52

ภาคผนวก

53

ภาคผนวก ก

ภาพประกอบการศึกษาคณุสมบัติของราและยีสต

54

1. ภาพประกอบการตรวจวัดคุณสมบตัิของเชื้อรา Mucor sp

ภาพผนวกที่ ก1 การเจริญของเชื้อรา Mucor sp. บนอาหาร Martin medium 2. ภาพประกอบการศึกษาปจจัยท่ีมีผลตอการเจริญของยีสต

20 ºC 30 ºC 37 ºC

ภาพผนวกที ่ก2 ผลของอุณหภูมิตอการเจริญของยีสต

55

pH 3.5 pH 3 pH4 pH4.5

ภาพผนวกที่ ก3 ผลของพีเอชตอการเจริญของยีสต

Glucose100g/l Glucose200g/l Glucose300g/l

ภาพผนวกที่ ก4 ผลของความเขมขนปริมาณน้ําตาลกลูโคสตอการเจริญของยีสต

0% 5% 10% 15%

ภาพผนวกที ่ก5 ผลของความเขมขนเอธานอลตอการเจริญของยีสต

56

ภาคผนวก ข ภาพประกอบการหมักสาโท

57

ภาพประกอบการหมักสาโทโดยใชเชื้อบริสทุธ์ิและธัญพืชชนิดตางๆ

ภาพผนวกที ่ขุ1 การหมักสาโทจากขาวเหนียว

ภาพผนวกที ่ข2 การหมักสาโทจากขาวหอมมะลิ

58

ภาพผนวกที ่ข3 การหมักสาโทจากขาวโพด

ภาพผนวกที ่ข4 การหมักสาโทจากลูกเดือย

59

ภาพผนวกที ่ข5 การหมักสาโทจากถั่วแดง

60

ภาคผนวก ค การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ

61

การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ อาหารเลี้ยงเชือ้ Potato dextrose agar (PDA)

Potato 200 g/l D (+) Glucose 20 g/l Agar 15 g/l

ขั้นตอนการเตรียม Potato dextrose agar (PDA) Slant 1. ช่ังPDA 39 กรัม ละลายในน้ํากลั่น 200 มิลลิลิตร 2. ปรับปริมาตรใหได 1 ลิตรดวยน้ํากลั่น 3. ดูดแบงใสหลอดทดลอง หลอดละ 10 มลิลิลิตร ปดจุก 4. นําไปฆาเชือ้ที่อุณหภูมิหอง 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที 5. วางหลอดใหเอียงจนอาหารเลี้ยงเชื้อแขง็ตัว

อาหารเลี้ยงเชือ้ YM slant เปปโตน (peptone) 5 กรัม ยีสตเอกแทรก (yeast extract) 5 กรัม มอลทเอกแทรก (malt extract) 5 กรัม กลูโคส (Glucose) 5 กรัม อะการ (agar) 20 กรัม น้ํากลั่น 1,000 มิลลิลิตร

แบงใสหลอดทดลอง หลอดละประมาณ 5 มิลลิลิตร ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งความดนัไอ ควบคุมอุณหภมูิที่ 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที วางหลอดใหเอยีงจนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัว เพื่อเก็บไวใชตอไป

62

อาหารเลี้ยงยีสต YM broth เปปโตน (peptone) 5 กรัม

ยีสตเอกแทรก (yeast extract) 3 กรัม มอลทเอกแทรก (malt extract) 3 กรัม กลูโคส (Glucose) 100 กรัม น้ํากลั่น 1,000 มิลลิลิตร

แบงใสขวดแกว ขวดละ 350 มิลลิลิตร ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งความดนัไอ ควบคุมอุณหภูมิที่ 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที

อาหารเลี้ยงยีสต Yeast extract glucose broth กลูโคส (Glucose) 20 กรัม ยีสตเอกแทรก (yeast extract) 3 กรัม น้ํากลั่น 1,000 มิลลิลิตร

แบงใสขวดแกว ขวดละ150 มิลลิลิตร ปดจุก ฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดความดัน ควบคุม

อุณหภูมิที่ 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที อาหารเลี้ยงเชือ้ Martin medium เดกโทส (Dextrose) 10 กรัม เปปโตน (peptone) 5 กรัม KH2PO4 1 กรัม MgSO4.H2O 0.5 กรัม Rose Bengal (1%) 3.3 มิลลิลิตร Agar 20 กรัม น้ํากลั่น 1,000 มิลลิลิตร

ฆาเชื้อในหมอนึ่งความดนัไอ ควบคุมอุณหภูมิที่ 121 องศาเซลเซียส นาน 15 นาท ี

63

อาหารเหลวน้ํามะพราว 1. น้ํามะพราว 1 ลิตร 2. น้ําตาลกลูโคส 160 กรัม 3. Peptone 5 กรัม 4. Yeast extract 2.5 กรัม ปรับ pH ใหเปน 5.0 ฆาเชื้อในหมอนึ่งความดัน ควบคุมอุณหภูมิที่ 110 องศาเซลเซียส นาน 15 นาที

น้ํามะพราวที่ผานการกรองดวยผาขาวบางแลว 1 ลิตร

เติมกลูโคส 160 กรัม Peptone 5 กรัม Yeast extract 2.5 กรัม

คนใหละลาย

แบงใส Flask หรือที่จะทําการเลี้ยงเชื้อ นําไปนึ่งฆาเชือ้ที่ 110 ºC 15 นาที

64

ภาคผนวก ง วิธีการวัดผล

65

วิธีการวัดผล การวิเคราะหปริมาณ Glucose โดยใช DNS reagent สารเคมีที่ใช : สารละลาย DNS (Dinitrosalicylic acid) สารละลาย DNS เตรียมไดโดย ช่ัง DNS มา 20 กรัมละลายในน้ํากลั่น 500 มิลลิลิตร เติมสารละลายดางลงไปทีละหยด (NaOH 32 กรัม ละลายในน้ํา 350 มิลลิลิตร) คนใหเขากันนําไปอังในอางน้ํารอนจนสารละลายใส แลวจึงเติม K , Na – tratrate ลงไปทีละนอยจนครบ 600 กรัม จากนัน้เติมน้ํากลั่นลงไปในสารผสมทั้งหมดใหครบ 2000 มิลลิลิตร ใสขวดมดื และเก็บไวที่อุณหภูมิหอง

สารละลายกลูโคสมาตรฐาน โดยเตรียมสารละลายกลูโคสใหมีความเขมขนตั้งแต 100-1,000 μg/ml

1. วิธีหาปริมาณกลูโคสมาตรฐาน 1.1 ปเปตสารละลายกลูโคสมาตรฐาน 1 ml ใสหลอดทดลองที่มีปริมาณกลูโคสในระดับ

ตางๆตั้งแต 100-1,000 μg/ml 1.2 เติมสาร DNS 1 ml ผสมใหเขากนั 1.3 ตมในน้ําเดือด 10 นาที หลังจากนัน้แชในน้ําเย็นทนัที 1.4 นําไปวดัคา Absorbance ที่ 570 nm 1.5 นําไป Plot เปนกราฟมาตรฐานกลูโคส

66

ตารางผนวกที่ ง1 แสดงปรมิาณกลูโคสและคา Absorbance ท่ี 570 nm

ปริมาณ glucose (μg/ml) คา Absorbance ที่ 570 nm

1,000 0.985 900 0.869 800 0.814 700 0.795 600 0.751 500 0.631 400 0.504 300 0.405 200 0.241 100 0.100

0

0.5

1

1.5

0 200 400 600 800 1000 1200

ปริมาณกลูโคส (ไมโครกรัมตอมลิลิลิตร)

Abso

rban

ce ที่

570 n

m

ภาพผนวกที ่ง1 กราฟมาตรฐานของน้ําตาลกลูโคส

67

2. การวิเคราะหหาปริมาณน้าํตาลกลูโคสที่มีอยูใน Crude enzyme (R0)

2.1 ปเปตสารที่กรองได 1 มิลลิลิตร ใสในหลอดทดลอง 2.2 ทําตามวิธีการในขอ 1.2-1.4 2.3 นําคา A570 nm ที่ไดไปอานคากลูโคสจากกราฟมาตรฐาน

3. การวิเคราะหหา Amylase activity 3.1 ปเปต citrate 0.1 M pH 6-7 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร และน้ําแปง 2% ปริมาตร1 มิลลิลิตรใสในหลอดทดลอง 3.2 ดูดเอนไซมอะไมเลสจากขาวเหนียวปริมาตร 1 มิลลิลิตรใสหลอดทดลอง 3.3 บมใน water bath อุณหภมูิ 40 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาทีเพื่อใหเอนไซมยอยแปงเปนน้ําตาล

3.4 หยุดปฏิกิริยาดวยการนําไปตมในน้ําเดือด 5 นาทีนําไปวเิคราะหปริมาณกลูโคส (R1) ตามวิธีการ 1.1-1.4

3.5 นําคา A570 nm ที่ไดไปอานคากลูโคสจากกราฟมาตรฐาน

68

ตัวอยางการคํานวณ เมื่อวิเคราะหหาปริมาณกลูโคสที่มีอยูใน Crude enzyme สามารถวัดคา Absorbance ที่ 570 nm ของตัวอยาง Crude enzyme R0 = 0.79 และ R1 = 0.85 และการเทียบกับกราฟมาตรฐานกลูโคสคูณดวยคาระดับความเจือจางพบวา มีปริมาณกลโูคสประมาณ 720 μg/ml (R0) และ 810 μg/ml (R1) คํานวณคา activity ของเอนไซมอะไมเลสไดจาก คา activity ของเอนไซมอะไมเลส = R1- R0 = 810 μg/ml -720 μg/ml = 90 μg/ml /10นาท ี = 9 μg/ml /1นาท ี = 0.04 μmole/ml /1นาท ี(หารดวยน้ําหนักโมเลกุลกลูโคส) = 0.04 Unit/ml

หมายเหตุ ปริมาณเอนไซมอะไมเลส หนวยเปน Unit โดย 1 Unit ของเอนไซม = ปริมาณ μmole กลูโคสที่ยอยได /ปริมาณเอนไซม 1 ml / 1 นาท ี

69

การวิเคราะหปริมาณแอลกอฮอลโดยใชเคร่ือง EBULLIOMETER โดยใชจุดเดือดของตัวอยาง ตองทําการ Calibrate เครื่อง Ebulliometer กอนโดยใชการหาจุดเดือดของน้ํา วิธีหาจุดเดือดของน้ําโดยใชเครื่อง Ebulliometer

1. เตรียมตะเกยีงแอลกอฮอลใหเรียบรอย 2. ลาง Boiler ใหทัว่ แลวเทน้ําออกทางทอ A 3. ใชกระบอกตวงแกว ตวงน้ําถึงขีด EAU (น้ํา) ปริมาตร 50 มิลลิลิตร กรอกใสชอง A แลว

ใสเทอรโมมิเตอรเขาที่ 4. จุดตะเกียงแลววางไวใตกระบอก B หลังจากนั้นปรอทจะสูงขึ้นและจะมีไอน้ําระเหย

ออกมาจากสวนบนของเครื่องมือ เมื่อระดับของปรอทอยูนิ่งแลว สมมุตวิาอานไดที่ 100.1 องศาเซลเซียส ใหหมุนแผนวงกลมชั้นบนที่มีอุณหภูมิ 100.1 องศาไปที่ศูนยดีกรีแอลกอฮอลของแผนลาง เมื่อทําดังนี้แลวเครื่องก็พรอมที่จะตรวจสอบ

วิธีตรวจสอบ

1. เปดก็อก C ใหน้ําออกใหหมด ใชสาโททีละนอยลางกลั้ว Boiler แลวเทออกใหหมด 2. เติมสาโทที่จะทดสอบใน Boiler ชอง A ดวยกระบอกตวงแกวตามขดีที่บอก WINE ใสเทอรโมมิเตอรแลวเติมน้ําเยน็ในกระบอก DE หลังจากนัน้ก็จุดตะเกียง ไมชาอุณหภูมจิะสูงขึ้น รอจนปรอทคอนขางคงที่ จึงอานอุณหภูมิที่กระเพื่อมสูงสุด สมมุติวาอุณหภูมิได 90.7 องศา ก็ใหดูแผนกลมบนตรงที่ 90.7 องศา จะตรงกับแผนลางที่ 13.5%แอลกอฮอลเปนตน นั่นคือเปอรเซ็นตของแอลกอฮอลในสาโทที่ตรวจสอบ

70

ก

ข

ภาพผนวกที่ ง2 ก เคร่ือง EBULLIOMETER ข แผนวงกลมเพื่อใชในการหาคาแอลกอฮอลโดยใชจุดเดอืดของตัวอยาง

A

B

C

% Alcohol จุดเดือด

71

การหาปริมาณกรดในรูปของกรดแลคติก 1. นําตัวอยาง 1 มิลลิลิตร เจือจางดวยน้ํากลั่น 10 มิลลิลิตร 2. เติมสารละลายฟนอฟทาลีน 3 หยด

3. ไตเตรตดวยสารละลายมาตรฐานโซเดยีมไฮดรอกไซด 0.1 นอรมัล จนกระทั่งถึงจดุ end point เปนสีชมพู 4. บันทึกปริมาตรสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซดที่ใชไป 5. คํานวนปรมิาตรกรดแลคติกโดยใชสูตรคํานวณขางลางนี้ เปอรเซ็นตของกรดแลคติก = มิลลิลิตรของ NaOH × normality ของ NaOH × 90.09 × 100 มลิลิลิตรของตัวอยาง× 1,000 การวัดคา pH วัดคาโดยใชเครื่อง pH meter ชนิดพกพา

ภาพผนวกที่ ง3 เคร่ือง pH meter ชนดิพกพา

72

การวัดปริมาณน้ําตาล (°Brix) วัดคาโดยใชเครื่อง Hand Refractometer

1. ใชแทงแกวจุมสารละลายตัวอยางหยดลงบนปริซึมของเครื่อง Hand Refractometer 2. คอยๆปดแผนใสที่ใหแสง

3. สารละลายตัวอยางตองกระจายทัว่ผิวปริซึม ระวังอยาใหมีฟองอากาศอยูใตแผนใส 4. สองดูสเกลในเครื่องผานชองมองของเครื่อง 5. อานคา องศาบริกซ ที่สเกลตรงรอยตอระหวางสีขาวและสีฟา 6. ลางดวยน้ําสะอาดและเชด็ดวยกระดาษทิชชูใหแหง

ภาพผนวกที่ ง4 เคร่ือง Hand Refractometer