06-廖宇賡(11卷4期) revised p243-256 final - TARIweb.tari.gov.tw/csam/CEB/member/publication/11(4)/11(4)-6.pdf · 研究報告 243 加州藜蘆癒傷組織及類根莖體之誘導及其環巴胺含量分析

研究報告 243

加州藜蘆癒傷組織及類根莖體之誘導及其環巴胺含量分析

古國隆 1、黃慧中 2、廖宇賡 2,*

1國立嘉義大學應用化學系 2國立嘉義大學森林暨自然資源學系

摘要

Cyclopamine (環巴胺)存在於黑藥花科

(Melanthiaceae)藜蘆屬(Veratrum L.)的植物

體內，近年來被認定為具有治療惡性腫瘤疾

病之潛力。本研究以加州藜蘆(V. californicum

Dur.)之成熟胚為培植體，分別進行癒傷組織

與類根莖體(rhizome-like tissues; RLT)的誘

導及增殖，並從增殖的細胞或組織中萃取該

成分。成熟胚培養於MS基礎培養基添加 4.65

µM kinetin與 5.37 µM 1-naphthaleneacetic

acid (NAA)，可誘導出少數癒傷組織，經繼

代於增殖培養基後，可獲 6.748.92 倍之增

殖，其中最佳組合為含有 8.88 µM

6-benzylaminopurine (BAP) 與 1.07 µM

NAA之 MS培養基。RLT之誘導則以 MS基

礎培養基添加 4.4 µM BAP 及 4.5 µM

thidiazuron (TDZ)，可誘導胚培植體發育成

為具有 RLT之小植株，將小植株繼代於上述增

殖培養基後，可同時生長並保持 RLT的增殖。

將培養之癒傷組織及 RLT以乙醇萃取後，以高

效液相層析結合電噴灑離子阱質譜儀 (high

performance liquid chromatography–

electrospray ionization ion-trap mass

spectrometer; HPLC-ESI-MS)進行分析，結

果顯示二者的乙醇萃取液內，均含有

cyclopamine成分，其中以 RLT含量較高，

且含有 cyclopamine之同分異構物(isomer)。

關鍵詞︰抗腫瘤、藜蘆、Hedgehog訊號通路。

Induction of Callus and Rhizome- like Tissue in Veratrum californicum Dur. and Analysis of Their Cyclopamine Content Kuo Lung Ku1, Hui Chung Huang2 and Yue Ken Liao2,* 1 Department of Applied Chemistry, National

Chiayi University, Chiayi 60004, Taiwan ROC 2 Department of Forestry and Natural Resources,

National Chiayi University, Chiayi 60004, Taiwan ROC

ABSTRACT

Cyclopamine can be found in plants of the genus Veratrum (Melanthiaceae), and is suggested to be a potential therapeutic agent for antitumor treatment recently. The present study is to take mature embryos of V. californicum Dur. for induction of callus and rhizome-like tissue (RLT) and then extract cyclopamine from those induced cells and tissues. The mature embryos were cultured in MS medium supplemented with 4.65 µM kinetin and 5.37 µM 1-naphthaleneacetic acid (NAA) at a lower rate to induce the callus formation. The callus multiplication rates were 6.74 to 8.92 after being subculture in various proliferating media. Among them, the MS basal salts supplemented with 8.88 µM 6-benzylaminopurine (BAP) and 1.07µM NAA had the highest proliferation rate. The RLT growth was better in the MS medium supplemented with 4.4 µM BAP and 4.5 µM thidiazuron (TDZ). The development of plantlet and RLT proliferation were achieved after subculturing in the best proliferation medium as mentioned before. Cyclopamine was determined via high performance liquid chromatography–

* 通信作者, [email protected] 投稿日期：2014年 10月 6日接受日期：2014年 11月 27日作物、環境與生物資訊 11:243-256 (2014) Crop, Environment & Bioinformatics 11:243-256 (2014) 189 Chung-Cheng Rd., Wufeng, Taichung 41362, TaiwanROC

244 Crop, Environment & Bioinformatics, Vol. 11, December 2014

electrospray ionization ion-trap mass spectrometer (HPLC- ESI-MS) from the ethanolic extract of both callus and RLT cultures. Results showed that the RLT had a higher cyclopamine content than that of callus and an isomer of cyclopamine was detected in the RLT. Key words: Antitumor, Corn lily, Hedgehog

signaling pathway.

前言

Cyclopamine (環巴胺 )是從黑藥花科

(Melanthiaceae)藜蘆屬 (Veratrum)植物體內

分離得到的一種固醇型生物鹼 (steroidal

alkaloid)，該屬植物被歸類具有毒性，因早

期觀察到受孕後的動物在放牧時若取食藜

蘆，會使胚胎畸形發育 (Binns et al. 1962,

Keeler and Stuart 1987)。近年來的研究指

出，與胚胎分化有關的 Hedgehog 訊號通路

(Hedgehog signaling pathway)如在胚胎發

育早期受到阻斷(或不活躍)，則會導致畸形胎

發育，而 cyclopamine 即為阻斷此訊號通路

之物質。相反的，在多種癌細胞中卻發現此

訊號通路有過度活化的現象，因此推測該訊

號傳遞機制與癌細胞的生長、維持有關，若

能有效及適當的抑制此訊號系統，或許就能

抑制癌細胞病變，因而 cyclopamine 與其衍

生物被認為是具有潛在療效之抗腫瘤藥劑

(Taipale et al. 2000)，醫學上也已在培養之人

體腫瘤細胞(Dahmane et al. 2001)或動物體

(Berman et al. 2003, Watkins et al. 2003)進行

投藥試驗。

目前市面上的 cyclopamine 主要由藥廠採集野生的加州藜蘆 (V. californicum Dur.)植物體萃取而得，雖然該植物在其原生地(美國西部及西北部山區)尚能自然繁衍，但某些州已將其列為受保護植物，管制其採

取，故取得不易。又因 cyclopamine 化學結構複雜(Fig. 1)，人工合成方法繁瑣且收率甚低，目前尚無法大量製造 (Oatis Jr. et al. 2008)，故其價格不斐(以 Sigma 公司生產，編號 C4116-1MG該化合物之採購價為例，本

地廠商報價為新臺幣 9,900元 mg-1)。加州藜蘆種子有強烈休眠性(Taylor 1956)，幼苗生長緩慢，成長至成熟需時多年(Williams and Kreps 1970)。雖然研究人員曾嘗試以組織培養方式大量繁殖加州藜蘆 (Ma et al. 2006, Song et al. 2014)，期望建立無性育苗方法以培育植株供大量栽培，但加州藜蘆天然分布

在海拔 1,000–3,000 m之山區，地上部在入冬後消失，地下根莖(rhizome)亦需要在 5 ℃低溫下維持 120 d 才能打破休眠 (Sun et al. 2012)，因此要大量收穫植物體作為藥物萃取來源，有另尋他法之必要。本研究從組織培

養方法著手，改以培養及增殖加州藜蘆的細

胞及組織為目標，建立大量取得植物材料的

方法，並驗證從其中萃取 cyclopamine 之可行性，了解此生產途徑是否具開發潛力，以

達到大量萃取此生物鹼之目的，進而有助於

cyclopamine 於醫學臨床試驗及抗癌藥物開發上之研究，造福更多腫瘤疾病患者。

材料與方法

一、植物材料

加州藜蘆成熟種子採集於美國原生育

地，由本校古森本教授贈予供作試驗。種子

在 4℃黑暗中儲存，試驗前以濕紗布包裹，以少量蒸餾水浸潤，於相同低溫環境中置放 16 wk 以解除休眠，期間定期更換蒸餾水浸液保持種子潔淨。選擇鼓脹、健康並呈淡黃色或乳

Fig. 1. Structure of cyclopamine (Oatis Jr. et al.

2008).

培養加州藜蘆組織萃取環巴胺 245

白色種子進行試驗。

二、癒傷組織誘導及增殖

將種子以 15% (v/v) Clorox® (USA)加入商用洗潔劑 (commercial detergent) (每100 mL 1 滴)表面殺菌 3 min，以 70%乙醇(ethanol) (v/v)消毒 30 sec，再以 0.3% (w/v) HgCl2水溶液殺菌 1 min，最後以無菌水清洗4次，每次 3 min。以解剖刀縱向將種子切開，選擇長度大於 4 mm之胚(n = 20)，每個培養皿放置 5 個，本試驗共進行 2 次。誘導癒傷組織之培養基為 MS 基礎培養基(Murashige and Skoog 1962)添加 4.65 µM kinetin與 5.37 µM 1-naphthaleneacetic acid (NAA) (Ma et al. 2006)，以 3% (w/v)蔗糖為碳源並以 0.3% (w/v)水晶洋菜(gelrite)固化(稱之為M1培養基)。在 22 ± 1℃之黑暗環境內培養，每 2-3 wk繼代一次。

在癒傷組織增殖試驗中，將前一階段誘

導出的癒傷組織取 1 g 鮮重，平敷於培養皿中，培養皿內有 MS 基礎培養基含 8.88 µM 6-benzylaminopurine (BAP)，並另外添加不同濃度之 NAA (1.07、3.22、4.30、5.37及 8.10 µM) 或 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) (0.90、2.71、3.62、4.52、6.78、11.30 µM)共 11種不同之組合處理，每處理重複接種 4盤，每 4 wk繼代培養一次，經 8 wk後秤取每盤癒傷組織的鮮重。本試驗進行 3次，培養環境與癒傷組織誘導時相同。試驗結束

後，從所有處理中選擇一種較佳組合，在後

續試驗作為增殖培養基(稱之為 M2培養基)。

三、類根莖體(rhizome-like tissue; RLT)之誘導與增殖

從消毒殺菌後之種子中，將胚取出培養

於MS基礎培養基添加 4.4 µM BAP及 4.5 µM thidiazuron (TDZ) (稱之為 M3培養基) 。本試驗進行 2 次，每次取用 100 個胚，每培養皿放置 5個(共 20盤)。先於 22 ± 1℃黑暗環境中培養 3 wk，再移置於相同溫度之光照環境，其光照條件是以冷白螢光燈作為光源，

光強度為 59 µmol m-2 s-1，並調整光週期為光

期 16 h/暗期 8 h，每 3 wk繼代一次。將陸續產生的小植株(基部有 RLT 增生)繼代於M2培養基內，以 500 mL三角燒瓶為容器，每 23 wk繼代培養一次，使 RLT持續增殖。

四、統計分析

本研究增殖癒傷組織之試驗，採用完全

逢機設計 (completely randomized design; CRD)。將各處理培養 8 wk之癒傷組織分別秤重後，所得之數據以 SPSS (12.0版)進行單因子變方分析(one-way ANOVA)。

五、Cyclopamine 之萃取及分析鑑定

(一)萃取將加州藜蘆之癒傷組織及 RLT從培養基

中取出，平鋪置於吸水紙上，於 22 ± 1℃之環境下蔭乾(RLT需切成厚 1.0 mm之薄片)，取粉碎機處理成細粉狀後，各秤取 5 g 置入圓筒濾紙內，移往索式萃取器 (Soxhlet extraction)內，加入約 250 mL 95%的乙醇為溶劑，以 9597℃之水浴進行迴流萃取，直至萃取管內乙醇呈現澄清透明為止。迴流結

束後，利用減壓濃縮移除乙醇溶劑，容器中

殘留物再逐次加入甲醇(methanol) 溶解，甲醇之總添加量控制在 10 mL，之後以 0.22 µm無菌濾膜過濾後備用。而依照此溶解步驟操

作所得之癒傷組織萃取液則再次進行減壓濃

縮後，改以總體積 2 mL之甲醇溶解以提升濃度，過濾後備用。 (二)高效液相層析串聯電噴灑離子阱質譜儀

(high performance liquid chromatography–electrospray ionization ion- trap mass spectrometer; HPLC-ESI-MS)分析本研究之 HPLC 為 Agilent 1100 series

(Wilmington, DE, USA); G1311A pump串聯 G1314A UV-Vis 偵測器，分離管柱為Mightysil RP-18 column (250 × 4.6 mm i.d., 5 µm, Kanto Chemical, Japan)，紫外光偵測器波長為 210 nm。移動相 A 為 0.1%甲酸


(formic acid)之水溶液，B 為含有 0.1%甲酸之乙腈(acetonitrile)溶液，梯度沖提條件為移動相 B由 5%增至 95%，時間 40 min (Wilson et al. 2010a)，流速為 1 mL min-1，樣品注射

量為 20 µL。

質譜儀為 Finnigan LCQ advantage

electrospray ion-trap mass spectrometer

(Thermo, San Jose, CA, USA)，MS分析條

件：Sheath Gas 流速為 45 arb, Aux/Sweep

Gas 流速為 2 arb, 電噴灑電壓為正 4.3 kV,

毛細管溫度設定在 210℃。

利用 HPLC-ESI-MS 系統偵測培養之加

州藜蘆樣本內是否含有 cyclopamine。HPLC

的流析物經由 50:1之 T形分流器，高流量部

分進入 UV-Vis 偵測器，低流量部分進入質

譜儀。Cyclopamine 的分子量為 411.62 g

mol−1，[M+H]+ 為 412 (Welch et al. 2009)。

Cyclopamine 標準品 (Merck, Darmstadt,

Germany)與受測樣品(癒傷組織及 RLT 之萃

取液) 則以 flow injection analysis (FIA，流

動注入法) 直接進樣至質譜儀中偵測m/z 412

之母離子，並調整碰撞誘導解離

(collision-induced dissociation, CID)的能量

(5-45%)進行 m/z 412 之二次質譜 (MS2)分

析，分別偵測 m/z 412之斷裂片段：m/z 126、

157、213、253、279、297、321、377及 394，

必要時進行三次質譜(MS3)之分析。

結果

一、癒傷組織誘導及增殖

加州藜蘆胚培植體於 M1 培養基中培養 8 wk 後，二次試驗所培養的培植體(n = 40)中有 10-20%的個體出現誘導反應，產生鮮黃色、粒狀且質地堅硬之癒傷組織，但因生長

遲緩，在胚體上增生出團塊狀組織後即不再

增殖。於是接續將其繼代於添加 BAP組合不同濃度 NAA或 2,4-D之培養基中，每培養皿放置鮮重 1 g 之癒傷組織，經 2個月培養後，分別秤重進行 ANOVA分析，在統計分析上

不同處理間鮮重增加之差異雖未達 5%顯著水準(Table 1)，但實際培養於 8.88 µM BAP組合 1.07 µM NAA 培養基中之癒傷組織

(Figs. 2a 及 2b)，其平均鮮重達 8.92 ± 0.46 g，高於其它組合，故本研究將此組合選為癒傷組織持續增殖之培養基(即 M2培養基)，而此培養基除了未添加 adenine sulfate之外，其 BAP 及 NAA 的濃度與先前 Bacchetta et al. (2003)所建議用來繼代百合(Lilium spp.)小植株之培養基相同。

二、RLT之誘導與增殖

胚培植體培養於誘導 RLT生長的 M3培

養基內，於黑暗中培養 3 wk後可觀察到子葉

抽長或捲曲，部分培植體在子葉底端會有些

微的膨脹(Fig. 3a)，之後移置光照環境下繼續

培養 2-3 wk後，子葉底端腫脹之培植體少數

會開裂，其內萌生小芽(Fig. 3b)。多數未開裂

者，則以人工的方式將包覆於外層的子葉鞘

切除，可取得裡層的小芽。再將這些小芽繼

代培養約 6 wk後，即有小植株生成，其數量

可達全數培植體之 25%，而小植株基部有發

育生成 RLT者，則佔 51%，惟二者均生長緩

Table 1. Incubation of Veratrum californicum callus in the MS medium containing 8.88 µM BAP supplemented with NAA or 2,4-D at various concentrations for 8 wk.

Auxin Concentration

(µM)Fresh callus weight

(g)z NAA 1.07 8.92 ± 0.46

3.22 8.25 ± 0.55 4.30 7.56 ± 0.72 5.37 7.10 ± 0.49 8.10 6.74 ± 0.62

2,4-D 0.90 8.20 ± 0.75 2.71 7.22 ± 0.60 3.62 8.40 ± 0.69 4.52 8.28 ± 0.62 6.78 7.34 ± 0.61

11.30 8.54 ± 0.52 z The fresh weight did not show significant

difference among treatments (p > 0.05).


Fig. 2. Veratrum californicum calli grown on M2 medium. (a) Active proliferated calli on a 9-cm diameter Petri

dish. (b) A close view of the calli exhibiting a yellowish color. (Bar = 1.0 cm).

Fig. 3. Developing plantlets of Veratrum californicum from proliferated rhizome-like tissues (RLT). (a) An

embryo explant cultured in a M3 medium for 3 wk showing swelling at the base of the cotyledon. (b) A cultured embryo in a M3 medium with growing shoots (arrow) partially covered by cotyledonary sheath at the end of a 6-wk incubation (under illumination for 23 wk). (c) and (d) A plantlet without or with RLT, respectively, transferred onto M2 medium in a 500-mL flask for 12 wk. Bars in (a) and (b) are 1.0 mm.


慢，不再有進一步的變化。但是將其移往促

進植株生長的 M2 培養基後，兩者的生長狀況獲得明顯改善，增長迅速(Fig. 3c、3d)。特別是帶有 RLT之小植株，其基部腫大呈現深褐色的組織(即為 RLT)可持續增殖(Fig. 4)。本研究在紀錄中測得最大之單一 RLT，是在培養約 20 wk後，其鮮重達 74.8 g。

三、 Cyclopamine 之HPLC-ESI-MS檢測

經 HPLC- ESI- MS 分析結果顯示，cyclopamine 標準品的滯留時間 (retention time, RT)為 16.54 min (Fig. 5a1)，其質譜 m/z [M+H]+ 為 412 (Fig. 5a2)。而在癒傷組織萃取液的總離子層析圖 (full-MS total ion chromatogram; full-MS TIC)裡，於相同時間(Fig. 5b1箭頭指示處)，也偵測到[M+H]+ 412之離子訊號，但明顯看出非其主要成分，因

其離子訊號強度微弱，需仔細搜尋(Fig. 5b2箭頭指示處)。在 RLT樣品中，則於相同滯留時間時(Fig. 5c1 箭頭指示處)，在 full-MS TIC 層析圖中呈現一個較癒傷組織萃取液稍強之訊號(Fig. 5c2 箭頭指示處)，但也得知RLT 萃取液中，化合物種類比癒傷組織所含者要複雜得多。為了進一步確認此訊號成

分，將標準品及二種樣品中之 m/z 412作為母離子，進行 MS2之分析。由 Fig. 6之 MS2分

析圖譜中可觀察到，標準品(Fig. 6a)與癒傷組織萃取液內 m/z 412的斷裂片段(Fig. 6b)有相同之離子訊號，因此幾可斷定癒傷組織萃液

中所偵測到的 m/z 412即為 cyclopamine。而RLT 萃取液的 MS2分析圖譜(Fig. 6c)，其內斷裂片段雖與標準品所產生者也有幾乎吻合

之共有峰，然其 m/z 297的訊號超過應有的強度，因此推斷 RLT萃取液內應該還含有其他質核比(m/z)同為 412 之化合物，且此未知化合物應為提供額外 m/z 297斷裂片段的來源。

四、存在與 cyclopamine 同分子量之化合物

為驗證 RLT 萃取液內是否含有與

cyclopamine 同分子量之化合物，本研究分

別將標準品與 RLT萃取液直接進樣至質譜儀中，針對母離子(m/z 412)進行 MS2分析。依

序由低至高調整撞擊 m/z 412 母離子之能量，觀察其斷裂片段在質譜儀中之動態變

化。結果顯示在 CID 能量為 26%時，cyclopamine 標準品中並沒有因擊碎而新增片段(Fig. 7a1)，然此時 RLT萃取液內首先出現 m/z 297的斷裂片段(Fig. 7a2)。當 CID能量提高到 27%時，標準品在這個能量範圍中才開始出現甚微量之 m/z 297 片段 (Fig. 7b1)，然 RLT萃取液MS2質譜圖裡的 m/z 297增加幅度明顯(Fig. 7b2)。在 CID 能量達到

30%時，標準品中該訊號僅微幅增加 (Fig. 7c1)，但此時 RLT 中該訊號的顯著增幅(Fig. 7c2)已經和標準品所呈現者完全相異。此現象應為前述未知之同分子量化合物在 CID能量逐漸提升時因較容易被解離，故產生比標準

品(不含此未知物)還多的 m/z 297碎片。但將CID 能量增加到 34%以上，來自標準品中的m/z 412母離子還是會被擊碎，並出現m/z 297的碎片(Fig. 8a)。由此二證據可推測 RLT 萃取液內的m/z 297是由另一個與 cyclopamine同分子量之化合物所提供，此同分異構物

(isomer)可能在較弱的 CID 能量下被擊碎而釋出 m/z 297斷裂片段。由於以上二種在質譜儀中不同的動態變化，可以得知 RLT萃液中的確存在 cyclopamine之同分異構物。

Fig. 4. Volume enlargement of rhizome-like tissue

at the basal end of a Veratrum californicum plantlet placed on a 9-cm diameter Petri dish.


Fig. 5. HPLC analysis and total ion chromatogram (TIC) of mass spectrums of the cyclopamine standard and

the extraction samples. (a1) Cyclopamine standard, (b1) callus extract and (c1) rhizome-like tissue (RLT) extract show a common peak signal in HPLC at retention time of 16.5 min. Figures in (a2) Cyclopamine standard, (b2) callus extract and (c2) RLT extract present the TIC of eluate taken from 16.5 min retention time.


Fig. 6. MS2 spectrums of [411+H] + ion at m/z 412 derived from (a) cyclopamine standard, (b) callus extract and

(c) rhizome-like tissue extract.


五、Cyclopamine 的 MS3質譜分析

由於前述標準品之 m/z 412在 CID能量為 34%的情形下，會被擊碎產生包括 m/z 297在內的多種片段(Fig. 8a)，而 RLT 萃取液在相同條件下，亦會產生另一組碎片圖譜(Fig. 8b)，但是因為 RLT 成分中有 cyclopamine的同分異構物，由該異構物所提供之 m/z 412較易遭擊碎，因此圖譜中出現大量擊碎後產

物 m/z 297片段為預期中之事。我們將此二圖個別放大後，則 Fig. 8c (來自 Fig. 8a放大) 所呈現之細節就是一組專屬 cyclopamine 標準品的指紋圖譜，而 Fig. 8d (來自 Fig. 8b放大)之指紋圖譜則屬於 RLT所有，由於後者所含之同分異構物提供了額外的碎片，因此其與

cyclopamine標準品被擊後所產生者(Fig. 8c)有異，但二者之間應該還是有部份片段相同

(源自相同來源 cyclopamine)，如此才能證明

RLT 中亦含有目標成分。於是我們進一步分析標準品及 RLT萃取液內 m/z 412 之二次離子片段之三次離子，同時將之前已經獲得驗

證的癒傷組織萃取液也一併納入進行相同檢

測。在以標準品的片段(Fig. 8c)為比對基礎之下，經檢視各個二次離子 m/z 126、157、213、253、279、297、321、377及 394經擊碎後之片段，發現在三種受測物中，其中 m/z 157及 213的 MS3質譜是吻合的。m/z 157被擊後在三種受測物中均產生m/z 142及 129二個主要片段(Figs. 9a1、9a2及 9a3)，m/z 213被擊後則出現 m/z 129、143、157、171、185、197等三者共有之片段(Figs. 9b1、9b2及 9b3)。二種受測材料與標準品所呈現之 MS3 圖譜

有此相符的情形，可據以驗證本研究所培養

出的癒傷組織及 RLT 內確實含有

cyclopamine。

Fig. 7. MS2 spectrums of [411+H] + ion at m/z 412 derived from cyclopamine standard (a1, b1 and c1) and

rhizome-like tissue (a2, b2 and c2). The energy used for collision-induced dissociation (CID) of 26, 27 or 30% is labeled on the top margin of these figures for (a), (b) or (c), respectively.


Fig. 8. MS2 spectrums of [411+H] + ion at m/z 412 derived from (a) cyclopamine standard and (b) rhizome-like

tissue extract as the energy applied for the collision-induced dissociation (CID) set at 34%. (c) and (d) are the magnified plots from (a) and (b), respectively.


Fig. 9. MS3 spectrums of m/z 157 (a) and m/z 213 (b) which were derived from MS2 ion fragment of m/z 412

from tested samples of (1) cyclopamine standard, (2) callus extract or (3) RLT extract.


討論

加州藜蘆之癒傷組織培養為一簡易取得

該植物大量細胞的方法，雖然本研究在誘導

階段，培植體呈現誘導反應之比例不高，但

在後續增殖階段，癒傷組織在 BAP組合多種不同濃度NAA或 2,4-D的培養基中均能有效增殖(Table 1)，顯見其培養條件並不困難。在經 HPLC-ESI-MS 分析後，得知癒傷組織中所含的化學成分種類較 RLT少，日後在設計從中萃取純化 cyclopamine 之條件時也應較為容易。但是癒傷組織中 cyclopamine 含量濃度偏低是其主要缺點，本研究是在萃取

階段將癒傷組織的萃取液濃度提高為 RLT萃液之 5 倍時，方才於偵測儀器中獲得訊號。已知從培養方法著手，如調整培養基中成

分、酸鹼值、植物生長調節劑、添加誘引劑

(elicitor)等，均可提升培養細胞中的二次代謝物濃度(Murthy et al. 2014)，本研究的癒傷組織培養未來可嘗試以相似的處理來改善目前

濃度偏低的缺點。在組織培養條件下培養植物地下部器

官，常見的有誘導刺激馬鈴薯 (Solanum tuberosum L.) 芽體結薯 (tuberization) (Dragicevic et al. 2008, Dobranszki and Tabori 2010)、培養球根植物的球莖(corm)進行繁殖(Zel et al. 1997, Podwyszynska et al. 2014)或是增殖根莖並從其上誘導芽體萌生以建立小苗 (Rout et al. 2001, Kang et al. 2004)。培育地下部器官，增加其生物量再從中提取二次代謝物者則相對少見，因為以受

培養器官之體積增大為目標時，要先面對長

期於無菌環境中進行操作而發生汙染的風

險，其次是要解決適當培養容器的設計問

題。Cousins and Adelberg (2008)曾有在 2.5 L 的容器中培養 Curcuma longa L. 根莖 23 wk的紀錄。本研究在 500 mL的燒瓶內維持無菌培養至 20 wk時，已無法順利搬移培植體(體積過大)轉換容器，尋找特殊的容器應是RLT 培養過程中最大的限制因子。RLT 中

cyclopamine 的含量雖相對較高，但其中非目標化學物成分也較複雜(Fig. 5c2)，又有與cyclopamine 同分子量之化合物混於其中，且二者分離不易，日後在純化與分析上都有

一定的影響，因此若能解決 cyclopamine 純化之問題，將是具開發潛力之生產途徑。

Wilson et al. (2010a) 將配製於酸、鹼性溶液內之 cyclopamine 標準品，以相同的HPLC條件進行分析，結果顯示對照組(不添加任何酸鹼溶液之 cyclopamine標準品)只出現單一波峰，而被酸化之 cyclopamine 則會出現與標準品同分子量之共析出(co-eluting)化合物。他們將酸化的 cyclopamine 溶液進行核磁共振譜(nuclear magnetic resonance, NMR) 鑑定，結果顯示被酸化後的cyclopamine 會轉換成 cyclopamine-(s)及cyclopamine-(x)二種同分異構物，二者對Hedgehog pathway 的抑制效果比天然的cyclopamine 差。另外作者也報告，分析過程中 HPLC 移動相內添加 0.1% 甲酸，並不會酸化 cyclopamine 標準品。本研究在HPLC-ESI-MS 分析中第一階段所使用之分析條件即來自Wilson et al. (2010a)，且在樣品萃取過程中並未添加任何酸性物質，因此

推測 RLT 內之同分異構物，不是因酸化形成，應該是由 RLT自行合成，因為其細胞分化程度較癒傷組織為高，組織結構較複雜，

因而使其所含之成分也較單細胞之癒傷組織

多。Wilson et al. (2010b)也曾以歐洲白藜蘆(V. album L.)根部萃取液進行分析，結果顯示該植物的根部含有一種容易與 cyclopamine混淆之化合物 (dihydroveratramine; DHV)，其分子量與 cyclopamine 相同，在MS2 分析圖譜裡的主要碎片峰也與

cyclopamine相同，但卻不存在 cyclopamine分析圖譜中的一些次要斷裂片段，再進一步

以 HPLC 及 NMR 分析後，驗證 DHV 為cyclopamine 之同分異構物。此外他們也對DHV進行生物試驗，顯示 DHV也具有抑制Hedgehog pathway 之功效，但其效果較


cyclopamine差。該報告在 DHV [M+H]+ 412 的 MS2分析圖譜中，只顯示了 2 個訊號，最強為 m/z 297.2 之訊號，次之為 m/z 394.3 (Wilson et al. 2010b)。在本研究 RLT萃取液之 m/z 412 MS2分析圖譜(Fig. 6c)中，m/z 297和 m/z 394 的訊號強度比 cyclopamine 標準品中相同片段(Fig. 6a)的訊號強度比例要大許多，推測這些增強的訊號有可能來自

DHV。而 cyclopamine 與 DHV 二者的鑑定及分離，是日後開發利用 RLT應注意並須設法解決的首要議題。

誌謝

本研究承蒙本校生物農業技術學系古森

本教授提供加州藜蘆種子及 cyclopamine 標準品，謹致最大謝忱。

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－編輯：楊純明

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06-廖宇賡(11卷4期) revised p243-256 final - TARIweb.tari.gov.tw/csam/CEB/member/publication/11(4)/11(4)-6.pdf · 研究報告 243 加州藜蘆癒傷組織及類根莖體之誘導及其環巴胺含量分析