafik yang ditampilkan oleh layar komputer secara runut. Adakalanya antara basa N yang satu berhimpitan dengan yang lain, sehingga tinggal dibaca sinyal yang paling kuat.

    Metode dalam Teknologi Rekombinan Kloning DNA Mekanisme:

    1. Mengambil gen atau bagian dari gen yang diinginkan dari 1 organisme (donor).

    2. Insersi gen yang diinginkan ke vektor (plasmid, virus, cosmid) 3. Memasukkan vektor yang telah mengandung insert DNA ke sel hospes yang

    sesuai (cloning host), baik bakteri, jamur, ataupun sel mamalia. 4. Seleksi sel host yang berisi DNA yang diinginkan. 5. Konfirmasi dengan analisis DNA/protein.

    Produknya macam-macam, bisa untuk memproduksi protein, menghasilkan tanaman transgenik bebas hama misalnya, ataupun sumber pembelajaran DNA. Sebagai tambahan, makhluk bernama E. coli ini teryata merupakan sel host dalam kloning yang paling digunakan secara massive untuk amplifikasi rekombinasi DNA. Selain itu, suatu penelitian menghasilkan pisang transgenik hasil klon DNA hepatitis yang dapat menginduksi imunitas terhadap hepatitis yang tadinya diinsersi ke suatu vektor, mis. plasmid. Pisang yang dihasilkan, jika dikonsumsi, dapat berperan sebagai vaksin hepatitis pada manusia. Sejarah Awal tahun 70an, Herbert Boyer, Stanley Cohen, Paul Berg dan co-workers memulai teknologi rekombinasi DNA dengan menyisipkan beberapa bagian DNA asing ke dalam

  • Biologi Molekuler 2010

    22 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    sel host dan mengklon sel host tersebut untuk memproduksi kopi dari DNA yang disisipkan sebanyak mungkin. Saat ini, terdapat berbagai teknik, yaitu dengan menyisipkan DNA dari satu spesies (donor) ke spesies lain (resipien). Sel resipien kemudian akan bereplikasi, lalu memproduksi banyak kopi dari DNA rekombinan yang baru. Organisme yang mengandung fragmen DNA asing yang sengaja dibuat inilah yang disebut sebagai transgenik. Sifat-Sifat Penting Vektor untuk Kloning Gen

    Punya oriC (origin of replication) supaya dapat berplikasi memperbanyak DNA. Plasmid adalah materi genetik yang dapat bereplikasi secara mandiri.

    Dapat menerima DNA insert, kecil, dan tidak mudah terdegradasi. Mempunyai situs restriksi yang dapat digunakan untuk insersi/penyisipan gen

    yang akan diklon. Membawa gen marker, misalnya membawa sifat resistensi antibiotika

    digunakan untuk seleksi. Misalnya kita ingin melakukan kloning DNA ke plasmid pada sel bakteri. Bagaimana cara menyeleksi bakteri mana yang mengndung plasmid rekombinan tersebut? Caranya, diinsersi pula gen penyandi resistensi ampicilin dan tetracyclin. Kemudian, mediumnya diberi kedua antiobiotik tersebut. Bakteri yang dapat tumbuh pada media tersebut yang mengandung gen yang disisipkan. Tapi, harus dibuktikan lebih lanjut.

    Selain sifat-sifat di atas, khusus untuk kloning yang bertujuan untuk ekspresi protein, sifat tambahannya adalah mempunyai promoter, untuk transkripsi dan ribosome binding sequence untuk translasi sebagai bagian dari ekspresi gen pada prokaryot, sedangkan pada mamalia memiliki fragment Kozak.

    Jenis-Jenis Vektor Vektor yang digunakan untuk kloning gen antara lain:

    Retrovirus Adenovirus Adeno-associated virus (AAV) Herpes simplex virus Rhinoviruses Human Immunodeficiency Virus (HIV) Plasmid of various types. Ex: plasmid pBR322 dan pUC; maksimal hingga 20

    kb. Faga lambda Kosmid (hibrid plasmid dan faga lambda); maksimal sampai 50 kb.

    Introduksi klon gen ke sel hospes

    Sel hospes: Bakteri, sel mamalia, serangga, tanaman Syaratnya: tumbuh cepat, non-patogen, genomnya sudah dipetakan, dapat menerima vektor plasmid atau faga, mempertahankan gen asing selama multiplikasinya, serta mengekspresi dan mensekresi protein klon dalam jumlah besar. Metode

    1. Transformasi DNA diambil langsung dari medium dan direkombinasikan ke genom sel kompeten, yaitu sel bakteri yang bisa mengambil DNA. DNA rekombinan diinsersi ke DNA sirkuler untai ganda pada salah satu untai saja (misalnya di luar), membentuk heteroduplex karena untai di dalam tidak mengalami rekombinasi. Kedua untai mengalami replikasi, sehingga bakteri yang dihasilkan ada yang mengandung gen insersi adapula yang tidak.

    2. Transfeksi Prosesnya dilakukan dengan memperkenalkan materi asing pada sel

    eukariotik. Transfeksi melibatkan pembukaan pori di membran plasma, sehingga materialnya bisa diambil. Materi genetik seperti supercoiled plasmid DNA dan siRNA, bahkan protein antibodi dapat ditransfeksikan. Metode ini sering diikuti dengan mencampur lipid kationik dengan material tertentu untuk memproduksi liposom yang akan berfusi ke membran plasma dan mendeposito isinya di dalam. Transfeksi sering digunakan untuk transfeksi yang berkaitan degnan sel mamalia, sedangkan pada bakteri dan terkadang, tumbuhan, jenis proses ini disebut transformasi.

    Disebut juga transformasi untuk proses yang terjadi di bakteri dan tumbuhan. HeBS (HEPES buffered saline solution) yang mengandung ion fosfat dikombinasikan dengan larutan kalsium klorida yang mengandung DNA. Ketika keduanya digabungkan, presipitat dari kalsium fosfat akan terbentuk dan akan mengikat DNA untuk ditransfeksikan. Suspensi dari presipitat ini kemudian ditambahkan ke dalam sel untuk ditransfeksikan (biasanya berupa kultur yang tumbuh di lapisan tunggal). Lalu, dengan suatu proses yang belum diketahui, sel akan mengambil beberapa presipitat, sehingga kandungan DNA di dalamnya turut masuk. Caranya: elektroporasi, heat shock, lipofectamin dan fugene, serta senjata gen (DNA dipasangkan dengan partikel nano dari solid inert (emas), kemudian ditembakkan ke nukleus sel target.

    3. Elektroporasi Untuk host yang punya dinding sel, digunakan enzim untuk mencerna dinding sel, menyisakan protoplasma. DNA asing dimasukkan melalui kanal yang terbuka akibat tegangan listrik yang diekspose ke protoplast. Sel yang udah ditransformasikan lalu dikultur dan dimedia yang menginduksi pembentukan

  • Biologi Molekuler 2010

    23 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    dinding sel dan pertumbuhan menjadi organisme utuh. Sel hewan gampang karena tidak memiliki dinding sel.

    4. Biolistik Dibombardir dengan proyektil mikroskopis (terbuat dari substansi inert, seperti emas) dan diselubungi DNA. Ditembakkan pada kecepatan tinggi ke dalam sel atau jaringan. Teknik ini menjanjikan untuk digunakan pada organisme yang masih hidup.

    5. Transduksi Melalui infeksi virus dengan afinitas tertentu untuk tipe sel tertentu, sehingga dapat digunakan sebagai vektor jika diisi oleh DNA asing.

    6. Mikroinjeksi Tujuannya untuk memperbaiki genetik disorder, supaya sel yang DNA nya mengalami kelainan bisa berubah dan mensubtitusi gen yang fungsional. Contohnya untuk menghasilkan hewan transgenik, DNA diinsersi ke zigot atau embryo awal dengan injeksi menggunakan pipet kecil/halus. Zigot/embrio yang sudah ditransformasikan lalu diimplantasi ke rahim ibu untuk pertumbuhan dan perkembangan.

    Seleksi klon yang mengandung insert DNA yang dikehendaki Sel bakteri : Ampicilin Sel mamalia : Geniticin

    DNA library berisi koleksi fragment klon terbatas yang berasal dari genom suatu organisme. Tujuannya untuk memiliki semacam database.

    Genomic library adalah perpus yang isinya genom komplit, dalam bentuk fragment kecil DNA (oligonukleotida) yang merepresentasikan gen yang telah diketahui.

    Bioinformatika cabang ilmu yang mengaplikasikan penggunaan komputer dalam analisa data genetik.

    cDNA library adalah perpus yang berisikan cDNA yang direkonstruksi dengan reverse transkriptase dari beberapa mRNA organisme.

    Konfirmasi Klon Untuk mengkonfirmasi klon dapat dilakukan:

    Pemotongan dengan restriksi endonuklease Southern blot PCR Western blot protein

    Langkah-langkahnya, yaitu: pertama, protein dengan komposisi yang berbeda-beda, dielektroforesis pada gel poliakrilamida. Hasilnya berupa

    pemisahan molekul protein berdasarkan ukurannya. Lalu, blot protein/gel ke membran nitroselulosa. Adanya protein tertentu akan dikenali dengan antibodi spesifik. Antibodi sekunder berlabel radioaktif atau enzim. Kemudian dilakukan visualisasi.

    Analis Ekspresi Protein dengan DNA mikroarray Contoh: Untuk mengetahui perbedaan ekspresi gen pada sel kanker dan sel normal Pada chip, direkatkan sejumlah probe oligonukleotida yang mengenali gen-gen yang akan diteliti. Sementara itu, dilakukan isolasi mRNA dengan enzim reverse transkriptase, dibuat cDNA dibuat pula label yang berbeda untuk sel kanker (merah) dan sel normal (hijau) Campurkan cDNA, hibridisasikan pada chip microarray yang telah disiapkan baca hasilnya. Mutagenesis dengan oligonukleotida sintetik DNA bakteri yang sirkuler dan beruntai ganda, terkadang ketika bereplikasi mengalami mutasi DNA. Misalnya basa G yang berpasangan dengan T (seharusnya yang berpasangan dengan T adalah basa C) ketika bereplikasi, terbentuk 2 DNA sirkuler yang mengandung mutan replikasi semakin sering. Hasilnya, terdapat DNA sirkuler yang mengandung mutan, ada pula yang tidak.

    - ONKOGENESIS -

    Onkogenesis adalah proses perkembangan sel-sel normal menjadi sel-sel tumor. Selama proses tersebut, terjadi perubahan seluler dan genetik secara permanen pembelahan tidak terkontrol. Tumor atau neoplasma adalah pertumbuhan yang berlebihan (abnormal) secara otonom dari sel atau jaringan. Jenis Tumor Berdasarkan sifat pertumbuhan, tumor dibagi menjadi 2 :

    1. Tumor Jinak 2. Tumor Ganas

    a. Karsinoma (epitelial) b. Sarkoma (mesenkimal) c. Karsinosarkoma (epitelial dan mesenkimal)

  • Biologi Molekuler 2010

    24 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Tumor Jinak Tumor Ganas

    Cara Pertumbuhan Ekspansif

    Batas Tumor Jelas

    Kecepatan Tumbuh Lambat

    Diferensiasi Sel Baik

    Inti Sel:

    Bentuk

    Mitosis

    Normal/atipia ringan Sangat Jarang

    Pleomorfik, hiperkhromatik, butir inti mencolok Sering

    Nekrosis Jarang ditemukan Sering ditemukan

    Penyebaran Tidak bermetastasis Umumnya bermetastasis

    Teori Multistep Karsinoma Perubahan sel normal menjadi sel tumor ganas memiliki 3 tahap, yaitu :

    1. Inisiasi Transformasi genetik oleh karsinogen (inisiator)

    2. Promosi Perubahan lebih lanjut karena adanya promotor yang menyebakan proliferasi klonal pada sel-sel yang ditranformasi

    3. Persistensi Terjadi bila proliferasi klonal dari sel tumor tidak lagi memerlukan initiator dan promotor sel tumor tumbuh secara otonom.

    Mekanisme Genetik Onkogenesis 1. Ekspresi Telomerase

    Telomer adalah suatu kompleks nukleuoprotein (untaian DNA khusus) pada ujung 3 kromosom linear. Telomer terdiri dari sekuens basa (TTAGGG) berulang sepanjang 2-20kb. Pada sel normal, telomer tidak akan direplikasi sehingga menyebabkan pemendekan telomer sebanyak 50 200 bp setiap pembelahan. Hilangnya telomer hingga di bawah ambang batas dapat menginduksi senescence. Telomerase adalah suatu RNA-dependent DNA polimerase yang menggunakan komponen RNA nya sendiri sebagai template untuk elongasi ujung 3 pita DNA dengan cara mensintesis ulang basa telomer. Fungsi telomerase : menstabilkan panjang telomer, terlibat dalam proses pembelahan sel (diferensiasi, proliferasi, hambatan apoptosis, tumorigenesis.) , perbaikan DNA. Telomerase terdapat pada > 90 % sel tumor manusia, sel line, germ-line cells, dan stem cells.

    2. Tumor Supresor Gen (TSG) TSG merupakan gen penghambat pertumbuhan dan merangsang diferensisasi sel. TSG adalah gen resesif. Inaktivasi TSG disebabkan oleh mutasi yang terjadi pada kedua alel. Mutasi protein inaktif kehilangan daya hambat. Mekanisme kerja TSG:

    Gatekeeper Menekan proliferasi sel secara langsung. (Rb, p53)

    Caretaker Mengatur integritas genom dengan memperbaiki DNA yang rusak. (BRCA1,2)

    3. Onkogen Onkogen adalah gen yang menentukan sifat-sifat neoplastik tumor. Pembagian onkoprotein :

    Faktor pertumbuhan (TGF,EGF)

    Reseptor faktor pertumbuhan (c-erbB2)

    Aktivitas terkait cyclic nucleotide

    Aktivitas tirosin kinase

    Nuclear-binding oncoprotein; pengaturan proliferasi seluler (c-myc,c-H-ras,)

  • Biologi Molekuler 2010

    25 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Onkoprotein:

    Abnormalitas ekspresi onkogen tumor (protein yang dibuat dapat berupa ):

    Jumlah normal, molekul berbeda (ras mutan)

    Jumlah berlebih, molekul normal (erb B1, erb B2, C myc ) 4. Pengatur Apoptosis Gen perangsang apoptosis adalah Bax, sedangkan gen penghambat apoptosis adalah bcl. Karsinogenesis Karsinogenesis adalah proses transformasi sel normal menjadi sel tumor karena adanya perubahan genetik yang permanen. Penyebaran tumor ganas :

    1. Invasi (penyebaran lokal) Teradapat fase in situ dan fase invasi

    2. Metastasis (penyebaran jauh)

  • Biologi Molekuler 2010

    26 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    Karsinogen Agen penyebab kanker :

    1. Kimia (Hidrokarbon polisiklik, Metilkloranten, Nitrosamina, Asbestos) 2. Fisik (ultraviolet) 3. Biologik (HPV, EBV, virus hepatitis) 4. Ko karsinogen (hormonal, imunologik)

    Pertumbuhan Masa Tumor Dipengaruhi oleh :

    1. Kinetik pertumbuhan sel tumor Waktu dari satu sel yang mengalami transformasi membentuk masa tumor.

    2. Angiogenesis tumor Pembuluh darah memberikan aliran darah nutrisi untuk sel tumor.

    3. Progresi dan heterogenitas tumor Sel tumor mudah mutasi spontan dan kemungkinan klonal subklonal dengan sifat sedikit berbeda.

    Grading dan Staging Tumor Ganas Latar belakang : tumor ganas apabila tidak diobati akan meningkat progresif. Tujuan :

    1. Perencanaan pengobatan 2. Petunjuk prognosis 3. Pertukaran informasi antar pusat pengobatan kanker

    Grading : Menentukan derajat keganasan dan keagresifan. Grading merupakan penilaian histologi yang mencakup jumlah mitosis, ukuran inti, dan derajat kesesuaian dengan jaringan normal. Kelemahan dari grading adalah hubungan gambaran histologi dengan sifat biologik tidak sempurna. Staging : Merupakan penilaian klinik berupa ukuran tumor primer dan luas penyebaran ke kelenjar getah bening (KGB) serta tempat yang jauh (metastatis). Pengobatan Kanker

    1. Pembedahan 2. Radiasi 3. Kemoterapi 4. Imunoterapi 5. Targeted Terapi

    - PATOGENESIS MOLEKULER INFEKSI -

    Pada tahun 1890 Robert Koch mengemukakan sebuah postulat yang disebut dengan Postulat Koch. Isinya yaitu :

    1. Mikroba harus ada dalam setiap kasus dari sebuah penyakit infeksi 2. Mikroba harus dapat diisolasi dari host dan dibiakkan di media kultur 3. Penyakit harus bisa di munculkan kembali ketika mikroba yang dikulturkan

    tadi dimasukkan ke dalam host yang sesuai yang tidak menderita penyakit 4. Mikroba harus bisa diambil kembali dari host yang terinfeksi hasil eksperimen

    Namun, postulat Koch memiliki pengecualian, yaitu :

    1. Mikroba tidak selalu bisa dikulturkan di laboratorium. Hanya sekitar 30 % mikroorganisme yang bisa dikulturkan

    2. Faktor imunologik dan genetik dari host memainkan peran yang besar 3. Pertimbangan etik mencegah penerapan Postulat Koch pada penyakit dan

    pathogen yang terjadi pada manusia 4. Penyakit ada yang tidak muncul dalam waktu yang singkat.

    Misalnya AIDS, gejalanya tidak muncul dalam waktu yang sebentar melainkan butuh waktu yang lama

    Proses terjadinya infeksi bisa dimulai dari masuknya mikroorganisme ke dalam tubuh host. Setelah itu mikroorganisme tersebut melakukan kolonisasi, adesi atau penempelan, dan invasi. Selanjutnya akan menimbulkan reaksi yaitu sebuah penyakit di tubuh host. Ada sebagian mikroorganisme yang masuk ke tubuh host hanya melakukan kolonisasi, tidak melakukan invasi. Maka dalam hal ini pasien/host tersebut tidak akan sakit. Host hanya akan sakit jika mikroorganisme tersebut melakukan invasi. Adapun jalan masuk mikroorganisme ke dalam tubuh kita melalui beberapa pintu, yaitu :

    1. Kulit, merupakan pintu masuk yang paling umum 2. Membran mukosa, memiliki sistem pertahanan yang lemah.

    Antara lain : Saluran pernapasan, gastrointestinal atau saluran pencernaan, saluran urin, saluran reproduksi, konjungtiva, membran tipis yang melapisi permukaan bola mata, dan bagian bawah dari kelopak mata

    3. Plasenta, ibu hamil dapat menularkannya ke anak yang dikandungnya 4. Rute parenteral, sebenarnya ini bukan pintu masuk. Seharusnya masuknya

    mikroorganisme melalui jalan masuk ini bisa dielakkan. Misalnya : suntikan, pemasangan kateter

    Kolonisasi Infeksi dari suatu organisme diawali dengan kolonisasi. Pada tahap kolonisasi ini, agen penginfeksi menduduki suatu wilayah infeksi dan mengambil nutrient atau makanan (siderophores). Organisme tersebut bisa mengatasi racun atau toksik yang mereka

  • Biologi Molekuler 2010

    27 Modul Biologi Molekuler Sumatif II SiePend 2009 BISA!

    produksi sendiri. Organisme tersebut juga bisa melakukan perlawanan terhadap sistem pertahanan tubuh host yang dijangkitinya, misalnya dengan mengeluarkan IgA protease (semacam enzim untuk menghancurkan protein atibodi), sehingga antibodi menjadi tidak berperan.

    Adesi/Pelekatan Merupakan suatu proses di mana mikroorganisme melekatkan diri ke sel. Faktor-faktor yang mendukung terjadinya adesi yang dilakukan oleh mikroorganisme :

    1. Mikroorganisme memiliki struktur yang spesial untuk menempel Misalnya cakram pelekatan (pada Protozoa), pengisap, pengait (pada cacing).

    2. Ligan, permukaannya disusun oleh lipoprotein dan glikoprotein (bakteri dan virus). Beberapa ligan yang mendukung adesi yaitu :

    - Adhesin (pada bakteri), ditemukan di fimbriae, flagel, dan glikokalises

    - Protein perlekatan (pada virus)

    Mekanisme perlekatan :

    a. b.

    c.

    faktor-faktor yang mendukung mekanisme perlekatan

    Fili dan fimbriae merupakan media perlekatan Fili terkadang bisa muncul dan bisa dihilangkan, hal ini akan membuat fili bisa

    terhindar dari fagositosis sistem imun tubuh

    Protein Adhesin, misalnya pada Streptococcus pyogenes, adhesins nonfibrillar memediasi perlekatan bakteri dengan fibronektin. Fibronektin yaitu sebuah protein yang ditemukan di banyak permukaan sel host (banyak terdapat di reseptor)

    Transduksi sinyal, yaitu sinyal yang mendorong pengaktivan atau menekan kemunculan dari ekspresi beberapa gen. Jadi pada miroorganisme bisa diekspresikan suatu gen yang membuat miroorganisme tersebut bisa melakukan perlawanan terhadap antibodi tubuh host

    - Pengikatan adhesin dengan reseptor sel host bisa mengaktifkan atau menekan gen virulen dari sel bakteri

    Suatu mikroorganisme bisa kehilangan kemampuan dalam membuat ligan. Hai ini dapat disebabkan oleh:

    - Perubahan genetik atau mutasi

    - Terkena bahan-bahan kimia atau fisika yang berbahaya karena mikroorganisme tersebut tidak memiliki kemampuan untuk membuat ligan, ma