Δυσλειτουργία των

μονοπατιών μεταγωγής σήματος και ογκογένεση:

Ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια

1. Γενικά χαρακτηριστικά δημιουργίας όγκων

Χαρακτηριστικά καρκινογόνων κυττάρων Γενετικές αλλαγές στα καρκινογόνα κύτταρα Αλλαγές στον τρόπο μεθυλίωσης Αιτίες των καρκινογόνων μεταλλάξεων Επιδιόρθωση του DNA και δημιουργία όγκων Κυτταρική διαίρεση και δημιουργία όγκων

2. Δραστηριότητα κυτταρικής διαίρεσης. Λάθη στη δημιουργία σηματοδοτικών πρωτεϊνών και δημιουργία όγκων Το μέλλον ενός κυττάρου: διαίρεση, μη διαίρεση, θάνατος Ορισμός και γενική δράση των ογκογονιδίων και των ογκοκατασταλτικών γονιδίων Κυτταρικά συστήματα για τη μελέτη της λειτουργίας των ογκογονιδίων και των ογκοκατασταλτικών γονιδίων

3. Ογκογονίδια και πρωτο-ογκογονίδια Μηχανισμοί ενεργοποίησης των πρωτο-ογκογονιδίων Ομάδες των πρωτο-ογκογονιδίων και των ογκογονιδίων και λειτουργίες τους

4. Ογκοκατασταλτικά γονίδια Γενικές δράσεις των ογκοκατασταλτικών γονιδίων Επιδιόρθωση του DNA, ακεραιότητα του DNA και καταστολή όγκων Η πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (pRb) ως ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη Ο γονιδιακός τόπος p16ink4a και η καταστολή όγκων Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 Άλλα ογκοκατασταλτικά γονίδια

17ο

514

1. Γενικά χαρακτηριστικά δημιουργίας όγκων

Χαρακτηριστικά καρκινογόνων κυττάρων

Τα καρκινογόνα κύτταρα εμφανίζουν ιδιαίτερα χαρακτηριστικά συγκρινόμενα με τα φυσιολογικά κύτταρα. Κάποια γενετική βλάβη στο DNA του κυττάρου ή πιθανότερα μια ομάδα γενετικών βλαβών παρεμποδίζουν μια σειρά από φυσιολογικές κυτταρικές λειτουργίες και επιβάλλουν στο κύτταρο να αποκτήσει τον καρκινικό φαινότυπο και τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του όπως:

• δυνατότητα εκτέλεσης απεριόριστων μιτωτικών διαιρέσεων • αποτροπή της απόπτωσης παρόλη τη συσσώρευση βλαβών (μεταλλάξεων) στο DNA • απώλεια της ικανότητας να επικοινωνεί με τα γειτονικά κύτταρα • δυνατότητα να μην επηρεάζεται από εξωκυτταρικά μηνύματα ελέγχου του κυτταρικού

κύκλου • απώλεια της δυνατότητας διαφοροποίησης • αυξημένη ικανότητα για εισβολή σε γειτονικούς ιστούς και μετάσταση • αλλαγή σχήματος και μορφολογίας • δυνατότητα δημιουργίας αιμοφόρων αγγείων (αγγειογένεση). Αποφασιστικό ρόλο στην καρκινογένεση παίζει η απενεργοποίηση κάποιων γονιδίων

(ογκοκατασταλτικά), τα οποία φαίνεται να έχουν ανασταλτική δράση στην όλη διαδικασία, ενώ ανάλογης σημασίας είναι και η ενεργοποίηση άλλων γονιδίων (από ανενεργά πρωτοογκογονίδια μετατρέπονται σε ενεργά ογκογονίδια), των οποίων η δράση προκαλεί άμεσα ή έμμεσα τις κατάλληλες προϋποθέσεις για το μετασχηματισμό του κυττάρου. Αυτός είναι άλλωστε ο λόγος για τον οποίο η έρευνες εστιάζουν πλέον στην ανίχνευση και την εκτενή μελέτη της δράσης των γονιδίων που ανήκουν στις παραπάνω δύο κατηγορίες

Γενετικές αλλαγές στα καρκινογόνα κύτταρα

Η ογκογένεση είναι μια αργή και πολύπλοκη πολλαπλών βημάτων διαδικασία, στην πορεία της οποίας τα κύτταρα χάνουν τον έλεγχο των μηχανισμών ρύθμισης της αύξησης. Οι επακόλουθοι ανεξέλεγκτοι πολλαπλασιασμοί οδηγούν στη σταδιακή συσσώρευση αλλαγών στο DNA, οι οποίες περνούν από το μητρικό στο θυγατρικό κύτταρο σε κάθε μιτωτική διαίρεση. Οι μεταλλάξεις που έχουν παρατηρηθεί σε όγκους περιλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα από αναδιοργανώσεις και αλλαγές των γενετικών πληροφοριών. Το μέγεθος των αλλαγών αυτών μπορεί να ποικίλλει. Στα πρώιμα στάδια εντοπίζονται απλές μεταλλάξεις όπως:

• Απλές αντικαταστάσεις βάσεων • Προσθήκες ή ελλείμματα βάσεων • Αντιστροφές ή διπλασιασμοί μικρών αλληλουχιών βάσεων.

Οι μεταλλάξεις αυτές μπορεί να οδηγήσουν σε αλλαγές γονιδίων με προϊόντα τα οποία εμπλέκονται σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος και στη ρύθμιση της αύξησης. Σε προχωρημένα στάδια της δημιουργίας όγκων, προκαλείται μια γενικευμένη γενετική

αστάθεια στο επίπεδο των χρωμοσωμάτων, ειδικά με τη μορφή μιας αλλαγής στον φυσιολογικό αριθμό των χρωμοσωμάτων. Έχουν παρατηρηθεί:

• Απώλεια ή διπλασιασμός ολόκληρων χρωμοσωμάτων • Πολλαπλασιασμός ομάδων χρωμοσωμάτων • Μετατοπίσεις χρωμοσωμάτων: απώλεια, πρόσθεση ή ανταλλαγή μεμονωμένων

χρωμοσωμάτων • Ενίσχυση αλληλουχιών DNA.

515

Αλλαγές στη δομή των χρωμοσωμάτων συχνά παρατηρούνται σε καρκίνους του αιμοποιητικού, όπως λευχαιμίες και λεμφώματα, αλλά και στα προχωρημένα στάδια των επιθετικών στερεών όγκων. Αυτή η εκτεταμένη αναδιοργάνωση έχει μεγάλες συνέπειες στη φυσιολογική συμπεριφορά του κυττάρου.

Αλλαγές στον τρόπο μεθυλίωσης

Εκτός από τις αλλαγές στο περιεχόμενο της πληροφορίας του DNA, κατά τη διάρκεια δημιουργίας όγκων παρατηρούνται και αλλαγές στον τρόπο μεθυλίωσης του DNA. Ο τρόπος μεθυλίωσης των αλληλουχιών CpG είναι σημαντικό εργαλείο στη ρύθμιση της μεταγραφής στους ευκαριώτες. Αλλαγή στον τρόπο μεθυλίωσης επιφέρει αλλαγές στον τρόπο έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων. Είναι λοιπόν σημαντικό ότι τρόπος μεθυλίωσης κληρονομείται στα θυγατρικά κύτταρα κατά την κυτταρική διαίρεση.

Αιτίες των καρκινογόνων μεταλλάξεων

Οι αιτίες που μπορεί να προκαλέσουν τις προαναφερόμενες μεταλλάξεις είναι ποικίλες και μπορεί να οφείλονται είτε σε εξωγενείς είτε σε ενδογενείς παράγοντες. 1/ Ενδογενείς παράγοντες Υπάρχουν πολλές ενδογενείς διαδικασίες που μπορούν να προκαλέσουν αλλαγές στις πληροφορίες που περιέχονται στο DNA. Αυτές οι διαδικασίες είναι αναπόσπαστα χαρακτηριστικά του οργανισμού και επηρεάζονται ελάχιστα από εξωτερικούς παράγοντες. Αυτές οι διαδικασίες είναι:

• Τα λάθη κατά την αντιγραφή του γονιδιώματος, καθότι η πιστότητα της δράσης της πολυμεράσης δεν είναι απόλυτη. Ο ρυθμός προσθήκης αταίριαστων νουκλεοτιδίων που ξεφεύγουν από την επιδιορθωτική διαδικασία και επομένως παραμένουν σαν μεταλλάξεις είναι πολύ μικρός, της τάξεως του ενός λάθους ανά 1.000.000-100.000.000 σωστά ταιριασμένα νουκλεοτίδια.

• Οι σημειακές μεταλλάξεις που συμβαίνουν αυθόρμητα στο DNA, λόγω της περιορισμένης του ευστάθειας σε μικρές αλλαγές του pH και της θερμοκρασίας. Σε αυτές τις περιπτώσεις συχνές είναι οι αποσχίσεις βάσεων πουρινών, με τα απουρινικά τμήματα που προκύπτουν να μπορούν να δώσουν γένεση σε μεταλλάξεις αν δεν διορθωθούν έγκαιρα.

• Μεταλλάξεις του DNA που προέρχονται από προϊόντα του μεταβολισμού και κυρίως από τις ελεύθερες ρίζες και μάλιστα τις ενεργές ρίζες οξυγόνου. Υπάρχουν όμως και άλλοι χημικοί παράγοντες που μπορούν να αντιδράσουν με το DNA και να προκαλέσουν μεταλλάξεις και οι οποίοι είτε εισέρχονται στον οργανισμό απευθείας με την τροφή είτε δημιουργούνται μετά από την επεξεργασία χημικών παραγόντων στο ήπαρ.

2/ Εξωγενείς παράγοντες

Ένας αριθμός εξωτερικών παραγόντων μπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή του DNA και συνεπώς σε μεταλλάξεις. Αυτοί περιλαμβάνουν την επικίνδυνη επίδραση καρκινογόνων χημικών και βλαβερές ακτινοβολίες όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, οι ακτίνες-Χ και άλλες ραδιενεργές ακτινοβολίες. Ένας άλλος εξωτερικός παράγοντας που μπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή του DNA είναι οι ογκογόνοι RNA- ή DNA-ιοί, οι οποίοι μπορούν να προκαλέσουν καρκινογένεση με πολλούς μηχανισμούς.

Ένας βασικός μηχανισμός είναι η ενσωμάτωση του ιού στο κυτταρικό γονιδίωμα σε τέτοιο σημείο ώστε η ρύθμιση της έκφρασης ενός πρωτοογκογονιδίου να τεθεί υπό τον έλεγχο ενός ισχυρού ιικού προαγωγέα. Συχνά όμως η απλή έκφραση ενός ιικού γονιδίου είναι

516

αρκετή για την πρόκληση του μετασχηματισμού επειδή η ογκοπρωτεΐνη αντιδρά με άλλες κυτταρικές πρωτεΐνες ενεργοποιώντας ή απενεργοποιώντας τις με ίδιο πάντα αποτέλεσμα την απώλεια ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Επίσης έχουν βρεθεί ενσωματωμένα ογκογονίδια σε DNA ιών, τα οποία ήταν πρώην κυτταρικά πρωτοογκογονίδια και αποσχίστηκαν μαζί με το ιικό DNA στο τέλος του λυτικού κύκλου. Απλή έκφραση των γονιδίων αυτών μπορεί να προκαλέσει ογκογένεση άμεσα.

Τα ογκογονίδια ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά μετά από μελέτες σε ογκογόνους ιούς όταν διαπιστώθηκε η εκπληκτική ομοιότητα στην αλληλουχία των ιικών ογκογονιδίων με κυτταρικά πρωτοογκογονίδια. Τέτοια παραδείγματα είναι τα ιικά γονίδια v-src και v-sis, πρώην κυτταρικά πρωτοογκογονίδια c-src και c-sis. Το c προέρχεται από τα αρχικά του cellular και το v από το viral.

Επιδιόρθωση του DNA και δημιουργία όγκων

Όπως προαναφέρθηκε, η καρκινογένεση έχει γενετική βάση, οφείλεται δηλαδή σε ένα συνδυασμό γενετικών βλαβών. Είναι λοιπόν ζωτικής σημασίας η προστασία του γονιδιώματος από μεταλλάξεις, κάτι που προϋποθέτει την άρτια λειτουργία του μηχανισμού επιδιόρθωσης του κυττάρου. Είναι μάλιστα γεγονός ότι κάθε κύτταρο του ανθρώπινου οργανισμού (όπως και όλων των οργανισμών) κατέχει ένα πλήρες, άκρως αποτελεσματικό και σχεδόν αλάνθαστο σύστημα επιδιόρθωσης του DNA στο οποίο συμμετέχουν πολλά ένζυμα. Μέρη αυτού του συστήματος είναι το ενζυμικό σύστημα αποκοπής-επιδιόρθωσης, το επιδιορθωτικό σύστημα κακοταιριάσματος (mispairing) και οι αλκυλ-τρανσφεράσες.

Από τα παραπάνω λοιπόν μπορούμε εύκολα να συμπεράνουμε ότι τα παραπάνω ένζυμα ενεργούν και ως φύλακες του γονιδιώματος και αναστολείς όγκων και επομένως μια μετάλλαξη σε αυτά τα ένζυμα θα προκαλούσε δυσκολίες στην επιδιόρθωση του DNA, συνεπώς θα καθιστούσε το κύτταρο πιο ευαίσθητο σε μεταλλαξιγόνους παράγοντες και τελικά θα έκανε πιο επίφοβη την πιθανότητα της ογκογένεσης. Μεταλλαγμένες ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες συχνά συσχετίζονται με κληρονομική προδιάθεση για δημιουργία όγκων (κληρονομικό καρκινικό σύνδρομο) και πολλές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του κατεστραμμένου DNA είναι ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες.

Αυτές οι παρατηρήσεις στηρίζουν τη θεωρία, ότι σε ένα αρχικό στάδιο της δημιουργίας όγκου συμβαίνει μια μετάλλαξη σε ένα σύστημα επιδιόρθωσης, απαραίτητο για τη διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος. Η απώλεια λειτουργίας του συστήματος επιδιόρθωσης ευνοεί τη συσσώρευση επιπλέον μεταλλάξεων οδηγώντας στην αστάθεια του γονιδιώματος. Ωστόσο, γενετική αστάθεια λόγω καταστροφής ενός συστήματος επιδιόρθωσης έχει παρατηρηθεί σε ορισμένους μόνο καρκίνους. Στην πλειονότητα των καρκίνων, παρατηρείται αστάθεια στο επίπεδο των χρωμοσωμάτων, η οποία φανερώνεται με μια απώλεια ή κέρδος ολόκληρου του χρωμοσώματος. Αυτή η αστάθεια συνδέεται με μια δυσλειτουργία των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου.

Κυτταρική διαίρεση και δημιουργία όγκων

Η κυτταρική διαίρεση παίζει μια κεντρική λειτουργία στη δημιουργία όγκων. Μια προ-καρκινική καταστροφή στο DNA, όπως η δημιουργία μιας επιπλέον βάσης που οδηγεί στην παραγωγή ενός καρκινικού συστατικού, μπορεί τότε μόνο να οδηγήσει σε μεταλλάξεις εάν το κύτταρο υποστεί ένα κύκλο κυτταρικής διαίρεσης με το κατεστραμμένο του DNA. Κατά την αντιγραφή του κατεστραμμένου DNA, υπάρχει μια επιπλέον πιθανότητα αλλαγών στην αλληλουχία του DNA, εκτός και αν το λάθος διορθωθεί πριν. Αυτές οι αλλαγές θα περάσουν τότε στις επόμενες γενιές ως μεταλλάξεις.

517

Επιπλέον, κάθε κύκλος κυτταρικής διαίρεσης περικλείει έναν πιθανό κίνδυνο επαναδιάταξης τμημάτων του χρωμοσώματος κατά τη διάρκεια της μίτωσης και συνεπώς ανωμαλίες στο χρωμόσωμα. Πειραματικές μελέτες συσχετισμού δόσης-αποτελέσματος διάφορων καρκινογόνων ουσιών έδειξαν ότι αυξημένη δραστηριότητα κυτταρικής διαίρεσης είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για τη δημιουργία όγκων.

2. ∆ραστηριότητα κυτταρικής διαίρεσης. Λάθη στη λειτουργία σηματοδοτικών πρωτεϊνών και δημιουργία όγκων

Η καταστροφή του DNA και οι συνεπακόλουθες μεταλλάξεις είναι τυχαία κατανεμημένες στο γονιδίωμα, γεγονός που μπορεί να επηρεάσει όλα τα γονίδια ενός οργανισμού με την ίδια πιθανότητα. Μέσα στα όρια της διαδικασίας της εξέλιξης ενός φυσιολογικού κυττάρου σε καρκινικό, ευνοούνται τα κύτταρα, των οποίων η ρύθμιση της φυσιολογικής αύξησης αναστέλλεται. Μεταλλάξεις γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της αύξησης ενός κυττάρου είναι συνεπώς ιδιαίτερης σημασίας για τη δημιουργία όγκων.

Το μέλλον ενός κυττάρου: διαίρεση, μη-διαίρεση, θάνατος

Ένα κύτταρο μπορεί να εισέλθει σε διάφορα στάδια ανάλογα με την ένταση και την ισορροπία των μιτογόνων και αντι-μιτογόνων σημάτων.

Εικόνα 17.1 Η μοίρα ενός κυττάρου. Τα

κύτταρα μπορούν να μετακινηθούν από μια κατάσταση ενεργούς διαίρεσης σε μια κατάσταση διαφοροποίησης ή σε μια κατάσταση ηρεμίας Go. Η μετάβαση στη φάση Go είναι αντιστρεπτή, ενώ τα διαφοροποιημένα κύτταρα συχνά δεν μπορούν να επιστρέψουν στην κατάσταση ενεργούς διαίρεσης. Το κύτταρο μπορεί να κατευθυνθεί και από τις τρεις καταστάσεις σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο ή απόπτωση.

Συνεχής κυτταρική διαίρεση: Συνεχής κυτταρική διαίρεση βρέθηκε για παράδειγμα στα βλαστικά κύτταρα, τα οποία χρησιμεύουν ως πρόδρομα άλλων κυττάρων και σε ιστούς στους οποίους πεθαμένα κύτταρα πρέπει να αντικατασταθούν. Αυτό απαιτεί τη συνεχή δράση μιτογόνων σημάτων. Σε αυτήν την περίπτωση, η κυτταρική διαίρεση πρέπει να εξασφαλίσει την ομοιόσταση της δομής του κυττάρου ή του ιστού.

Μετάβαση σε μια κατάσταση ηρεμίας: Απουσία εξωτερικών μιτογόνων σημάτων ή παρουσία αντι-μιτογόνων σημάτων, η κυτταρική διαίρεση μπορεί να σταματήσει. Το κύτταρο εισέρχεται σε μια φάση ηρεμίας (resting state, Go). Από τη φάση Go το κύτταρο μπορεί να ξαναμπεί στην κυτταρική διαίρεση όταν ξαναεμφανιστούν μιτογόνα σήματα.

518

Διαφοροποίηση των κυττάρων: Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης ενός οργανισμού, πολλά κύτταρα εισέρχονται σε μια φάση τελικής διαφοροποίησης κατά την οποία αποκτούν την εξειδικευμένη τους δράση. Τα διαφοροποιημένα κύτταρα προέρχονται από διαιρούμενα βλαστικά κύτταρα και μετά τη διαφοροποίησή τους χάνουν την ικανότητα διαίρεσης.

Απόπτωση: Μια άλλη οδός που μπορεί να ακολουθήσει το κύτταρο είναι ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος ή απόπτωση. Πολλοί και διαφορετικοί μπορούν να οδηγήσουν σε απόπτωση, μερικοί από τους οποίους είναι συστατικά των μιτογόνων ή αντι-μιτογόνων μονοπατιών

Ορισμός και γενική δράση των ογκογονιδίων και των ογκοκατασταλτικών γονιδίων

Τα μιτογόνα σήματα που χρησιμοποιεί ο οργανισμός για τη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης λαμβάνονται από ανάλογους υποδοχείς και μετατρέπονται σε ενδοκυτταρικές σηματοδοτικές αλυσίδες. Τα σήματα τελικά συναντούν το μηχανισμό ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου. Εδώ αποφασίζεται αν η κυτταρική διαίρεση θα συμβεί ή όχι. Είναι συνεπώς αναμενόμενο ότι μεταλλάξεις που συσσωρεύονται σε μια διαδικασία πολλών βημάτων κατά τη μετάβαση ενός φυσιολογικού κυττάρου σε ένα καρκινικό, θα είναι κυρίως ορατές σε γονίδια που συμμετέχουν στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Όπως ήδη έχουμε δει πολλές πρωτεΐνες εμπλέκονται στη μετατροπή των εξωτερικών σημάτων στο επίπεδο του κεντρικού μηχανισμού του κυτταρικού κύκλου (CDKs, cyclins, CDIs).

Η συμπεριφορά αύξησης ενός φυσιολογικού κυττάρου καθορίζεται από μια σχέση εξισορρόπησης ανάμεσα σε θετικές πολλαπλασιαστικές επιδράσεις και αρνητικές αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις, η οποία είναι προσαρμοσμένη στη λειτουργία του κυττάρου μέσα στον οργανισμό. Ελαττώματα στην κυτταρική διαίρεση μπορούν να προέλθουν από λάθη των θετικών αλλά και των αρνητικών σημάτων. Αν τα πολλαπλασιαστικά σήματα είναι υπερβολικά ενεργά, το κύτταρο έχει ένα αυξητικό πλεονέκτημα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα και ευνοείται η δημιουργία όγκων. Στο ίδιο αποτέλεσμα καταλήγουμε αν ελαττωθεί η δραστηριότητα των αντι-μιτογόνων μονοπατιών.

Λόγω του μεγάλου αριθμού των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο δίκτυο της ρύθμισης της κυτταρικής αύξησης, δεν είναι περίεργο ότι έχουν αναγνωριστεί πολλά γονίδια, τα οποία όταν μεταλλάσσονται οδηγούν σε εσφαλμένη ρύθμιση της αύξησης και συνδυάζονται με τη δημιουργία όγκων. Τα μεταλλαγμένα γονίδια χωρίζονται σε ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια.

Κυτταρικά και ιϊκά ογκογονίδια. Πρωτο-ογκογονίδια Ο όρος ογκογονίδιο προήλθε από την έρευνα για στοιχεία των ρετρο-ιών που προκαλούν

καρκίνο. Οι ρετροϊοί περιέχουν RNA ως γενετικό υλικό και μπορούν να μεταγράφουν RNA σε DNA, με τη βοήθεια ενός ενζύμου τους, της αντίστροφης μεταγραφάσης. Η DNA μορφή των ρετροϊών μπορεί να ενσωματωθεί στο DNA των κυττάρων του ξενιστή, και κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης περνάει στα θυγατρικά κύτταρα ως προ-ιός. Από τον προ-ιό μπορούν να σχηματιστούν το ιϊκό RNA και πλήρη τμήματα του ιού.

Ορισμένοι αντιπροσωπευτικοί ρετροϊοί προκαλούν καρκίνους σε ζώα, όπως τα ποντίκια και τα κοτόπουλα. Η ανακάλυψη των ογκογονιδίων ξεκίνησε από το γονίδιο src του Rous sarcoma virus, το οποίο αναγνωρίστηκε ως το υπεύθυνο στοιχείο του ιού για την πρόκληση όγκων. Το γονίδιο src κωδικοποιεί την κινάση τυροσίνης Src. Τα τμήματα των γονιδίων των ρετροϊών υπεύθυνα για τη δημιουργία όγκων ονομάστηκαν ογκογονίδια.

Λίγο μετά την ανακάλυψη του πρώτου ογκογονιδίου, δείχθηκε ότι τα ιϊκά ογκογονίδια είναι μεταλλαγμένες μορφές γονιδίων κυτταρικών πρωτεϊνών, οι οποίες είναι επίσης ενεργές στα φυσιολογικά κύτταρα. Οι κυτταρικές παραλλαγές των ιϊκών ογκογονιδίων ονομάστηκαν

519

πρωτο-ογκογονίδια. Τα ογκογονίδια των ρετροϊών έχουν ως πρόθεμα ένα v (πχ v-src, v-sis), ενώ τα αντίστοιχα πρωτο-ογκογονίδια έχουν ως πρόθεμα ένα c (πχ c-src, c-sis).

Επιπλέον έρευνες έδειξαν ότι τα πρωτο-ογκογονίδια μπορούν επίσης να μετατραπούν, μέσω ενεργών μεταλλάξεων, σε ογκογονίδια χωρίς τη συμμετοχή των ιών. Η χρήση του όρου ογκογονίδιο έκτοτε εξαπλώθηκε και ο όρος είναι πλέον πιο γενικός.

Τα ογκογονίδια είναι γονίδια που προέρχονται από ενεργή μετάλλαξη των πρόδρομών τους, των πρωτο-ογκογονιδίων και έχουν ως αποτέλεσμα ένα μεταλλαγμένο ή αθάνατο φαινότυπο. Τα πρωτο-ογκογονίδια συχνά εμπλέκονται άμεσα στη ρύθμιση της αύξησης των φυσιολογικών κυττάρων. Τα ογκογονίδια έχουν γενικά ένα κυρίαρχο χαρακτήρα. Η μετάλλαξη ενός πρωτο-ογκογονιδίων σε ογκογονίδιο είναι φαινοτυπικά εμφανής όταν μόνο ένα από τα δυο αντίγραφα του γονιδίου σε ένα διπλοειδές χρωμόσωμα υφίσταται μετάλλαξη. Η κυρίαρχη μετάλλαξη συνοδεύεται από μια αύξηση της δραστικότητας (gain-of-function), η οποία ενισχύει τη ρύθμιση της κυτταρικής αύξησης.

Ογκοκατασταλτικά γονίδια Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια είναι γονίδια που έχουν μια αρνητική, κατασταλτική

δράση στη δημιουργία όγκων. Οι μεταλλάξεις των ογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι συχνά υποτελείς. Μετά από μετάλλαξη του ενός αλληλόμορφου, το ανέπαφο αλληλόμορφο του άλλου χρωμοσώματος συνεχίζει την ογκοκατασταλτική του δράση. Μόνο όταν και τα δυο αλληλόμορφα απενεργοποιούνται, η ογκοκατασταλτική δράση παύει να υφίσταται. Ωστόσο, η μετάλλαξη ακόμη και ενός μόνο αλληλόμορφου οδηγεί σε δημιουργία όγκων.

Ωστόσο οι όροι ογκογονίδιο ή ογκοκατασταλτικό γονίδιο δεν δίνουν καμιά πληροφορία για τη δράση του γονιδίου ή την πρωτεΐνη την οποία κωδικοποιεί.

Κυτταρικά συστήματα για τη μελέτη της λειτουργίας των ογκογονιδίων και των ογκοκατασταλτικών γονιδίων

Η δράση των ογκογονιδίων και των ογκοκατασταλτικών γονιδίων γενικά μελετήθηκε σε καθορισμένες κυτταρικές σειρές. Αυτές χρησιμεύουν σαν μοντέλα συστημάτων στα οποία μπορούν να μελετηθούν μεμονωμένες πλευρές της δημιουργίας όγκων.

Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται διαφέρουν σε πολλά σημεία από τα ανθρώπινα σωματικά κύτταρα. Ανθρώπινα κύτταρα που πάρθηκαν από φυσιολογικό ιστό μπορούν να διατηρηθούν σε πρωτογενή καλλιέργεια με την προσθήκη των απαραίτητων θρεπτικών έχοντας όμως μια περιορισμένη ικανότητα διαίρεσης. Για παράδειγμα, κύτταρα ανθρώπινων ινοβλαστών σταματούν να διαιρούνται μετά από 50-60 διαιρέσεις και εισέρχονται σε μια κατάσταση γνωστή ως κυτταρική γήρανση. Σε αντίθεση, κύτταρα που προέρχονται από έναν όγκο έχουν μια απεριόριστη ικανότητα διαίρεσης σε κυτταρική καλλιέργεια.

Ο μετασχηματισμός ενός φυσιολογικού κυττάρου σε καρκινικό σημειώνεται από την εμφάνιση ορισμένων χαρακτηριστικών:

• Τα μετασχηματισμένα κύτταρα είναι αθάνατα, δηλαδή δε μπορούν να καταστραφούν με απόπτωση.

• Χρειάζονται μικρότερη ποσότητα αυξητικών παραγόντων για να πολλαπλασιαστούν (στα αρχικά στάδια, καθότι στο τελικό καρκινικό στάδιο δεν χρειάζονται την ύπαρξη των αυξητικών παραγόντων για τον πολλαπλασιασμό τους).

• Αλλάζει το σχήμα και η μορφολογία τους. • Παρατηρείται ανάπτυξη κυττάρων γύρω από έναν αρχικό μικρότερο πυρήνα

κυττάρων (foci), που και αυτός δημιουργήθηκε από τον κλωνικό πολλαπλασιασμό ενός μόνο αρχικού μετασχηματισμένου κυττάρου. Τέτοια συσσωματώματα δεν παρατηρούνται σε φυσιολογικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές.

520

• Παρατηρείται απώλεια της αναστολής του πολλαπλασιασμού μέσω επαφής με γειτονικό φυσιολογικό κύτταρο, γεγονός που προκύπτει από την αδυναμία επικοινωνίας του καρκινικού κυττάρου με τα γειτονικά κύτταρα, πιθανώς λόγω της καταστροφής των χασμοσυνδέσμων.

Η σημασία της χρήσεως του συστήματος της καλλιέργειας ανθρώπινων καρκινικών

σειρών για διερευνητικούς σκοπούς φαίνεται από το γεγονός ότι πολλά από τα μεταλλαγμένα ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικά γονίδια που ανιχνεύτηκαν σε αυτές τις κυτταρικές σειρές έχουν βρεθεί με τις ίδιες μεταλλάξεις σε όγκους ποντικών αλλά και ανθρώπων, και άρα η όλη διαδικασία αποκτά μια αξιοπιστία όσον αφορά τα αποτελέσματά της. Η μέθοδος όμως έχει και αρκετά μειονεκτήματα: τα είδη των όγκων είναι πολλά και σε καθένα από αυτά συμβαίνουν συγκεκριμένες γενετικές αλλαγές που μάλιστα πραγματοποιούνται με καθορισμένη σειρά. Ο αριθμός των απαιτούμενων γενετικών μεταλλάξεων, το ποια ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια ενεργοποιούνται / απενεργοποιούνται και με ποια σειρά σε κάθε συγκεκριμένο είδος όγκου, είναι πληροφορίες που δε μπορούν να αποκτηθούν από τα ανθρώπινα κυτταρικά μοντέλα.

3. Ογκογονίδια και πρωτο-ογκογονίδια

Η πλειοψηφία των πρωτο-ογκογονιδίων κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη μεταγωγή μιτογόνων σημάτων με έμμεσο ή άμεσο τρόπο. Η ενεργοποίηση ενός πρωτο-ογκογονιδίου σε ογκογονίδιο οδηγεί σε αύξηση της δραστικότητας της πρωτεΐνης και κατά συνέπεια και της κυτταρικής αύξησης. Σε ένα κυτταρικό σύστημα η ενεργοποίηση εκδηλώνεται με τη μετατροπή του κυττάρου σε αθάνατο, με την ελάττωση των αναγκών του σε αυξητικούς παράγοντες και με απώλεια της αναστολής λόγω επαφής.

Μηχανισμοί ενεργοποίησης των πρωτο-ογκογονιδίων

Η ενεργοποίηση ενός πρωτο-ογκογονιδίου σε ογκογονίδιο βασίζεται σε μεταλλάξεις που μπορούν να αλλάξουν τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Δυο μηχανισμοί ενεργοποίησης μπορούν να συμβούν. Από τη μια πλευρά να επηρεαστεί η δομή της κωδικοποιούμενης πρωτεΐνης και από την άλλη, η ενεργοποίηση μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης.

521

Εικόνα 17.2 Μηχανισμοί ενεργοποίησης των πρωτο-ογκογονιδίων σε ογκογονίδια. Τα πρωτο-

ογκογονίδια μπορούν να μετατραπούν σε ογκογονίδια είτε μέσω ενός μονοπατιού που οδηγεί σε αύξηση της συγκέντρωσης είτε μέσω ενός μονοπατιού που οδηγεί σε δομικές αλλαγές. Στην περίπτωση της αύξησης της συγκέντρωσης υπάρχει μια υπερβολική και απρογραμμάτιστη λειτουργία της σηματοδοτικής πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το πρωτο-ογκογονίδιο. Στην περίπτωση της δομικής αλλαγής, η πολλαπλασιαστική δραστηριότητα της ογκοπρωτεΐνης προκαλείται από την αλλαγή της δραστικότητας, την αλλαγή της ρύθμισης ή τη δημιουργία μιας χιμαιρικής πρωτεΐνης.

1. Ενεργοποίηση μέσω δομικών αλλαγών Μια συχνή αιτία ενεργοποίησης ενός πρωτο-ογκογονιδίου είναι μια αλλαγή της δομής

της κωδικοποιούμενης πρωτεΐνης, που επηρεάζει τη ρύθμιση και τη λειτουργία της. Μέσω της ογκογόνας ενεργοποίησης, δεν δημιουργούνται καινούριες λειτουργίες αλλά τροποποιείται η φυσιολογική λειτουργία ενός πρωτο-ογκογονιδίου και/ή ξεφεύγει από την κυτταρική ρύθμιση.

Το φάσμα των δομικών μεταλλάξεων που μπορούν να μετατρέψουν ένα πρωτο-ογκογονίδιο σε ογκογονίδιο είναι ποικίλο, από απλές αλλαγές αμινοξέων στην κωδικοποιούμενη πρωτεΐνη μέχρι μεγαλύτερες δομικές αλλαγές.

Αύξηση της δραστικότητας σηματοδοτικών πρωτεϊνών: Σημειακές μεταλλάξεις μπορούν άμεσα να επηρεάσουν την ενζυμική δραστικότητα μιας σηματοδοτικής πρωτεΐνης. Ο μηχανισμός ογκογόνων σημειακών μεταλλάξεων έχει καλύτερα μελετηθεί στην πρωτεΐνη Ras. Για παράδειγμα, οι σημειακές μεταλλάξεις στις θέσεις 12 και 13 στη μικρή GΤΡάση Ras, οι οποίες παρατηρούνται σε στερεούς όγκους, έχουν ως αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση της δομής Ras-GTP (που καθιστά την πρωτεΐνη Ras ιδιοσύστατα ενεργή) και δυσκολεύει την υδρόλυση του GTP σε GDP και το σχηματισμό της ανενεργής Ras-GDP μορφής. Έτσι, η Ras πρωτεΐνη υπερλειτουργεί και προκαλεί μια αυξημένη διέγερση του μονοπατιού Ras-MAPK, το οποίο οδηγεί σε αύξηση της κυτταρικής διαίρεσης.

522

Αλλαγή στη ρύθμιση των σηματοδοτικών πρωτεϊνών: Μεταλλάξεις μπορούν να οδηγήσουν σε απώλεια του κυτταρικού ελέγχου πάνω στη δραστικότητα του πρωτο-ογκογονιδίου. Συνήθως αυτόοδηγεί σε ιδιοσύστατη ενεργοποίηση της σηματοδοτικής πρωτεΐνης. Μια τέτοια περίπτωση είναι αυτή της Raf κινάσης : Η ιική πρωτεΐνη v-Raf έχει χάσει το Ν-τελικό άκρο της, φωσφορυλίωση (και αυτοφωσφορυλίωση) του οποίου θα είχε φυσιολογικά ως αποτέλεσμα τη μετάβαση της πρωτεΐνης στην ανενεργό μορφή της. Έτσι η κινάση δρα ασταμάτητα και μεταφέρει μηνύματα κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Σχηματισμός χιμαιρικών πρωτεϊνών: Σε πολλούς όγκους, μια αμοιβαία ανταλλαγή παρατηρείται σε τμήματα του DNA από διαφορετικά χρωμοσώματα. Από μεταθέσεις κομματιών DNA των χρωμοσωμάτων θα μπορούσε να συμβεί μεταφορά και συγχώνευση γονιδίων. Η προκύπτουσα χιμαιρική πρωτεΐνη θα μπορούσε να διατηρήσει τη δράση μιας τουλάχιστον εκ των δύο αρχικών πρωτεϊνών χάνοντας παράλληλα την ενεργότητα της ρυθμιστικής της περιοχής, λόγω δομικής αλλαγής στην περιοχή αυτή. Τέτοιες περιπτώσεις συμβαίνουν με κινάσες τυροσίνης και διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες. Συνήθως η παρουσία μιας χιμαιρικής πρωτεΐνης είναι αντιπροσωπευτική ενός συγκεκριμένου είδους όγκου.

2. Ενεργοποίηση μέσω αύξηση της συγκέντρωσης Μια αλλαγή στη έκφραση του γονιδίου ή στη σταθερότητα του προϊόντος του πρωτο-ογκογονιδίου μπορεί να οδηγήσει σε μια αύξηση της κυτταρικής συγκέντρωσης της πρωτεΐνης. Λόγω της αυξημένης συγκέντρωσης, ένα μιτογόνο σήμα που μεσολαβείται από το προϊόν ενός πρωτο-ογκογονιδίου μπορεί να ενισχυθεί.

Υπερέκφραση των πρωτο-ογκογονιδίων: Η υπερέκφραση πρωτεϊνών που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό μπορούν να καταστήσουν το κύτταρο αθάνατο και/ή να μετασχηματίσουν την κυτταρική σειρά. Υπερέκφραση σηματοδοτικών πρωτεϊνών παρατηρούνται σε πολλούς καρκίνους και θεωρείται ότι η υπερέκφραση συνδέεται με την παθογένεση του καρκίνου. Οι μηχανισμοί που οδηγούν στην υπερέκφραση είναι ποικίλοι.

Εάν μετά από χρωμοσωμικές μεταθέσεις ένα πρωτοογκογονίδιο βρεθεί σε μια θέση μετά από ένα άλλο γονίδιο αλλά πολύ κοντά σε αυτό, τόσο ώστε να εξαρτάται από τον προαγωγέα του ξένου γονιδίου. Σαν αποτέλεσμα, εάν ο προαγωγέας του ξένου γονιδίου είναι αρκετά ισχυρός, το πρωτοογκογονίδιο υπερεκφράζεται και μετατρέπεται σε ενεργό ογκογονίδιο. Ένα παράδειγμα είναι η μεταφορά του πρωτοογκογονιδίου c-myc σε περιοχή που βρίσκεται κάτω από την επίδραση ενός ισχυρού προαγωγέα των ανοσοσφαιρινών, με αποτέλεσμα την πρόκληση του λεμφώματος Burkitt. Παρόμοιες περιπτώσεις με υπερέκφραση λόγω χρωμοσωμικών μεταθέσεων έχουν βρεθεί και σε λευχαιμίες.

Ή σταθεροποίηση του mRNA ενός πρωτο-ογκογονιδίου με αποκοπές στο 3΄άκρο μπορεί επίσης να οδηγήσει σε υπερέκφραση, όπως συμβαίνει για την κυκλίνη D1.

Άλλος ένας μηχανισμός πρόκλησης καρκινογένεσης που βασίζεται στην απορύθμιση της μεταγραφής των αυξητικών παραγόντων είναι η δημιουργία αυτοκρινών βρόγχων (autocrine loops). Κατά τη διάρκεια της δημιουργίας του όγκου, απρογραμμάτιστη έκφραση των αυξητικών παραγόντων μπορεί να συμβεί σε κύτταρα στα οποία φυσιολογικά οι πρωτεΐνες αυτές εκφράζονται λίγο ή και καθόλου. Εάν αυτά τα κύτταρα εκφράζουν τους αντίστοιχους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, οι αυξητικοί παράγοντες συνδέονται και επάγουν την κυτταροκή διαίρεση. Το κύτταρο δεν εξαρτάται πλέον από έναν εξωτερικό αυξητικό παράγοντα, αλλά παράγει το δικό του, ελέγχοντας την κυτταρική του διαίρεση με τρόπο παρόμοιο με αυτόν των κυττάρων του ανοσοποιητικού από τα αντιγόνα. Μια αυτοκρινής θηλιά ενεργοποιείται οδηγώντας σε ανεξέλεγκτη κυτταρική αύξηση.

523

Εικόνα 17.3 Αυτοκρινής βρόγχος κατά τη δημιουργία όγκου. Λόγω ενός λάθους στη ρύθμιση της

μεταγραφής, αυξητικοί παράγοντες μπορούν να παραχθούν και να εκκριθούν από το κύτταρο, το οποίο σε φυσιολογικές συνθήκες παράγει λίγους ή καθόλου. Εάν το κύτταρο έχει και ανάλογους υποδοχείς, οι αυξητικοί παράγοντες ενεργοποιούν ένα μιτογόνο σήμα. Υπάρχει πιθανότητα οι αυξητικοί παράγοντες να μπορούν να ενεργοποιήσουν μιτογόνα μονοπάτια δρώντας και ενδοκυτταρικά. Ο μηχανισμός όμως παραμένει άγνωστος.

Ενίσχυση των γονιδίων σηματοδοτικών πρωτεϊνών: Ένας άλλος παράγοντας που

συνδέεται στενά με τη δημιουργία όγκων είναι αύξηση του αριθμού των αντιγράφων ενός γονιδίου μιας σηματοδοτικής πρωτεΐνης (gene dose effect). Σε ορισμένους καρκίνους παρατηρείται ενίσχυση γονιδίων των οποίων τα προϊόντα παίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της αύξησης.

Ομάδες των πρωτο-ογκογονιδίων και των ογκογονιδίων και λειτουργία τους

Ένα εξωκυτταρικό σήμα (όπως τα μιτωτικά σήματα) μεταφέρεται και ερμηνεύεται στο εσωτερικό ενός κυττάρου με τη βοήθεια ενός πολύπλοκου, σύνθετου συστήματος. Συνήθως το σήμα αυτό είναι μια ορμόνη-αυξητικός παράγοντας η οποία προσδένεται σε έναν συγκεκριμένο και απόλυτα εξειδικευμένο πρωτεϊνικό υποδοχέα και τον ενεργοποιεί. Ο υποδοχέας αυτός μπορεί να είναι υποδοχέας κινάσης τυροσίνης, υποδοχέας κινάσης σερίνης-θρεονίνης ή υποδοχέας G πρωτεϊνών. Τότε ακολουθεί ένας καταρράκτης αντιδράσεων όπου μια πρωτεΐνη ενεργοποιεί μια άλλη (συνήθως με φωσφορυλίωση, ενώ έχουμε και περιπτώσεις συμμετοχής μικρών G πρωτεϊνών στα μονοπάτια) ώσπου μια πρωτεΐνη θα ενεργοποιήσει τελικά ένα μεταγραφικό παράγοντα στον πυρήνα. Ο τελευταίος θα προκαλέσει μεταγραφή ενός συγκεκριμένου γονιδίου, και στην περίπτωση που το αρχικό σήμα είναι μιτωτικό (όπως ένας αυξητικός παράγοντας) θα προκληθεί ενεργοποίηση της διαδικασίας προώθησης του κυτταρικού κύκλου στη φάση M. Επίσης υπάρχουν εξωκυτταρικά σήματα-στεροειδείς ορμόνες που λόγω της υδρόφοβης φύσης τους διαπερνούν τις μεμβράνες χωρίς να συνδέονται σε υποδοχέα και ενεργοποιούν κατευθείαν μεταγραφικούς παράγοντες στον πυρήνα. Είναι λοιπόν κατανοητό πως η απορύθμιση του κυτταρικού κύκλου μπορεί να γίνει αν μεταβληθεί η δράση μιας οποιασδήποτε από τις προαναφερόμενες εμπλεκόμενες πρωτεΐνες, δηλαδή:

• του εξωκυτταρικού σήματος

524

• του υποδοχέα • των πρωτεϊνών του μονοπατιού μεταγωγής σήματος (π.χ. κινάσες και G πρωτεΐνες) • του μεταγραφικού παράγοντα • βέβαια η ογκογόνος μετάλλαξη θα μπορούσε ακόμα να συμβεί κατευθείαν στο γονίδιο

στόχο του μεταγραφικού παράγοντα

Πιο συγκεκριμένα τα πρωτοογκογονίδια μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ως εξής:

α) Γονίδια αυξητικών παραγόντων. Τέτοιο παράδειγμα είναι το ογκογονίδιο sis. Το ιϊκό ογκογονίδιο v-sis κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που έχει περίπου 90% ομολογία με τη β-αλυσίδα του κυτταρικού αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από τα αιμοπετάλια (platelet derived growth factor, PDGF-β) Η υπερέκφραση του PDGF-β οδηγεί σε μετασχηματισμό του κυττάρου με αυτοκρινή ή με παρακρινή βρόγχο.

β) Γονίδια υποδοχέων κινασών τυροσίνης. Υπάρχουν πολλά παραδείγματα ογκογονιδίων που κωδικοποιούν για μεταλλαγμένες μορφές υποδοχέων κινασών τυροσίνης. Σε αυτήν την περίπτωση, η ικανότητα μετασχηματισμού οφείλεται στην ιδιοσύστατη ενεργοποίηση του υποδοχέα, συνεπώς οι υποδοχείς κινάσες λειτουργούν συνεχώς χωρίς την απαίτηση προσδέτη. Τέτοια παραδείγματα αποτελούν το ογκογονίδιο v-erbB που κωδικοποιεί μια κολοβωμένη μορφή του υποδοχέα του επιδρεμικού αυξητικού παράγοντα (EGF receptor) και το ογκογονίδιο v-fms που κωδικοποιεί έναν υπερενεργό κυτταρικό υποδοχέα του CFS-1 (CFS-1: colony stimulating factor1 receptor).

γ) Γονίδια κινασών τυροσίνης που δεν είναι υποδοχείς. Πολλές από τις μη υποδοχείς κινάσες τυροσίνης ανακαλύφθηκαν ως προϊόντα ιϊκών ογκογονιδίων. Τα πιο χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι οι κινάσες τυροσίνης Src και Αbl. Η σχέση της Αbl με τη μετάθεσης χρωμοσώματος Philadelphia, έχει μελετηθεί εκτενώς. Η μετάθεση Philadelphia είναι μια χρωμοσομική μετάθεση που επηρεάζει το γονίδιο c-abl του χρωμοσώματος 9 και το γονίδιο bcr του χρωμοσώματος 22. Η μετάθεση οδηγεί στη δημιουργία ενός γονιδίου υβρίδιου που αποτελείται από το γονίδιο bcr, που κωδικοποιεί πρωτεϊνική κινάση Ser/Thr και το γονίδιο c-abl. Οι δυο εναλλακτικές πρωτεΐνες που δημιουργούνται p120BCR-ABL και p180BCR-ABL είναι χαρακτηριστικές σε πολλούς τύπους λευχαιμίας.

Κατά τη μετάθεση, ένα μέρος του γονιδίου c-abl συγχωνεύεται με το πρώτο εξόνιο του γονιδίου bcr. Η πρωτεΐνη υβρίδιο που προκύπτει p180BCR-ABL εμφανίζει αυξημένη δραστικότητα κινάσης τυροσίνης, αλλάζει υποκυτταρικό εντοπισμό και προσκολλάται στον κυτταροσκελετό. Το τμήμα BCR της πρωτεΐνης υβριδίου συνδέεται με την πρωτεΐνη προσαρμογέα Grb-2, η οποία ενεργοποιεί στη συνέχεια το μονοπάτι των Ras.

δ) Ρυθμιστικές GTPάσες. Ογκογόνα ενεργοποίηση πολλών μικρών ρυθμιστικών

GTPασών έχει μελετηθεί καλά με κύριο παράδειγμα τις πρωτεΐνες Ras. Σε αντίθεση, παρατηρείται σπανιότερα ογκογόνα ενεργοποίηση των ετεροτριμερών G

πρωτεϊνών. Σε μερικούς καρκίνους ενδοκρινών οργάνων (θυρεοειδής αδένας) εμφανίζονται μεταλλάξεις στην Gαs υπομονάδα μιας ετεροτριμερούς G πρωτεΐνης, οι οποίες ελαττώνουν τη δραστηριότητα της GTPασης. Κατά συνέπεια ενεργοποιείται ιδιοσύστατα η αδενυλοκυκλάση, αυξάνοντας την παραγωγή cAMP οδηγώντας σε μιτογόνα σήματα. Οι μεταλλάξεις στην α-υπομονάδα επηρεάζουν τις θέσεις Arg201 και Gln227. Η Arg201 είναι η θέση για ADP-ριβοσυλίωση από την τοξίνη της χολέρας, ενώ η Gln227 εμπλέκεται στην αντίδραση GTPάσης.

525

Εικόνα 17.4 Δημιουργία μιας ογκοπρωτεΐνης-χίμαιρας. Το γονίδιο για την πρωτεϊνική κινάση

Ser/Thr, Βcr, συγχωνεύεται με ένα τμήμα του γονιδίου c-abl με τη διαδικασία μετάθεσης χρωμοσώματος Philadelphia. Τα συγχωνευμένα γονίδια σχηματίζονται στο χρωμόσωμα 22 και κωδικοποιούν διάφορες πρωτεΐνες-υβδρίδια, με πιο σημαντικές τις p120BCR-ABL και p180BCR-ABL, που έχουν αυξημένη δραστικότητα κινάσης τυροσίνης και αλλαγμένο υποκυτταρικό εντοπισμό.

ε) Κυτταροπλασματικές κινάσες σερίνης-θρεονίνης και οι ρυθμιστικές τους υπομονάδες. Η ενζυμική δράση των κινασών Ser//Thr συχνά ελέγχεται από αυτορυθμιστικές περιοχές. Απώλεια της λειτουργικότητας αυτών των περιοχών λόγω μετάλλαξης ενισχύει υπέρμετρα την ένταση των μιτωτικών σημάτων. Τέτοιο παράδειγμα είναι αυτό της Raf κινάσης, η οποία σε μεταλλαγμένη μορφή -κατά την οποία λείπει το αμινοτελικό άκρο της που περιέχει την αυτορυθμιζόμενη περιοχή της- είναι ογκογόνος. Το μεταλλαγμένο ογκογονίδιο της Raf κινάσης έχει βρεθεί στο γονιδίωμα ογκογόνων ιών (v-Raf). Οι κυκλίνες είναι ρυθμιστικές υπομονάδες των πρωτεϊνικών κινασών του κυτταρικού κύκλου. Η συγκέντρωσή τους αυξάνεται θεαματικά όταν το κύτταρο εισέρχεται στη φάση S και στη φάση M. Οι κυκλίνες συμπλέκονται με πρωτεϊνικές κινάσες (Cyclin-Dependent Kinases) που ρυθμίζουν την είσοδο του κυττάρου στις παραπάνω δύο φάσεις και η παρουσία τους είναι σημαντική για τη συνολική ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Yπέρμετρη αύξηση της συγκέντρωσης των κυκλινών ή των CDKs οδηγεί σε απορύθμιση του κύκλου και μετασχηματισμό. Τέτοια είναι η περίπτωση της κυκλίνης D1 σε έναν τύπο καρκίνου του παραθυροειδούς αδένα. Μετάθεση του γονιδίου της κυκλίνης D1 σε περιοχή όπου βρίσκεται υπό τον έλεγχο του ισχυρού προαγωγέα της παραθυροειδούς ορμόνης έχει ως αποτέλεσμα την υπερέκφραση και την πρόκληση του καρκίνου. Σε άλλες περιπτώσεις το γονίδιο της ίδιας κυκλίνης βρίσκεται εξαιρετικά ενισχυμένο (σε πολλά αντίγραφα), όπως σε καρκίνους του μαστού και του εντέρου.

στ) Πρωτεΐνες προσαρμογείς και μεταγωγή σήματος. Οι πρωτεΐνες αυτές, όπως η Crk και η Shc συνδέουν συνήθως τους υποδοχείς με άλλες πρωτεΐνες μεταγωγής σήματος και ο ρόλος τους στην ογκογένεση δεν είναι γνωστός. Πάντως έχουν βρεθεί μεταλλαγμένες μορφές τους σε γενώματα ογκογόνων ιών.

526

ζ) Μεταγραφικοί παράγοντες. Ένας μεγάλος αριθμός πρωτο-ογκογονιδίων κωδικοποιούν για μεταγραφικούς παράγοντες που εμπλέκονται στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και/ή στο μετασχηματισμό του κυττάρου. Τα πιο γνωστά είναι τα γονίδια jun, fos, myc και τα γονίδια για τον υποδοχέα Τ3 και τον υποδοχέα της βιταμίνης Α.

Το γονίδιο c-myc είναι ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα υπερέκφρασης ενός μεταγραφικού παράγοντα λόγω μετάθεσης. Η μετάθεση έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση της έκφρασης του γονιδίου c-myc σε σύγκριση με τη φυσιολογική κατάσταση. Επιπλέον κατά τη διάρκεια της δημιουργίας όγκου συμβαίνουν επίσης μεταλλάξεις και στην κωδικεύουσα περιοχή του γονιδίου c-myc. Η πρωτεΐνη Myc δρα ως μεταγραφικός παράγοντας, ο οποίος ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνών loop-helix-loop και μπορεί να συνδεθεί με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες μέσω ενός διμερούς μοτίβου φερμουάρ λευκίνης. Η πρωτεΐνη Myc μπορεί να δημιουργήσει ομοδιμερή ή ετερο-διμερή με άλλους loop-helix-loop μεταγραφικούς παράγοντες, όπως οι MAD, MAX και Mxi-1. Τα διάφορα ετεροδιμερή έχουν και διαφορετικές δράσεις, το σύμπλοκο Myc-MAX ενεργοποιεί τη μεταγραφή, ενώ τα σύμπλοκα MAX-MAD και MAX-Mxi-1 όχι. Σε ένα φυσιολογικό κύτταρο, υπάρχει μια ισορροπία ανάμεσα στα διαφορετικά διμερή. Η ισορροπία αυτή διαταράσσεται από τη χρωμοσωμική μετάθεση που οδηγεί σε υπερέκφραση της Myc. Θεωρείται ότι η υπερβολική μεταγραφή των γονιδίων στόχων της Myc οδηγεί σε δημιουργία όγκων.

Εικόνα 17.5 Το δίκτυο των μεταγραφικών παραγόντων Myc-MAX στο λέμφωμα του Burkitt. Το

λέμφωμα του Burkitt χαρακτηρίζεται από χρωμοσωμικές μεταθέσεις κατά τις οποίες κομμάτια του γονιδίου της ανοσοσφαιρίνης (πχ του γονιδίου της IgH) μεταθέτονται στην περιοχή του γονιδίου c-myc. Σαν αποτέλεσμα της μετάθεσης t(8,14) έχουμε συνεχή έκφραση του γονιδίου c-myc. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί για το μεταγραφικό παράγοντα c-Myc, ο οποίος μπορεί να δημιουργήσει ετεροδιμερή με τους μεταγραφικούς παράγοντες MAX, MAD και Mxi-1. Η ιδιοσύστατη έκφραση του c-myc μετατοπίζει το ισοζύγιο ετεροδιμερών προς τη μεριά των c-Myc-MAX, γεγονός που οδηγεί σε απρογραμμάτιστη ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων τους.

Ένα παράδειγμα ογκογονιδίου που κωδικοποιεί έναν πυρηνικό υποδοχέα είναι το γονίδιο v-erbA. Το κυτταρικό γονίδιο c-erbA κωδικοποιεί για τον πυρηνικό υποδοχέα Τ3, ενώ το προϊόν του αντίστοιχου ογκογονιδίου v-erbA έχει χάσει την περιοχή όπου συνδέεται ο προσδέτης Τ3. Ο ανέπαφος Τ3 υποδοχέας ενεργοποιείται μετά τη σύνδεση του προσδέτη, Τ3 ορμόνη, και ενεργοποιεί τη μεταγραφή, ενώ απουσία προσδέτη, ο υποδοχέας καταστέλλει τη μεταγραφή. Συνεπώς χάνοντας την ικανότητα πρόσδεσης της Τ3 ορμόνης, η μεταλλαγμένη ογκοπρωτεΐνη καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων-στόχων. Πιθανόν, η συνεχής

527

καταστολή οδηγεί σε αλλαγή από το μονοπάτι διαφοροποίησης στην απρογραμμάτιστη κυτταρική διαίρεση.

4. Ογκοκατασταλτικά γονίδια

Γενικές δράσεις των ογκοκατασταλτικών γονιδίων

Ογκοκατασταλτικά γονίδια είναι τα γονίδια εκείνα των οποίων η απενεργοποίηση, λόγω μεταλλάξεις, έχει σαν αποτέλεσμα το μετασχηματισμό ενός φυσιολογικού κυττάρου σε καρκινικό. Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούν είναι γνωστές ως ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες. Πολλές από τις γνωστές ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες έχουν ένα κατασταλτικό και αρνητικό αποτέλεσμα στη ρύθμιση διαδικασιών, οι οποίες είτε είναι άμεσα συνδεδεμένες με τη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης είτε την επηρεάζουν με έμμεσο τρόπο. Άλλες εξίσου σημαντικές λειτουργίες των ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών είναι στον τομέα της επιδιόρθωσης του DNA και της κυτταρικής συγκόλλησης.

Η απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων μπορεί να έχει διάφορες συνέπειες:

1. Απώλεια των αρνητικών, κατασταλτικών σημάτων στην κυτταρική διαίρεση Μιτογόνα σηματοδοτικά μονοπάτια και ο μηχανισμός του κυτταρικού κύκλου περιέχουν

πολλά συστατικά που ελαττώνουν ή αναστέλλουν τη μετάδοση των μιτογόνων σημάτων. Απενεργοποίηση της ανασταλτικής αυτής δράσης ισοδυναμεί με ενεργοποίηση της κυτταρικής διαίρεσης. Αρνητική ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης επιτελείται κυρίως από την καταστολή γονιδίων, των οποίων τα προϊόντα είναι απαραίτητα για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Κύρια ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη αυτής της κατηγορίας είναι η πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (pRb).

2. Προώθηση της συσσώρευσης επιπλέον μεταλλάξεων Όλα τα κύτταρα που υφίστανται μια βλάβη στο DNA τους μπορούν να σταματήσουν τον κυτταρικό κύκλο στα σημεία ελέγχου (DNA damage checkpoints) για να κερδίσουν χρόνο και να την επιδιορθώσουν. Απώλεια των ρυθμιστικών μηχανισμών που συνδέουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου με τον έλεγχο βλαβών του DNA ευνοεί τη δημιουργία μεταλλάξεων. Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 έχει μια κεντρική δράση στο σημείο ελέγχου βλάβης του DNA.

3. Απώλεια των αποπτωτικών σημάτων Η απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι ένα πρόγραμμα που οδηγεί σε θάνατο το κύτταρο με ένα στοχευμένο τρόπο μετά από βλάβη του DNA του. Η απόπτωση είναι μια προστασία ενάντια στη δημιουργία καρκινικών κυττάρων. Εάν ένα κύτταρο υποστεί βλάβη στο DNA του, η απόπτωση βοηθάει να πεθάνει το αρχικό κύτταρο πριν συσσωρευτούν μεταλλάξεις. Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 παίζει επίσης ένα σημαντικό ρόλο σε αυτό το σημείο. Με βάση τη λειτουργία τους στη δημιουργία όγκων, οι ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες μπορούν να χωριστούν σε δυο τάξεις:

• Φύλακες της πύλης (Gatekeeper): Αυτός ο τύπος ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών εμποδίζει άμεσα την αύξηση των όγκων αναστέλλοντας την κυτταρική αύξηση ή προωθώντας την απόπτωση. Κάθε κυτταρικός τύπος έχει μόνο μερικούς φύλακες και η απενεργοποίηση των γονιδίων τους οδηγεί άμεσα σε νεοπλασματική αύξηση. Σημαντικοί φύλακες είναι η πρωτεΐνη pRb και ο αναστολέας του κυτταρικού κύκλου p16ink4a.

528

• Φροντιστές (Caretaker): Γονίδια και πρωτεΐνες γνωστοί ως φροντιστές έχουν μια άμεση επίδραση στη δημιουργία όγκων. Είναι ευαίσθητα γονίδια που καταστέλλουν άμεσα τη δημιουργία όγκων. Μια σημαντική ομάδα αυτών των πρωτεϊνών είναι οι πρωτεΐνες επιδιόρθωσης. Απενεργοποίηση ενός γονιδίου φροντιστή αυτής της ομάδας οδηγεί σε μια οξεία αύξηση του ρυθμού μεταλλάξεων και ισοδυναμεί με συνεχή έκθεση σε μιτογόνα.

Επιδιόρθωση του DNA, ακεραιότητα του DNA και καταστολή όγκων

Κάθε κύτταρο έχει ένα εύρος προστατευτικών μηχανισμών για να αποτρέψει τη βλάβη του DNA και να εξασφαλίσει την ακεραιότητα και τη σταθερότητα του γονιδιώματος. Οι ακόλουθες δράσεις φροντίδας συνδέονται με δημιουργία όγκων.

Επιδιόρθωση κακοταιριάσματος, hMSH2 Για μια κληρονομική μορφή ενός συγκεκριμένου καρκίνου του εντέρου (hereditary

nonpolyposis cancer, HNPPC) υπεύθυνη είναι μια ανωμαλία του συστήματος επιδιόρθωσης για κακοταίριασμα DNA, που οφείλεται σε ένα έλλειμμα στο γονίδιο hMSH2 των γενετικών κυττάρων. Το γονίδιο hMSH2 είναι ομόλογο του γονιδίου MutS της E. coli, το οποίο εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του κακοταιριασμένου DNA στα βακτήρια.

BRCA1 και BRCA2 Τα γονίδια BRCA1 (breast cancerA1) και BRCA2 όταν απενεργοποιηθούν προκαλούν μια κληρονομική ευαισθησία στην πρόκληση του καρκίνου του μαστού. Τα προϊόντα αμφότερων των γονιδίων συνδέονται με την πρωτεΐνη Rad51 που συμμετέχει στον ανασυνδυασμό και την επιδιόρθωση του DNA. Ειδικότερα η πρωτεΐνη BRCA1 συμμετέχει στην επιδιόρθωση της βλάβης του DNA από οξειδωτικά μέσα όπως οι ελεύθερες ρίζες.

Ελαττώματα στο σημείο ελέγχου Μετάφασης-Ανάφασης Το προϊόν του γονιδίου BUB1 είναι μέρος του σημείου ελέγχου μετάφασης-ανάφασης και προκαλεί "πάγωμα" της διαίρεσης εάν τα χρωμοσώματα δεν πάρουν τη σωστή διάταξη κατά το σχηματισμό της ατράκτου. Απώλεια δράσης του BUB1 έχει ως αποτέλεσμα τη χρωμοσωμική αστάθεια και το μετασχηματισμό των κυττάρων.

Η πρωτεΐνη του Ρετινοβλαστώματος (pRb) ως ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη

Το γονίδιο του ρετινοβλαστώματος είναι το πρώτο ογκοκατασταλτικό γονίδιο που ανιχνεύτηκε και ταυτοποιήθηκε στον άνθρωπο. Σε ένα σπάνιο όγκο στο μάτι, παρατηρήθηκε απώλεια μιας αλληλουχίας του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος. Στην κληρονομική μορφή αυτού του καρκίνου, που εμφανίζεται στην παιδική ηλικία, η απώλεια αυτή της αλληλουχίας μεταβιβάζεται μέσω των γενετικών κυττάρων. Απενεργοποίηση και του δεύτερου αλληλόμορφου του γονιδίου τουρετινοβλαστώματος οδηγεί σε πλήρη απώλεια της δράσης του γονιδίου και συνεπώς σε δημιουργία όγκου. Ακόμα, έχει βρεθεί ότι το συγκεκριμένο γονίδιο σχετίζεται και με άλλα είδη καρκίνων.

Το προϊόν του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος είναι ένας πραγματικός μοριακός διακόπτης και εντοπίζεται σε δύο μορφές, στην υποφωσφορυλιωμένη, όπου και αποτρέπει την προώθηση του κυτταρικού κύκλου και στην υπερφωσφορυλιωμένη όπου επιφέρει το αντίθετο ακριβώς αποτέλεσμα, προάγει δηλαδή την κυτταροδιαίρεση. Πιο συγκεκριμένα η Rb πρωτεΐνη στην υποφωσφορυλιωμένη μορφή συνδέεται και απενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγοντα E2F και αναστέλλει με αυτό τον τρόπο την έκφραση μιτωτικών γονιδίων. Από την άλλη, όταν βρίσκεται στην υπερφωσφορυλιωμένη μορφή δεν συνδέεται με τον E2F, ο οποίος μένει ελεύθερος να ενεργοποιήσει αυτά τα γονίδια και η περαιτέρω πορεία του κυτταρικού

529

κύκλου δεν εξαρτάται πια από την παρουσία αυξητικών παραγόντων. Προφανώς, από τα παραπάνω συνεπάγεται ότι άμεσο ρόλο στη διαδικασία της πρόκλησης ή αποτροπής όγκου έχουν όλες οι πρωτεΐνες που σχετίζονται άμεσα ή έμμεσα με τη φωσφορυλίωση ή αποφωσφορυλίωση της Rb.

Εικόνα 17.6 Σφάλματα στη ρύθμιση της ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης του ρετινοβλαστώματος.

Η πολλαπλασιαστική δραστηριότητα της πρωτεΐνης pRb εάν παρουσιαστεί απρογραμμάτιστα υψηλή συγκέντρωση του συμπλόκου CDK4-cyclin D1 ή αν απουσιάζει η ανασταλτική δραστηριότητα της CKI. Επίσης, η απουσία της πολλαπλασιαστικής δραστηριότητας της pRb μπορεί να οφείλεται σε σύνδεση της πρωτεΐνης pRb με ιϊκές ογκοπρωτεΐνες ή λόγω δομικών μεταλλάξεων της pRb. Σε αυτήν την περίπτωση, ο μεταγραφικός παράγοντας E2F σταματά την ανασταλτική του δράση στον κυτταρικό κύκλο και προωθείται η δημιουργία όγκων.

Λάθη στη ρύθμιση της κατάστασης φωσφορυλίωσης της pRb

Οι κινάσες που εξαρτώνται από κυκλίνες (οι CDKs και ιδιαίτερα η CDK4 που εξαρτώνται κυρίως από τις κυκλίνες D1 και E) φωσφορυλιώνουν την pRb και την οδηγούν στην υπερφωσφορυλιωμένη μορφή της. Υπερέκφραση της κυκλίνης D1 ή της CDK4 έχει βρεθεί σε καρκίνους του πνεύμονα, του παγκρέατος, του στήθους και της κύστης.

Από την άλλη, οι αναστολείς των κινασών που εξαρτώνται από κυκλίνες (CKIs, κυρίως οι p16 και p27) εμποδίζουν τη δράση των CDKs και διατηρούν την pRb σε υποφωσφορυλιωμένη μορφή. Ο λόγος κυκλινών/CKIs είναι πρωτεύουσας σημασίας για τον τελικό καθορισμό της μορφής της Rb. Οι κυκλίνες όπως έχει προαναφερθεί είναι προϊόντα πρωτο-ογκογονιδίων ενώ οι CKIs είναι προϊόντα ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Σύνδεση σε ιϊκές ογκοπρωτεΐνες Οι ιοί DNA που μπορούν να προκαλέσουν καρκίνο λόγω ύπαρξης γονιδίων τους που κωδικοποιούν ογκοπρωτεΐνες, ανήκουν στις κατηγορίες των πολυωματικών ιών (με κύριο αντιπρόσωπο τον SV40), των αδενοϊών και των ιών του θηλώματος (πχ ο ΗΡV, human papilloma virus). Οι ογκοπρωτεΐνες αυτές (TAg του SV40, E1A του αδενοϊού και E7 του HPV) αλληλεπιδρούν με τη δράση της pRb αίροντας την αναστολή της πάνω στο μεταγραφικό παράγοντα E2F. Αυτό που συμβαίνει είναι ότι οι ογκοπρωτεΐνες μπορούν να συνδεθούν στην υποφωσφορυλιωμένη μορφή της Rb πρωτεΐνης στην ίδια "θήκη σύνδεσης"

530

του E2F, και να εμποδίσουν τη σύνδεση με το μεταγραφικό παράγοντα E2F, και άρα να τον απελευθερώσουν από την αρνητική επίδραση της Rb και να του επιτρέψουν τη μεταγραφική δραστηριότητα μιτωτικών γονιδίων.

Γενετική απενεργοποίηση της pRb Γενετική απενεργοποίηση της pRb παρατηρείται σε πολλούς καρκίνους. Το ελάττωμα

του γονιδίου μπορεί να οφείλεται σε μετάλλαξη που αφορά τον προαγωγέα του γονιδίου, με αποτέλεσμα τη μειωμένη μεταγραφή ή μπορεί να αφορά την κωδικοποιούσα περιοχή με αποτέλεσμα την αλλαγή της χωροδιαμόρφωσης της πρωτεΐνης, της αλλοίωσης της τρισδιάστατης μορφής του ενεργού κέντρου και την αδυναμία προσκόλλησης στον παράγοντα E2F, με τα γνωστά αποτελέσματα.

Ο γονιδιακός τόπος p16ink4a και η καταστολή όγκων

Οι CKIs είναι σημαντικά στοιχεία ρύθμισης που σταματούν τον κυτταρικό κύκλο όταν το DNA υποστεί κάποια βλάβη, όταν δεν υπάρχουν μιτογόνα σήματα ή παρουσία αυξημένων αντιμιτογόνων σημάτων. Αν η ανασταλτική δράση αποτύχει, τα μιτογόνα σήματα κυριαρχούν και αρχίζει ανεξέλεγκτη κυτταρική διαίρεση. Η in vivo σημασία των CKIs στη δημιουργία όγκων είναι δύσκολο να εκτιμηθεί. Αυτό φαίνεται από το παράδειγμα του αναστολέα p21CIP1, απουσία του οποίου τα ποντίκια αναπτύσσονται κανονικά. Αυτό συμβαίνει γιατί όταν ένας αναστολέας δεν λειτουργεί, τη δράση του αναλαμβάνουν άλλοι αναστολείς.

Από τους CKIs, ο p16ink4a έχει έναν κεντρικό ρόλο στον έλεγχο της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης Rb και τον έλεγχο της μετάβασης του κυττάρου από τη φάση G1 στη φάση S. Η σημασία του p16 φαίνεται από το γεγονός ότι σε κάποιους όγκους, όπως στον καρκίνο του πνεύμονα, το γονίδιο αυτό είναι απενεργοποιημένο λόγω μετάλλαξης ή λόγω ανώμαλης μεθυλίωσης.

Μάλιστα έχει διαπιστωθεί ότι κωδικοποιούνται δυο πρωτεΐνες από το γονιδιακό τόπο p16ink4a, η πρωτεΐνη p16ink4a, και η p19ARF (ARF: alternative reading frame). Το γονίδιο δηλαδή διαθέτει τη δυνατότητα εναλλακτικής μετάφρασης λόγω χρησιμοποίησης εναλλακτικού πλαισίου ανάγνωσης από το ριβόσωμα κατά τη μετάφραση και η προκύπτουσα πρωτεΐνη p19 δεν είναι ομόλογη με την p16 λόγω εναλλακτικού ματίσματος. Η p16 αναστέλλει το σύμπλοκο κυκλίνηD-CDK και σταματάει τον κυτταρικό κύκλο μέσω της πρωτεΐνης Rb, ενώ η p19 είναι και αυτή ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη και η δράση της σχετίζεται με την ενεργοποίηση του κεντρικού ογκοκατασταλτικού παράγοντα κλειδού p53, αποτρέποντας τη σύνδεσή του με την πρωτεΐνη.

Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53

Το γονίδιο p53 είναι σίγουρα από τα σημαντικότερα γονίδια κλειδιά που ρυθμίζουν την πορεία πολλών βιοχημικών μονοπατιών που αποτελούν μέρος ποικίλων σημαντικών λειτουργιών, όπως η προώθηση της κυτταροδιαίρεσης, η προστασία της ακεραιότητας του DNA και η ενεργοποίηση της αποπτωτικής διαδικασίας.

Η πρωτεΐνη p53 είναι μια πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη 393 αμινοξέων και μετάλλαξή της έχει παρατηρηθεί σε περισσότερους από το 50% όλων των ανθρώπινων όγκων. Έλλειμμα στο γονίδιο p53 στα γαμετικά κύτταρα προκαλεί γενετική προδιάθεση για διάφορα είδη καρκίνων, κυρίως για καρκίνους συνδετικών ιστών που μπορεί να εμφανιστούν σε παιδική ηλικία.

Η p53 προστατεύει το κύτταρο από το μετασχηματισμό με τους εξής τρόπους :

531

• Προσκολλάται σε ειδικά σημεία του DNA και δρα σα μεταγραφικός παράγοντας προκαλώντας τη μεταγραφή αντιμιτωτικών γονιδίων.

• Όταν παρουσιαστεί βλάβη στο DNA σταματάει τον κυτταρικό κύκλο και εμποδίζει τη μετάβαση του κυττάρου από τη φάση G1 στη φάση S. Επίσης σταματάει τον κυτταρικό κύκλο και σε άλλα σημεία ελέγχου για τον ίδιο λόγο.

• Συνδέεται με πρωτεΐνες που παίζουν ρόλο στην επιδιόρθωση του DNA και τις ενεργοποιεί όταν υπάρχει γενετική βλάβη.

• Όταν είναι απαραίτητο προκαλεί την έναρξη της αποπτωτικής διαδικασίας.

Δομή και βιοχημικές ιδιότητες της πρωτεΐνης p53 Η πρωτεΐνη p53 είναι μια πολύ-λειτουργική ρυθμιστική πρωτεΐνη. Διακρίνονται τρεις

περιοχές της με χαρακτηριστική λειτουργία η καθεμιά.

Εικόνα 17.7 Δομικές περιοχές της πρωτεΐνης p53 και οι βιοχημικές τους δράσεις. Ρ: θέσεις

φωσφορυλίωσης από πρωτεϊνικές κινάσες, CKI: κινάση Ι της καζεΐνης, CKII: κινάση ΙΙ της καζεΐνης, dsDNA-PK: πρωτεϊκή κινάση Ser/Thr της διπλής έλικας του DNA, Hsp: θέση σύνδεσης για πρωτεΐνες θερμικού σοκ, TAS: αλληλουχία δι-ενεργοποίησης (transactivating sequence), MDM2: θέση σύνδεσης για την ογκοπρωτεΐνη MDM2, HPV E6, SV40 Tag: θέσεις σύνδεσης για την ιϊκή ογκοπρωτεΐνη Ε6 του ιού HPV και για την Tag του ιού SV40, NLS: nuclear localization signal- σήμα πυρηνικού εντοπισμού, CDC2: θέση φωσφορυλίωσης από την κινάση CDC2, Oligo: περιοχή ολιγομερισμού.

Περιοχή δι-ενεργοποίησης (transactivation domain): Το αμινοτελικό άκρο της p53 είναι

μια περιοχή δι-ενεργοποίησης, η οποία περιλαμβάνει σημεία σύνδεσης για διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες όπως ο TFIID, ή συνενεργοποιητές όπως ο CBP/p300.

Περιοχή εξειδικευμένης σύνδεσης στο DNA: Στην κεντρική περιοχή της p53 υπάρχει μια αλληλουχία 100-300 αμινοξέα, όπου βρίσκεται η θέση εξειδικευμένης σύνδεσης στο DNA και οι θέσεις σύνδεσης ιϊκών ογκοπρωτεϊνών, όπως η Tag του ιού SV40. H p53 σε μορφή τετραμερούς δεσμεύεται στην περιοχή 5'-RRRC(A/T)(T/A)GYYY-3' όπου R=πουρίνη και Υ=πυριμιδίνη. Επίσης, η p53 στη μεγάλη έλικα του DNA προσδένεται στην παραπάνω αλληλουχία μέσω ενός μοτίβου helix-loop-helix, ενώ όταν η αλληλουχία αναγνώρισης του DNA βρίσκεται στη μικρή έλικα τότε η σύνδεση γίνεται μέσω μιας στροφής και ο δεσμός σχηματίζεται από την αργινίνη 248. Στην κεντρική περιοχή της p53 συνδέονται και ογκοπρωτεΐνες εμποδίζοντας την πρόσδεση στο DNA.

Περιοχή μη ειδικής σύνδεσης στο DNA: Το καρβοξυτελικό άκρο της p53 μπορεί να συνδεθεί χωρίς εξειδίκευση με μονές αλυσίδες DNA που έχουν προκύψει ως αποτέλεσμα

532

γενετικής βλάβης και να ενεργοποιήσει με κάποιο άγνωστο τρόπο τη διαδικασία επιδιόρθωσης.

Αλληλεπίδραση της p53 με ρυθμιστικές πρωτεΐνες: Η p53 αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες που έχουν μια ρυθμιστική δράση ή συμμετέχουν στην αντιγραφή του DNA (TFIIB, TFIID, TAF, CBP/p300 coactivators) ή στον επιδιορθωτικό μηχανισμό του (RPA και το TFIIH complex). Στο καρβοξυτελικό άκρο υπάρχουν ακόμα διάφορα σημεία φωσφορυλίωσης (πιθανόν μέσω της οποίας ενεργοποιείται και η ικανότητα σύνδεσης στο μονόκλωνο DNA), η περιοχή σύνδεσης για το σχηματισμό των τετραμερών και περιοχές σύνδεσης μεταγραφικών παραγόντων. Πιθανόν η σύνδεση με τους τελευταίους να γίνεται με τη βοήθεια ακετυλίωσης της p53 από τις πρωτεΐνες CBP/c300.

. Εικόνα 14.8 Η περιοχή σύνδεσης στο DNA της πρωτεΐνης p53 σε σύμπλοκο με το DNA. Η κεντρική περιοχή της p53 (αμινοξέα 102-292) συνδέεται με τη διπλή αλυσίδα του DNA. Τα

αμινοξέα τα οποία σημειώνονται στο σχήμα είναι εκείνα τα οποία εμφανίζουν τις συχνότερες μεταλλάξεις.

Η σημασία της ογκοκατασταλτικής δράσης της p53 έγινε εμφανής όταν αναλύθηκε για

πρώτη φορά η δομή της με τεχνικές κρυσταλλογραφίας και κατόπιν συγκρίθηκε με τη δομή p53 πρωτεϊνών ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων από διάφορα είδη καρκίνων. Τότε βρέθηκε ότι σε πάρα πολλές περιπτώσεις η p53 ήταν μεταλλαγμένη και μάλιστα αυτό το γεγονός επηρέαζε τη δυνατότητα σύνδεσης με το DNA, αφού η συχνότερη μετάλλαξη γινόταν στο αμινοξύ 248 στη θέση της αργινίνης. Βέβαια παρατηρήθηκαν μεταλλάξεις και σε άλλα αμινοξέα, αλλά πάντα το τελικό αποτέλεσμα ήταν άμεσα ή έμμεσα (λόγω αλλαγής της τρισδιάστατης διαμόρφωσης του μοτίβου που συνδέεται με το DNA) ότι η p53 δε μπορούσε να συνδεθεί με το DNA και αυτή η εξέλιξη είχε ως επίπτωση την προώθηση της

533

ογκογένεσης. Παρόμοια εξέλιξη προκαλεί και η συμπλοκοποίηση της p53 με ογκοπρωτεΐνες όπως η Τag του SV40.

Γονίδια τα οποία ρυθμίζονται από την πρωτεΐνη p53 Η p53 μπορεί να δράσει σαν μεταγραφικός παράγοντας ενεργοποιώντας τη μεταγραφή

γονιδίων αλλά μπορεί και να αναστέλλει τη μεταγραφή άλλων γονιδίων. Κάποια από τα γονίδια τα οποία ενεργοποιεί είναι και τα παρακάτω :

• CDK inhibitor p21 : Το προϊόν αυτού του γονιδίου όπως είδαμε αναστέλλει τη δράση του συμπλόκου CDK-κυκλινών και σταματάει τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G1. Δύο θέσεις σύνδεσης της p53 έχουν βρεθεί στον προαγωγέα αυτού του γονιδίου.

• Το γονίδιο Bax: Το προϊόν του γονιδίου αυτού εμπλέκεται στην έναρξη της αποπτωτικής διαδικασίας και ενεργοποιείται από την p53 όταν το γενετικό υλικό έχει υποστεί σοβαρές βλάβες.

• Θρομβοσπορίνη-1: Η θρομβοσπορίνη εμποδίζει τη δημιουργία καινούριων αιμοφόρων αγγείων και επομένως η μη μεταγραφή της λόγω δυσλειτουργίας της p53 ευνοεί την αγγειογένεση. Το γεγονός αυτό αποκτά ιδιαίτερη σημασία στα τελικά στάδια του μετασχηματισμού ενός κυττάρου σε καρκινικό.

• Γονίδια σχετικά με το οξειδωτικό στρες: Η p53 μπορεί να ενεργοποιήσει γονίδια τα οποία προκαλούν το σχηματισμό ενεργών ριζών οξυγόνου και αυτό συσχετίζεται άμεσα με το χαρακτηριστικό της p53 να ενεργοποιεί την απόπτωση.

Η p53 όμως δρα και σαν αναστολέας μεταγραφής (γονιδίων που προκαλούν μιτωτικά

σήματα) και αυτό το πετυχαίνει με το να εμποδίζει το σχηματισμό του αρχικού συμπλόκου έναρξης της μεταγραφής είτε επειδή προσδένεται στο ΤΑΤΑ box είτε επειδή συνδέεται με το μεταγραφικό σύμπλοκο TFIID και εμποδίζει την πρόσδεσή του στον προαγωγέα του γονιδίου. Παραδείγματα γονιδίων των οποίων η έκφραση αναστέλλεται από την p53 είναι τα c-fos, c-jun, κυτοκίνης IL-6, bcl-2, pRB.

Ενεργοποίηση, Ρύθμιση και Τροποποίηση της δράσης της p53 Η μεταγραφή της p53 ενεργοποιείται από τη στιγμή που θα προκύψει βλάβη στο DNA.

Ένα από τα πιο ισχυρά σήματα που προκαλεί αύξηση της συγκέντρωσης της p53 στο κύτταρο είναι η παρουσία απλής έλικας DΝΑ (ssDNA), που μπορεί να προκύψει λόγω λαθών κατά την επιδιόρθωση, λόγω σπασίματος της αλυσίδας από ακτινοβολία UV και λόγω προβλημάτων που οδηγούν στη διακοπή της αντιγραφής του DNA. Αν η γενετική βλάβη είναι περιορισμένη, η p53 σταματά τον κυτταρικό κύκλο είτε στο σημείο ελέγχου μετάβασης από τη φάση G1στη φάση S, είτε στο σημείο ελέγχου G2/M είτε στο σημείο ελέγχου του σχηματισμού της μιτωτικής ατράκτου. Σύμφωνα με έρευνες το σταμάτημα του κυτταρικού κύκλου είναι μόνιμο και το κύτταρο επιβιώνει για αρκετά σημαντικό χρονικό διάστημα όντας σε αυτή την κατάσταση. Αντίθετα, στην περίπτωση που η βλάβη του DNA είναι εκτενέστερη η p53 προκαλεί απόπτωση του κυττάρου.

Παρόλη την μέχρι τώρα ερευνητική πορεία, σημαντικές λεπτομέρειες για τον ακριβή τρόπο ενεργοποίησης της p53 δεν έχουν γίνει γνωστές, έχουν προταθεί όμως κάποια μοντέλα.

Το κεντρικό μοντέλο προβλέπει την ύπαρξη της p53 σε ανενεργή μορφή μέσα στο κύτταρο υπό φυσιολογικές συνθήκες. Όταν όμως το DNA υποστεί ζημιά, η p53 συνδέεται χωρίς εξειδίκευση σε μονόκλωνο τμήμα της αλυσίδας. Εκεί πρωτεϊνικές κινάσες φωσφορυλιώνουν την πρωτεϊνική κινάση ATM και την ενεργοποιούν. Η τελευταία (ανήκει στην οικογένεια των PI3 κινασών, το όνομά της προήλθε από την ασθένεια ataxia telangiectasia mutated με την οποία συνδέεται) φωσφορυλιώνει την p53 στη σερίνη15 και την

534

ενεργοποιεί, αυξάνοντας ταυτόχρονα τη σταθερότητά της και άρα τη συγκέντρωσή της στο εσωτερικό του κυττάρου.

Η πρωτεΐνη MDM2 (πρωτοανιχνεύτηκε σαν ογκοπρωτεΐνη) συνδέεται με την μη φωσφορυλιωμένη απενεργοποιημένη μορφή της p53 και προκαλεί την πρωτεολυτική αποικοδόμησή της αλλά δε μπορεί να συνδεθεί με την ενεργοποιημένη φωσφορυλιωμένη μορφή. Η MDM2 ενεργοποιείται από υψηλές συγκεντρώσεις της απενεργοποιημένης p53 και έτσι εξασφαλίζεται η διατήρηση της p53 σε χαμηλά επίπεδα συγκέντρωσης, αλλιώς θα υπήρχε ο κίνδυνος άσκοπης ενεργοποίησης της απόπτωσης. Και η δράση της MDM2 όμως ελέγχεται από την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p19Arf, η οποία συνδέεται με την MDM2 και την απενεργοποιεί. Εξασφαλίζεται έτσι το να μην συμβαίνει υπερβολική αναστολή της δράσης της p53. Συνεπώς, μπορεί να δημιουργηθούν ευνοϊκές συνθήκες για ογκογένεση σε καθεμιά από τις παρακάτω περιπτώσεις :

• Μετάλλαξη του γονιδίου p53 με αποτέλεσμα την άμεση απώλεια της ικανότητάς της πρωτεΐνης p53 να συνδέεται με το DNA.

• Απενεργοποίηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p19Arf με αποτέλεσμα την υπερβολική δραστηριοποίηση της MDM2 και την αυξημένη αποσταθεροποίηση της p53.

• Υπερέκφραση ή ενίσχυση του MDM2 γονιδίου. Το τελευταίο φαινόμενο έχει παρατηρηθεί σε αρκετές κατηγορίες όγκων.

Εικόνα 17.10 Ρύθμιση της συγκέντρωσης της p53 από την καταστροφή του DNA και από τις

πρωτεΐνες MDM2 και p19Arf. Τα επίπεδα της p53 ρυθμίζονται από την αλληλεπίδρασή της με την πρωτεΐνη MDM2. Η σύνδεση της MDM2 στην p53, στοχεύει την p53 για πρωτεολυτική αποικοδόμηση, κρατώντας τη συγκέντρωσή της χαμηλή. Υπάρχει μια θηλιά αρνητικής ανατροφοδότησης ανάμεσα στην p53 και στην MDM2, εφόσον η p53 ελέγχει την έκφραση της MDM2 στο επίπεδο της μεταγραφής. Μια άλλη ρύθμιση επιτελείται από την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p19Αrf , η οποία συνδέεται στην MDM2 και την οδηγεί σε αποικοδόμηση, αυξάνοντας τη συγκέντρωση της p53. Κατά τη βλάβη του DNA, ενεργοποιείται η κινάση ΑΤΜ, η οποία φωσφορυλιώνει την p53 στην Ser15. Η φωσφορυλιωμένη p53 δεν μπορεί να συνδεθεί πλέον με την MDM2, και η πρωτεόλυση ελαττώνεται. Τα επίπεδα της p53 τώρα αυξάνονται οδηγώντας σε ογκοκατασταλτική δράση.

Μεταμεταγραφική τροποποίηση της p53: Φωσφορυλίωση και Ακετυλίωση

535

Η p53 έχει πολλές θέσεις φωσφορυλίωσης Ser/Thr. Αυτές περιλαμβάνουν τις θέσεις του καρβοξυ-τελικού άκρου, φωσφορυλίωσης από τις CDKs των φάσεων S και G2/M. Η φωσφορυλίωση των θέσεων αυτών επηρεάζει την ικανότητα σύνδεσης της p53 στο DNA. Μια άλλα μετα-μεταγραφική τροποποίηση είναι η ακετυλίωση του C-τελικού άκρου, η οποία πιθανόν μεσολαβείται από τις πρωτεΐνες CBP/p300 και αυξάνει την ειδική σύνδεση της p53 στο DNA.

Τρόπος δράσης της p53 Η πρωτεΐνη p53 αντιπροσωπεύει ένα ρυθμιστικό στοιχείο το οποίο συνδέει την πρόοδο

του κυτταρικού κύκλου και την επιβίωση ενός κυττάρου με τη βλάβη του DNA. Αντίδραση σε σήματα που προέρχονται βλάβες του DNA οδηγούν σε συσσώρευση, τροποποίηση και ενεργοποίηση της p53. Οι μηχανισμοί ενεργοποίησης της p53 είναι πολλοί και εμπλέκουν πολλές πρωτεΐνες. Ένα σημαντικό στοιχείο ελέγχου που συνδέει τη βλάβη του DNA με την πρωτεΐνη p53 είναι η πρωτεΐνη ΑΤΜ. Η πρωτεΐνη MDM3 ρυθμίζει αρνητικά τη δραστηριότητα του p53: η MDM2 είναι μέρος μιας αυτορυθμιστικής θηλιάς που προωθεί την αποικοδόμηση της p53. Οι δράσεις της p53 ρυθμίζονται με φωσφορυλίωση, και σύνδεση με κυτταρικές ρυθμιστικές πρωτεΐνες και ογκοπρωτεΐνες.

Εικόνα 17.11 Μοντέλο της λειτουργίας της πρωτεΐνης p53, όπου διακρίνονται οι δυο κύριες

λειτουργίες της, το σταμάτημα του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 και την έναρξη της απόπτωσης. Σαν αντίδραση στην καταστροφή του DNA, η ενεργοποιημένη p53 μπορεί να δρα σε

πολλά σημεία του κυτταρικού κύκλου και να τον σταματά. Το σταμάτημα στο σημείο

536

μετάβασης G1/S μεσολαβείται κυρίως από τον αναστολέα p21CIP1 ενώ το σταμάτημα στο σημείο μετάβασης G2/M μεσολαβείται από την ενεργοποιημένη p53.

Η δεύτερη σημαντική λειτουργία της p53 είναι η έναρξη της απόπτωσης. Αυτό το μονοπάτι εμπλέκει την πρωτεΐνη Bax, η οποία αποτελεί μέρος του αποπτωτικού μηχανισμού.

Συνολικά, η ενεργός μορφή της p53 ενεργοποιεί ή αναστέλλει τη μεταγραφή γονιδίων (παραδείγματα των οποίων προαναφέρθηκαν) με τελικό αποτέλεσμα την ακινητοποίηση του κυτταρικού κύκλου ή την απόπτωση. Οποιοδήποτε γεγονός θα επηρέαζε την ομαλή λειτουργία της p53 θα επέτρεπε στο κύτταρο να πολλαπλασιάζεται ακόμα και αν έχει υποστεί βλάβες στο DNA του χωρίς να προλάβει να τις επιδιορθώσει. Θα επέτρεπε ακόμα την επιβίωση κυττάρων με πολύ ασταθές γενετικό υλικό, τα οποία θα έπρεπε να υποστούν τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Και στις δύο περιπτώσεις η διαδικασία του καρκινικού μετασχηματισμού ευνοείται.

Άλλα ογκοκατασταλτικά γονίδια

Άλλα ογκοκατασταλτικά γονίδια που ανιχνεύτηκαν πρόσφατα σχετίζονται με την οργάνωση του κυτταροσκελετού, τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων και την αλλοίωση της δράσης δευτέρων μηνυμάτων. Για παράδειγμα, το προϊόν του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN είναι μια φωσφατάση φωσφολιπιδίων, η οποία προκαλεί τη διάσπαση μιας φωσφορικής ομάδας από το δεύτερο μήνυμα φωσφατίδυλο-3,4,5-τριφωσφορική ινοσιτόλη (PtdInsP3) και την απενεργοποιεί εμποδίζοντάς την να μεταδώσει μιτωτικά μηνύματα.

Σίγουρα οι γνώσεις μας για το τόσο περίπλοκο αυτό φαινόμενο που ονομάζεται καρκίνος είναι ακόμα εξαιρετικά περιορισμένες και είναι αναμενόμενο όσο προχωρούν οι έρευνες να προκύπτουν νέα δεδομένα που να βοηθήσουν στην αποτελεσματικότερη κατανόηση των αιτιών που το προκαλούν.

Βιβλιογραφία

Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter : essential cell biology : an introduction to the molecular biology of the cell, Ιιατρικές εκδόσεις Πασχαλίδης κεφ.18 (έλεγχος του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικός θάνατος)

Krauss G., Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, Chapter 14: Malfunction of signaling pathways and tumorigenesis : ongogenes and tumor supressor genes, Wiley-VCH editions, 2002