MED RAZGL 2005; 44: 81–90 PREGLEDNI ^LANEK

81

Tadej Kotnik1, Alenka Ma~ek Lebar2, Ma{a Kandu{er3, Gorazd Pucihar4, Mojca Pavlin5, Bla` Vali~6, Damijan Miklav~i~7

Elektroporacija celi~ne membrane: teorija ter poizkusi in vitro

Electroporation of the Cell Membrane: Theory and Experiments in vitro

IZVLE^EK

KLJU^NE BESEDE: elektroporacija, membranski potenciali, elektri~na kapacitivnost, celi~na membrana prepustnost

Elektroporacija je pojav, pri katerem pride zaradi kratkotrajne izpostavitve celice elektri~ne-mu polju dovolj visoke jakosti do izrazitega pove~anja prepustnosti membrane. Reverzibilnaelektroporacija se pogosto uporablja za vnos snovi v celice v raziskavah, vse bolj pa se uve-ljavlja tudi v klini~nem okolju (elektrokemoterapija tumorjev). Najbolj uveljavljena razlagaelektroporacije pravi, da pride zaradi povi{anja membranske napetosti, ki nastopi ob izpo-stavitvi polju, do nastanka nanometrskih hidrofilnih por v lipidnem dvosloju. To razlagopodpirajo tudi najnovej{e simulacije molekularne dinamike lipidov v dvosloju. Elektroporacijeni mogo~e opazovati neposredno, saj so pore premajhne, lahko pa jo preu~ujemo z merje-njem elektri~nih in opti~nih lastnosti membrane ali z opazovanjem pretoka ionov in molekulskoznjo. Dele` elektroporiranih celic in vnos snovi nara{~ata z vi{anjem jakosti, trajanja in{tevila pulzov, vendar s tem nara{~a tudi dele` celic, ki izpostavitve ne pre`ivijo. Vrednostiparametrov pulzov, pri katerih dobimo najbolj{e rezultate, je potrebno dolo~iti eksperimen-talno v tistih pogojih, v kakr{nih nameravamo izvajati poizkuse

ABSTRACT:

Electroporation is a phenomenon during which exposure of a cell to an electric field resultsin a significant increase in its membrane permeability. Reversible electroporation is widelyused for internalisation of various substances in research, and is also becoming importantin clinics (tumor electrochemotherapy). Electroporation is explained as formation of

1 Doc. dr. Tadej Kotnik, univ. dipl. in`. el., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Laboratorijza biokibernetiko, Tr`a{ka 25, 1111 Ljubljana.

2 Doc. dr. Alenka Ma~ek Lebar, univ. dipl. in`. el., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko,Laboratorij za biokibernetiko, Tr`a{ka 25, 1111 Ljubljana.

3 Dr. Ma{a Kandu{er, univ. dipl. biol., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Laboratorij zabiokibernetiko, Tr`a{ka 25, 1111 Ljubljana.

4 Mag. Gorazd Pucihar, univ. dipl. in`. el., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Laboratorijza biokibernetiko, Tr`a{ka 25, 1111 Ljubljana.

5 Dr. Mojca Pavlin, univ. dipl. fiz., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Laboratorij zabiokibernetiko, Tr`a{ka 25, 1111 Ljubljana.

6 Mag. Bla` Vali~, univ. dipl. in`. el., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Laboratorij zabiokibernetiko, Tr`a{ka 25, 1111 Ljubljana.

7 Prof. dr. Damijan Miklav~i~, univ. dipl. in`. el., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Laboratorijza biokibernetiko, Tr`a{ka 25, 1111 Ljubljana.

KEY WORDS: electroporation, membrane potentials, electric capacitance, cell membrane permeability

T. KOTNIK, A. MA^EK LEBAR, M. KANDU[ER, G. PUCIHAR, M. PAVLIN, B. VALI^, D. MIKLAV^I^ … MED RAZGL 2005; 44

82

UVODCeli~na membrana prepu{~a le tiste moleku-le, za katere obstajajo specifi~ni mehanizmitransporta. Posamezne vrste ionov in manj-{ih molekul vstopajo v celico skozi proteinskekanale in ~rpalke, ki so vgrajeni v mem-brano, dolo~ene ve~je molekule pa z vezavona endocitotske receptorje v membrani inposledi~no tvorbo endocitotskih veziklov.Molekule, za katere specifi~en mehanizemtransporta ne obstaja, v fiziolo{kih razme-rah prakti~no ne morejo skozi membrano.Te`aven prehod skozi membrano omeji upo-rabnost mnogih zdravil, katerih delovanjev notranjosti celice je sicer zelo u~inkovito.

Ena od uspe{nej{ih metod umetnegapove~anja prepustnosti membrane je kratko-trajna izpostavitev celice dovolj mo~nemuelektri~nemu polju. Tak{na izpostavitev pri-vede do izrazitega pove~anja prepustnostimembrane, ki mu pravimo elektropermeabili-zacija oziroma elektroporacija. Strogo gledanopojma nista sopomenki, saj se prvi nana{a napove~anje prepustnosti nasploh, drugi pa priv-zema, da je to pove~anje posledica nastankahidrofilnih por v membrani. Slednja razlagase je v zadnjih dveh desetletjih uveljavila zara-di svoje teoreti~ne podprtosti, njej v prid pagovorijo tudi najnovej{e simulacije moleku-larne dinamike lipidnih dvoslojev. Tako danesve~ina avtorjev – v nadaljevanju ~lanka tudimi – uporablja le {e besedo elektroporacija.O elektropermeabilizaciji beremo vse redkeje,nekaj krivde za to pa gre verjetno tudi okor-nosti pojma.

^e elektri~no polje ni premo~no in netraja ve~ kot nekaj milisekund, se po koncuizpostavitve prepustnost membrane postopo-ma zni`a na za~etno raven, celice pa ohranijosvoje fiziolo{ko delovanje; pravimo, da je

bila elektroporacija reverzibilna. Povi{anjeprepustnosti nastopi ̀ e v nekaj mikrosekun-dah, okrevanje pa je mnogo po~asnej{e in sepopolnoma zaklju~i {ele po ve~ sekundah alicelo minutah.

V ~asu povi{ane prepustnosti membraneje mogo~ vnos najrazli~nej{ih u~inkovin v celi-co. Manj{e molekule, ki jih sicer v celici ni,vstopajo vanjo z difuzijo, k pretoku ionov inelektri~no nabitih molekul, predvsem ve~jih(npr. DNA in proteinov), pa v ~asu delovanjaelektri~nega polja pomembno prispeva tudivle~na (elektroforetska) sila, ki jo ustvarjaelektri~no polje. Uporaba elektroporacije zavnos snovi v celico sega danes od temeljnihraziskav v biokemiji in molekularni biologiji,prek uporabnih raziskav v biotehnologiji infarmaciji, do predklini~ne in klini~ne upora-be v onkologiji in genski terapiji. Kombinacijaelektroporacije in kemoterapevtikov (elektro-kemoterapija) se je izkazala kot zelo uspe{nametoda zdravljenja ko`nih in podko`nih tumor-jev in se ̀ e uveljavlja v klini~nem okolju (1–4).Uporaba elektroporacije za vnos DNA (elektro-genska terapija) je {e v predklini~ni fazi,rezultati pa so zelo vzpodbudni in obetajoponovljivo in predvsem varnej{o alternativogenski transfekciji z virusnimi vektorji (5–8).

Namen pri~ujo~ega ~lanka je seznaniti bral-ce s teoreti~no razlago elektroporacije in njenouporabo v raziskovalnem okolju in vitro.

MIROVALNA IN VSILJENANAPETOST NA CELI^NIMEMBRANI

Zgradba in elektri~ne lastnosticeli~ne membrane

Z elektri~nega vidika predstavlja celi~namembrana tanek izolacijski sloj, ki lo~i dve

nanometer-sized aqueous pores in the lipid bilayer due to increased membrane voltage causedby an electric field. This explanation is also supported by molecular dynamics simulationsof the lipid bilayer. The pores are too small for electroporation to be observable directly, butit can be studied by measuring the electrical and optical properties of the membrane, or bymonitoring the flux of ions or molecules through the membrane. The fraction of electropo-rated cells and the uptake increase with the increase in the strength, duration and/or numberof pulses, but so does the fraction of cells that lose viability. For optimal results under spe-cific experimental conditions, the values of pulse parameters must be determined under thesesame conditions.

MED RAZGL 2005; 44

83

elektri~no prevodni podro~ji – citoplazmo inzunajceli~ni prostor. Lipidi, ki so glavni gradni-ki membrane, se v njej organizirajo v dvosloj,v katerem so polarne glave lipidov obrnjenenavzven, nepolarni repi pa navznoter (slika 1).Tudi proteini, ki se nahajajo v membrani, sozgrajeni iz polarnih in nepolarnih podro~ij,v membrano pa se vgradijo tako, da so nepolar-ni deli v notranjosti membrane, torej v stikuz repi lipidov, polarni deli pa segajo navzven.Zaradi tak{ne zgradbe voda in v njej raztoplje-ni ioni obdajajo membrano, v njeno notranjostpa ne morejo oziroma so iz nje hitro izrinjeni.

Mirovalna membranska napetost

Na celi~ni membrani je vseskozi prisotnaelektri~na napetost, ki je posledica majhne-ga primanjkljaja pozitivnih ionov v citoplazmi.Ta primanjkljaj ustvari in vzdr`uje sistem~rpalk Na+-K+ in trajno prepustnih kanalov K+.Na+-K+ ~rpalka v enem ciklu pre~rpa tri ioneNa+ iz citoplazme v zunajceli~ni prostor in dvaiona K+ v nasprotni smeri. Z vsakim ciklomte ~rpalke tako nara{~a razlika med elektri~-nima potencialoma, hkrati pa tudi razlika medkoncentracijama Na+ in K+ na zunanji innotranji strani membrane. Trajno prepustniK+ kanali omogo~ijo ionom K+ pretok skozimembrano v smeri padanja njihove koncen-tracije, torej navzven, vendar to {e pove~ujerazliko med elektri~nima potencialoma. Odte-kanje ionov K+ je zaradi tega vse po~asnej{ein se kon~no ustavi, s tem pa se vzpostavi rav-

note`no stanje. Napetosti, ki je takrat namembrani, pravimo mirovalna napetost,dolo~a pa jo Goldmanova ena~ba (9)

kjer je RT plinska konstanta, T absolutnatemperatura, F Faradayeva konstanta, q raz-merje prepustnosti membrane za Na+ in K+

(tipi~no okoli 0,01), [Na+]e, [K+]e, [Na+]i, in [K+]i

pa so koncentracije Na+ in K+ v zunajceli~nemprostoru in v citoplazmi.

Po uveljavljenem dogovoru merimo mem-bransko napetost tako, kot ~e bi bila referen~naelektroda zunaj celice, merilna elektroda pav citoplazmi. Zato ima mirovalna membran-ska napetost negativen predznak, po velikostipa zna{a med 40 in 90 milivoltov, odvisno odvrste celice in od faze celi~nega cikla.

Pri vzdra`ljivih celicah, kot so nevroni inmi{i~na vlakna, predstavlja mirovalna nape-tost izhodi{~no to~ko za za~etek vzdra`enjacelice (nastanek akcijskega potenciala). Obsta-ja vrsta hipotez, ki pravijo, da ima tudi prinevzdra`ljivih celicah mirovalna napetostsvojo vlogo, saj npr. pove~a ob~utljivost kana-lov v membrani na razli~ne spremembe. Neglede na veljavnost tak{nih predpostavk palahko z gotovostjo trdimo, da celi~na membra-na brez {kodljivih posledic prenese napetostireda nekaj deset milivoltov. To so tudi najve~-je vrednosti, ki se lahko na membrani pojavijo

Slika 1. Lipidni dvosloj in njegova okolica. Glave lipidov so polarne, zato se privla~ijo med seboj, privla~ijo pa tudi ione in molekulevode, ki so prav tako polarne. Repi lipidov so nepolarni, zato privla~ijo repe ostalih lipidov, ione in molekule vode pa izrinejo iz notranjostimembrane.

Umirovalna = ,lnRT T

F

q [Na+]e + [K+]e

q [Na+]i + [K+]i

T. KOTNIK, A. MA^EK LEBAR, M. KANDU[ER, G. PUCIHAR, M. PAVLIN, B. VALI^, D. MIKLAV^I^ … MED RAZGL 2005; 44

84

v fiziolo{kih razmerah, pred iznajdbo elektri~-nih naprav pa so bile lahko prese`ene br`konele ob udaru nevihtne strele ali pa ob bli`njemsre~anju z jeguljo ali skatom.

Vsiljena membranska napetost

Vsiljena membranska napetost nastane zara-di prerazporeditve ionov v elektri~nem polju.Med trajanjem elektri~nih pulzov se ta nape-tost pri{teje mirovalni, po koncu pulzov pa namembrani ponovno ostane samo mirovalnanapetost. Ustaljeno vrednost, ki jo vsiljenanapetost na membrani okrogle celice dose`ev nekaj mikrosekundah po vklopu enosmer-nega polja, opisuje Schwanova ena~ba (10)

kjer je E jakost zunanjega elektri~nega polja,R polmer celice, θ pa kot med smerjo poljain daljico, ki poteka od sredi{~a celice doobravnavane to~ke na membrani. Vsiljenamembranska napetost se tako za razliko odmirovalne, ki je povsod po membrani enaka,spreminja z lego, kot to dolo~a kosinusv Schwanovi ena~bi (slika 2).

Schwanova ena~ba pove tudi, da je vsilje-na membranska napetost sorazmerna jakostizunanjega elektri~nega polja. Tako lahko pridovolj mo~nem polju celotna membranskanapetost znatno prese`e najve~je fiziolo{kevrednosti, na kakr{ne je membrana prilago-jena. ̂ e membranska napetost dose`e nekajsto milivoltov – natan~na vrednost je odvisnaod vrste celice in eksperimentalnih pogojev –pride do elektroporacije celi~ne membrane.

^e celica ni okrogla, velja Schwanovaena~ba zanjo le pribli`no. Za nekatere pravil-ne geometrijske oblike, kot so sferoidi inelipsiodi, lahko izpeljemo natan~ne izraze, kiveljajo namesto Schwanove ena~be (11–13),pri bolj nepravilnih oblikah celic pa si poma-gamo s pribli`ki (numeri~nimi izra~uni), kijih dobimo z ra~unalnikom. Slika 3 prikazu-je podoben poizkus kot slika 2, le da je bilizveden na celici bolj zapletene oblike.

TEORETI^NA RAZLAGAELEKTROPORACIJEObstaja ve~ teoreti~nih modelov, ki sku{a-jo razlo`iti, kako izpostavitev elektri~nimpulzom privede do povi{ane prepustnostimembrane. Med njimi so tak{ni, ki sku{ajo

Uvsiljena = ERcosθ ,32

Slika 2. ^e celice obarvamo z enim od t. i. potenciometri~nih barvil, lahko membransko napetost opazujemo s fluorescen~nim mikroskopom.Na zgornjih slikah je bilo uporabljeno barvilo di-8-ANEPPS, ki pri negativni membranski napetosti fluorescira {ibko, z nara{~anjem napetostipa vse mo~neje. Levo zgoraj je prikazana celica B16-F1 (mi{ji melanom) brez zunanjega elektri~nega polja (samo mirovalnanapetost ∼ –40 mV), levo spodaj pa ista celica pri izpostavitvi elektri~nemu polju (na levi strani celice je napetost bolj, na desni pamanj negativna od mirovalne). Desno je {e graf membranske napetosti v odvisnosti od kota θ za spodnjo sliko (krogci prikazujejoizmerjene vrednosti, krivulja pa kosinusni potek, ki ga podaja Schwanova ena~ba).

MED RAZGL 2005; 44

85

pojav razlo`iti z elektrokompresijo membra-ne, z denaturacijo membranskih kanalov, patudi s tvorbo razpok med lipidnimi mikropo-dro~ji. Nobena od na{tetih razlag, katerihpodrobnej{i pregled najdemo v ~lanku Wea-verja in ^izmad`eva (14), ni na{la podporev eksperimentalnih rezultatih.

Kot smo `e omenili v uvodu, je danesnajbolj uveljavljen model, ki povi{anje pre-pustnosti membrane pripisuje nastankuhidrofilnih por v membrani (15, 16). Ta model

napoveduje, da povi{ana membranska nape-tost zmanj{uje energijo, potrebno za nastanekhidrofilnih por, s tem pa pove~uje verjetnosttak{nega dogodka (slika 4). S tem razlo`i tudipostopnost in po~asnost okrevanja, saj moravsaka pora za svoje zaprtje spet prese~i dolo~enenergijski prag. Model elektroporacije predvi-deva, da je premer hidrofilnih por velikostnegarazreda enega nanometra, z nara{~anjemmembranske napetosti pa stabilnost porehitro upada, dokler pri nadkriti~ni napetosti

Slika 3. Membranska napetost pri celici B16-F1, pritrjeni na podlago. Ker celica ni okrogla, vsiljene napetosti na njeni membrani nemoremo dolo~iti s Schwanovo ena~bo, temve~ si moramo pomagati z numeri~nim izra~unom na ra~unalniku. Levo zgoraj je celica brezzunanjega polja (samo mirovalna napetost), levo spodaj pri izpostavitvi elektri~nemu polju, desno pa je graf membranske napetostiv odvisnosti od kota θ za spodnjo sliko (krogci so izmerjene vrednosti, krivulja pa potek, ki ga dolo~imo z ra~unalnikom).

Slika 4. Energija membranske pore v odvisnosti od njenega polmera (levo) in skica elektroporacije na molekularnem nivoju (desno).Po zakonih termodinamike minimumi energije pore ustrezajo stabilnim stanjem. Prvi minimum je pri polmeru ni~, ko pore ni, torejtedaj, ko membrana ni elektroporirana (desno, A). Koni~ast maksimum energije, ki sledi, predstavlja prag, pri katerem se pora preob-likuje iz hidrofobne (B) v hidrofilno obliko (C, D). Napetost na membrani ta prag zni`a, kar pove~a verjetnost nastanka hidrofilnih por.^e ta napetost ni previsoka, sledi {e en minimum energije, v katerem se hidrofilna pora ustali (C), to pa omogo~i tudi poznej{e okre-vanje (reverzibilna elektroporacija). Pri previsoki napetosti ta minimum izgine, pora ob raztezanju ne dose`e ve~ stabilnosti (D), okrevanjepa prav tako ni ve~ mogo~e (ireverzibilna elektroporacija).

T. KOTNIK, A. MA^EK LEBAR, M. KANDU[ER, G. PUCIHAR, M. PAVLIN, B. VALI^, D. MIKLAV^I^ … MED RAZGL 2005; 44

86

reda nekaj sto mV ne pride do ireverzibilneporu{itve, kar je prav tako v skladu z ekspe-rimentalnimi ugotovitvami.

Predlaganih je bilo ve~ raz{iritev in dopol-nitev opisanega modela elektroporacije, kiupo{tevajo {e vlogo prevodnosti membrane(17, 18), ukrivljenosti membrane (19), osmot-skega tlaka (20, 21) in koncentracij ionovv celici in njeni okolici (22).

V zadnjih letih je zmogljivost ra~unalni-kov presegla mejo, nad katero je `e mogo~esimulirati molekularno dinamiko lipidov, tj.njihovo gibanje v dvosloju, obdanem z vodooziroma raztopino ionov. Tak{ne simulacijev splo{nem potrjujejo, da membranska nape-tost, ki za velikostni razred presega mirovalnovrednost, povi{a verjetnost oziroma pogostostnastanka por, pride pa tudi do spontanegaoblikovanja hidrofilne notranjosti pore – zaradivode in ionov v pori se lipidi v njej reo-rientirajo tako, da z glavami segajo v njenonotranjost (23–25).

Pore, ki nastajajo v simulacijah molekular-ne dinamike, so precej manj pravilnih oblikod tiste na sliki 4, a so vseeno dokaj stabilne inse ob ustreznem zni`anju membranske nape-tosti postopoma zapirajo. To ka`e, da je dorazumevanja vseh podrobnosti elektropora-cije sicer {e dale~, a so raziskovalci verjetnona pravi poti.

EKSPERIMENTALNI REZULTATIKot prvi je o elektri~ni poru{itvi celi~nemembrane leta 1958 poro~al Stämpfli (26).Pribli`no desetletje kasneje sta Sale in Hamil-ton objavila serijo ~lankov, v katerih sta opisalanetermi~no uni~evanje mikroorganizmov s krat-kimi elektri~nimi pulzi visoke napetosti (27–29).Leta 1972 pa sta Neumann in Rosenheck (30)pokazala, da lahko elektri~ni pulzi povzro~ijoznatno, a reverzibilno povi{anje prepustnostimembrane, ki ga lahko uporabimo za vnossnovi v celico. Njune ugotovitve predstavljajomejnik v raziskovanju elektroporacije, saj sovzbudile zanimanje {ir{ega kroga raziskoval-cev, eksperimentalni podatki pa so se natopri~eli kopi~iti hitreje in bolj sistemati~no.V nadaljevanju bomo pregledali razli~ne meto-de raziskovanja elektroporacije in rezultate,dobljene z njimi.

Prve sistemati~ne raziskave elektropo-racije so temeljile na meritvah elektri~nih

lastnosti membrane med izpostavitvijo elek-tri~nim pulzom. Te meritve so pokazale, dav primeru, ko napetost na membrani prese-`e dolo~eno kriti~no vrednost (med 0,2 V in1V, odvisno od vrste celic in eksperimentalnihpogojev), `e nekaj mikrosekund po za~etkuelektri~nega pulza zaznamo spremembo pre-vodnosti in kapacitivnosti membrane (30–32).Prevodnost membrane se pove~a za ve~ tiso~-krat, za~etno pove~anje kapacitivnosti pazna{a le nekaj odstotkov, kar ka`e, da elektro-kompresija membrane ne igra znatne vloge prielektroporaciji. ̂ e pulzi niso predolgi, se po nji-hovem koncu kapacitivnost in prevodnostmembrane postopoma vrneta v za~etno stanje.

Raziskave na celicah so pokazale, da greve~ji del povi{anja prevodnosti pripisati lipidne-mu delu membrane, tako da tudi denaturacijamembranskih proteinov nima pomembnej-{ega vpliva na elektroporacijo (32, 33).

Ve~ raziskovalcev je poizku{alo elektro-poracijo opazovati pod mikroskopom. Danesvemo, da neposredno opazovanje por ni mogo-~e, saj so premajhne tudi za najvi{je lo~ljivostielektronskih mikroskopov. Zato preostanele posredno opazovanje, pri katerem sprem-ljamo enega od pojavov, ki so posledicaelektroporacije. Tako lahko s katerim odpotenciometri~nih barvil, ki se vgradijov membrano, opazujemo spremembe mem-branske napetosti (glej npr. sliki 2 in 3),s katerim od vodotopnih (ponavadi fluores-centnih) barvil pa lahko opazujemo pretoksnovi skozi membrano. ^e v celico vnesemobarvilo, ki fluorescira le ob prisotnosti dolo~e-nih ionov, za katere je membrana neprepustna(pogosto Ca2+), v zunajceli~ni prostor dodamoraztopino teh ionov, nato pa celice elektro-poriramo, lahko opazujemo vnos ionovv celico (34). Primer tak{nega poizkusaprikazuje slika 5. Druga mo`nost je, dav zunajceli~ni prostor dodamo barvilo, ki neprehaja skozi membrano, ~e ta ni elektropo-rirana, nato pa celico elektroporiramo inopazujemo vnos tega barvila.

Pri opazovanju membranske napetosti jepomembno, da uporabimo barvilo, ki se odzi-va dovolj hitro, saj spremembe membranskenapetosti nastopijo ̀ e v prvih mikrosekundahpo za~etku elektri~nih pulzov. Na ta na~in sougotovili, da `e v manj kot mikrosekundi poza~etku pulza membranska napetost dobi

MED RAZGL 2005; 44

87

komponento kosinusne oblike, kot to pred-videva Schwanova ena~ba. ^e je napetostdovolj visoka, se kosinusna porazdelitev napodro~jih, kjer presega dolo~eno kriti~novrednost, v naslednjih nekaj mikrosekundahspet zni`a, kar odra`a za~etek elektroporaci-je tistega podro~ja membrane (35, 36).

^e `elimo opazovati pretok snovi skozimembrano, hitrost barvila ni tako pomembna.Za opazovanje pretoka ionov je pomembnopredvsem, da barvilo, ki fluorescira ob pri-sotnosti teh ionov, prehaja skozi membranotudi tedaj, ko ta ni elektroporirana, saj morabarvilo v celico vstopiti ̀ e pred elektropora-cijo, ki jo `elimo opazovati. Kadar opazuje-mo vnos barvila samega, pa je pogoj ravnonasproten – barvilo ne sme prehajati skozimembrano, ~e ta ni elektroporirana.

Z meritvami polarizacije absorbirane inodbite svetlobe je mogo~e oceniti tudi orien-tacijo glav lipidnih molekul v membrani. Neu-mann s sodelavci (37) je na ta na~in ugotovil,da prve spremembe polarizacije svetlobenastopijo v prvih mikrosekundah po za~etkupulza. Njihove meritve tudi nakazujejo, dav ~asu teh sprememb v lipidni dvosloj vdredolo~ena koli~ina vode, kar vidijo kot dokazza nastanek hidrofilnih por (prehod iz B v Cna sliki 4). Te naj bi obsegale med 0,02 in 0,2%celotne povr{ine membrane, odvisno od inten-zivnosti elektroporacije (torej od jakosti in tra-janja napetostnih pulzov).

^e poizkuse izvajamo na ve~ji populacijicelic, `elimo dose~i ~im ve~ji dele` tak{nihcelic, ki so elektroporirane in nato okrevajo.Hkrati je pogosto za`eleno, da je tudi vnos

Slika 5. Pretok kalcijevih ionov v celice HeLa (humani karcinom), pritrjene na podlago, pri izpostavitvi razli~nim jakostim elektri~negapolja med 200 V/cm in 600 V/cm. Uporabljeno je bilo fluorescentno barvilo Fura-2 AM, ki je aktivno le v notranjosti celice in fluoresciraob vezavi na ione Ca2+. Vidimo, da se z vi{anjem jakosti polja pove~uje dele` celic, pri katerih pride do elektroporacije, pa tudi vnoskalcija v te celice.

T. KOTNIK, A. MA^EK LEBAR, M. KANDU[ER, G. PUCIHAR, M. PAVLIN, B. VALI^, D. MIKLAV^I^ … MED RAZGL 2005; 44

88

snovi ~im ve~ji. V splo{nem velja, da inten-zivnost elektroporacije – s tem pa tudi vnossnovi – nara{~a z vi{anjem jakosti in trajanjaelektri~nega pulza, ~e uporabimo ve~ pulzov,pa tudi s {tevilom pulzov. Vendar z vi{anjem

vsakega od teh parametrov nara{~a tudi dele`celic, ki izpostavitve ne pre`ivijo oziroma ponjej ve~ ne okrevajo popolnoma. Skozi ve~ kotdesetletje eksperimentalnega dela {tevilnihskupin po svetu so nastala okvirna priporo-

Slika 6. Primerjava dele`a elektroporiranih celic, pre`ivelih celic (tistih, ki okrevajo) in povpre~nega vnosa barvila Lucifer Yellow (LY)v celico pri izpostavitvi enemu ali osmim pulzom dol`ine 100 µs ali 1000 µs in pri razli~nih jakostih (razmerjih med napetostjo naelektrodah in razdaljo med njima) pulzov. Grafi ka`ejo, da lahko z osmimi pulzi dose`emo znatno vi{ji vnos kot z enim samim pulzom.Glede na namen poizkusov je optimalna jakost pulzov tista, ki ustreza vrhu krivulje vnosa (za ~im vi{ji povpre~ni vnos), ali pa prese~i{~umed krivuljama elektroporacije in pre`ivetja (za ~im ve~ celic z vnosom). Na grafih je pri osmih pulzih dol`ine 100 µs to prese~i{~evi{je kot pri osmih pulzih 1000 µs, zato je v teh pogojih najbolje uporabiti osem pulzov dol`ine 100 µs in jakosti 1200 V/cm.

MED RAZGL 2005; 44

89

~ila glede napetosti, trajanja in {tevila pulzov,pri katerih dose`emo optimalno razmerjemed {tevilom elektroporiranih in pre`ivelihcelic (38–40). V eksperimentalnih pogojihin vitro se tako za vnos manj{ih molekul pogo-sto uporablja osem pulzov, od katerih vsaktraja 100 µs, sledijo pa si v razmikih 1 s.

Pri vnosu ve~jih elektri~no nabitih mole-kul igra pomembno vlogo tudi elektroforeza,torej vle~na sila, s katero elektri~no polje delu-je na nabite delce. Za zadovoljiv vnos molekul,kakr{na je na primer DNA, so zato potrebnidalj{i pulzi kot v primeru manj{ih molekul.Tako se v zadnjem ~asu v genski terapiji uve-ljavljajo postopki, v katerih kraj{emu pulzu(nekaj sto mikrosekund) z visoko napetost-jo sledi dalj{i pulz (nekaj deset milisekund)z nekajkrat ni`jo napetostjo (41–43).

Napetost na elektrodah, pri kateri dose-`emo najbolj{e rezultate, je odvisna od tega,kako dale~ narazen sta elektrodi. Schwanovaena~ba namre~ pove, da je vsiljena membran-ska napetost sorazmerna jakosti elektri~negapolja, ki mu je celica izpostavljena, ta jakostpa je sorazmerna napetosti med elektrodamain pribli`no obratno sorazmerna z razdaljomed njima. ̂ e sta elektrodi plo{~ati in njunavelikost znatno presega razdaljo med njima,je razmerje med napetostjo in razdaljo medelektrodama dober pribli`ek jakosti elektri~-nega polja; ~e je UE napetost med elektrodama

in d razdalja med njima, lahko torej pi{emoE ≈ UE/d. S tem izrazom in Schwanovo ena~-bo si pomagamo pri dolo~anju napetosti medelektrodama, pri kateri bo membranska nape-tost dosegla `eleno vrednost.

[tevilo, trajanje in jakost pulzov, pri kate-rih dose`emo najbolj{e rezultate, so sevedaodvisni tudi od vrste celic, s katerimi delamo,snovi, ki jo ̀ elimo vna{ati, pa tudi od ostaliheksperimentalnih pogojev. Optimalne vrednostiteh parametrov lahko dolo~imo le s poiz-kusi, seveda s tistimi celicami in v tak{nihpogojih, v kakr{nih nameravamo poizkusetudi nadaljevati. Slika 6 prikazuje del rezul-tatov serije poizkusov, katerih namen je bildolo~iti optimalne pogoje za elektroporacijocelic DC-3F (plju~nih fibroblastov kitajskegahr~ka).

Preu~evali so tudi u~inek oblike pulzovna u~inkovitost elektroporacije. Nekaj poro~ilje trdilo, da lahko u~inkovitost elektroporaci-je povi{amo tako, da navadnim »pravokotnim«pulzom dodamo sinusno valovanje s frek-venco nekaj deset ali nekaj sto kHz. Vendarzaenkrat ka`e, da sta klju~na parametra pul-za najve~ja napetost, ki jo pulz dose`e, intrajanje te napetosti (38–40). Razlike v rezul-tatih, ki jih dobimo z razli~nimi oblikamipulzov, je mogo~e razlo`iti z razlikami medvrednostmi teh dveh parametrov pri posa-meznih oblikah pulzov.

LITERATURA1. Mir LM, Glass LF, Ser{a G, Teissie J, Domenge C, Miklav~i~ D, Jaroszeski MJ, Orlowski S, Reintgen DS, Rudolf

Z, Belehradek M, Gilbert R, Rols MP, Belehradek JJr, Bachaud JM, DeConti R, [tabuc B, ^ema`ar M, Coninx P,Heller R. Effective treatment of cutaneous and subcutaneous malignant tumors by electrochemotherapy. BrJ Cancer 1998; 77: 2336–2342.

2. Heller R, Gilbert R, Jaroszeski MJ. Clinical applications of electrochemotherapy. Adv Drug Deliv Rev 1999 35: 119–129.3. Gothelf A, Mir LM, Gehl J. Electrochemotherapy: results of cancer treatment using enhanced delivery of bleomy-

cin by electroporation. Cancer Treat Rev 2003; 29: 371–387.4. Ser{a G, ̂ ema`ar M, Rudolf Z. Electrochemotherapy: advantages and drawbacks in treatment of cancer patients.

Cancer Ther 2003; 1: 133–142.5. Rols MP, Delteil C, Golzio M, Dumond P, Cros S, Teissie J. In vivo electrically mediated protein and gene trans-

fer in murine melanoma. Nat Biotechnol 1998; 16: 168–171.6. Aihara H, Miyazaki J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnol 1998; 16: 867–870.7. Ferber D. Gene therapy: safer and virus free. Science 2001; 294: 1638–1642.8. Golzio M, Rols MP, Teissie J. In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and

expression. Methods 2004; 33: 126–135.9. Goldman DE. Potential, impedance, and rectification in membranes. J Gen Physiol 1943; 27: 37–60.

10. Schwan HP. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Adv Biol Med Phys 1957; 5: 147–209.11. Schwarz G, Saito M, Schwan HP. On the orientation of nonspherical particles in an alternating electrical field.

J Chem Phys 1965; 10: 3562–3569.12. Kotnik T, Miklav~i~ D. Analytical description of transmembrane voltage induced by electric fields on spheroi-

dal cells. Biophys J 2000; 79: 670–679.13. Vali~ B, Golzio M, Pavlin M, Schatz A, Faurie C, Gabriel B, Teissie J, Rols MP, Miklav~i~ D. Effect of electric field

induced transmembrane potential on spheroidal cells: theory and experiment. Eur Biophys J 2003; 32: 519–528.

T. KOTNIK, A. MA^EK LEBAR, M. KANDU[ER, G. PUCIHAR, M. PAVLIN, B. VALI^, D. MIKLAV^I^ … MED RAZGL 2005; 44

90

14. Weaver JC, Chizmadzev YA. Theory of electroporation: a review. Bioelectroch Bioener 1996; 41: 135–160.15. Weaver JC, Mintzer RA. Decreased bilayer stability due to transmembrane potentials. Phys Lett 1981; 86A: 57–59.16. Glaser RW, Leikin SL, Chernomordik LV, Pastushenko VF, Sokirko AV. Reversible electrical breakdown of lipid

bilayers: formation and evolution of pores. Biochim Biophys Acta 1988; 940: 275–287.17. Barnett A, Weaver JC. Electroporation: a unified, quantitative theory of reversible electrical breakdown and rup-

ture. Bioelectroch Bioener 1991; 25: 163–182.18. Freeman SA, Wang MA, Weaver JC. Theory of electroporation for a planar bilayer membrane: predictions of

the fractional aqueous area, change in capacitance and pore-pore separation. Biophys J 1994; 67: 42–56.19. Neumann E, Kakorin S, Tonsing K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes. Bioelectroch

Bioener 1999; 48: 3–16.20. Rols MP, Teissie J. Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary

cells by osmotic pressure. Biochemistry 1990; 29: 4561–4566.21. Golzio M, Mora MP, Raynaund C, Delteil C, Teissie J, Rols MP. Control by osmotic pressure of voltage-induced

permeabilization and gene transfer in mammalian cells. Biophys J 1998; 74: 3015–3022.22. DeBruin KA, Krassowska W. Modeling electroporation in a single cell. II. Effects of ionic concentrations. Biophys

J 1999; 77: 1225–1233.23. Tieleman DP, Leontiadau H, Mark AE, Marrink SJ. Simulation of pore formation in lipid bilayer by mechani-

cal stress and electric fields. J Am Chem Soc 2003; 125: 6382–6383.24. Leontiadou H, Mark AE, Marrink SJ. Molecular dynamics simulations of hydrophilic pores in lipid bilayers. Biophys

J 2004; 86: 2156–2164.25. Kasson PM, Pande VS. Molecular dynamics simulation of lipid reorientation at bilayer edges. Biophys J 2004;

86: 3744–3749.26. Stämpfli R. Reversible electrical breakdown of the excitable membrane of a Ranvier node. An Acad Brasil Ciens

1958; 30: 57–63.27. Sale JH, Hamilton WA. Effects of high electric field on microorganisms I. Killing of bacteria and yeasts. Bioc-

him Biophyis Acta 1967; 148: 781–788.28. Hamilton WA, Sale JH. Effects of high electric field on microorganisms II. Mechanisms of action of the lethal

effect. Biochim Biophyis Acta 1967; 148: 789–800.29. Sale JH, Hamilton WA. Effects of high electric field on microorganisms III. Lyses of erythrocytes and proto-

plasts. Biochim Biophyis Acta 1968; 163: 37–43.30. Neumann E, Rosenheck K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J Mem-

brane Biol 1972; 10: 279–290.31. Babakov AV, Ermishkin LN. Influence of electric field on the capacity of phospholipids membranes. Nature 1966;

210: 953–955.32. Zimmermann U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochim Biophys Acta 1982;

694: 227–277.33. Chernomordik LV, Sukharev SI, Popov SV, Pastushenko VF, Sokirko AI, Abidor IG, Chizmadzev YA. The elec-

trical breakdown of cell and lipid membranes: the similarity of phenomenologies. Biochim Biophys Acta 1987;902: 360–373.

34. Bobanovi} F, Bootman MD, Berridge MJ, Parkinson NA, Lipp P. Elementary [Ca2+]i signals generated by elec-troporation functionally mimic those evoked by hormonal stimulation. FASEB J 1999; 13: 365–376.

35. Hibino M, Shigemori M, Itoh H, Nagayama K, Kinosita KJr. Membrane conductance of an electroporated cellanalyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential. Biophys J 1991; 59: 209–220.

36. Hibino M, Itoh H, Kinosita KJr. Time courses of cell electroporation as revealed by submicrosecond imagingof transmembrane potential. Biophys J 1993; 64: 1789–1800.

37. Kakorin S, Stoylov SP, Neumann E. Electrooptics of membrane electroporation in diphenylhexatriene-dopedlipid bilayer vesicles. Biophys Chem 1996; 58: 109–116.

38. Rols MP, Teissie J. Electropermeabilization of mammalian cells. quantitative analysis of the phenomenon. BiophysJ 1990; 58: 1089–1098.

39. Canatella PJ, Karr JF, Petros JA, Prausnitz MR. Quantitative study of electroporation-mediated molecular upta-ke and cell viability. Biophys J 2001; 80: 755–764.

40. Kotnik T, Pucihar G, Reber{ek M, Mir LM, Miklav~i~ D. Role of pulse shape in cell membrane electropermea-bilization. Biochim Biophys Acta 2003; 1614: 193–200.

41. Klenchin VA, Sukharev SI, Serov SM, Chernomordik LV, Chizmadzev YA. Electrically induced DNA uptake bycells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J 1991; 60: 804–811.

42. Sukharev SI, Klenchin VA, Serov SM, Chernomordik LV, Chizmadzhev YA. Electroporation and electrophore-tic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophys J 1992; 63: 1320–1327.

43. [atkausakas S, Bureau MF, Puc M, Mahfoudi A, Scherman D, Miklav~i~ D, Mir LM. Mechanisms of in vitro DNAelectrotransfer: Respective combination of cell electropermeabilization and DNA electrophoresis. Mol Ther 2002;5: 1–7.

Prispelo 25. 10. 2004