1

1 Spektroskopische Methoden 1.1 Die elektromagnetische Welle

Bei der Wechselwirkung von elektromagnetischer Strahlung mit Materie ist außer bei Elektronenspin- und kernmagnetischer Resonanzspektroskopie nur der elektrische Anteil von Bedeutung.

83 10 m/sc λν= = ⋅

E hν=

1.2 Polarisation des Lichtes

2

2 Wechselwirkung von Licht mit Materie Mögliche Messmethoden in Abhängigkeit vom verwendeten Spektralbereich

3

2.1 Energie eines Moleküls elek vib rot spinE E E E E= + + +

2

1 B

expN EN k T

−∆=

3 Elektronenspektroskopie 3.1 Das Übergangsdipolmoment

el21 2 el 1| |µ µ= Ψ Ψ

|µel| = 1.15⋅10-29 Cm (3.46 D)

3.2 Biologische Chromophore

λmax / nm ε / (M cm)-1

NH

O

µel

4

Peptide / Proteine Peptidbindung n → π* π → π*

220 190

100 7.000

Trp Tyr Phe

280 219 274 222 193 257 206 188

5.600 47.000 1.400 8.000 48.000 200 9.300 60.000

Nukleinsäuren Guanosin Cytidin Uridin Thymidin DNA RNA

276 252 188 271 230 198 261 205 267 206 258 258

9.000 13.700 26.800 9.100 8.200 23.200 10.100 9.800 9.700 9.800 6.600 7.400

andere Flavin (ox) 450 12.000 Flavin (red) NADH NAD+ Cytochrom c (ox)

600 340 - 420

5.000 3.400 - 126.000

Cytochrom c (red) 550 27.700 Rhodopsin

498

48.000

350 11.000

5

3.3 Peptide und Proteine 3.3.1 Absorptionsspektren von aromatischen Aminosäuren

E280 wird zur Konzentrationsbestimmung von Proteinen genutzt: E c dε=

3.3.2 Einfluss der Umgebung auf die Trp-Absorption Trp ist ein unpolarer Chromophor. Die energetische Lage der π-Orbitale hängt von der Polarisierbarkeit α des umgebenden Mediums ab.

π

π∗

π∗

π

Kleines α Grosses α

6

Bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums eines π → π*-Übergangs bei Veränderung der Umgebung von geringer Polarisierbarkeit (H20) zu größerer Polarisierbarkeit (Lipidmembran). Melittin in wässriger Umgebung und in einer Lipidmembran

3.3.3 Einfluss der Sekundärstruktur auf die Absorptionsbanden Absorptionsspektren von Poly-L-Lysin

Poly- L-Lysin kann drei verschiedene Konformationen annehmen Zufallsknäuel (298 K, pH 6.0)

β-Faltblatt (325 K, pH 10.8)

α-Helix (298 K, pH 10.8) Warum zeigen unterschiedliche Konformere unterschiedliche Absorptionsspektren?

α-Helix

Zufallsknäuel

β-Faltblatt

7

Jede Aminosäure besitzt ein Übergangsdipolmoment. Diese sind im Raum zueinander angeordnet und wechselwirken miteinander. Dadurch kommt es zur einer Aufhebung der Entartung.

Ψ1,0

Ψ1,0∗ Ψ2,0∗

Ψ1,2

Ψ2,0

Ψ0

Ψ−

Ψ+

E

∆E+V

∆E

∆E-V

E

ε

ε

Bei der α-Helix treten zwei deutlich getrennte Banden auf

π → π* Übergang: Parallelkomponente (parallel zur Helixachse) 205 nm

π → π* Übergang: Senkrechtkomponente (senkrecht zur Helixachse) 190 nm

8

3.4 DNA und RNA Absorptionspektren von Nukleotiden

3.4.1 Abhängigkeit der Absorptionsspektren von der Struktur Hypochromie: Erniedrigung der Extinktion Hyperchromie: Erhöhung der Extinktion

9

Durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen kommt es zur Hypochromie bei 260 nm. Diese kann zur Bestimmung der Konformation der Nukleinsäuren genutzt werden. 3.4.2 Denaturierung von DNA

Der TM-Wert ist ein Maß für die Stabilität der DNA. Zur theoretischen Beschreibung eines Helix-Knäuel-Übergangs eines doppelsträngigen Polynukleotidstrangs geht man von einem Ensemble von Polynukleotiden gleicher Kettenlänge aus, die aus Segmenten aufgebaut sind. Ein solches System lässt sich durch ein Gleichgewicht von zwei Zuständen beschreiben:

Segment im Knäuel-Zustand (A) Segment im Helix-Zustand (B)

Die Umwandlung eines Segments in einem Polynukleotidstrang ließe sich dann wie folgt wiedergeben:

...ABBAA... ...ABBBA... Die Helixbildungskonstante ist definiert als:

10

[ ][ ]...ABBBA......ABBAA...

K = Gl. (1)

Der im Helixzustand befindliche Bruchteil der Segmentgesamtheit wird als Helixbildungsgrad Θ bezeichnet und ist definiert als:

[ ][ ] [ ]

...ABBBA......ABBAA... ...ABBBA... 1

KK

Θ = =+ +

Gl. (2)

1-Θ bezeichnet entsprechend die im Knäuelzustand befindliche Segmentgesamtheit. Die folgende Abbildung zeigt den typischen Verlauf der Größe 1-Θ in Abhängigkeit von der Temperatur.

Man bezeichnet die dem Umwandlungsgrad ΘM (Θ = 0.5) zuzuordnende Temperatur TM als Umwandlungstemperatur. Um diesen Kurvenverlauf zu beschreiben, muss ein Ausdruck für die Temperaturabhängigkeit des Helixbildungsgrads gefunden werden.

Es wird also ein Ausdruck gesucht für ddTΘ = ??

Dieser kann entwickelt werden, indem man wie folgt erweitert:

( )( ) ( )d ln d lnd d d

d d ln d dK K

KT K T K dTΘ Θ Θ

= = Gl. (3)

Suchen wir zunächst einen Ausdruck für die Temperaturabhängigkeit der

Helixbildungskonstanten: dlnd

KT

= ??

0

0 0 0

0 0

ln0

ln

ln

G G RT KGG RT K H T S

H SKRT R

∆ ∆∆∆ ∆ ∆

∆ ∆

= +=

= − = −

= − +

Gl. (4a-d)

Unter der Annahme, dass ( )0

d0

d

SR

T

∆≈ ist, ergibt sich:

1-Θ

11

0

2

d(ln )d

K HT RT

∆= Gl. (5)

∆H0 ist die auf ein Mol einer Segmenteinheit bezogene Van’t Hoffsche Helixbildungs-

bzw. Umwandlungsenthalpie. Suchen wir nun einen Ausdruck für: dd

KKΘ = ??

Aus Gl. (2) ergibt sich sofort:

2dd (1 )

KKK KΘ

=+

Gl. (6)

Bei T = TM erhält man somit folgenden Zusammenhang:

M

0

2M

dd T 4T

HRT

Θ ∆ =

bzw. ( )M

0

2M

d 1-dT 4

T

HRT

Θ ∆ = −

Gl. (7)

Der Wert der Van’t Hoffschen Umwandlungsenthalpie (Helixbildungsenthalpie ∆H0) kann nach Gl. (7) aus der Steigung der erhaltenen Messkurve entnommen werden. Vergleicht man nun aber die aus der Messkurve erhaltene Van’t Hoffsche Umwandlungsenthalpie (- 9000 kJ/mol) mit der kalorimetrisch bestimmten Umwandlungsenthalpie des Übergangs eines einzelnen Nukleotidpaares vom Knäuel in den Helix-Zustand (- 30 kJ/mol), so zeigt sich, dass die Van’t Hoffsche Umwandlungsenthalpie deutlich (negativ) größer ist. Dies bedeutet, dass bei der Umwandlung nicht jeweils nur ein einzelnes Nukleotidpaar schmilzt, sondern ein Segment, welches aus mehreren Nukleotidpaaren aufgebaut ist. Offenbar ist die Bildung der Helixsequenz in unmittelbarer Nachbarschaft von bereits im Helixzustand vorliegenden Segmenten stark begünstigt. Die Begünstigung bedeutet auch, dass die benachbarten Segmente einer Helixsequenz der Polynukleotidkette kooperativ aus dem Helix- in den Knäuelzustand übergehen. Unter Beibehaltung des bisherigen Formalismus führt man zur Beschreibung der experimentellen Daten die sogenannte mittlere kooperative Länge N0 ein. Sie entspricht der mittleren Länge der bei TM kooperativ vom Helix- in den Knäuel-Zustand übergehenden Segmente. Die in Gl. (7) auftretende Größe ∆H0 ist also nicht die molare Umwandlungsenthalpie ∆HM (pro Mol Nukleotidpaare, die mittels Kalorimetrie bestimmt wird) sondern eine „scheinbare“ Umwandlungsenthalpie (pro Mol kooperative Segmenteinheiten). Da die Enthalpieänderung des Gesamtschmelzprozesses jedoch wegunabhängig ist (H ist eine Zustandgröße) muss gelten:

0M 0H H N∆ ∆= ⋅ Gl. (8)

Bei bekanntem ∆HM kann somit die mittlere kooperative Länge N0 bestimmt werden. Mit den angegebenen Daten ist N0 dann also etwa 300, d.h. 300 Basenpaare schmelzen als Segment kooperativ.

12

3.5 Porphyrine Absorptionsspektren von Oxy- und Desoxyhämoglobin.

Pulsoximetrie Die Pulsoximetrie dient der Bestimmung der O2-Beladung des Hämoglobins im Blut. Es handelt sich um eine nicht-invasive Methode.

13

Definition der funktionellen Sättigung (SaO2 func):

22

2

HbOSaO funcHbO Hb

cc C

=+

Die funktionelle Sättigung berücksichtig nicht die Existenz von Dyshämoglobinen (Carboxyhämoglobin und Methämoglobin)

( )out LED

i i i

exp( )I I dcα

α ε λ

= −

= ∑

Berücksichtigt man nur die Species HbO2 und Hb, so muss man bei zwei verschiedenen Wellenlängen die Extinktion messen, die nach Lambert-Beer eine Funktion der Konzentrationen der Species ist. Es wird zumeist bei 660 nm und 940 nm gemessen. Da allerdings nicht nur Hämoglobin bei der Messung absorbiert, sondern auch immer ein konstanter Absorptionsanteil durch das Gewebe (Haut, Knochen etc.) vorhanden ist, wird die Absorption bei zwei verschiedenen Zeiten t1 und t2 aufgezeichnet. Die Intensität nimmt infolge der arteriellen Gefäßdickenänderung periodisch maximale bzw. minimale Werte an und ist so von dem offset durch die konstante Absorption durch das Gewebe zu unterscheiden. Aus diesen Überlegungen ergibt sich für zwei Species HbO2 und Hb bei zwei Wellenlängen und zwei Zeiten gemessene Absorptionen unter Zuhilfenahme des Lambert-Beerschen Gesetzes folgender Zusammenhang:

( ) ( )( ) ( ) ( ) ( )

Hb 2 Hb 12

Hb 2 Hb 1 HbO2 2 HbO2 1

SaO funcε λ ε λ

ε λ ε λ ε λ ε λΩ −

=Ω − −Ω +

( )( )( )( )

out 1 1

out 1 2

out 2 1

out 2 2

,ln

,,

n,

I tI tI t

lI t

λλλλ

Ω =

14

Das reale Verhalten ist weniger ideal als nach Lambert-Beer berechnet. Deshalb wird zumeist eine Kalibrationskurve erstellt.

Pulsationsfolge bei einer realen Messung