Funktionelle und strukturelle FT-IR spektroskopische ... Funktionelle und strukturelle FT-IR spektroskopische

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  • Funktionelle und strukturelle FT-IR spektroskopische

    Untersuchungen an der Ubichinol Oxidase Cytochrom bo3 von

    Escherichia coli

    Dissertation zur Erlangung des Grades

    eines Doktors der Naturwissenschaften

    der Fakultät für Biologie

    der Ruhr-Universität Bochum

    angefertigt im

    Lehrstuhl für Biophysik/

    Projektgruppe Cytochrom Oxidasen

    vorgelegt von:

    Alexander Prutsch

    aus Mannheim

    Bochum

    (2002)

  • Danksagung

    Ganz besonderer Dank gilt meinem Betreuer Herrn PD Dr. Mathias Lübben für sein Interesse an

    meiner Arbeit und seine ständige Diskussionsbereitschaft.

    Herrn Prof. Dr. W. Hengstenberg danke ich für die bereitwillige Übernahme des Korreferats.

    Bei Herrn Prof. Dr. Klaus Gerwert bedanke ich mich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes an

    seinem Lehrstuhl.

    Großer Dank gilt Herrn Dr. Benedikt Heßling für die Einweisung in die Methodik der FT-IR

    Messung an Proteinen, seinen vielen guten Tipps und Anregungen, sowie für die Korrektur des

    FT-IR-spektroskopischen Teils dieser Arbeit.

    Weiterhin danke ich den Mitarbeitern der Feinmechanischen Werkstatt des Lehrstuhls für Bio-

    physik, insbesondere Herrn H. Lehky, der mir mit seinen Lehrlingen bei der Verwirklichung

    von Gerätschaften immer mit Rat und Tat zur Seite stand. Bei Herrn J. Rotzing von der Glasblä-

    serei der Fakultät für Chemie möchte ich mich für die guten Lösungsvorschläge und die schnelle

    Realisierung dieser Vorschläge bedanken.

    Allen Mitarbeitern des Lehrstuhls danke ich für die gute und wissenschaftlich fruchtbare Zu-

    sammenarbeit, sowie die sehr angenehme Arbeitsatmosphäre. Den technischen Mitarbeitern des

    Lehrstuhls gilt ebenfalls mein Dank, ohne die eine Arbeit im Labor kaum möglich gewesen wä-

    re. Bei Herrn Axel Martin möchte ich mich für seine Geduld und seine guten Ratschlägen bei

    Fragen „rund um den Computer“ bedanken.

    Ganz speziell möchte ich mich bei den Mitarbeitern der Projektgruppe „Cytochrom Oxidase“

    bedanken, die einen großen Anteil am Gelingen dieser Arbeit hatten. Besonders sei Iris Schön-

    haar erwähnt, die immer ein freundliches Wort übrig hatte und von deren technischen Erfahrun-

    gen ich im Laboralltag viel profitieren konnte. Herrn Dipl. Biochem. Karsten Vogtt möchte ich

    für seine Diskussionsbereitschaft und für die Übernahme der Korrektur dieser Arbeit danken.

    Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Jürgen Kurzeck, der mich seit Studienbeginn an der RUB

    freundschaftlich begleitete und mit mir viele Jahre zu Mittag die abwechslungsreiche und deli-

    kate Mensakost genoß. Zudem hat er bei der Durchsicht dieser Arbeit viele hilfreiche Anreg-

    ungen gegeben.

    Meinem Vater Friedrich Prutsch danke ich für den Rückhalt und seine liebevolle Unterstützung,

    die erst mein Studium und meine Dissertation ermöglicht haben.

  • Abkürzungen und Schreibweisen

    Schreibweisen

    In der Regel werden Deutsche Wörter im Text dieser Arbeit bevorzugt und Ausdrücke aus ande-

    ren Sprachen, wie z.B. aus dem Englischen nur verwendet, wenn es sich um feststehende Fach-

    begriffe handelt oder keine treffende Übersetzung möglich ist. Im Text sind diese Ausdrücke

    durch Kursivschrift hervorgehoben. Der Text berücksichtigt weiterhin die Regeln der z-, k- und

    c-Schreibweise, ohne diese Regeln zwangsläufig auf die aus dem Lateinischen und Englischen

    übernommenen termini technici anzuwenden. Die „neuen Rechtschreibregeln“ werden als Or-

    thografiegrundlage benutzt. Bei der Bezeichnung von (bio-)chemischen Substanzen wird meist

    eine Abkürzung verwendet und organische Säuren werden meist in ihrer dissozierten Form ab-

    gebildet und bezeichnet. Die im Periodensystem verwendeten Elementsymbole werden bei

    Atomen und den Summenformeln von chemischen Verbindungen benutzt und sind hier nicht

    aufgelistet.

    Abkürzungen 1. Aminosäuren Im Text werden die Aminosäuren in der Regel mit ihrer Dreibuchstabenbezeichnung abgekürzt, in den Graphiken und bei Mutantenproteinen wird gewöhnlich ihre Einbuchstabenbezeichnung verwendet. Ala A Alanin Arg R Arginin Asn N Asparagin Asp D Aspartat Cys C Cystein Gln Q Glutamin Glu E Glutamat Gly G Glycin His H Histidin Ile I Isoleucin

    Leu L Leucin Lys K Lysin Met M Methionin Phe F Phenylalanin Pro P Prolin Ser S Serin Thr T Threonin Trp W Tryptophan Tyr Y Tyrosin Val V Valin

    2. Bezeichnungen der Spektren Absolutspektrum Extinktionsspektrum der Probe minus Pufferreferenz APR-Differenzspektrum Auto-photoreduktions-induziertes FT-IR Redox-Differenz-

    spektrum von Cyt bo3 COFR-Absolutspektrum Absolutspektrum des Kohlenmonoxid gebundenen, voll-

    ständig reduzierten Cyt bo3 CO-Differenzspektrum Differenzspektrum des reduzierten Kohlenmonoxid ge-

    bundenen minus reduzierten Cyt bo3 CO-Rekombinationsspektrum Photolysespektrum des COFR- Komplexes des Cyt bo3

  • Abkürzungen und Schreibweisen ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

    Differenzspektrum Die aus dem reduzierten Absolutspektrum minus oxidier- ten Absolutspektrum von Cyt bo3 resultierende Differenz

    Einkanalspektrum FT-IR Emissionsspektrum der Infrarotquelle, nach Licht- durchgang durch die Cyt bo3 IR-Probe

    FT-IR Spektrum Fourier-transformiertes Spektrum im mittleren Infrarot 77 K-Differenzspektrum Reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Differenzspektrum

    bei 77 K PR-Differenzspektrum Mit caged electrons photoreduktions-induziertes FT-IR

    Differenzspektrum von Cyt bo3 Redox-Differenzspektren Reduziertes minus oxidiertes Cyt bo3 Differenzspektrum

    bei Raumtemperatur VIS-Spektrum Extinktionsspektrum im sichtbaren Spektralbereich 3. Sonstige Abkürzungen (alphabetisch geordnet) Å Ångström Abb. Abbildung A.d. Aqua dest ADP Adenosindiphosphat ALV δ-Aminolävulinat Amp. Ampicillin ATP Adenosintriphosphat BCA Bicinchoninsäure bp Basenpaare bzw. beziehungsweise °C Temperatur in Grad Celsius ca. zirka CO Kohlenmonoxid COFR CO gebundenes, vollständig

    reduziertes Cyt bo3 COMV mixed-valence CO gebunde-

    nes Cyt bo3 cm-1 Wellenzahl CoA Coenzym A C-Terminus Carboxy-Terminus Cyt Cytochrom ∆ Differenz 3d Dreidimensional d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinsäure DQ/DQH2 Durochinon/Durochinol E Energie oder Extinktion E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FMN Flavinmononukleotid FT-IR Fourier-Transform Infrarot His-tag Oligohistidinmodifikation IR Infrarot K Temperatur in Kelvin kDa Kilodalton kJ Kilojoule

    KPi K2HPO4 / KH2PO4 M Molar mA Milliamper mg Milligramm µg Mikrogramm mL Milliliter µL Mikroliter mM Millimolar ms Millisekunde N-Terminus Amino-Terminus nm Nanometer ν? Wellenzahl OD Optische Dichte PCR Polymerase chain reaction QL Low-affinity-quinol oxidation

    site QH High-affinity-quinone bind-

    ing site RSA Rinder Serum Albumin RT Raumtemperatur s. siehe SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgel-

    elektrophorese Tab. Tabelle TEMED N, N, N, N´-Tetramethyl-

    ethylendiamin Tris Tris(hydroxymethylamino-

    methan) ü.N. über Nacht UpM Umdrehungen pro Minute V Volt vgl. vergleiche v/v Volumen pro Volumen v/w Volumen pro Gewicht VIS sichtbarer Spektralbereich

  • Inhaltsverzeichnis

    1. Einleitung Seite

    1.1 Aerobe Atmungskette.................................................................................................... 1

    1.2 Cytochrom Oxidasen..................................................................................................... 2 1.2.1 Reaktionsmechanismus 5 1.2.2 Häm-Kofaktoren 6

    1.3 Cytochrom bo3 von Escherichia coli............................................................................. 8

    1.4 VIS-Spektroskopie......................................................................................................... 10

    1.5 Infrarotspektroskopie................................................................................................... 11 1.5.1 Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie 12 1.5.2 Reaktionsinduzierte Redox-FT-IR-Differenzspektroskopie 14 1.5.3 Allgemeine Hinweise zur FT-IR Spektroskopie an Cytochrom bo3 17

    1.6 Zielsetzung...................................................................................................................... 19

    2. Material und Methoden

    2.1 Biologisches Material..................................................................................................... 20 2.1.1 Antikörper 20 2.1.2 Bakterienstämme 20 2.1.3 Plasmide 20 2.1.4 Oxidasen und Mutanten 21

    2.2 Chemikalien................................................................................................................... 22

    2.3 Geräte............................................................................................................................. 23

    2.4 Computersoftware ......................................................................................................... 23

    2.5 Nährmedien...............................................................