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19/10/04 1
Etude d ’interactions protéines-protéines Etude d ’interactions protéines-protéines in vivo (in vivo (in celluloin cellulo)) : :
Exemple des récepteurs de la famille Exemple des récepteurs de la famille erbB/HERerbB/HER
Pierre Hubert Pierre Hubert (LISM - IBSM)(LISM - IBSM) [email protected]@ibsm.cnrs-mrs.fr
19/10/04 2
Douglas Hanahan & Robert A. Weinberg The Hallmarks of CancerCell, 100, 57–70, 2000
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Récepteurs à activité tyrosine-kinaseRécepteurs à activité tyrosine-kinase
Human ~ 70Human ~ 70C. elegans ~ 40C. elegans ~ 40Yeast ~ 0 (dual)Yeast ~ 0 (dual)
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Organisation en domaines du récepteur de l ’EGF, Organisation en domaines du récepteur de l ’EGF, et mécanisme d ’activation et mécanisme d ’activation par par transtrans-autophosphorylation-autophosphorylation
19/10/04 5
Dim
éris
atio
nD
imér
isat
ion
19/10/04 6
Sig
nali
sati
onS
igna
lisa
tion
> 10> 10
44
19/10/04 7
Srckinase
InteractionsInteractionsProtéines-protéinesProtéines-protéines
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PPPVPPRR
EYINQ
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EGFR ErbB2 FGFR+ egf + anticorps +fgf et héparine
D
Grb2 PH-PTB SH2
Bennasroune et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2004, 50, 23-38
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Nature Biotech. 2000, 18, 218 - 222
Epidermal growth factor receptor dimerization monitored in live cells
Bruce T. Blakely, Fabio M. V. Rossi, Bonnie Tillotson, Michelle Palmer, Angeles Estelles & Helen M. Blau
1- Dimérisation de récepteurs de l ’EGF 1- Dimérisation de récepteurs de l ’EGF par une méthode « double hybride »,par une méthode « double hybride »,dans des myoblastes de souris (C2C12)dans des myoblastes de souris (C2C12)
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Méthode « double-hybride » classique, rappelMéthode « double-hybride » classique, rappel
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Complémentation de mutants de la ß-galactosidaseComplémentation de mutants de la ß-galactosidase
FACS, FDG = fluorescein digalactosideFACS, FDG = fluorescein digalactoside
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Complémentation de mutants de la ß-galactosidaseComplémentation de mutants de la ß-galactosidase
??Dimérisation - EGFDimérisation - EGF
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Cinétiques, courbes effet-doseCinétiques, courbes effet-dose
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Effets de ≠ anticorpsEffets de ≠ anticorps
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PNAS | December 18, 2001 | vol. 98 | no. 26 | 15003-15008
Genetically encoded fluorescent reporters of protein tyrosine kinase activities in living cells
Alice Y. Ting, Kristin H. Kaindagger, Richard L. Klemkedagger, and Roger Y. Tsien
2- FRET I : 2- FRET I : Rapporteurs fluorescents de phosphorylationRapporteurs fluorescents de phosphorylation((cellules HeLa, NIH 3T3 & B82cellules HeLa, NIH 3T3 & B82))
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Rappel :Rappel :
Interactions between two proteins can be imaged by detecting fluorescence resonance energy transfer (FRET) between donor and acceptor fluorophores. FRET is a photophysical phenomenon where energy is transferred non-radiatively from a donor fluorophore to an acceptor fluorophore with an efficiency defined by:
where r is the distance between the two fluorophores, and R0 is the distance at which 50% energy transfer takes place (typically 2–6 nm). There are a number of ways to measure FRET in a microscope that can be broadly divided into intensity-based methods and fluorescence decay-kinetics-based methods
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Rappel bis :Rappel bis :
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Copyright ©2001 by the National Academy of Sciences
Fig. 1. General design of ratiometric indicators for monitoring tyrosine kinase activities
In vitro
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Principe de la microscopie confocalePrincipe de la microscopie confocale
19/10/04 22
F. Gaits, K. Hahn, Shedding light on cell signaling: Interpretation of FRET biosensors. Sci. STKE 2003, pe3 (2003)
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Fig. 2. B82 cells transfected with the EGFR indicator responded to EGF stimulation with an [approx] 30% increase in yellow to cyan emission ratio (transition from blue to red pseudocolor)
SrcSrcreporterreporter
LocalisationLocalisation IP + WBIP + WB Réversibilité Réversibilité
Egf - + +Egf - + + AG - - +AG - - +
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Fig. 3. Cellular response of the Crk-based reporter
WBWB Localisation Localisation
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J. Biol. Chem., 279, 36972-36981, 2004
Imaging Phosphorylation Dynamics of the Epidermal Growth Factor Receptor
Martin Offterdinger, Virginie Georget, Andreas Girod, and Philippe I. H. Bastiaens
3- FRET II (FLIM) : 3- FRET II (FLIM) : Imagerie dynamique de la Imagerie dynamique de la phosphorylation du récepteur de l ’EGF phosphorylation du récepteur de l ’EGF (cellules MCF7 et COS7)(cellules MCF7 et COS7)
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Overview presenting the described constructs
FLAME = Sensors (détecteurs) ratiométriquesFLAME = Sensors (détecteurs) ratiométriques
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Translocation and binding of soluble PTB domain to EGFR-ECFP in MCF7 cells
EGFEGF--
++
+pb+pb
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Nature Biotechnology 22, 198 - 203 (2004)
Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor–mediated signal transduction
Diane S Lidke, Peter Nagy, Rainer Heintzmann, Donna J Arndt-Jovin, Janine N Post, Hernan E Grecco, Elizabeth A Jares-Erijman & Thomas M Jovin
4- Fluorescence et transduction du signal : 4- Fluorescence et transduction du signal : Récepteurs-GFPs et EGF-QD (quantum dots)Récepteurs-GFPs et EGF-QD (quantum dots)(cellules CHO et A431)(cellules CHO et A431)
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Comparative sizes of common fluorophores and protein carriers used in FRET imaging.
Elizabeth A Jares-Erijman1 & Thomas M JovinNature Biotech. 2003; 21, 1387 - 1395
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InternalisationInternalisation
PhosphorylationPhosphorylation
= endocytose= endocytose(transferrine)(transferrine)
200 pM egf-QDs200 pM egf-QDs
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CinétiquesCinétiques
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QuickTime™ et un décompresseurH.263 sont requis pour visualiser
cette image.
19/10/04 35
QuickTime™ et un décompresseurH.263 sont requis pour visualiser
cette image.
19/10/04 36
Transport rétrograde des egf-QDsTransport rétrograde des egf-QDs
19/10/04 37
QuickTime™ et un décompresseurH.263 sont requis pour visualiser
cette image.
19/10/04 38
QuickTime™ et un décompresseurH.263 sont requis pour visualiser
cette image.Fusion d ’endosomesFusion d ’endosomes
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Analyse quantitativeAnalyse quantitative
Binding erbB1 / erbB3Internalisation
masques
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Molecular Biology of the Cell, 2002, 13, 1522-1535
Coordinated Traffic of Grb2 and Ras during Epidermal Growth Factor Receptor Endocytosis Visualized in Living Cells
Xuejun Jiang, and Alexander Sorkin
5- FRET III : 5- FRET III : Localisation dynamique de complexes protéiquesLocalisation dynamique de complexes protéiques(cellules A431, NIH 3T3, endothéliales B11)(cellules A431, NIH 3T3, endothéliales B11)
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Ea = efficacité du transfert d ’énergie
Interaction Grb2 / shc Interaction Grb2 / shc
19/10/04 42
Etc…Etc…